（环境工程专业论文）降解纤维素高效混合菌群的选育及其对火药氨化水解物降解的初步探究.pdf

题只能就此告一段落。虽然本研究选育出的9 组降解纤维素的高效混合菌群对 火药的氨化水解物制品的处理效果不甚理想，但是也为后续的工程菌的选育工 作积累了很多宝贵的经验。例如：可以考虑从火药的堆肥产物中获取目标微生 物，这样选出来的微生物在降解火药方面的针对性更强；可以考虑将选出的9 组混合菌群以排列组合的方式进行混合培养，然后用火药制品来分别驯化混合 培养的菌群；在试验时间和试验条件允许的情况下，可以考虑分离出降解纤维 素的单菌，再用细胞融合和转基因等技术制备出降解火药的高效工程菌。 关键词：纤维素降解混合菌群滤纸降解产酶特性火药 a b s t r a c t i nt h ep r o c e s so fd e s t r o y i n gt h ee n d o f - l i f ep o w d e r , t h ee n v i r o n m e n t a lp r o b l e m s i s i n c r e a s i n g l ys e r i o u s ，e s p e c i a l l yt h ep o w d e ru s e d i nc o m b u s t i o na st h em a i n m e t h o d so fd e s t r u c t i o n b c a u s eo fi t su n s t a b i l i t ya n di n s e c u r i t y , a n ds o m e e v e nh a v ea c e r t a i nt o x i c i t y , t h es t o r a g eo fp o w d e ri sd a n g e r o u s i tw o u l db r i n g s e r i o u s c o n s e q u e n c ei fd e a l i n gw i t ht h e s ed a n g e r o u sg o o d s n o tp r o p e r l y t h ep r o je c tp r o p o s e s t oc o m p o s te n t i r e dp r o p e l l a n ta m m u n i t i o nt of a r mt h e mi n t oo r g a n i cf e r t i l i z e r , w h i c h w o u l dg e tan e wm e t h o do fd e a l i n gw i t ht h ee n t i r e dp o w d e r i ti sn e c e s s a r yt oa d d h i g h - p e r f o r m a n c e dm i x e df l o r at os h o r t e nt h ec o m p o s t i n gc y c l e t h ep u r p o s eo fm y s t u d yi st os e l e c th i g h l ye f f i c i e n td e g r a d a t i o nm i x e df l o r ao ft h ee n t i r e dp o w d e r t h e m a i nc o m p o n e n to fp o w d e ri sn i t r o c e l l u l o s e ，a n dt h es t r u c t u r eo fn i t r o c e l l u l o s ei s s i m i l a rt ot h es t r u c t u r eo fc e l l u l o s e ，s ot h i se x p e r i m e n tw a sb e g i n n i n gf r o ms c r e e n i n g c e l l u l o s e d e g r a d i n gm i x e df l o r a ，a n dt h e n id i daf u r t h e rs t u d yo ft h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rd e g r a d a t i o no ff i l t e rp a p e ra n de n z y m ep r o d u c t i o n f i n a l l y , iu s e dt h e e n t i r e dp o w d e rt od o m e s t i c a t et h e s em i x e df l o r ao fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o n i nt h i ss t u d y , is c r e e n e d9g r o u p sm i x e df l o r as 1 ，s 2 ，s 3 ，s 4 ，s 5 ，j 1 ，j 2 ，j 3 ，j 4 劬mt h es u r f a c eh u m u so ff o r e s ts o i la n dt h eo u t f a uo fp a p e rm i l l t h es t u d i e so f t h e o p t i m a lc o n d i t i o n so f t h i s9g r o u p sm i x e df l o r ad e g r a d a t i n gc e l l u l o s ef i l t e rp a p e rh a v e s h o w nt h a tt h eg e n e r a lm o s ta p p r o p r i a t et e m p e r a t u r eo fd e g r a d a t i n gf i l t e rp a p e rw a s 5 0 6 0 ，t h eg e n e r a lm o s ta p p r o p r i a t ei n i t i a lp hw a s6 0 8 0a n d t h eg e n e r a l m o s ta p p r o p r i a t eb a c t e r i aq u a n t i t yw a s2 m l 4 m l t h ee n z y m ep r o d u c t i o nc h a r a c t e r i s t i c ss t u d yo ft h e9g r o u p so fm i x e df l o r ah a v e s h o w e dt h a t ：c u l t u r et i m e ，c u l t u r et e m p e r a t u r e ，i n i t i a lm e d i u mp ha n dt h ev o l u m eo f b a c t e r i af l o r ah a dag r e a t e ri m p a c to nt h ee n z y m ep r o d u c t i o n t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w i n g ：i n c u b a t i o np e r i o di s3 6 h 6 0 h ，c u l t u r et e m p e r a t u r ei s5 0 6 0 t l l ei n i t i a lm e d i u mp hi s6 0 8 0a n dt h ev o l u m eo fb a c t e r i af l o r ai s 2 m l 4 m l t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fe n z y m ep r o d u c t i o ns t u d ya n dd e g r a d a t i n g f l i t e rp a p e rh a dt h eb a s i ca g r e e m e n t t h a ti n d i c a t e dt h e9g r o u p so fm i x e df l o r aa l l a d a p t e dt ot h ee n v i r o n m e n to fh i g ht e m p e r a t u r ec o m p o s t i n g i i i i h er e s u l tw a sn o tv e r yg o o dt h a tu s i n gp o w d e rt od o m e s t i c a t et h e 9g r o u p s m i x e df l o r a w h e nt h ea m o u n to fp r o p e l l a n tp r o d u c tw a sn o tt o om u c h ，i tm a d e t 1 1 e f i l t e rp a p e rc o l l a p s ep e r i o dg r o wb yo 5 d l d ，a n dw h e ng r a d u a l l yi n c r e a s e dt h e a m o u n to fp o w d e rp r o d u c t ，t h ee f f e c t so nm i c r o o r g a n i s m s w e r e g r o w i n ga n d g r o w i n g ，a sp o w d e rp r o d u c ti n c r e a s e dt oo 5 9 t h e9g r o u p so fm i x e df l o r ac o u l dn o t m a k et h ef i l t e rp a p e rc o l l a p s e t h er e a s o nm i g h tb et h ep o w d e rp r o d u c th a ds o m e c e r t a i nt o x i ct ot h eb a c t e r i a i nt h i ss t u d y , id i dn o tf i g u r eo u te f f i c i e n tm i x e df l o r a ，b u tia c c 啪u l a t e d al o to f v a l u a b l e e x p e r i e n c e f o rf o l l o w i n gs e l e c t i o n f o r e x a m p l e ：c o n s i d e r i n gt og e t m i c r o 。o r g a m s m sf r o mt h ep r o d u c t i o no ft h ec o m p o s t i n g ；c o n s i d e r i n gt om a k et h e9 g r o u p sm i x e df l o r ac o m b i n a t ew i t he a c ho t h e ra n dt h e nu s et h et h ep o w d e r p r o d u c tt o d o m e s t i c a t et h e m ；i nt h ep e r m i s s i o no ft i m ea n dt e s tc o n d i t i o n ，w e c a nc o n s i d e rt og e t s i n g l e c e l l u l o s eb a c t e r i a ，a n dt h e n u s ec e uf u s i o n t e c h n o l o g ya n dt r a n s g e n i c t e c h n o l o g yt op r e p a r eh i g h p e r f o r m a n c eb a c t e r i a k e yw o r d s ：p o w d e r ；c e l l u l o s ed e g r a d a t i o n ；m i x e df l o r a ；f i l t e rp a p e rd e g r a d a t i o n ； c h a r a c t e r i s t i c so fe n z y m ep r o d u c t i o n i v 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生( 签名) 酶 日期 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论 文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有关机构或论文数据库使用或收录 本学位论文，并向社会公众提供信息服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) ：毖导师( 签名) ：日期 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 现有废旧火药的处理方法，对环境的污染十分严重，特别是燃烧法，不仅 浪费了二次资源，而且所造成的环境污染问题尤为突出。废旧火药由于其固有 的爆炸和燃烧特性，以及剧毒性，在储存时具有潜在危险，若不能妥善的处理 这些危险品，将会给社会带来严重的后果。本课题总体上拟将废旧火药进行安 全化堆肥，使之转化为农用有机肥，从而创立一种资源化处理废旧火药的新方 法。 在堆肥过程中有针对性的添加高效工程混合菌群，对于缩短堆肥周期十分 必要。本论文研究的目的就是对废旧火药堆肥化降解具有较高降解能力的高效 工程混合菌群的选育作初步探索性研究。鉴于硝化棉为火药的主要成分，而硝 化棉的结构和纤维素的结构相似，所以本实验研究从筛选纤维素的高效降解菌 群入手，并且对筛选出的混合菌群降解滤纸的最适条件和产酶特性做了进一步 探讨。最后用火药制品来分别驯化选育出的纤维素降解混合菌群。 1 1 课题的研究目的和意义、技术路线及本论文的主要研究 内容 1 1 1 课题研究的目的和意义 保护自然环境和“绿色化 生产，是现代社会的一项重要国民经济工作， 是人类可持续发展的物质源泉。在废旧火药处理过程中，环境污染问题日益严 重，特别是废旧火药以燃烧法作为主要处理方法，环境污染问题尤为严突出。 目前和今后相当长的时间里，仍然有相当大数量的废旧火药。废旧火药由 于其固有的不安定性和不安全性，有的甚至有一定毒性，储存时具有潜在危险， 若不能妥善的处理这些危险品，将会给社会带来严重的后果。目前露天焚烧法 是处理火药的主要方法，即把火药运到空旷的烧毁场进行露天焚烧，这种方法 操作简单，处理费用低廉，但火药焚烧后生成大量高浓度的致癌物质及其他污 染废气，与故态燃烧残渣一起随着空气，雨水或水土流失侵害人类和生态环境， 武汉理工大学硕士学位论文 并使大量具有资源价值的有机化合物被白白浪费。所以采用焚烧火药的处理方 法已经明显落后，与现在大力提倡的环境保护也相悖。 在废旧火药资源化利用方面，目前已有不少学者专家在研究，已有的研究 成果主要是把废旧火药再造为民用炸药及化工原料，但该技术要求较高，种种 原因使之迄今尚难于大规模应用。 基于上述存在的问题，有必要探索废旧火药的资源化利用的新途径新方法。 本论文所属总课题的研究内容是：将废旧火药进行安全堆肥，使之转化为农用 有机肥，从而获得一种处理废旧火药的新方法。该方法的优点是：l 、可以安全 廉价地对废旧火药进行资源化处理；2 、可以将废旧火药转化为农业生产必不可 少的高效有机肥；3 、可以完全避免废旧火药处理对大气环境和水环境造成的污 染。该项目一旦成功，具有较大的经济效应、环境效应和社会效应。 1 1 2 课题的技术路线 ( 1 ) 火药的安全化处理：在火药中加入浓氨水( 化学纯) ，控制适当的水解反 应温度，反应一周的时间，得到近似泥状的水解产物，而火药有效成分经氨的 水解后其爆炸性能受钝化，从而降低其爆炸的危险。 ( 2 ) 降解火药制品的高效工程混合菌群的选育。 ( 3 ) 火药水解产物的堆肥化处理。在堆肥过程中添加选育出的高效工程混合 菌群，来缩短堆肥周期。 1 1 3 本论文的主要研究内容 本论文研究主要涉及课题总技术路线的第二部分，即降解火药水解物的高 效工程混合菌群的选育探索性研究，具体设定的研究内容为： ( 1 ) 根据生态模拟法原则，采集长期被稻草或树叶等覆盖的土壤样品和造纸 厂排污口污泥样品。并且筛选出对纤维素降解效果明显的混合菌群。 ( 2 ) 通过观察滤纸的崩解情况，得到各组混合菌群降解滤纸的最适条件，为 堆肥过程条件研究提供理论依据。 ( 3 ) 对筛选出的混和菌群的最适产酶条件进行研究，为堆肥过程条件研究提 供理论依据。 ( 4 ) 用火药制品来驯化筛选出的混合菌群，期望得到最终的降解火药的高效 2 武汉理工大学硕士学位论文 混合菌群。 1 2 火药简介 火药在火焰作用下能很快的燃烧，产生高温高压气体和火焰，对介质作抛 射功，火药作为枪、炮、火箭和导弹的发射能源，广泛用于军事。不同的武器， 配不同性质的火药，由于武器种类多，因而火药的品种也很繁杂【1 1 。 1 2 1 火药的分类 按照物理化学结构分为：均质火药和异质火药两类。均质火药包括单基、 双基、三基三种火药。异质火药包括低分子和高分子混合火药两种火药。分述 如下： ( 1 ) 溶塑火药 以高分子化合炸药( 主要是硝化棉) 为主体，用溶剂使其塑化、压实、成型的 火药。制成品为塑料结构。这类药的特点是：结构比较均匀，故叫它均质火药。 单基药：硝化棉用挥发性的醇( 乙醇) 醚( 乙醚) a g 合溶剂塑化，在成型后， 除去大部分溶剂，但仍留下少量剩余溶剂，故又称为挥发型溶剂火药。又因为 成份中只有硝化棉一种炸药为它的能量基础，所以叫单基药。 双基药：硝化棉和另一种爆炸性的溶剂组成的火药。这种爆炸性溶剂常 用的是硝化甘油和硝化二乙二醇。由于在成份中含有两种炸药成份作为能量基 础，故称双基药。又因为用炸药做溶剂，在制造中不需要除去，而且本身挥发 性很小，又叫它难挥发性溶剂火药。 三基药：硝化棉与两种爆炸性溶剂组成的火药。这两种爆炸性的溶剂一 般是：硝化甘油与硝化二乙二醇，硝化甘油与硝基胍，硝化甘油与黑索金等。 因为溶剂是不挥发的，所以又叫不挥发性溶剂火药。 ( 2 ) 混合炸药 主要是由氧化剂与可燃物经机械混合而成，各成分之间只有紧密接触，没 有化学上的结合，这类药的特点是：结构不很均匀，故叫它异质火药。 低分子火药：氧化剂、可燃物、粘合剂都是低分子化合物或单质所组成。 如黑药。 高分子混合火药：由高分子化合物作可燃物，与氧化剂混合而成。如橡 武汉理工大学硕士学位论文 胶火药、塑料火药等。 1 2 2 硝化棉 本实验中的火药制品选用单基药，它的能量基础只有硝化棉一种炸药，硝 化棉的含量占到整个单基药成分的9 0 以上，因此它的性质主要由硝化棉的性 质所决定。硝化棉又名硝化纤维素，它是纤维素的衍生物，分子结构式如下： h洲0 2 o h撇 其链由葡萄糖酐环状残基组成，具有一定的刚性，但环间的醚链又使链的 内旋转比较容易，所以分子链的主链介于完全刚性与完全柔性两个极端之间， 是一种半刚性高分子链。 1 2 3 火药的报废 在各种枪弹、炮弹和导弹中填充的火药，经过一定时间的存放后其燃烧性 能会因自然分解而降低。当其燃烧性能已经影响到枪弹、炮弹以及导弹的发射 威力时，我们就称之为“废旧火药”，而必须加以安全处理。 以往各国军队废旧火药的处理，都主要采取引爆或燃烧方式，不但影响了 环境，而且还使这一本可以作为资源二次利用的物质白白浪费。至8 0 年代以来， 国内外都在探索废旧火药的环保化处理方法，但由于问题的复杂性，收效甚微。 1 3 堆肥简介 1 3 1 堆肥化概述 堆肥化( c o m p o s t i n g ) 是利用自然界广泛存在的微生物( 细菌、放线菌、真菌等) 或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物 化学过程【2 1 。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与着地球表面的物 4 武汉理工大学硕士学位论文 质和能量循环。堆肥化过程可用下述反应式表达【3 1 ： 有机废物+ 0 2 苎竺生稳定的有机残渣+ c0 2 + h 2 0 + 能量 在人为控制条件下，堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成有机肥料一 一堆肥( c o m p o s t ) ，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，而且 对环境的危害甚小，是各种有机固体废物无害化与资源化的有效处理途径之一， 是集处理和资源循环利用于一体的生物方法。由于其无害化比较彻底和资源化 率比较高，目前已受到越来越多的关注。 根据处理过程中起作用的微生物对氧气的不同要求，可以把有机废物堆肥 处理分为好氧堆肥和厌氧堆肥。好氧堆肥堆体温度高，一般在5 0 6 5 ，故亦 称为高温堆肥。由于高温堆肥可以最大限度地杀灭病原菌，同时对有机物的降 解速度快，所以高温好氧堆肥方法是工厂化处理有机固体废物最常用的方法， 也是发展最快的技术。高温堆肥的本质就是在通气条件下，群落结构演替非常 迅速的多个微生物群体共同作用而实现的动态过程，在该过程中，每一个微生 物群体都有在相对短的时间内适合自身生长繁殖的环境条件，并且对某一种或 某一类特定的有机物质的起分解作用【4 j 。 1 3 2 微生物在堆肥中作用 堆肥过程是一个生物学过程，需要有一定数量和活力的生物源。由于人们 认为在人工条件下通过接种方法提高堆肥微生物数量和降解能力可加速堆肥反 应过程，因此广泛地进行了接种效应的研究。研究包括微生物培养剂、商业添 加剂、有效的自然材料等。其中商业添加剂是一种比较好的选择，经过专门研 究实验的复合菌剂在很大程度上可以加快堆肥的速度。清华大学王洪涛【5 】等开发 的木质纤维素类固体废物堆肥化促腐复合菌剂不仅减少了发酵时间，还促进了 堆肥的腐熟度，提高了产品品质达3 0 以上。 研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆 肥化进程中作用都比不上多种微生物群体的共同作用，各群体菌体在不同时期 起着主导作用。著名微生物学家陈华癸教授曾在他主编的微生物学一书中 指出在堆肥堆制过程中，进行微生物定向接种，可以加速堆肥材料的腐熟作用。 1 9 8 0 年上海辞书出版社出版的辞海一书中将“高温堆肥 称为“速成堆肥”， 与一般堆肥的主要区别是保证通气良好，更好地控制堆积物的碳氮比，湿度和 武汉理工大学硕士学位论文 酸碱度等，并常用人工接种高温纤维素分解菌。这种堆肥，腐熟分解快，堆制 时间短，且温度高，对消灭某些病原体，虫卵和杂草种子等效果较大。 接种微生物促进堆肥腐熟的机理有( 1 ) 提高堆肥初期微生物的群体数量，增 强微生物的降解活性；( 2 ) 缩短达到高温期的时间；( 3 ) 接种分解有机物质能力强的 微生物，促进腐殖化过程。目前应用的主要三种接种剂有微生物培养剂、营养 添加剂和有效的自然材料。有效自然材料主要是指粪便堆肥、牛粪、耕层土壤 和菜园土壤等，其中含有种类极其丰富的微生物群体【6 】。 ( 1 ) 真菌在堆肥化过程中的作用 在堆肥化过程中，真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要的作用。真菌不 仅能分泌胞外酶，水解有机质，而且由于其菌丝的机械穿插作用，还对物料施 加一定的物理破坏作用，促进生物化学作用。与细菌相比真菌抗干燥能力强， 但物料含水量大，通风不良时不利于真菌的生长和繁殖。有的研究针对堆肥化 中真菌群体落演替，将真菌分为三个特征组，并指出利用复杂碳源，能力及耐 受高温的程度是决定真菌在堆肥中定殖的两个最重要的因素。第一组真菌包括 中温类群，它们在堆肥的升温的前几天很快被杀死；嗜热真菌和耐热真菌也被 杀死。嗜热真菌在高温期降温之后人无法定殖，是因为它们仅能降解简单碳源 而不能利用纤维素和半纤维素，所以堆肥后期无法定殖。耐热真菌可以利用纤 维素和半纤维素，所以在堆肥后期可以继续存在。第二组真菌是在高温期结束 后很快出现真菌，它们都能很快利用纤维素和半纤维素且快速生长；第三组真 菌在高温结束后一段时间堆温下降阶段，它们在二次发酵对木质素的降解起着 主要作用。研究显示【7 j ，温度是影响真菌生长的最重要因素之一，绝大部分的真 菌是嗜温性菌，可以在5 3 7 的环境中生存，其最适温度为2 5 3 0 。但是， 在堆肥过程中，由于高温时间持续较短，在增强真菌降解能力的同时却不足以 将其致死，因此，高温意味着小群落的嗜热性真菌成为生物降解的重要因素。 其他影响真菌生长的重要因素包括：碳源、氮源和p h 值。通常较低的氮浓度是真 菌降解木质素的前提条件。但有时低氮浓度却会成为木质素分解的一个限制因 素。大多数真菌喜欢酸性环境，但实事上它们又都能在很广的p h 值范围内生存 瞵圳。总之，在有机废物降解过程中，真菌起着至关重要的作用，应调节堆肥物 料环境以促进真菌生长。 ( 2 ) 细菌在堆肥化过程中的作用 在好氧堆肥系统中，存在着大量的细菌。细菌凭借大的比表面积，可以快 6 武汉理工大学硕士学位论文 速将可溶性底物吸收到细胞中。所以在堆肥过程中，细菌在数量上通常要比体 积更大的微生物( 如真菌) 多得多。研究表明，嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微 生物，a b d e n n a c e u r 等人o j 的研究表明，在堆肥过程的初始阶段，嗜温细菌最为 活跃，其数量为8 5 1 0 8 5 8 1 0 9 g 干物料( w d w ) 之间，随着垛温达到最大值， 其种群数量达到最低；在降温阶段，嗜温细菌的数量又有所回升。b e f f a 等人【l l 】 曾经在堆肥过程中的高温期筛选出嗜热菌属，这些细菌能够在6 5 以上，甚至 高达8 2 的垛温下生长。 ( 3 ) 放线菌在堆肥化过程中的作用 放线菌是具有多细胞菌丝的细菌，因此它更像是真菌。在堆肥化过程中， 放线菌可以分解一些纤维素，并溶解木质素。同时，它们比真菌能够忍受更高 的温度和p h 值。所以，尽管放线菌降解纤维素和木质素的能力并没有真菌强， 但是它们在堆肥过程中的高温期却是分解木质纤维素的优势菌群【1 2 】。据研究， 放线菌之所以降解木质素纤维素的能力低于真菌，可能是放线菌比细菌和真菌 的繁殖缓慢，在养分充足的时候在竞争中居于劣势。目前有关于生物降解有机 固体废物的研究越来越受到人们的重视，其核心问题则是木质纤维素的生物降 解，黄得扬等人针对好氧堆肥和厌氧发酵两项主要的微生物处理技术，对其优 势微生物菌群、不同降解底物和微生物降解动力学方面的最新研究进展进行了 回顾和总结，并对环境微生物制剂的用以及有机固体废物的微生物处理技术的 发展做了合理的展望【l 引。 1 4 纤维素简介 天然纤维素难溶于水，也不能为微生物中的酸分解，对微生物分解具有强 抵抗力，并具有很大的张力【1 4 】。因此，虽然纤维素是储存葡萄糖的重要形式， 但不能为动物和人类所消化吸收，无法作为动物与人类的直接营养源。自然界 中，只有部分可通过其分泌的特殊酶分解纤维素的微生物，可直接利用纤维素， 但若自然地进行，速度相当缓慢。 1 4 1 纤维素的结构 纤维素的近似分子式为c 6 h 1 0 0 5 ，分子量约为2 0 万- - 2 4 0 万，是由1 3 d 葡萄 糖单链构成的大分子直链多聚物，大约含2 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 个葡萄糖单体，有的植物 7 武汉理工大学硕士学位论文 种甚至多至1 5 0 0 0 个，是一种高分子化合物。在纤维素链之间存在着氢键的缔合 作用，使纤维素链形成纤维素束1 1 5 。在纤维素的连续结构中，分子密度大的地 方，成平行排列，有较好的定向胜，形成纤维素的结晶性区域1 1 6 j 。在纤维素分 子的结晶区内，其直链状聚合物是同向配位的，被称作平行构造( 在纤维素的构 造研究中，关于聚合物的配位方向有两种说法；平行构造和逆平行构造。最近的 研究证明，天然纤维素为平行构造，而人为处理的纤维素，在外观上也有逆平 行构造) 。在纤维素分子中邻近的聚合物，有l 4 个分子离开原来位置在晶格空间 无间隙地配位形成氢键，使其稳定化。随着分子密度的变小，结合程度变弱， 分子间空隙变大，定向性变差，形成了纤维素的无定形区域。在纤维素中，除 了纤维素链之间存在氢键外，在分子内也存在氢键。氢键的存在给纤维素水解 带来很大的困难【l7 。 1 4 2 纤维素的化学性质 纤维素的化学性质比较稳定，不溶于一般的有机溶剂，在水性溶剂如纯水、 稀酸与稀碱中极难溶解，但有很强的亲水性，可被水溶胀。纤维素仅溶于一些 特殊的试剂，如氢氧化铜的氨溶液 c u ( n h 3 ) 4 ( o h ) 2 、铜乙二胺碱 c u e n 2 ( o h ) 2 、 季胺碱 ( c 2 h 5 ) 4 n o h 、氯化锌的盐酸溶液和二硫化碳等，用这些试剂处理纤维素 可以得到多种人造纤维的原料。 一定条件下纤维素可发生纤维素的降解和与纤维素羟基有关的衍生化反 应，前者指纤维素被氧化、被酸碱和酶水解、被微生物降解等，后者指纤维素 发生酯化、醚化、亲核取代、接枝共聚和交联等化学反应。 纤维素分子中的1 3 1 ，4 糖苷键是一种缩醛键，对酸敏感，在适当的氢离子 浓度、温度和时间作用下，糖苷键断裂、聚合度下降、还原能力提高，发生酸 水解反应。纤维素还能被纤维素酶水解。纤维素分子的末端含有潜醛基，失水 葡萄糖单元上有三个羟基，因此具有多元醇的结构，可在分子链上引入羰基或 羧基，使功能基改变而被氧化，其氧化方式有选择性氧化和非选择性氧化，一 些试剂可使纤维素发生特定位置和形式的选择性氧化，而大多数氧化是非选择 性的，如在不同的位置引入羰基或羧基并发生分子链的断裂。 纤维素中每一个葡萄糖残基含有3 个自由羟基( c 2 ，c 3 ，c 6 ) ，与酸可生成酯。 如将纤维素加到浓硝酸和浓硫酸的消化剂中，由于所用酸的浓度和消化的时间 不同，可以将其中的3 个羟基逐步酯化。存在的自由羟基也可发生醚化、亲核取 8 武汉理工大学硕士学位论文 代、接枝共聚和交联等化学反应。 1 5 降解纤维素的微生物 自然界中，纤维素能被千百种真菌、细菌和放线菌等微生物所降解。微生 物破坏纤维素有两种可能的方式，一种是先外部，再逐渐向内发展；另一种是由 内向外破坏。细菌一般是粘在纤维素纤维上，从纤维的表面向内部增生，在接 触点处纤维素被溶解，使纤维表面呈锯齿蚀痕，被细菌破坏后的纤维，如果被 某种溶液溶胀，由于不存在初生壁、次生壁均匀润涨、外观为伸直纤维，很容 易被分解。 霉菌是线状的，对纤维素纤维的降解集中在纤维的端部，并不断生长，由 内向外消化纤维素，使纤维逐渐被分解破坏。微生物降解纤维素释放出酶，再 引起纤维素的酶降解。天然纤维素结构极其复杂，纤维素的分解是一个复杂的 酶学过程。非结晶态纤维素分子由于氢键极少，酶易侵入，因而易水解；而晶体 状态的纤维素分子内及分子间的氢键极多，酶只能作用于微纤维的表面，且具 有高度的立体专一性，因而需要多种酶的参与。 在自然界中，有很多微生物，如真菌、细菌、放线菌可以降解纤维素类物 质。从表1 1 中，可以看到工业生产和实验室研究中常用的一些纤维素降解微生 物。 表1 1 纤维素降解常见微生物 t a b 1 1c o m m o n l yu s e dc e l l u l o l y t i cm i c r o o r g a n i s m s 种类菌属及菌种 9 武汉理工大学硕士学位论文 热梭菌属( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e u u m ) 热解糖梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m s a c c h a r o l y t i c u m ) 热硫化氢梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m h y d r o s u l f u r i c u m ) 生孢纤维粘菌属( s p o r o c y t o p h a g a ) 真菌好氧型木菌属( t r i c h o d e r m a ) 里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 拟康氏木霉( t r i c h o d e r m ap s e u d o k o n i n g i i ) 青霉属( p e n i c i l l i u m ) 细小青霉( p e n i c i l l i u mp u s i l l u m ) 特异青霉( p e n i c i l l i u mn o t a m m ) 绳状青霉( p e n i c i l l i u mf u n i c u l o s u m ) 斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 根霉属( r h i z o p u s ) 黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 漆斑霉属( m y r o t h e c i u m ) 疣孢漆斑霉( m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a ) 黑球漆斑霉( m y r o t h e c i u mm e l a n o s p o r u m ) 厌氧型 n e o c a l l i m a s t i x o r p i n o m y c e s p r o m y c e s c a e o m y c e s a n a e r o m y c e s 放线菌好氧型黑红旋丝放线菌( a c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l e s ) 玫瑰色放线菌( a r o s e u s ) 纤维放线菌( a c e l l u l o s a e ) 武汉理工大学硕士学位论文 纤维素降解细菌常见于腐植土，堆肥，还有反刍动物的胃肠中。一般纤维 素降解细菌是黏附在纤维素材料的表面，然后从表面先内部生长，在纤维素材 料的接触点的纤维素会先溶解，使纤维表面呈现锯齿蚀斑，而且若被破坏后的 纤维素材料被溶液侵入，纤维素就更加容易被降解。 好氧性的纤维素降解细菌多数是纤维单胞菌属、纤维弧菌属、噬胞菌属等。 常见的有节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 、小单孢菌( m i c r o m o n o s p o r as p ) 、小双孢菌 ( m i c r o b i s p o r as p ) 、诺卡氏菌( n o c a r d i as p ) 、红球菌( r h o d o c o c c u ss p ) 、链 霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 、高温单孢菌( t h e r m o m o n s p o r a m e s o p h i l a ) 等。 在自然好氧条件下纤维素材料的分解，主要是纤维素降解真菌在起主要作 用，细菌的作用占很小一部分。而在厌氧条件下纤维素材料的降解，一些厌氧 性细菌，如芽孢梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 就会起重要作用。纤维素厌氧降解菌研究 较多的是：产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌 等。细菌产生的纤维素酶大多结合在细胞膜上，所以细菌细胞需要吸附在纤维 素材料上才能起作用，生产上使用很不方便，而且酶的分离提取也较困难，经 济效益不高。但是细菌产生的中性纤维素酶和碱性纤维素酶，在其他工业生产 中有很高的利用价值。纤维素降解真菌对纤维素材料的降解可以分为物理性降 解和化学性降解。物理降解是因为真菌对纤维素具有很强的穿透能力，它能够 穿透角质屏障，分解很难被细菌和原生动物降解的木质素纤维物质。有研究表 明，纤维素降解真菌的穿透降低了植物纤维组织的内部张力，这样分离可木质 化的纤维组织，从而为细菌和自己下一步利用与木质素结合的纤维素材料创造 了条件。至于化学性降解则指的是纤维素降解真菌可以分泌多种类纤维素酶， 然后这些酶在协同作用下进行纤维素的降解【1 8 1 。 真菌中自腐菌和褐腐菌对木质素的降解效果较明显。研究较多的纤维素降 解真菌有康氏木霉( t f i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 、黑曲霉( a s p e r g i l lu sn i g e r ) 、斜卧青霉 ( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 等l l 引。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸 性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶一般是胞外酶，产生的纤维素酶被分 泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。 1 6 纤维素酶 纤维素是具有许多同质异晶体的聚合物，它的聚合度范围非常宽，可以从 武汉理工大学硕士学位论文 几百至1 5 0 0 0 左右。纤维素链之间存在着氢键，通过氢键的缔合作用，形成纤维 束，分子密度大的区域，成平行排列，形成结晶区；分子密度小的区域，分子 间隙大，定向差，形成无定形区。纤维素的多样性不仅表现在晶体结构上，也 表现在不同结构的分布上。这种底物结构的复杂性可能会诱导纤维素酶的多样 性。 纤维素酶对于纤维素的酶解是若干研究领域的热点，如农业废物的生物转 化，再生纸生产的改进，食物和燃料的生产，纺织品的生物磨光，除此之外， 还有洗衣粉，动物饲料，纸浆，果汁和饮料生产，烘焙，以及燃料酒精的生产【2 眦2 1 。 1 6 1 纤维素酶的组成 纤维素酶是多酶组分的一个复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。在天然纤 维素分子完全降解为葡萄糖的过程中至少需要三类酶的协同作用：内切葡聚糖 酶，外切葡聚糖酶，纤维二糖酶。 内切葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e s ) ，编号e c 3 2 1 4 ，系统命名为：内切1 3 一l ，4 d 葡聚糖酶( e n d ob 1 ，4 d g l u c a n a s e ，简称e g ) 。这种酶降解纤维素可溶合无定形 的区域，随机水解1 3 1 ，4 糖苷键，将长链的纤维素分子切断，产生新的纤维素 末端【2 3 1 。内切葡聚糖酶可为外切葡聚糖酶提供大量的反应末端，同时它也能水 解小分子的纤维素寡糖。 外切葡聚糖酶( e x o g l u c a n a s e s ) ，编号e c 3 2 1 9 ，系统命名为：外切l ，4 b d 葡聚糖酶( e x o 1 ，4 b d g l u c a n a s e ) 。这种酶也叫作纤维二糖水解酶 ( c e l l o b i o h y d r o l a s e ，简称c b h ) 。这类酶作用于纤维素分子的末端，依次从纤维素 分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲 基纤维素。传统上认为，外切酶是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖，然而 有研究表明，还有一些外切酶优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。所 以这一媒介作用同时需要对还原性末端和非还原性末端有特异性的纤维素二糖 水解酶。 纤维二糖酶( c e l l o b i a s e ，简称c b ) ，编号e c 3 2 i 2 1 ，系统命名为：1 3 葡萄糖 苷酶( 1 3 g l u c o s i d a s e ) 。这类酶的作用是将先前产生的寡聚糖，纤维二糖等水解为 葡萄糖。纤维素二糖酶是一种非专一性酶，它可以水解多种1 3 糖苷键，也能水 解纤维三糖、纤维六糖等。纤维二糖酶在水解过程中可以大大减小低聚糖对外 切酶和内切酶的产物抑制。 1 2 武汉理工大学硕士学位论文 这三个组分并非完全独立的，只有在它们的协同作用下才能使纤维素顺利 地分解为最终产物一葡萄糖。最近的研究表明，这些组分还包含一些同功酶。 1 6 2 纤维素酶的分子结构 研究人员通过对纤维素酶一级结构和三级结构的研究发现，纤维素酶分子 普遍具有类似的结构，纤维素酶全酶分子呈蝌蚪状，由球状的催化结构域 ( c a t a l y t i cd o m a i n s ，c d ) 、连接桥( 1 i n k e r ) 和纤维素结合结构域( c e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n s ，c b d ) 三部分组成 2 4 1 。( 1 ) 连接桥。纤维素酶的连接区大多富含脯氨酸 ( p r o ) 和羟基氨基酸。连接桥的作用可能是保持c d 和c b d 之间的距离，也可能有 助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；( 2 ) 纤维素结合结构域。它对酶的催化 活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。 其结合纤维素的作用机理目前尚不是很清楚。有人认为c b d 是通过氢键稳定结 合结晶底物的，纤维素酶的c b d 可位于肽链的n 末端或c 末端。据研究发现，一 些细菌的c b d 顺序有一定的共同特点，即带电荷氨基酸含量较低，羟基氨基酸 含量很高，均含有色氨酸、天冬