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摘要 筛选优化适合发酵高含糖原料生产酒精的酵母菌株、探索将其制成干酵母菌剂 的工艺流程对以含高糖物质( 如甜高粱) 为原料生产乙醇产业的建设和发展具有十 分重要的意义。用甜高粱秸杆大规模发酵生产酒精需要大量的酵母菌剂，但是目前 在我国适合于甜高粱秸秆生产酒精干粉茵剂的研究较少，一般仅限于菌种的分离、 筛选、鉴定。本研究利用经过低能矿离子束诱变的发酵甜高粱秸秆的高活性菌种， 通过对最适培养基的选择及优化，将其逐级扩大培养，离心分离，真空冷冻干燥， 使其浓缩转变为干粉，并保持其菌种活性，以适应工业化干粉菌剂的大规模生产。 主要研究内容如下： 1 、通过对已诱变的菌株进行分离筛选优化，选育出一株高活性酵母菌进行试验， 重点是对培养基进行优化，证明甜高粱汁培养基非常适合生产酵母菌剂，得出最适 培养基配方为：在糖锤度为1 2 。以上的甜高粱汁中加入o 3 硫酸铵、o 1 磷酸、 0 3 硫酸镁、0 2 氯化钙、o 0 3 磷酸二氢钾。获得扩培中最适培养条件为在2 8 ，p h 5 0 下，扩培过程中接种量为1 0 ，每步培养时间为2 4 h 。 2 、通过对离心条件做三因素三水平正交试验得出：4 、6 0 0 0 r m i n 、3 0 m i n 的离心效果最好，能获得较大的菌泥重量，适合于浓缩菌剂，以便于最后干粉的转 变。 3 、本实验摸索了一套生产发酵菌剂的工艺方法。研究表明采用逐级扩大培养的 方法能够达到本研究的目的。通过菌的扩大培养、离心分离、真空冷冻干燥得到酵 母干粉。适合于酵母菌真空冷冻保护剂配方的初步研究结果为甘油1 0 9 ，蔗糖1 0 9 。 经过对本工艺方法各个步骤进行发酵性能跟踪试验，发现各步骤c o ：失重总量变化 不大。 关键字：酵母菌菌剂甜高梁乙醇 t e c h n i c a ls t u d yo fd r i e dy e a s ts u i t a b l ef o rt h ef e r m e n t a t i o no f h i g hs w e e tm a t e r i a l a b s t r a c t s w e e ts o r g h u mc a l lg r o wi nt h ea d da r e ai nc h i n a , a n di ti sa b u n d a n t ，c h e a p ，s w e e t s o r g h u mc a l lb eu s e di nt h ep r o d u c t i o no fa l c o h o lt h r o u g hw h i c ht h es a f e ，c h e a pa n d e n v i r o n m e n t f r i e n d l ye n e r g yc a nb eo b t a i n e da n dt h es h o r t a g eo fe n e r g yw o r l d w i d ec a n b er e l e a s e d m o r ea n dm o r ey e a s ti sn e e d e dt os a t i s f yt h ef e r m e n t a t i o no fs w e e ts o r g h u m s t r a wt op r o d u c ea l c o h o li nl a r g es c a l e ，b u tn o wt h er e s e a r c ha n dp r o d u c t i o no fd r i e d y e a s tp o w d e ri n c h i n aa r er a r e l yr e p o r t e d i nt h i sp a p e r ，an e wy e a s ts t r a i nt h a t p e r f o r m e dw e l li nt h ef e r m e n t a t i o no fs w e e ts o r g h u ms t r a wf o ra l c o h o lp r o d u c t i o nw a s o b t a i n e d t h ec o n s t i t u t i o no fm e d i u mw a so p t i m i z e da n dt h ep o p u l a t i o nw a se n l a r g e d s t e pb ys t e p a f t e rt h ec o n c e n t r a t i o na n df r e e z i n g d r y ，t h ed r i e dy e a s tp o w d e rw a s o b t a i n e d m a i nr e s e a r c hc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w s ： f i r s t l y t h em u t a n ty e a s ts t r a i n st h a tc a np r o d u c e sm o s ta l c o h o li nt h eb a s i cm e d i u m o f s w e e ts o r g h u mj u i c ew e r es e l e c t e da n dp u r i f i e d t h en i t r o g e ns o u r c ea n dd i f f e r e n t i n o r g a n i cs a l to fa l c o h o lf e r m e n t a t i o nw a so b t a i n e df r o mt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ， a n dt h eo p t i m a lf i t t i n gc o m b i n a t i o n sg e tf r o mt h ef o u rf a c t o r sa n dt h r e el e v e lo ft h e o r t h o g o n a lf i t t i n gw e r e ：a d d i n g0 3 ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，o 1 h 3 p 0 4 ，0 3 m g s 0 4 ，0 2 c a c l 2 ， 0 0 3 k h 2 p 0 4i ns w e e ts o r g h u mj u i c eo ft h es u g a rd e g r e e12 。a b o v e i ne n l a r g ec u l t u r e ， t h eo p t i m a li n c u b a t i o nc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e2 8 c ，t h ep h5 0 ，t h ea m o u n to f i n o c u l a t i o nw a s10 ，t h et i m eo fe a c hp r o c e d u r ec u l t u r ew a s2 4h o u r s s e c o n d l y ， b e s tc e n t r i f u g a t i o nc o n d i t i o nw i t hl 9 3 3 0 r t h o g o n a ld e s i g n i n ge x p e r i m e n t w a s ：4 c ，6 0 0 0 r p m ，3 0 m i n al a r g ea m o u n to fg e r mc a r l b ea c q u i r e d ，w h i c hw a s s u i t a b l ef o rt h ep r o c e d u r et h a tf o l l o w s t h i r d l y ，t h eo p t i m a lt e c h n i c a lm e t h o df o rp r o d u c t i o no fy e a s tp o w d e ro b t a i n e d f r o mt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h i se x p e r i m e n ts h o w e dt h a tc u l t u r ee n l a r g e ds t e pb y s t e pc a l lr e a c ht h er e s e a r c ho b j e c t d r i e dy e a s tp o w d e rc a n b eo b t a i n e dt h r o u g he n l a r g e d c u l t u r e ，c e n t r i f u g a t i o n a n d f r e e z e - d r y i n g t h e f o r m u l ao f p r o t e c t i v ea g e n t f o r v a c u u m f r e e z e d r y i n gw a sg l y c e r i n10 9a n ds u c r o s e10 9 t h r o u g ht r a c kt e s tw i t he v e r y s t e p si nt e c h n o l o g i c a lm e t h o d ，i tw a sf o u n dt h a tt h ec 0 2 l o s e sd i dn o tc h a n g eal o ti n e a c hs t e p k e yw o r d s ：y e a s t ；b a c t e r i a ；s w e e ts o r g h u m ；e t h a n o l 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 主! j 盗3 日 期：垄绰；：f 导师指导研究生学位论文的承诺 ，a 占 本人承诺：我的研究生 皇簋i 磬 所呈交的学位论文是在 我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现任岗位职务 工作的结果，并严格按照国家及学校有关学术道德规范的规定要求而 获得的研究结果。如果违反，我必须接受按国家及学校有关规定的处 罚处理并承担相应导师连带责任。 指导教师签名：一塑绺 日 期：坦尘丝 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名： 蔓! i 塑j指导教师签名：国燃 日 期：2 趔! 生 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 从生物学角度来说，酵母是一种单细胞微生物，在真菌分类系统中属于子囊菌 纲、担子菌与半知菌类。在含糖质较多的酸性环境中生长，如水果、花蜜以及植物 叶子上，特别是果园、葡萄园的土壤中较多。甚至人体内也有酵母菌的存在。早在 数千年前酵母就与人类的日常生活有着密切的联系。目前，酵母主要用作面包、馒 头、包子、饼干和糕点等食品的发酵剂和强化增富剂，一直在为发酵食品提高营养 价值做着很大的贡献。同时，酵母在酿造、生物制药及酶制剂等工业中都有着广泛 而重要的应用。酵母与人们生活息息相关，是目前世界上唯一年利用量超过百万吨 的微生物，也是当代遗传工程利用最多的模式生物菌之一。 我国酵母工业化生产始于1 9 2 2 年，但是发展的速度很慢，随着国民经济的发展 和人民生活水平的提高，酵母生产发展速度迅速提高。全国各地纷纷建起现代化、 具有国际水平的酵母生产企业。产品种类从单一的压榨酵母发展为高质量的发面用 高活性干酵母、酿酒用高活性干酵母、酿酒生香酵母、酵母调味料等多种。 营养物质的选择是生产酵母的基础。营养物质一般包括六大类，即碳源、氮源、 无机盐、微量元素、特殊生长因子、水。其中碳源对酵母的生长影响最大，既是构 成酵母细胞和代谢产物中碳架的来源，同时又是合成细胞所需生物能量的来源，所 以选择一个能提供合适碳源的物质非常重要瞳，。 1 1 糖质原料 1 1 1 糖质原料概述 糖质原料是指含单糖、双糖等可被微生物( 酵母菌) 直接利用发酵的一种原料， 如糖蜜、红糖、甜高粱秸秆汁等1 。它区别于淀粉质原料，如薯干、玉米、大麦等 谷物原料，此类原料需经粉碎、蒸煮、水解、过滤等过程糖化后才能用作酵母的碳 源。 糖蜜是糖厂的副产品，可发酵性糖的含量一般在3 0 6 0 ，除此之外，还有一 定的可发酵性氮、多种无机盐及维生素，是酵母生产中比较理想的碳源“1 。 1 1 2 糖质原料工业 目前国内外普遍采用甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作为面包酵母、食用酵母、酿酒酵母 和药用酵母生产的碳源。甘蔗糖蜜是甘蔗糖厂的副产物，产于我国南方各省，以广 东、广西、福建、台湾、四川为最多。甘蔗糖蜜含有大量的蔗糖和转化糖，它的成 分随产地、品种和制糖工艺的不同而异，目前，我国甘蔗糖蜜总固形物含量多在 7 5 9 5 ，而可发酵性糖的含量大多在4 0 左右。 甜菜糖蜜是甜菜糖厂的副产物，产于我国北方地区，以东北、西北、华北为主。 2用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 俄罗斯和欧洲也盛产甜菜和甜菜糖蜜。甜菜糖蜜总固形物含量多在7 5 左右，可发 酵性糖的含量大多在4 0 左右。 由于糖蜜中含总糖分5 0 以上，在这样高的浓度下，酵母的生长十分困难。为 此，在生产酵母之前，糖蜜必须加水稀释。又因为糖蜜中含有大量的焦糖、氨基糖 等黑色素的胶体物质，它们的存在是发酵时产生大量泡沫的主要原因。所以在发酵 前需采用澄清方法将糖蜜中的胶体或色素除去。糖蜜中存在的糠醛，也会对酵母的 出芽数产生影响。 所以新型的糖质原料甜高粱在酵母菌的生产上具有很大的发展空间。 1 1 3 甜高梁 甜高粱( s o r g h u mb i e o l o r ( l ) m o e n e h ) 是近来新兴的一种糖料作物、饲料作物 和能源作物，它是产粒高粱的变种，由于糖粉较高，因此也被叫做甜秆哺1 。 甜高粱适应性较强，可以从海南岛到黑龙江的大庆等全国大部分地区种植。甜 高粱有抗旱、耐涝、耐盐碱的特性。它耐p h 值的范围很广，p h 值5 o 8 o 之间均 能生长。其根系发达，能够耐旱，也能耐水涝。品种不同其糖锤度也不周，部分为 2 0 左右，最高能到达3 0 ，汁液中含糖的主要成分为蔗糖、葡萄糖、果糖等哺3 。 甜高粱秆中的葡萄糖、果糖和蔗糖可直接发酵生产酒精，而以玉米或薯干等淀 粉质为原料生产酒精时，需要经过粉碎、糊化、水解等工序，生产成本会增高，工 艺复杂，且污染环境盯1 1 2 活性干酵母 国内常见酵母分类如下： 鲜酵母( f r e s hy e a s t ) 民p 新鲜酵母。新鲜酵母因含有大量水分，所以必须保持在 低温环境中，随取随用。可将新鲜酵母存于零下2 5 冰库内，保存期限可延至一年 之久，使用时，先取出放置于常温下，直至可用手捏碎，方可使用。但这种冷冻方 式会使酵母失去1 0 3 0 活力，所以用量必须随着储存时间延长而加大埔1 。 活性千酵母( d r yy e a s t ) 。活性干酵母是以固体形式存在，而不失去活性的酵母细 胞产品。干性酵母的使用量为新鲜酵母的半。干性酵母会因颗粒大无法溶解，而 失去作用悖1 。干性酵母使用水温以3 0 - 4 0 为理想，加入糖量为酵母的2 为佳。加 糖是为供给酵母营养，使干燥休眠的酵母菌能在水中短时间内恢复原来的活力，糖量 过多反而抑制酵母恢复活力，以致复活速度减慢，所以糖量不宜过多。干性酵母发 酵耐力比新鲜酵母强，但发酵速度不如新鲜酵母快n 们。 高活性干酵母( 1 n s t a n ty e a s t ) 。即发酵母的形成，是由于干性酵母颗粒大，使用 前须先泡上水略显麻烦，所以人们进一步将颗粒大的干性酵母改良制成细小颗粒类 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 似粉状的酵母。因即发酵母颗粒较细，在酵母低温干燥时处理迅速，因此酵母消耗 的活力较少。由于类似粉状，溶解快，能迅速恢复发酵作用，因此发酵速度比干酵 母快，稍逊于新鲜酵母1 。因活力较强，使用量少于活性干酵母。目前欧美国家使 用鲜酵母及酵母乳，东南亚处于热带主要还是使用干酵母，鲜酵母、酵母乳和干酵 母各有其优劣性，要综合考虑气候、贮运条件、使用方便性及成本等多种因素。 1 2 1 活性干酵母的特点 活性干酵母可在常温下长期贮存而不失活，而且将其复水活化后，能快速恢复 成正常活性的细胞。每克细胞数超过2 0 0 亿c f u ，含水量小于6 的活性干酵母被称 为高活性干酵母。高活性干酵母具有复水快、含水量低、贮藏时间长、使用方便等 优点。由于活性干酵母性能稳定、易于运输，因此广泛地应用于发酵和酿酒领域。 1 2 2 活性千酵母的应用 活性干酵母产品的便于运输特点，促进了酵母在偏远地区的应用，使酵母更广 泛的使用，方便了人们的生活，市场对酵母的需求量也越来越大。 目前，国内白酒厂、酒精厂都在使用酿酒干酵母，其应用范围包括酒精、麸曲白 酒、小曲酒、大曲酒和液态白酒，其可以提高发酵的稳定性和安全性、提高出酒率、 节能降耗等。酿酒活性干酵母在白酒、酒精、醋的生产发酵的应用中，可以节约成 本，节约人力，提高粮食利用率( 3 5 ) 。目前国内正在用活性干酵母代替白酒厂 和酒精厂的酵母培养车间，大大节省了建厂投资。啤酒、葡萄酒工厂也需要专用的 啤酒和葡萄酒干酵母。 活性干酵母在饲料、医药、化妆品等领域也有广泛的应用。 1 2 3 国内外的研究现状 从1 9 4 9 年的上海大华利酵母厂的鲜酵母到1 9 7 4 年的首次面包干酵母，我国干 酵母发展较为缓慢。随着改革开放，湖北安琪酵母股份有限公司、广东丹宝利酵母 厂和梅山马利酵母有限公司的相继投产，我国的干酵母朝着工业化道路逐渐的发展 起来n 2 1 。 总体说来，我国活性干酵母的生产有以下几个特点。 首先，我国活性干酵母产品产量、生产规模不断扩大。 活性干酵母行业处于快速发展期，全国的销售量每年基本上以1 0 - 1 5 的速 度递增。1 9 9 8 年国内高活性干酵母的总产量为1 8 万吨，2 0 0 1 年活性干酵母总产量 达3 5 万吨，2 0 0 2 年的总产量在4 5 万吨左右，2 0 0 3 年国内高活性干酵母总产量达 到了4 8 万吨，活性干酵母生产企业也由1 9 9 8 年的3 家发展到目前规模不等的企 4 用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 业1 4 家。 其次，活性干酵母品种由单一化向多样化发展。 现在的活性干酵母有面包酵母、高活性面包酵母( 低糖) 、高活性面包酵母( 高 糖) 、耐高温酒精活性千酵母、常温酒精高活性干酵母、生香酒用高活性干酵母、 黄酒高活性干酵母、葡萄酒高活性干酵母、啤酒高活性干酵母等。 再次，活性干酵母的生产技术也在不断的提高。 从发酵技术到生产工艺都在逐步的提高，生产设备装备也达到国际先进水平。 糖蜜的处理、杂菌的控制、发酵、离心、过滤、干燥、包装等工艺水平和自动化程 度不断提高。 单罐发酵产量也在逐渐增大，酵母密度逐渐提高，能耗逐渐降低。 国际酵母大公司也纷纷来中国投资，l e s a f f r e 集团成立于1 8 5 3 年，目前为全 球最大的酵母供应商，其酵母业务覆盖全球5 大洲，年产活性干酵母2 0 多万吨，其 高糖面包活性干酵母的质量一流，2 0 0 1 年全资收购了安徽明光酵母厂。 宾那斯集团( b u n sp h i i p & c o m p a n yl i m i t e d ) ，是目前全球三大酵母集团之一， 在全球2 0 个国家拥有3 1 个酵母厂，目前在中国有烟台马利、河北马利、哈尔滨马 利、梅山马利合资酵母公司。 这些国际大公司有经营理念、资本、管理等方面的优势，掌握着面包酵母菌种、 发酵等方面的核心技术以及酵母在全球布局的经验，无疑会对国内的酵母行业形成 冲击。同时也会促进国内酵母企业生产和管理水平的提高。 1 3 立题的目的及意义 当前，能源问题引起了世界各国共同关注。煤炭、石油和天然气储量有限且不 断减少，能源紧缺日益加剧，所以各国都在积极地寻找新的可再生能源。 可再生能源包括水能、生物质能、风能、太阳能、地热能和海洋能等。在众多 的可再生能源中，生物质能以独特的优越性受到了人们的青睐。具体表现在：生物 质能源分布广泛，可以不断再生：有些能源作物可以适应恶劣的土壤环境，能防风 治沙，提高土地的利用率。开发生物质资源，可以促进农村地区经济发展，有经济 和社会的双重效益。因此，生物质能在近年来的可再生能源开发利用热潮中有举足 轻重的地位，特别是在发达国家已经成为开发和利用的重点。其中转基因大豆生产 生物柴油，利用甘蔗中的糖粉生产酒精，利用甜高粱生产燃料乙醇都是各国重点研 究的课题嘲。 利用甜高粱秸杆大规模发酵生产酒精需要大量的酵母菌剂 1 4 】，但是目前在我 国适合于甜高粱秸秆生产酒精干粉菌剂的研究较少，一般仅限于菌种的分离【1 5 】、 筛选、鉴定，利用甜高粱汁生产活性干酵母的研究还未有报道，探索将适合发酵高 内蒙古农业大学硕士学位论文5 含糖原料的酵母菌株制成干酵母菌剂的工艺，对以甜高粱为原料生产乙醇产业的建 设和发展具有十分重要的意义【1 6 】。 1 4 主要的研究内容及技术路线 ( 1 ) 对已诱变的菌株进行分离筛选优化。 ( 2 ) 初步研究培养基的选择及优化。 ( 3 ) 对菌株扩培工艺进行研究，制定一个合适的生产菌剂工艺。确定最佳扩培条件。 ( 4 ) 选择合适的菌剂浓缩方法。确定最佳离心条件，最佳真空冷冻条件及菌株活性 保护剂配方。 ( 5 ) 观察并保持各个步骤菌株的活力 1 5 创新点 ( 1 ) 选择甜高粱汁为生产菌剂的培养基。 ( 2 ) 对适合发酵甜高粱汁的高活性酵母进行干粉转变的研究。 ( 3 ) 制定了一整套生产菌剂的工艺。 1 6 拟解决的关键问题及预达到的目的 ( 1 ) 培养基的选择及优化。 ( 2 ) 最佳扩培条件的确定。 ( 3 ) 选择合适的菌剂浓缩方法，最佳离心条件的确定。 ( 4 ) 真空冷冻条件及保护剂配方的研究。 2 材料与方法 2 1 材料 2 。1 1 原料、菌种 原料：甜高梁，内蒙古农业大学科技园区种植，八月下旬至九月初成熟，成熟 后将秸秆砍倒，去掉穗、根和叶子后，用榨汁机榨汁，冷藏备用。 出发菌株：1 2 # ( 内蒙古农业大学发酵工程实验室保藏) 。 2 1 2 培养基的制备 6用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 表1培养基及其配制方法 2 2 方法 2 2 1 菌株的培养 2 2 1 1 出发菌株的分离 从经过离子束诱变优化的菌株中，分离筛选菌株。 无菌条件下将实验室保藏的菌种接入甜高粱汁液体培养基在2 8 1 培养至培 养基内产生气泡即进行稀释，涂平板，分离n 们。根据在固体培养基上长出的菌落大 小、颜色、边缘及菌体的形状进行初筛n 。选择菌落乳白色、中等大小、表面光滑、 向上凸起、中心略有凹陷、边缘整齐、镜检椭圆形者进行下一步实验心。 2 2 1 2 出发菌株的筛选 将分离得到的酵母菌，接种到1 0 m l 糖锤度为1 8 的甜高粱汁试管培养基中n 引， 在2 84 c ，p h4 8 - - 5 0 下培养，每隔1 2 h 后测定c 0 2 失重，并在发酵结束测定酒精 含量和残糖量，从中筛选性状良好的出发菌株。做三次平行试验删。 2 2 2 酵母菌基本培养基的研制 本着对甜高粱汁进行充分利用和工程菌的需要进行酵母菌基本培养基的研制。 2 2 2 1 酵母菌在各种培养基上繁殖的对比 将酵母菌分别接入自制培养基、甜高粱汁培养基、麦芽汁培养基、土豆培养基、 豆芽汁培养基中进行生长情况观察陋。对比不同培养基中菌种的形态及数量。以此 来摸索哪种培养基成分更适合酵母菌发酵产生酒精啪1 。 具体方法为： ( 1 ) 准备自制培养基、甜高粱汁培养基、麦芽汁培养基、豆芽汁培养基、土豆 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 培养基这5 类培养基。分装到l o 支试管中( 每种培养基接入1 0 m l ，作两个平行) 。 ( 2 ) 将酵母菌种接入麦芽汁培养基中，在2 6 c 条件下经过2 4 h 培养，然后将 其分别接入装有各种培养基的2 5 0 m l 小三角瓶中，接种量为1 0 。2 6 c 培养2 4 h ，其 间对菌种进行形态和数量的观察。 ( 3 ) 对比不同培养基中菌种的形态及数量。 2 2 2 2 单因素实验 通过查阅资料，对甜高粱汁的全分析数据结果来看，甜高粱汁里缺少酵母生 长所需的几种无机盐乜钔，无机盐是微生物生命活动中不可缺少的物质，试验中添加 了硫酸镁0 3 、氯化钙o 2 、磷酸二氢钾0 0 3 对甜高粱汁进行了调配盈钔，然后 对碳源、氮源、磷源分别做了单因素试验，具体试验如下： 碳源：因为本试验采用的原料( 甜高粱汁) 中含有大量酵母菌可利用的糖类，所 以在培养基中不用再添加碳源。只需改造甜高粱汁，使其糖含量分别为6 、8 、 1 0 、1 2 、1 4 、1 6 ，然后通过菌的数量，活力确定其适宜的碳源。 氮源：选取硫酸铵作为氮源，在甜高粱汁中分别添加0 1 、0 2 、o 3 、0 4 、 o 5 、0 6 ，然后通过菌的数量，活力确定其适宜的氮源。 磷源：选取磷酸为磷源，在甜高粱汁中分别添加o 0 5 、0 1 、0 1 5 、o 2 、 o 2 5 、0 3 ，然后通过菌的数量，活力确定其适宜的氮源。 2 2 2 3 正交实验 根据以上试验结果，选择各因素下较合适的3 个水平，通过菌的数量、活力测 定得出结论。设计三因素三水平( l 9 ( 3 3 ) ) 正交试验，对碳源、氮源和磷源进行优化。 将甜高粱汁进行改良，得到最适培养基。 2 2 3 菌种扩培条件的优化 2 2 3 1 菌株适宜条件实验 适宜扩培温度的测定： 将酵母种子液接入最适培养基中，分别在2 2 、2 4 、2 6 、2 8 c 、3 0 、3 2 、3 4 下1 2 0 r m i n 的摇床中发酵培养，2 小时取一次样，利用血球板计数法测定 菌数n 引，确定酵母菌最适生长温度。 适宜扩培p h 值的确定： 在适宜生长温度下，将酵母种子液接入最佳培养基中，再调整至不同的p h 值， 分别在3 6 、4 0 、4 4 、4 8 、5 2 、5 6 酸碱度下静置发酵培养，2 小时取一次样，利 用血球板计数法测定菌数，确定适宜生长p h 值啪1 。 8 用于直接发酵含高糖质原料活性干酵母的生产工艺研究 2 2 3 2 生长曲线和存活率曲线的测定 将酵母种子液，在2 8 下培养1 2 小时，分别以1 、5 、1 0 、1 5 的接种量 加入到含有改造的最适甜高粱汁培养基的大三角瓶中培养，在t 2 0 r m i n 的摇床中， 每隔2 h 取样，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制酵母生长曲线，确定培养时间和 接种量。 2 2 4 菌种的富集培养( 扩大培养) 扩大培养工艺流程： 菌株一试管( 1 0 m 1 ) 一三角瓶( 2 0 0 m 1 ) 一大三角瓶( 2 0 0 0 m 1 ) 一一大三角瓶 ( 5 0 0 0 m 1 ) 一卡氏罐一发酵罐 根据酵母菌最适培养条件及培养基试验结果，采用上述的流程进行甜高粱汁发 酵，逐步扩大培养。扩培过程中对菌株进行形态观察和c 0 2 失重测定瞳钆2 8 1 。 2 2 5 离心分离及保藏 离心分离法是借助离心力的作用使菌体沉积以提高悬浮液含菌量的浓缩方法。 酵母繁殖培养阶段结束后，用离心机将酵母从发酵液内分离出来，用水将酵母 洗涤2 - - 3 次，除去发酵液内酵母代谢副产物、杂质等1 。如酵母的颜色较深，可增 加水洗涤次数和用水量，或添加少量的酸至洗涤水中以增加洗涤效果。正常的酵母 乳为乳白色或略带米黄色啪3 。 菌泥重量测定：取1 0 m l 发酵液转移至烘干、称重后的离心管内，离心( 4 ， 6 0 0 0 r m i n ，3 0 r a i n ) 收集菌体，用l o m l 去离子水洗涤茵体，离心( 条件同上) 收集菌 体后称重，减去离心管重即可。 2 2 5 1 离心条件单因素实验 用无菌吸管将在最优条件下培养的菌液移入5 0 m l 离心管中，配平后上机离心。 离心后，弃去上清液，观察菌的存活率、测定菌泥重量 离心温度的影响：以3 0 0 0 r m i n 的转速分别在4 、1 0 、2 0 下，离心3 0 m i n ， 离心后观察菌的存活率、测定菌泥重量。 转速的影响：在4 下，分别以0r r a i n 、1 5 0 0r m i n 、3 0 0 0r m i n 、4 5 0 0r r a i n 、 6 0 0 0r m i n 、7 5 0 0r m i n 的转速，离心3 0 m i n ，离心后，观察菌的存活率、测定菌泥 重量。 离心时间的影响：在4 ，6 0 0 0 r m i n 的转速下，离心l o m i n 、2 0m i n 、3 0m i n 、 4 0m i n 、5 0m i n ，观察菌的存活率、测定菌泥重量。 2 2 5 2 正交实验 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 根据以上试验结果，选择离心温度、转速、离心时间三个因素中较合适的3 个 水平，通过菌的数量、存活率、菌泥重量为测定指标，设计三因素三水平( l 9 ( 3 3 ) ) 正交试验，如下表，确定菌液最佳离心分离条件。 表2 离心正交试验b ( 3 3 ) 2 2 5 3 保藏 将富集培养得到的菌种与培养基分多次移入离心管中，离心。将离心后得到的 菌泥放入冰箱进行保藏，反复扩大培养、离心，待菌泥达到一定量时进行干粉的转 变。 2 2 6 干粉转变 对菌株添加保护剂，并在2 0 c 下预冷冻，然后真空冷冻干燥，冷冻条件为：温 度5 0 ，干燥时间4 8 h 、真空度9 9 9 p a _ 8 p a 。 2 2 6 1 保护剂的制备 表3 保护剂配方 l 2 3 2 3 l 3 l 2 l 2 3 l 2 3 l 2 3 l l l 2 2 2 3 3 3 l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 九1 0 9一1 0 9一 十1 0 9 一 5 9一 具体配制方法为按照上述方案分别称取甘油和糖口3 l ，放于小培养皿上，在1 0 5 摄氏度下、干热灭菌3 0 分钟。让后将离心后的菌泥倒入小培养皿中，混匀，预冷冻， 准备真空干燥。 2 2 6 2 活力的测定( 0 0 。失重) 用c 0 2 失重法对真空冷冻后的菌种进行活力的测定。 2 2 7 菌种数量及形态观察 利用血球计数板测定菌种数量，利用1 0 0 倍双目光学显微镜观察菌种形态。 2 2 8 分析测试方法 2 2 8 1 对甜高粱秸秆中糖份、含氮量、粗脂肪、灰分、粗纤维的测定 参考g b t5 0 0 9 7 2 0 0 3 、g b t5 0 0 9 5 19 8 5 、g b 5 0 0 9 4 19 8 5 等。 2 2 8 2 酒精含量的测定 取发酵后的5 0 9 发酵料( 液) 加入到蒸馏瓶中，补加2 0 0 m l 蒸馏水，蒸馏5 0 m l 后停止。取1pl ，进气相色谱外标法测定乙醇含量。 气相色谱仪：日本岛津g c - 9 a ，带f i d 检测器。 色谱条件：色谱柱：g d x - 1 0 2 ，8 0 - 1 0 0 目，2 m 3 m m 不锈钢柱。 温度：柱温1 7 0 ，检测器2 3 0 。 载气：氮气，流量4 0 m l m i n 。 氢气流量：5 0 m l m i n ； 空气流量：4 8 0 m l m i n 灵敏度：1 0 2 纸速：2 m m m i n 3 结果与分析 3 1 出发菌株的分离培养结果 为了让菌株能够适应甜高粱汁的发酵，首先对菌株进行低能盯离子束诱变，筛 t 警 g 豫 l 5 & 一 一 一 一 一 一 g g g m m 加 六 七 八 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 选出高活性优质菌株，并进行了保藏。本实验直接应用了实验室的这种高活性菌株， 所以在这里只进行了简单培养、筛选、分离。 根据固体培养基平板上长出菌落大小、颜色、边缘及菌体的形状进行初筛。挑 选了菌落乳白色、中等大小、表面光滑、向上凸起，中心略有凹陷，边缘整齐，镜 检椭圆形的5 个菌落( 见表4 ) 。 表4分离得到菌株的菌落特征及细胞形态 由表4 可见，得到的菌落形态主要有为圆形和椭圆形：繁殖方式为一端出芽： 菌落特征为干燥、乳白色、隆起。 由表5 可以得出，菌株的酒精产量为6 8 4 8 5 0 ，残糖量为o 3 5 0 7 8 g 1 0 0 m l ，比较后得出最低为9 0 s 2 # ，最高是9 0 s l # 。综上试验选择9 0 s l # 做为出发 菌株，并对其进行活化复壮。 对9 0 t t l s 进行生理特性及发酵特性试验，结果表明其可适p h 值为2 0 ，可耐酒 精度为1 2 ，死灭温度为5 4 - 5 8 。可发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖。 生理特性试验结果见表6 、7 、8 ，发酵特性实验结果见表9 。 表5 发酵后的测定结果( 2 0 0 m i ) 酒精度采用质量百分含量 表6 不同p h 值条件下培养2 4 h 的产气情况 注：“+ ”表示已经发酵，“一”表示没发酵，“+ ”的多少表示卜蚓产气量大小，“+ 十+ + ”表示气泡较多，以 下相同。 12 用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 表7 酒精浓度不同情况下培养2 4 h 的产气情况 菌株 温度 44485 2 5 6 6 0 3 2 酵母菌基本培养基研究结果 3 2 1 酵母菌在各种培养基上的性质对比 实验结果见表1 0 ： 表1 0 各种培养基中细胞的形态及数量 由上表可以看出，甜高粱汁培养基( 糖锤度1 8 ) 中碳源较丰富，其菌的数量 最多，而且出芽率也较大，说明甜高粱汁培养基适用于生产酵母菌口引。自制培养基 的菌种数量也较多，但死亡率较高，说明自制培养基营养单一，不能满足酵母生长 要求，也说明其他营养物质如氮源、磷源、其他微量元素在酵母生长过程中的重要 性。 3 2 2 单因素实验结果 碳源对酵母菌生长的影响如图l 所示： 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 = 6 宣 害主 x3 螽2 翘l o o24681 01 2 1 41 61 82 0 2 2 2 4 时间( h ) 图1不同碳源对酵母菌生长的影响 表11 不同糖浓度对酵母菌数量及活性的影响 + 6 碳源 + 8 蛾源 1 0 碳源 一1 2 碳源 卜1 4 碳源 + 1 6 碳源 由图1 和表1 l 可以看出，当糖浓度从6 增加到1 6 时，菌种的数量在不断的 增加，从4 2 x1 0 8 到到6 2 3 x1 0 8 ，c 0 2 失重总量也不断增加，所以菌数量与糖浓度的 呈正比关系，当浓度大于1 0 时，菌种数量增加不明显，说明菌的代谢产物的积累 和营养物质的缺乏抑制了茵的生长。 8 o7 ；4 - ： 24 兰3 骚2 酒1 0 o2 468l o1 21 4 1 6 1 8 2 0 2 22 4 时间( h ) + o 1 氮源 + o 2 氮源 0 3 氮源 * o 4 氮源 - - y v - - 0 5 氮源 - - o - - , 0 6 氮源 图2 不同氮浓度( 硫酸铵) 对酵母菌生长的影晌 1 4 用于直接发酵含高糖质原料活性干酵母的生产工艺研究 氦浓度菌种数量 c 0 2 失重总量( g 1 5 0 m 1 ) 由图2 和表1 2 可以看出，当氮浓度为o 3 时菌种数量最多，为7 0 2x1 0 8 ，0 2 的氮浓度次之，但当氮浓度大子0 3 时，菌的数量呈现没规律的变化，c 0 2 失重总 量也呈没有规律变化。 o e 七 z 2 、 氦 ： 医 o24 681 0 1 21 41 61 82 0 2 2 2 4 时间( h ) 一0 0 5 磷酸 + 0 1 磷酸 0 1 5 磷酸 坶一0 2 磷酸 + 0 2 5 磷酸 一0 3 磷酸 图3 不同磷酸添加量对酵母甍生长的影响 表13 不同磷浓度对酵母菌数量及活性的影响 磷浓度菌种数量 c 0 2 失重总量( g 1 5 0 m 1 ) o0542l108 1 1 1 3 o 1 6 2 1 1 0 s 1 7 2 4 o 1 5 6 4 3 1 0 。 i7 “ o 2 5 9 x1 0 。1 7 2 6 0 2 5 4 。4 8 x 1 0 。 1 1 3 4 0 3 3 x 1 0 。 9 2 - i i m _ _ - - _ _ _ l _ _ _ l _ - _ 一 菌体中磷的含量较高，磷是构成核酸、磷脂和和许多辅酶的成分；它参与碳水 化合物代谢主要步骤的磷酸化过程，生成高能磷酸化合物( a t p ) ，贮存和运送能 量。所以这里主要对磷浓度进行了单因素试验。 由图3 和表1 3 可以看出，当磷浓度为o 1 5 时，菌种数量最多，为6 4 3 1 0 8 ， o 1 的磷浓度次之，但当磷浓度大于o 2 时，菌的数量反而下降，c 0 2 失重总量也 内蒙古农业大学硕士学位论文 相应的减少，可能是因为磷酸过量后影响p h 值的原故。 3 2 2 正交实验结果 正交实验设计l 9 ( 3 3 ) 女n - v ： a碳源8 、1 0 、1 2 b 氮源0 2 、0 3 、o 4 c 磷源0 1 、0 1 5 、0 2 表1 4 培养基三因素三水平【l 3 3 正交试验结果 1 5 正交试验：以菌种数量和c 0 2 失重总量的相对多少作为评价指标，表1 6 为出 16 用于直接发酵含高糖质原料活性千酵母的生产工艺研究 发菌株9 0 s 1 # 的结果。综合比较三因素的极差r ，其大小为：碳源 氮源 磷源，最 优工艺条件为a 3 8 2 c i 。因此选择最佳培养基配方为：碳源1 2 、氮源0 3 、磷源 o 1 。按正交试验结果得到的最佳培养基对出发菌种进行培养，菌种数量为7 5 3x 1 0 8 ，菌种活力为1 8 7 4 9 1 5 0 m 1 。以下为菌种数量和c 0 2 失重总量f 检验结果。 表1 5 菌种数量f 检验结果 通过正交实验，对菌种数量进行观察、菌种活力进行测定( c 0 2 失重) ，得出 种适合酵母菌生长及繁殖的培养基基本配方，即在糖锤度为1 2 。以上的甜高粱汁 中加入o 3 硫酸铵、0 1 磷酸、o 3 硫酸镁、o 2 氯化钙、0 0 3 磷酸二氢钾。 3 3 菌种扩培条件的优化结果 3 3 1 适宜扩培温度的测定结果 。 皇 牛 为 - 一 、 籁 殴 o2468l o1 21 41 61 82 02 2 2 4 时间( h ) + 2 2 + 2 4 2 8 蚌一2 6 叫卜3 2 + 3 4 图4 温度对生长曲线的影响 由上图得出，各个温度下的前期，酵母菌均有明显的适应期。在生长到对数期 时，不同温度下酵母生长速度也不同，在2 8 时菌种生长最快，1 8 小时就可以到稳 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 7 定期且菌种数量最高：2 6 、3 2 时生长次之，2 2 、2 4 、3 4 时2 0 小时可以达 到稳定期，但菌体数量明显减少。温度大于或小于2 8 都不适合菌体的生长，2 2 及2 4 时，细胞中不同的酶没有适宜的温度，对菌体生长有一定的影响：当3 2 以 上时，菌体数量也偏少，超过3 4 c 时，菌体数量明显变少，说明温度升高对菌种影 响越大，当温度太高还会导致菌体中的酶失活。由此可见，2 8 为其适宜的生长温 度。 3 3 2 适宜扩培p h 值的测定 在适宜生长温度下，将酵母种子液接入最佳培养基中，再将p h 分别调整至3 6 、 4 0 、4 4 、4 8 、5 2 、5 6 下静置发酵，每两小时取样，测定菌种数量( 血球计数板) ， 确定其适宜生长p h 值。 由图5 可知，在不同p h 值下，均有显著的适应期；p h 值为3 6 、4 、4 4 和5 6 的条件下，生长速度非常缓慢，经过1 2 小时就逐渐达到稳定，且菌体数量较少，而 p h 值为4 8 到5 2 时，生长达到2 0 小时时进入稳定期且达到菌种数量高峰。因此得 出，p h 值在4 8 - - 5 2 时为适宜p h 值。 7 o6 置 时间 温度，根据活菌数得出，影响顺序为：温度 转速 时间，最优 工艺条件为a i b 3 c 2 。因此得出：在4 c 、6 0 0 0 r