（环境工程专业论文）烟草中生物碱、甾醇和非挥发酸的气相色谱质谱法分析.pdf

南京理t 大学硕士学位论文烟革中生物碱、甾醇和 # 辱垄堕箜墨塑鱼堕! 厦堕鲨坌塑 摘要 烟草是一种叶用经济作物，烟草及其制品的品质主要是由其内在化学成分的组成 含量所决定的。烟草化学成分的变化极为复杂，烟草类型不同，化学成分存在差异a 本文通过对前处理方法和柱系统选择的比较和研究，采用溶剂萃取气相色谱法分 析了烟草中的生物碱和甾醇，衍生化气相色谱法分析了烟草中的非挥发酸，以保留时 问、相对保留时闻和g c m s 定性，内标法定量。生物碱测定结果的相对标准偏差为 2 2 1 5 0 ，方法回收率为8 9 4 9 8 8 。甾醇测定结果的相对标准偏差为2 6 8 8 ， 方法回收率为9 2 7 1 0 2 1 。非挥发性酸测定结果的相对标准偏差为0 6 1 9 8 ， 方法回收率为8 6 7 1 0 3 6 。 在上述研究基础上，对常德卷烟厂提供的5 2 个烟叶样品中的生物碱、甾醇和非 挥发酸进行了相对含量的测定和比较，发现不同烟叶中主要生物碱、甾酵、非挥发酸 的相对含量差异较大，生物碱总星为o 9 2 3 0 3 ，甾醇总量为o 0 2 0 0 6 。非挥 发酸总含量为2 3 1 4 5 5 。 本文所获结论为智能卷烟配方系统的开发提供了理论依据，对实现降焦减害、推 进企业和行业现代化有积极意义。 关键词：烟草分析生物碱甾醇非挥发酸g c m s 塑室里三查兰堡! 堂垡丝塞 塑苎生塑壁：墅壁塑斐堡垄堕塑塑鱼塑望塑塑堑堑! i 一 a b s t r a c t t o b a c c oi sf l ne c o n o m i cc r o pf o ri t sl e a v e sa n dn e e d e df o ri t s t a s t es e n s a t i o n t h e q u a l i t yo ft o b a c c op r o d u c t si sd e t e r m i n e db y am u l t i t u d i n o u sv a r i e t yo fs u b s t a n c e si n t o b a c c ol e a v e s ，w h i c ha r ee x t r e m e l yc o m p l e xm i x t u r e s c o m p o s i t i o n so fd i f f e r e n tt o b a c c o s a l en o t l h es a m e ， i nt h et h e s i s ，g a sc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d sf o ra n a l y s i so fa l k a l o i d s ，s t e r o l sa n d n o n v o l a t i l ea c i d si nt o b a c c o ，w e r ed e v e l o p e d a l k a l o i d sa n ds t e r o l sw e r ea n a l y z e db y e x t r a c t i o n - g a sc h r o m a t o g r a p h y w h i l en o n v o l a t i l eo r g a n i ca c i d sb yd e r i v a t i o n g a s c h r o m a t o g r a p h y t h r e ek i n d so fc o m p o u n d s i nt o b a c c om e n t i o n e da b o v ew e r eq u a l i t a t i v e l y a n a l y z e db ) ，r t ( r e t e n t i o nt i m e ) ，r r t ( r e l a t i v e r e t e n t i o n t i m e ) a n d g c m sa n d q u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e db yi s ( i n t e r n a ls t a n d a r d ) t h es i m p l ep r e t r e a t m e n t sp r o v i d e dg o o d r s d s ( a l k a l o i d s ：2 2 1 5 ，o ；s t e r o l s ：2 6 8 8 ：n o n v o l a t i l eo r g a n i ca c i d s ：0 ，6 1 9 8 ) a n dh i g hr e c o v e r i e s ( a l k a l o i d s ：8 9 4 9 8 8 ；s t e r o l s ：9 2 7 10 2 1 ；n o n v o l a t i l eo r g a n i c a c i d s ：8 6 7 1 0 3 6 1 b a s e du p o nt h er e s e a c ha b o v e ，w er e l a t i v e l yd e t e r m i n e dt h eq u a n t i t yo fa l k a l o i d s ， s t e r o l sa n dn o n v o l a t i l eo r g a n i ca c i d si n5 2d i f f e r e n tk i n d so ft o b a c c ol e a v e sc o l l e c t e db y c h a n g d ec i g a r e t t ef a c t o r ya n dc o m p a r e dt h e i rm u t u a lp r o p o r t i o n s t h er e l a t i v ec o n t e n t so f a l k a l o i d s ，s t e r o l sa n dn o n v o l a t i l eo r g a n i ca c i d sa r eo 9 2 3 0 3 ，0 0 2 0 0 6 ，2 31 4 5 5 r e s u l t so ft h i st h e s i sp r o v i d e dd a t af o ri n t e l l i g e n t i z e dc i g a r e t t ed e s i g na n dh e l p e d t om d u c et a ra n ds p e e dt h ed e v e l o p m e n to fc i g a r e t t ei n d u s t r y k e y w o r d s ：a n a l y s i so f t o b a c c o ，a l k a l o i d s ，s t e r o l s ，n o n v o l a t i l eo r g a n i ca c i d s ，g c m s 审 ? 7 6 3 7 7 2 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名： 适垫兰叁印r 年6 月q 目 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：粗p 叮年占月q 目 南京理丁大学硕上学位论文 烟草中生物碱、 ；醇和非挥发酸的气相色谱，质谱法分析 1 绪论 1 1 烟草分析的背景和意义 烟草在世界上的种植历史己有1 5 0 0 多年。我国的烟草种植历史也有4 0 0 多年了。 但烟草化学的研究历史相对于烟草种植历史是比较短的，至今还只有1 0 0 多年。烟草 化学研究是从研究烟草的化学成分开始的，随着研究烟草化学成分与烟草品质的关系 而深入，因吸烟与健康研究而受到重视，并随着当代植物化学、生物化学、普通化学 和分析化学的发展而发展起来的。 烟草是一种叶用经济作物，其主要用途是将其叶片加工成各种各样的烟制品供人 们吸食。同人类所有的吸食、饮用品一样，烟草的品质受到人们的广泛关注。烟草及 其制品的品质主要是由其内在化学成分的组成含量所决定的。烟草化学成分的变化极 为复杂，烟草类型不同，化学成分存在差异。烟草种植的生态环境、栽培措施、烟草 成熟后的采收调制、发酵加工，以及陈化，都对作为卷烟原料的烟叶的化学成分产生 影响。在烟制品的加工制造过程中，加工工艺、加香加料等各项技术加之烟叶原料的 品质，又决定了烟制品的质量。所有上述因素，所形成的化学成分及其含量的综合， 通过人们的吸食过程烟制品的燃烧过程，最终决定了烟气的化学构成，从而形成 了人们对烟草的吸食需求和质量评价，也决定了烟草对人体健康的影响。因此，烟 草化学研究，在烟草科技、工农业生产和吸烟与健康等领域都有非常重要的地位。 烟草的组成复杂，对烟草吸食需求、质量评价和人体健康作用各不相同，而烟草 中的生物碱类、甾醇类和不挥发酸为影响这几个方面的主要因素。因此对烟草中的生 物碱类、涵醇类和不挥发酸的提取分离以及定量分析成为关键。生物碱是烟叶中的主 要含氮杂环化合物，绝大部分是2 一吡啶基衍生物，其含量的高低不仅关系到烟的质量， 而且直接影响人体健康。因此，对烟草中生物碱含量进行分析，把成分与吃味关联， 就能为卷烟配方提供理论依据。烟草中的 醇类物质是一种潜在的影响人体健康的物 质，且影响卷烟香气，对甾醇种类和含量的分析对改善卷烟配方具有参考价值。烟草 中的不挥发酸是碳水化台物代谢的中间产物，也是合成氮基酸的原料。不挥发酸在卷 烟燃吸过程中能进入烟气，其种类和含量直接影响卷烟的吸味和品质，所以分析不同 烟叶中不挥发酸的含量对于卷烟配方和调香具有重要意义。 国内在烟草分析方面的研究还刚起步，研究的深度和广度均有较大局限性。多数 集中在焦油、还原糖、总氮、烟碱、挥发酚的常规分析上，这些研究在对烟草及制品 的类别、质量和产地进行鉴别的准确性和配方系统软件稳定性和适应性上均不够完 善。以下将分别对生物碱类、龋醇类和不挥发酸这三类组分目前的研究现状加以介绍。 南京理工大学琐1 学位论文烟草中生物碱、 醇和非挥发酸的气相色谱质谱法分析 1 2 烟草生物碱类、甾醇类和不挥发酸分析的研究现状 1 2 1 生物碱前处理和分析方法的研究进展 烟叶中生物碱的分析是烟草分析工作中特别重要的部分，一直受到烟草界的重 视。生物碱是烟叶中的主要含氮杂环化合物，它的种类较多，其中最主要的就是尼古 丁，尼古丁是烟草中特有的一种生物碱。生物碱绝大部分是2 一吡啶基衍生物，其含量 的高低不仅关系到烟的质量，而且直接影响人体健康。! i 7 1 前从烟草中已经分离出的此 类化合物主要包括：烟碱、去甲基烟碱( 降烟碱) 、新烟草碱( 去氢新烟碱) 、假木贼 碱( 新烟碱) 、去氢去甲基烟碱( 麦斯明) 等。烟碱还存在游离和结合两种形态l z j 。 由于受到分离分析方法和条件的限制，早期烟草中生物碱的分析多数只针对烟碱 及降烟碱的研究。2 0 世纪初，就有重量法分析烟碱的的报道，之后的几十年里，发 展了很多分析方法：如添加活性炭法、滴定法、光度法、色谱法、自动分析仪法等， 总结起来主要有四类：硅钨酸重量法，滴定法、光度法和色谱法。 硅钨酸重量法由gb e r t r a n d 和mj v i l l i e r 于1 9 0 9 年提出。这种方法利用烟碱与水 蒸气共挥发的性质，在碱性条件下用水蒸气将烟碱带出，然后与硅钨酸( s i 0 2 1 2 w 0 3 2 6 h 2 0 ) 形成晶形沉淀，灼烧沉淀后重量法求出烟碱含量。1 9 l1 年rmc h a p i n 对这 种方法进行了改进。硅钨酸重量法可得到准确的结果，但其缺点一是分析时间过长( 一 次分析周期为2 4 4 8 小时) ：二是不能区分烟碱和降烟碱，测定结果是烟碱类植物碱 的总和；三是当溶液中有铵盐等无机盐存在时，沉淀不易形成，干扰测定f 3 】。 滴定法有多种。r k i s s l i n g 、y o t h 和g a r n e r 分别采用水蒸气蒸馏法配合使用，将 烟碱从烟草中分离出来，然后用酸滴定求出烟碱含量，这些方法的缺点是将所有碱性 物质都计算为烟碱，因而测定值比实际值偏高。美国公职分析化学家协会( a o a c ) 方 法中的c u n d i i f - m a r k u n a s 法是在上述方法的基础上改进的，采用苯一氯仿作为萃取 齐j ，萃取液用高氯酸滴定，可分别测定总植物碱( 以烟碱计) 、叔植物碱( 烟碱) 、伯 植物碱( 如降烟碱) 。c u n d i f f - m a r k u n a s 法可得到与硅钨酸重量法相同的结果。 m a r k w o o d 于1 9 3 9 年报道了烟碱的比色测定法。这种方法采用溴化氯( 或氯化氰) 将烟碱的吡啶环断开，然后与胺基苯磺酸反应产生一显色化合物，用比色法测定这个 化合物吸光度而求出烟碱含量。这种方法较为简便快速但反应不专一，测定值仍为 烟碱类植物碱的总量。就国内而言，杨长府等 4 l 应用非水滴定法，在前人工作的基础 上，在样品中加入固体b “o h ) 2 及其饱和水溶液，直接以电磁搅拌器搅拌，使烟叶中 烟碱充分萃溶，省去文献中加入硅藻土的操作，减少其对烟碱的吸附造成的误差，同 时改进苯一氯仿萃取烟碱。待两相分层后，用大口径滤纸过滤，省去文献中用无水 m g s 0 4 除水的操作，对烟碱含量在1 8 范围内的烟叶进行了测定。盛良全等1 5 】 南京理工人学硕二l 学位论文烟草中生物碱、； i 醇和非挥发酸的气相色谱，质漤法分析 用共沉淀一电位滴定法测定烟草中的烟碱，通过四苯硼钠一钾，四苯硼钠一烟碱的沉 淀作用，用钟离子选择性电极作电位滴定的指示电极，在同一试样中同时测定烟碱和 钾的含量，并以微机运算、绘图，实现分析结果的快速处理。 光度法中最常用的是紫外分光光度法，该方法是基于一般物质对光辐射都有吸收 作用，并具有选择性的原理。同一物质对各种吸收波长光的吸收程度不同。紫外分光 光度法是根据物质对光的吸收特征进行定量分析的【6 l 。烟碱分子对紫外光有特定吸 收，吸收峰值为2 5 9 n m ，吸收光与烟碱溶液的浓度成正比关系。紫外分光光度法的缺 点是准确性差。夏炳乐等【7 j 用萃取分光光度法快速测定烟草中的烟碱，在p h = 4 5 的 乙酸一乙酸钠缓冲溶液中，使烟碱与甲基橙生成稳定的黄色络合物，然后用二氯甲烷 萃取，于 m a x = 4 3 5 n m 处测定有机相的吸光度，烟碱浓度在0 6 5 p g m l 范围内符合 比尔定律，摩尔吸光系数为9 9 1 0 。3 l t o o l - i c m 。徐茂田等口1 用酸性染料光度法测定 了烟草中的烟碱，试验了多种酸性染料与烟碱的反应发现在p h = 4 5 的醋酸一醋酸 钠缓冲溶液中，酸性染料溴甲酚绿与烟碱能形成离子缔合物，并能被氯仿所萃取，其 最大吸收在4 2 0 n m 处，烟碱含量在o 1 2ug m l 范围内符合比尔定律。张群玲 g j 系 统研究了烟草中烟碱的水蒸气蒸馏的适宜条件及烟草中烟碱的定量分析方法，提出了 在碱性条件下将烟草浸泡1 2 小时以上，用水蒸气蒸馏法收集7 0 0 8 0 0 m l 蒸出液， 即可收集到9 5 以上的烟碱，分别用酸碱滴定法和紫外光谱法测定其烟碱含量，通过 比较得出紫外光谱法较快速和准确的结论。张立杰【l o l 研究了甲基橙与烟碱的显色反 应，并将其应用于赢接测定烟气中的烟碱含量，实现了烟碱的快速分析。 色谱法是一种物理的( 或物理化学的) 分离分析方法。当两相( 流动相和固定相) 做相对运动时，混合组分随流动相流动并在两相中进行多次的分配平衡从而达到完 全的分离。检出测量分离后的组分，进行定性和定量分析坤j 。dt h o r b u m b u m s s j 用 快速气相色谱法分析了烟草中的尼古丁、去甲基尼古丁、麦斯明、新烟碱、异烟碱、 二烯烟碱、去氢新烟碱、可替宁，喹哪啶为内标物。sp a k h a l e 等1 1 2 j 用气相色谱一氢 火焰离子化检测器分析了卷烟主流烟气、侧流烟气和烟叶中的尼古丁、去甲基尼古丁、 新烟碱、去氢新炳碱和可替宁。丁丽等l l 习用二筑甲烷甲醇( v v , 3 ：1 ) 萃取一毛细管 气相色谱法分析了烟草中的尼古丁、去甲基尼古丁、新烟碱和去氢新烟碱，方法简单， 重现性好。单卫青等【1 4 l 研究了烟草中烟碱的水相萃取和液相色谱分析，将准确称取的 烟末置于盛有二次蒸馏水的锥形瓶中，在水浴中搅拌萃取，过滤后供色谱分析用。色 谱条件：c 8 反相柱，含8 4 甲醇的4 0 1 0 3 m o l l n h 4 c i 溶液( p h = 7 5 ) 作为流动相， 流速1 m l m i n ，紫外检测波长2 5 4 n m 。进样量2 0 p l 。分别用蒸馏一色谱法、蒸馏一 紫外法和水相萃取一色谱法测定了膨化前后同一烟样中烟碱的含量，发现前两种方法 测定膨化前的结果均低于膨化后。而用水相萃取法，膨化前后结果基本一致，表明水 南京理工大学碳l 学位论文 烟草中生物碱、l ； 醇和非挥发酸的气相色谱，! ! ! ! 婪分析 相萃取较蒸馏法具有较高的提取效率。张明时等【l5 j 用气相色谱法分析了烟草中的烟 碱，主要工作是对几种固定相( 柱l ：2 m 0 3 r a m 不锈钢柱，6 0 8 0 目s h i m a l i t e w 1 0 d c 2 0 0 一份混合装柱；柱2 ：1 6 m 0 3 m m 玻璃柱，8 0 l o o 目c h r o m o s o r b w i o v - 1 7 ；柱3 ：2 m 0 3 m m 不锈钢柱，6 0 8 0 目s h i m a l i t ew 5 s e 一3 0 ；柱4 ：1 1 m 0 3 m m 玻璃柱，6 0 8 0 目s h i m a l i t e l 0 p e g 2 0 m ；柱5 ：1 6 m 0 3 r a m 玻璃柱，8 0 - - 1 0 0 目g a sc h r o mq0 5 e g a ：柱6 ：1 m 0 3 m m 玻璃柱，6 0 8 0 目 s h i m a l i t e l 5 d e g s ) 进行了比较，色谱条件：汽化室温度2 4 0 ， h 2 5 0 m l m i n ，a i r 3 0 0 m l m i n ，使用柱1 时，柱温1 8 0 ，载气n 2 8 5 m l m i n ，结果发现柱 4 得到的烟碱峰形最好，无拖尾。黄注传等【坫】幂0 用h p l c 法测定烟叶烟碱含量，将烟 叶溶于稀硫酸中，经试验调整使烟碱含量在1 8 0 m g 5 0 m l 范围内，在4 5 。c 恒温下 振荡萃取l 小时后过滤，缓冲溶液；o 1 m o l l 磷酸一o 1 m o i l 磷酸二氮钾，u v - 2 6 2 n m 检测器。由于烟碱在碱性介质有伴随水蒸汽挥发的特性，而用稀硫酸作萃取剂能提高 其稳定性。ss y a n g 等7 j 采用毛细管电泳法分析烟草中的生物碱，成功分离了从烟叶 中提取的烟碱、降烟碱、去氢去甲基烟碱、去氢新烟碱和假木贼碱等。前处理：把烟 末置于1 的三乙醇胺溶液，超声萃取6 r a i n ，过滤后供毛细管电泳分析。sr a l a p a t i 博1 研究了用毛细管电泳检测烟草产品( 包括雪茄烟、卷烟、烟斗烟、自卷烟、咀嚼烟和 鼻烟等) 中的烟碱，用磷酸钠作缓冲溶液，p h = 2 5 ，在2 6 0 n m 紫外检测波长处测定 烟碱。zs ；r o j e 等i l 圳用液相色谱紫外吸收检测器分析了烟叶提取物中的生物碱和 糖，用的萃取剂是乙酸一甲醇溶液。cw u 等【2 0 1 用超临界漉体色谱离子运动检测器 ( s f c i m d ) 分析测定了烟草中的烟碱，用氯仿萃取后经s f c 分离后用i m d 定性，提 供了一种分析烟草中的烟碱和其它生物碱的简便的方法。fmm a t y s i k i 2 l j 用非水体系 毛细管电泳一电化学检测器分析了烟草中的烟碱，用的缓冲液是碱化乙睛溶液，高效 萃取剂为乙腈一乙酸一水溶液( 2 0 ：5 ：7 5 ) 。l a c i o l i n o 等【2 2 j 用反相离子对液相色谱对市 售烟草产品的检测进行了优化，结果表明用缓冲液一甲醇( 6 5 ：3 5 ) ( 其中缓冲液为5 0 n m 柠檬酸盐和1 0 n m 辛烷磺酸钠) ，调节p h 值为3 0 ，能使烟碱和其它含量较少的生物 碱如降烟碱、去氢新烟碱、假木贼碱和可替宁等很好地分离。杨娟等1 2 3 j 研究了高效液 相色谱法测定烟草中烟碱的含量，选择了甲醇一磷酸缓冲液作流动褶p h 为6 , 8 ，加 入( n h 4 ) 2 s 0 4 可使峰宽得到改善。md gl o u r e n c o 等用气液色谱检测了烟草中主要 的生物碱，采用了非极性基团修饰相分析烟草产品中的烟碱。杨金辉i ”j 用g c 法快速 测定了烟样中生物碱的含量，前处理：用l m l 0 1 t o o 几n a 0 h 溶液使碱性成分游离出 来，用含内标喹啉的二氯甲烷将其萃取出来。kdb n l r u l e m a n n 等f 2 6 j 用气相色谱一氮 磷检测器分析了鼻烟的含水量、p h 、碱性成分和烟草特有的亚硝胺。jc a i 等f 27 】用气 相色谱氢火焰离子化检测器分析了烟草和烟气中的生物碱。hh a s e b c 2 8 悃顶空蒸汽 法对不同烟草进行了定性分析。 堕塞里! 查兰堡! 堂垡笙壅 塑兰! 竺塑堕：堑壁塑韭堡堡墼堕：塑鱼堂生理堑墅丛生一 1 2 2 甾醇前处理和分析方法的研究进展 在烟草化学分析研究中发现有大量的醇类化合物，在烟叶和烟气中鉴定出3 7 7 种醇，其中包括脂肪醇、芳香醇及植物甾醇。同时发现烟叶中醇类化合物对烟气质量 有较大的影响。植物甾醇主要存在于植物细胞中，对于烟草的品质有着较大的影响， 其含量与烟草品质有正相关性。对于一般植物甾醇的分析研究已有不少文献提到，但 就复杂生物体内的植物甾醇的分析，特别是对于烟草及制品中的植物甾醇则罕有报 道。 甾醇的分析方法主要有薄层色谱法、可见光比色法、气相色谱法和液相色谱法等， 前处理方法主要有皂化、超临界流体萃取和分馏、固相萃取等。 利用薄层色谱分析甾醇已有较长的历史。在硅胶g 板上可以分离游离甾醇、甾 醇酯、游离脂肪酸、脂肪酸甘油酯等不同组分【3 7 】。为了使各组分达到完全分离，将不 皂化物从皂脚或馏出物中萃取出来，然后再进行衍生化，点样分析，其处理方法比较 繁杂。考虑到分析的实际需要，不妨只取其两个目的：a 直观评定。无论是甾醇产 品还是脱臭馏出物原料，其中的游离甾醇、甾醇酯等均可通过t l c 达到良好分离， 根据斑点的大小、颜色的深浅可以直接判断它们之间的大约比例关系( 药用甾醇要求 箔醇酯含量较低，以便于生产衍生化药品) ；b 准确测定。将上述薄板进行扫描，利 用标准曲线，可以确知产品中甾醇与甾醇酯的含量。用标准溶液点样显色，在c s 9 1 0 薄板扫描仪上，于参比波长7 0 0 r a n 、样品波长5 5 0 h m 的条件下进行双波长扫描即 可得到标淮扫描图，进而得到标准扫描曲线。 比色分析是一种十分简便的方法。采用改进的l i e b e r m a n n b u r e h a r d 比色法测定 甾醇产品中总甾醇的含量，方法如下：准确称取淄醇制品，配成l m l 系列标准溶液。 溶剂为乙酸酐，浓度分别为o 0 1 ，o0 3 ，0 0 5 ，0 1 ，0 1 5 ，0 2 ，o 2 5 ( m m l ) 溶解 温度6 0 c ：向溶液中加一滴浓硫酸，颜色由无色经红变为暗绿色，稳定l o m i n 后可 见光扫描( 7 2 3 型) ，测得最大吸收波长为6 5 0 r t m ；在此波长下由各标准溶液的吸光 度绘制标淮曲线。测定未知样品的吸光度，然后根据标准曲线确定其浓度，从而测知 样品中总甾醇的含量。此方法简单快速，整个操作仅需o 5 h ，适用于快速鉴定。 2 0 世纪6 0 年代以来，由于气相色谱的应用，对甾醇的分析推动很大，采用气相 色谱法很好逾解决了甾醇的含量与组成同时分析的问题，但因甾醇分子中含有极性羟 基，需对样品进行t m s 甲硅烷基化处理，由于操作要求商，重现性差，所需时间长。 lc e r e a c i 等1 2 9 l 用固相萃取薄层气相色谱法分析了橄榄油中的淄醇酯类。尹键等f 3 0 1 用 气相色谱法分析烟草中的p 一谷甾醇，基本步骤是将烟草样品粉碎后用重蒸石油醚进行 抽提，再将抽提液进行皂化处理并用乙醚萃取分离皂化产物与非皂化产物，然后对于 南京理工人学硕十学位论义烟草中生物碱、甾醴黧j ! 堡叁堕塑墨塑鱼登塑堕鲨坌堑 非皂化产物进行气相色谱分析，方法准确度高，重现性好。md u p ”采用f o l c h 法 通过k o h 一乙醇皂化萃耿液体，然后是用正己烷萃取生育酚、胆固醇和植物甾醇，萃 取出的样品在氮流下干燥，再使用三甲硅烷化合物将其引出，最后进行气相色谱分析， 胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇的萃取率约达1 0 0 。jg i a e o m e t t i 3 2 1 对橄榄油中脂肪醇、角 鲨烯、生育酚和甾醇进行了测定，对不可皂化部分硅烷化处理后进行气相色谱分析， 采用外标法对甾醇进行定量，重现性和回收率均很好。张铁垣等1 3 3 j 从芦笋茎及芦笋根 的脂溶性提取物中分离了非皂化物，采用薄层层析和加压快速柱层析法使非皂化物分 离得到甾醇类化合物，经乙酰化后进行g c 和g c m s 分析，从芦笋嫩茎中分析出 5 种箔醇：胆箔醇、菜油甾醇、豆鲻醇、豆甾烯醇、5 一燕麦鲻醇，从芦笋根中分离分 析出3 种甾醇：豆甾烯醇、豆甾醇和螺旋甾醇。曹栋等牡4 j 通过大量的实验，综合考察 了h p l c 和g c ，提出了用乙醚萃取样品不皂化物后g c 直接进样分析，方法快速， 准确可靠。倪捷儿p5 】用胆甾醇作内标，经醋酐和吡啶混合物衍生化后丙酮萃取植物中 的甾醇进g c 分析，方法简便快速。王三永等口6 j 用8 胆固醇作内标，7 0 下在 k o h e r o h 溶液中皂化1 h ，用正己烷萃取，采用毛细管气相色谱法测定了含脂肪食 品中的菜籽甾醇、菜油甾醇、p - 豆甾醇和b 谷甾醇。由于甾醇分子中含有极性羟基， 一般需对其进行衍生化处理( n 3 3 t 珏3 6 ，4 2 0 4 4 7 】爿进气相色谱分析，操作过程比较繁琐。 许多文献已报道t h p l c 对甾醇的分析结果。用此方法甾醇不用衍生化即可直接 进样分析，操作简便。精确度较高，重现性好。高瑜莹等【”】采用w a t e r s 9 9 6 型液相色 谱仪做甾醇的分离分析实验，检测器为紫外检测器，检测波长为2 1 0 r m a 色谱柱为c ，。 反相柱( 4 5 6 2 5 0 m ms t a i n l e s ss t e e l ；5 9 m p a r t i c l es i z e ) ，柱温为4 5 ，流动相为色谱纯 甲酵，流动相流速为1 1 m l m i n 。k w a r n e r 等 3 8 】利用高效滚相色谱结合蒸发光散射检 测器，建立了种分离、检测和定量维生紊e 和植物甾醇的方法，分析了豆油、向日 葵油、低芥酸菜籽( l e a r ) 油和玉米油中的四种维生素e ( a ，p ，y 和6 ) 以及四种植物甾 醇：菜油甾酵、p - 谷甾醇、菜籽甾醇和豆甾醇。许文林等f 3 9 】应用高效液相色谱对豆甾 醇、p - 谷甾醇和重结晶法分离精制的混合甾醇进行了分析测定，实验采用的色谱柱为 h y p e r s i lo d s 反相柱( 4 6 ) 41 5 0 m m ，5 m - n ) ，流动相为甲醇，紫外检测波长为2 1 0 r i m ， 恒溶剂洗脱，混合植物甾醇在1 0 r a i n 得到了很好的分离，实验结果表明，采用液相 色谱法能够快速准确地测定混合甾醇中豆甾醇和口谷甾醇的含量。sl a b i d i t 4 0 澜毛细 管电泳分析了植物油中的甾醇和酯类，固定相是c 1 8 和c3 0 ，流动相包括非水或水体系 中的乙腈、四氢呋喃和羟甲基一三氨基甲烷缓冲溶液。比较而言，c 。对洗脱支链结 构的化合物更具有选择性。 1 2 3 非挥发酸前处理和分析方法的研究进展 非挥发酸是烟草中的重要组成部分。烟草中的非挥发酸主要是指除氨基酸以外的 - 6 - 南京理t 大学硕j ：学位论文烟草中生物碱、甾醇和非挥发酸的气相色谱，垂堕法分析 非挥发性有机酸忆其种类繁多，含量差异大，总含量一般为1 2 1 6 ，且大部分 以与碱金属或有机碱化合成盐或以酯类的形式存在吐非挥发酸不仅在烟草生长过程 中起着重要的作用，而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响。 非挥发酸的色谱分析方法主要有气相色谱法和高效液相色谱法。 国外对烟草中的非挥发酸研究较早，2 0 世纪初就有关于烟草中草酸、琥珀酸、 柠檬酸、苹果酸和滔石酸的报道。aps w a i n 和rls t e d m a n 等【4 8 l 采用正己烷萃取、 甲酯化和气相色谱法定量分析了晒烟中的肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸 和亚麻酸。随后，is c h m e l t z 等f 4 9 】采用气相色谱法测定了2 个等级的烤烟和香料烟中 1 4 种c i c b 有机酸。rls t e m m a n 等【5 0 】通过对不同品种烟草中1 7 种c l c 9 挥发酸的 分析发现，香料烟含有比烤烟商得多的3 ，甲基戊酸、戍酸和异戊酸，而甲酸和乙酸则 相对较低。相比之下，白肋烟和马里兰烟中所有不挥发酸的含量都较香料烟和烤烟的 低。ed e m o l e 等【5 l 】采用水蒸气蒸馏、氯仿萃取和真空蒸馏法先将白肋烟精油分为高、 中、低3 个沸程馏份，再分别进行1 0 n a 2 c 0 3 溶液处理、c h 2 n 2 酯化和g c 分析， 在3 5 8 0 中沸程馏份酸性部分中鉴定出甲酸、乙酸、丙酸和异丁酸等酸性成分： 在8 4 1 1 4 高沸程酸性部分中鉴定出2 2 种酸性成分，包括山梨酸、苯甲酸、苯乙 酸、旺一苯基巴豆酸、2 壬烯酸和香豆酸等。dlr o b e r t s 和w a r o h d e 【5 2 1 采用氯仿萃取、 酸碱中分离和g c m s 法从白肋烟中鉴定出2 一甲基丁酸、戊酸、3 甲基戊酸、己酸等 1 2 种酸性成分。r a l l o y d 等 5 列同时采用溶剂萃取和水蒸气蒸馏2 种不同的分离路线， 再用稀碱溶液处理分离出酸性成分，而后甲醇酯化和g c m s 分析，共鉴定出4 8 种酸 性成分，包括c 2 c 1 2 的脂肪酸、苯甲酸、巴豆酸、香叶酸、花生酸、棕榈酸、水杨 酸、香草酸、茴香酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、丙酮酸等。iw a h l h e r g 等 胪4 j 采用顶空吸附、乙醚萃取、酸碱中分离、重氮甲烷甲酯化( o ) 、g l c 和g c m s 法对烘烤和陈化过程中烤烟酸性成分的变化进行了分析，共鉴定出8 6 种酸性成分。t c h u m a n 和mn o g l c h ii 5 卅采用异丙醚萃取、重氮甲烷甲酯化和g c m s 法对香料烟中 的酸性成分进行了分析，共鉴定出9 3 种酸性成分：2 6 种饱和脂肪酸、2 4 种不饱和脂 肪酸、1 0 种二元脂肪酸、1 2 种芳香酸、1 6 种菇烯酸及5 种其它酸。aw i l l i a m 和jg h e n d e l 等p 6 j 采用硫酸一甲醇甲酯化和g c 法分析了生长期间烟草中的草酸、丙二酸、 反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等6 种非挥发性有机酸，发现苹果酸是烟草生 长的各个阶段的主要有机酸。tc j e f f r e y 和jeb u n c h 等【5 7 】采用固相微萃取、重氦甲 烷甲酯化和g c 法分析了烟草中包括乙酸、异戊酸、戊酸、3 甲基戊酸、苯甲酸和苹 果酸等4 0 种有机酸。l kn g t 5 8 谰g c 和g c m s 分析了酒精饮料和烟草种的脂肪酸和 脂肪酸酯，其中烟草中的含量为m g ，g 级。 在国内，李云1 5 孵采用索氏萃取器萃取、碱洗酸化、水蒸气蒸馏和h p l c 法首次 南京理t 大学硕士学位论文烟草中生物碱、甾醇和非垤掌酸的气坦鱼掣堕堂堕坌堑 测定了国产烤烟和香料烟中c i c 9 的低级脂肪酸。郭亚东f 6 0 】采用重氮甲烷甲酯化和 g c 法分析了云南烤烟和晾晒烟中的5 1 种有机酸，其中包括2 6 种一元脂肪酸。该法 对分子量大、难挥发的酸性成分分析效果较好，而对于分子量小的挥发酸分析则不理 想。随后，李云等【6 1 】又采用三甲基硅烷化酯化技术结合毛细管g c 法对1 1 种国产烤 烟、香料烟和白肋烟中的1 2 种低级脂肪酸进行了分析。李炎强和冼可法【6 2 l 采用同时 蒸馏萃取、碱洗、酸化和h p 2 0 m 毛细管柱赢接迸样g c m s 法鉴定了烟草中1 9 种 挥发性和半挥发性酸性成分，并迸行了定量分析。重复性和回收率试验显示，该方法 适于分析不少于6 个碳原子的挥发性、半挥发性酸成分，其中包括3 一甲基戊酸、肉豆 蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等重要酸性香味成分的测定。与甲酯化法相比， 该方法简化了分析步骤，对于c 9 以上脂肪酸的分析有较高的回收率，但c 5 以下低级 腊肪酸的回收率则很低。李炎强等【6 3 j 采用同时蒸馏萃取和g c m s 法对云南、河南烤 烟烟叶中游离态和结合态的挥发性及半挥发性脂肪酸进行了分析，共定量测定了2 1 神酸性成分。同年，刘百战】采用样品直接甲酯化( 甲酯化试剂为硫酸一甲醇) 和 g c 法对云南烤烟中高级脂肪酸和多元酸进行了分析。结果表明，中部烟叶的高级脂 肪酸含量最丰富，下部烟略少，上部烟最少。此外还发现，桔黄色烟叶中非挥发性有 机酸的平均含量最高，其次依次为杂色、红棕，柠檬黄烟叶最低。陈章玉 6 5 】等采用甲 酯化后固相微萃取顶空吸附和g c 技术对3 个不同品种的烤烟烟叶中的有机酸进行分 析，共鉴定出了4 0 多种挥发及半挥发性有机酸，但仅对3 甲基丁酸、苯乙酸、辛酸、 十四酸和十六酸进行了定量分析。 早期的烟草组成成分的分析主要采用化学方法，由于很多成分含量很低，分离、 纯化、鉴定都十分困难，能分析检测的成分种类很少，很难全面深入研究。自从1 9 5 2 年j a m e s 和m a r t i n e 提出g c 法以来，特别是1 9 5 5 年g o l a y 提出毛细管柱g c 法，以 及h p l c 、m s 、i r 、n m r 、o c m s 和g c i r 等技术的相继开发与应用，使复杂的烟 草组分分析步人了全新的时代。烟草中非挥发酸的分析一般是先对烟草样品进行适当 的前处理，再用g c 、g c m s 或h p l c 进彳亍检= i 煲 i 。前处理主要是指用有机溶剂或水等 对烟草样品进行萃取和碱洗、酸化，以及进行或不进行适当的衍生化处理。直接进样 法是将所得到的酸部分直接注入仪器中进行分析。该法虽然简化了前处理，但一般较 难取得理想的效果，仪器的响应值较低，且严重污染色谱柱。衍生化法主要包括甲酯 化k 6 _ 6 9 1 、氯甲基化【砌、丁酯化1 7 l 】、硅烷基化i 7 2 】、苄基化 7 3 1 等。该法有效降低了分析 物的沸点、提高了仪器响应值，避免了柱子污染。该法主要适用于非挥发酸，对于水 溶性强、挥发性强的低于c s 小分子脂肪族酸如甲酸、异戊酸等的效果不佳。对于多 元酸和高级脂肪酸，衍生化法取得了较好的效果。h p l c 法主要适用于烟草中多元酸 和高级脂肪酸，也可用于烟气中有机酸的分析。如dl a g o u t t e 和gl o m b a r d 等h4 j 应 用反相h p l c 及毛细管电泳对卷烟烟气中含量较高的4 种低分子酸：甲酸、乙酸、乳 8 南京理r 大学硕士学位论文烟草中生物碱、甾醇和莲堡塑墼塑墨塑鱼堕! 垂堕些坌堑 酸和羟基乙酸等进行了对比分析。 1 1 3 本课题研究的主要内容 本文的主要内容是建立或完善适合于分析各种烟叶中生物碱、甾醇和非挥发酸的 简便、易于操作、重复性好的前处理方法，并用上述方法对常德卷烟厂提供的5 2 个 烟叶样品进行定性和定量分析。本项目所获成果对实现“降焦减害”和“烟医结合”、 推进企业和行业现代化有积极的意义。此外，对新领域的研究工作也有重要的研究意 义；项目在方法和理论上的创新，对我国烟草行业基础研究、应用基础研究的深入发 展有重要的意义，对我国烟草行业跨入世界先进行列有一定意义。 本实验采用溶剂萃取一毛细管气相色谱法分析了烟碱等常规成分，并且同时对其 它组分也进行测定，主要包括了尼古丁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、新烟碱、去氢 新烟碱、2 ，3 一联二毗啶和可替宁等烟草中八种主要的生物碱。 针对改善烟草品质，鉴别烟草质量的迫切需要，对烟草这一复杂植物中的主要植 物甾醇进行了分析研究，提出了一种简单可行的气相色谱分析方法。考虑到类固醇的 脂溶性较好，本文用三氯甲烷对烟叶粉末直接进行固液萃取，毛细管气相色谱分析了 烟草中的四种甾醇类物质：胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和b 谷 醇。 选用硫酸作催化剂的甲醇酯化法，用二氯甲烷萃取酯化产物一非挥发酸甲酯，毛 细管气相色谱法分析烟草中的八种非挥发酸，如苹果酸、柠檬酸、十四酸、十六酸、 亚油酸、亚麻酸、油酸和十八酸。 南京艘t 人学颂j j 学位论立 烟挚中生物碱、 ； 醇和计挥发酸的气相也球耵质i 井法分析 2 气相色谱厂贡谱法分析烟草中主要生物碱 生物碱是烟叶中的主要含氮杂环化台物，它的种类较多，其中最主要的就是烟碱 ( 即尼古丁) ，从某种意义上讲，没有烟碱，烟草也就不成为人们吸烟需要的植物。 烟碱是烟草中特有的一种生物碱，绝大部分烟草生物碱是2 一毗啶基衍生物，主要以有 机酸盐和无机酸盐的形式存在，其含量的高低关系到卷烟的吃味和口感。生物碱含量 过低，烟气没有劲头，吃味平淡；含量过高时，刺激性大、味苦、烟味粗糙。因此， 对烟草中生物碱含量进行分析，把成分与吃味关联，就能为卷烟配方提供理论依据。 烟草中生物娥的分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临 界流体色谱法等。气相色潜法是烟草中分析生物碱的常用方法，本文采取溶剂萃取一 毛细管气相色谱法，力求以简单的前处理方法同时分析烟草中的主要生物碱。烟草样 品经二氯甲烷甲醇( v ，v ，3 ：1 ) 萃取，过次性滤膜，进样，经毛细管柱分离，氢火焰离 子化检测器( f i d ) 检测，同时分离分析了烟草中的烟碱( n i c o t i n e ) 、降烟碱( n o r n i c o t i n e ) 、 新烟碱( a n a b a s i n e ) 、去氢新烟碱( a n a t a b i n e ) 、麦斯明( m y o s m i n e ) 、2 ，3 ，联二吡啶 ( 2 ，3 - d i p y r i d y l ) 、二烯烟碱( n i c o t y r i n e ) 、可替宁( c o t i n i n e ) 等8 种主要的生物碱，如图2 1 所示。前处理方法简单可行重现性和回收率令人满意。 n i c o t i n e n o m i 0 0 f l n ea n a b a s i n ea n a l a b i n e 啤咿护 n i c o t y d n em y o s m i n e 2 3 - d i p y d d y l c o l i n i n e 图2 1 烟草主要生物碱的结构式 2 1 主要设备及试剂 气相色谱仪( f i d 检测器) ：a g i l e n t 6 8 9 0 n ( 美国安捷伦公司) 气质联用仪：q p 2 0 1 0 g c m s 联用仪( 同本岛津公司) ： 超声波清洗器：舒美k q l l 8 ( 昆山市超声电子有限公司) ； 电子天平：m e t t l e r a e t 0 0 ( 瑞典梅特勒托利多仪器有限公司) 南京理1 = 大学硕士学位论文烟草中生物碱、甾醇和非挥发酸的气相色滑质谱法分析 生物碱标样：尼古丁、降烟碱、麦斯明、新烟碱、可替宁购自s i g m a 公司； 尼古丁标样溶液：准确称取o 0 8 1 5 9 尼古丁标样于1 0 m l 容量瓶，用二氯甲烷甲 酵( v v , 3 ：n 定容，浓度为8 1 5 m g m l ； 降烟碱标样溶液：准确称取0 0 0 4 1 9 降烟碱标样于1 0 m l 容量瓶，用二氯甲烷甲 酵( v v , 3 ：1 ) 定容，浓度为o 4 1 m g m l ； 麦斯明标样溶液：准确称取o 0 0 6 0 9 新烟碱标样于1 0 m l 容量瓶，用二氯甲烷甲 醇( w v 3 ：1 ) 定容，浓度为0 6 0 m g m l ； 新烟碱标样溶液：准确称取o 0 0 7 6 9 新烟碱标样于1 0 m l 容量瓶，用二氯甲烷，甲 醇f v v , 3 ：1 ) 定容，浓