（细胞生物学专业论文）甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达.pdf

sc c r - “一 啃 -i ， 一 f 、e v 毒 f，i 1 2 3 裂果相关基因研究3 1 2 4 雄性不育和育性恢复相关基因研究。4 1 3 植物a d c 基因的研究进展5 1 3 1 植物a d c 基因及编码蛋白的基本特性5 1 3 2a d c 基因的定位与编码蛋白的分布6 1 3 3a d c 基因的表达特性7 1 4 植物基因克隆的主要策略7 1 4 1 图位克隆7 1 4 2 转座子标记法8 1 4 3 同源克隆9 1 4 4 表达序列标签法10 1 4 5 差异表达基因克隆技术1l 第二章引言13 2 1 研究的目的与意义1 3 2 2 技术路线。1 3 第三章甘蓝型油菜a d c 基因的克隆与序列分析1 5 3 1 试验材料与试剂。15 3 1 1 材料一1 5 3 1 2 克隆载体与大肠杆菌感受态1 5 3 1 3 主要试剂1 5 3 1 4 主要仪器设备1 5 3 1 5 自配的主要化学试剂1 5 3 2 实验方法16 3 2 1 花蕾r n a 提取( t d z o l 法) 1 6 3 2 2 彳d c 基因保守区域的扩增1 6 3 2 3 利用r a c e 技术克隆a d c 基因c d n a 的3 和5 末端1 8 3 2 4 彳d c 基因c d n ao i 强扩增1 9 3 2 5 , 4 d c 基因c d n a 全长的生物信息学分析方法2 0 3 3 结果与分析2 l 3 3 1 甘蓝型油菜a d c 基因c d n a 全长的克隆2 1 3 3 2 甘蓝型油菜a d c 基因及编码蛋白的生物信息学分析2 3 3 4 讨论3 2 第四章甘蓝型油菜a d c 基因的原核表达3 5 4 1 试验材料与试剂3 6 4 1 1 试验材料一3 6 西南大学硕士学位论文 4 1 2 主要试剂3 6 4 1 3 主要设备3 6 4 1 4 自配主要试剂3 6 4 2 试验方法。3 7 4 2 1 质粒d n a 提取一3 7 4 2 2 表达目的基因蛋白的引物设计3 7 4 2 3b 以d c j 基因o r f 序列加酶切位点扩增3 8 4 2 4p e t 3 0 a ( + ) 质粒和目的基因片段的双酶切3 8 4 2 5 酶切片段胶回收与连接3 9 4 2 6 菌液p c r 与双酶切验证3 9 4 2 7 重组质粒转化b l 2 1 ( d e 3 ) 及菌落p c r 鉴定3 9 4 2 8b n a d c l 融合蛋白的诱导表达3 9 4 2 9b n a d c j 融合蛋白表达的可溶性分析4 0 4 2 1 0b n a d c j 融合蛋白的s d s p a g e 检测4 0 4 3 结果与分析。4 2 4 3 1b n a d a 编码区添加双酶切位点的p c r 扩增4 2 4 3 2p e t 3 0 a ( - + ) b n a d c l 重组质粒的p c r 鉴定、双酶切与测序4 2 4 3 3b n a d c l 蛋白的诱导表达及s d s p a g e 检测4 3 4 3 4b n a d c l 蛋白在b l 2 1 ( d e 3 ) 中的诱导表达方式4 4 4 3 5i p t g 对b 剃d c j 蛋白表达的影响4 4 4 3 6 诱导时间对b n a d c l 蛋白表达的影响4 5 4 4 讨论4 6 第五章结论4 7 5 1 结论4 7 5 1 1 甘蓝型油菜a d c 基因保守区域的克隆：_ ：4 7 5 1 2 甘蓝型油菜a d c 基因全长e d n a 的获得及同源性分析4 7 5 1 3 成功构建b n a d c l 基因的原核表达载体4 7 5 1 4b n a d c l 基因在大肠杆菌宿主菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中的诱导表达4 7 5 2 下一步工作打算。4 7 参考文献4 9 缩略词表6 1 墅| 【谢6 3 附录1b n a d c j 基因c d n a 全长序列6 5 附录2b n a d c 2 基因e d n a 全长序列。6 6 附录3p e t 3 0 a ( + ) 图谱6 7 硕士期间发表的文章6 8 原核表达 细胞生物学硕士研究生：洪林 指导教师：梁国鲁研究员；魏文辉研究员 摘要 精氨酸脱羧酶基因( a d c ) 属于一类基因家族，具有很多的同源基因成员，广泛存在 于许多生物体中，目前已有大量的a d c 基因被克隆。其编码的精氨酸脱羧酶蛋白是多 胺合成的限速酶之一。研究表明，a d c 基因在植物花和果实发育、茎秆的伸长、胚发育、 细胞分裂、逆境胁迫响应等诸多方面发挥关键作用。目前尚未见甘蓝型油菜a d c 基因 克隆的报道，因此对其克隆并进一步进行功能研究具有重要意义。 本研究根据n c b i 已公布物种a d c 基因比对结果设计简并引物，扩增保守区域， 结合r a c e 技术从甘蓝型油菜中克隆到两个同源a z k 7 基因e d n a 全长，定名为b n a d c l 、 b n a d c 2 ，并构建原核表达载体，在大肠杆菌中表达b n a d c l 基因。主要研究结果如下： 1 甘蓝型油菜a d c 基因保守区域的克隆 通过设计简并引物扩增反转录e d n a ，获得了大小为1 0 4 0 b p 、1 0 5 2 b p 的两种序列。 通过n c b ib l a s t n 分析，表明所获得的序列与已知a d c 基因同源，两段序列可能是来 自两个同源a d c 基因。 2 甘蓝型油菜a d c 基因全长e d n a 的克隆 根据保守区域序列设计基因特异引物结合r a c e 技术分别扩增a d c 基因的5 和3 末端，序列拼接得到两个同源a d c 基因全长e d n a 。其中b n a d c l 全长2 6 4 9 b p ，该基 因包含3 4 4 b p 的5 q 3 t r ，2 0 7 9 b p 的o r f 框，2 2 5 b p 的3 q 3 t r ，编码6 9 2 个氨基酸；b n a d c 2 全长2 6 2 5 b p ，该基因包含3 5 2 b p 的5 1 j t r ，2 0 6 4 b p 的o r f 框，2 0 9 b p 的3 q _ r l r ，编码 6 8 7 个氨基酸。通过引物f u l i - a t g l 和f u l l t g a l 、f u l i - a t g 2 和f u l l t g a 2 分别成功扩 增出b n a d c l 和b n a d c 2 基因e d n ao r b 。然后b l a s t n 比对初步推定所获得的e d n a 全长序列为甘蓝型油菜a d c 基因。 3 原核表达载体构建 设计带e c o r i 和b g l i i 酶切位点的引物，p c r 扩增b n a d c l 基因，同时用e c o r i 和 b r o i l 分别双酶切b n a d c i 基因和原核表达载体p e t 3 0 a ( + ) ，将b n a d c i 基因片段连接到 原核表达载体p e t 3 0 a ( + ) 上，经双酶切、p c r 验证、测序，表明成功构建了含目的基因 4 b n 4 d c l 基因在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中的诱导表达 将构建好的表达载体转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) q h ，s d s p a g e 检测到b n d d c l 基因 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中成功表达8 2 k d a 大小的融合蛋白。同时对诱导条件进行了初步 的探讨，实验认为3 7 、l m m o l l 终浓度i p t g 、诱导时间5 h 条件下，目的蛋白的表达 量最大。 关键词：精氨酸脱羧酶基因同源克隆生物信息学分析原核表达 型氮 a b s t r a c t | i l i bi l l! ii i 曼鼍 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o no f 彳d cg e n ef r o m b r a s s i c a n a p u sl c a n d i d a t e ：h o n gl i n a d v i s o r ：p r o f l i a n gg u o l u p r o f w 西w e n h u i c o l l e g eo f h o r t i c u l t u r ea n d l a n d s c a p ea r c h i t e c t u r e ，s o u t h w e s t u n i v e r s i t y , c h o n g q i n g4 0 0 7 15 ，c h i n a a b s t r a c t a r g i n i n ed e c a r b o x y l a s eb e l o n g st oah u g eg e n ef a m i l yw h i c hh a sl o t so fh o m o l o g o u s m e m b e r s 1 1 1 哆p o s s e s st h ee x i s t e n c eo fab r o a dv a r i e t yo fp l a n t sa n dp l a yai m p o r t a n tr o l ei n p o l y a m i n em e t a b o l i s m s of a r , m a n yr e l a t e dg e n e sh a v eb e e nc l o n e df r o mp l a n t s ag r e a td e a l o fe x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t et h e c r u c i a lf u n c t i o n so fa d cg e n ed u r i n gm a n yb i o l o g i c a l p h a s e s ，s u c ha sd e v e l o p m e n to fp l a n tf l o w e ra n df r u i t , s t r e t c ho fs t e m ，c e l ld i v i s i o n , r e s p o n s et o s t r e s s ，e r n b 巧og r o w t h t h e r e f o r ei tw i l lb ew o r t h yo fc l o n i n gt h ea d cg e n ef r o mb r a s s i c a n a p u sa n dv e r i f y i n gt h eg e n ef u n c t i o n i nt h i sp a p e r , w ef i r s t l ya m p l i f i e dt h ec o n s e r v a t i v er e g i o no f a d c g e n eu s i n gd e g e n e r a t e d p r i m e r t h e nt h ef u l ll e n g t he d n ao f a d cg e n en a m e db n a d c la n d b n a d c 2w a so b t a i n e d w i t ht h er a g em e t h o d ，m e a n w h i l ew ec o n s t r u c tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n dd e t e c t t h ea d c p r o t e i nu s i n gs d s p a g e t h eb r i e f r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 c o n s e r v a t i v er e g i o nc l o n i n go f b r a s s i c an a p u sa d c g e n e t w ok i n d so fs e q u e n c e s1 0 4 0 b p ，1 0 5 2 b pw e r ea m p l i f i e du s i n gd e g e n e r a t e dp r i m e r t h e s e s e q u e n c e sh a v eh i i g hs i m i l a rw i t ho t h e ra d cg e n e sp u b l i c i z e db yn c b i t h ea n a l y s i so fb l a s t s h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo b t a i n e di sp a r to f t h ea d c g e n e 2 t h ec l o n i n go ff u l ll e n g t he d n ao f a d c g e n ef r o mb r a s s i c an a p u sl w i t ht h ec o n s e r v a t i v es e q u e n c e sk n o w n , t h e5 a n d3 c d n ae n do fa d cg e n ew e r e a m p l i f i e d w i t hg e n es p e c i f i cp r i m e r s , t h e nt w of u l ll e n g t he d n ao fa d c h o m o l o g o u sg e n e w e r eo b t a i n e dt h r o u g hs e q u e n c ea s s e m b l y t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fb n a d c li s2 6 4 9 b p l o n gi n c l u d i n g5 u t r3 4 4 b p ，o r f2 0 7 9 b p ，3 t i t r2 2 5 b pa n di te n c o d e sap r o t e i no f6 9 2 a m i n oa c i d s ；t h en u e l e o t i d es e q u e n c eo fb n a d c 2i s 2 6 2 5 b pl o n gi n c l u d i n g5 u t r 3 5 2 b p ，o r f2 0 6 4 b p ，3 ，u t r2 0 9 b pa n di te n c o d e sap r o t e i no f6 8 7a m i n oa c i d s o r fo f l i i 西南大学硕士学位论文 b n a d c la n db n a d c 2w e r ec l o n e du s i n gp r i m e r sc o m b i n a t i o n ：f u u a t gia n df u l l - t g a1 、 f u l l a t g 2a n d f u l l - t g a 2 t h er e s u l to fh o m o l o g ya n a l y s i si nn c b is u g g e s t st h a tt h e s et w o c d n af u l ll e n g t hs e q u e n c e ss h o u l db e l o n gt oa d c g e n eo f b r a s s i c an a p u sl 3 c o n s t u c t i o no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r d e s i g nt h ep r i m e rw i t ht h ee c o r la n db g l l is i t e s ，t h e nc l o n et h eb n a d c lg e n e t h r o u g hp c k d i g e gt h eb n a d c la n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a ( + ) b yd o u b l e r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ee c o r la n db g l l i ，t h e nr e c y c l et h et a r g e tg e n ea n dl i n kt o e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a ( + ) d i g e s t i o na n dp c rv e r i f i c a t i o ns h o w e dt h a tt h ep r o k a r y o t i c e x p r s s i o nv e c t o rw i t ht h ep u r p o s eo fg e n e _ 邓t 3 0 a ( + ) b n a d c ih a sb e e ns u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e da n dt h ei n s e r t e da d c lg e n es e q u e n c ei sc o r r e c t 4 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i nv e c t o rp e t 3 0 a ( + ) b n a o c le x p r e s s e di ne c o i lb l 21 ( d e 3 ) u n d e rt h ep r o p r i a t ei n d u c ec o n d i t i o n , w et r a n p l a n t e dt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r i n t oe c o l it oi n d u c e db n a d c ig e n ee x p r e s s i n gi ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，a n dt h e np r o v e dt h e e x p r e s s i o no f b n a d c lt h r o u g ht h es d s - p a g ed e t e c t i o no nt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n m e a n w b i l ei n d u c i n gc o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e di nt h ee x p e r h n e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es p e c i f i c p r o t e i ne x p r e s s e di nt h e c o n d i t i o no f 3 7 c 、l m m o l li p t g 、5 h k e yw o r d s ：a r g i n i n ed e c a r b o x y l a s eg e n e a n a l y s i sp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i v h o m o l o g o u sc l o n i n g b i o i n f o r m a t i c 第一章文献综述 第i 章文献综述 1 1 油菜的基本研究背景 油菜属于十字花科( b r a s s i c a c e a e ) 芸薹属( b r a s s i c a ) 植物，芸薹属近缘物种的遗传背景 和进化上的关联比较复杂。根据染色体数目及其同源性在不同种间的变化，将它们分为 两大类。一类为二倍体基本种，包括甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e al ) 、黑芥( b r a s s i c an i g r al ) 和白菜型油菜( b r a s s i c ar a p al ) ，其染色体基数分别为n = 8 、9 、1 0 ，分别用染色体组型 b 、c 、a 表示。另一类为异源四倍体复合种，包括埃塞俄比亚芥、芥菜型油菜和甘蓝 型油菜，它们的染色体基数分别为n = 1 7 、1 8 、1 9 ，染色体组型分别用b c 、a b 、a c 表 示，它们是由3 个基本种之间的自然杂交及染色体加倍进化来的。如甘蓝型油菜( a a c c ， 2 n = 3 8 ) 起源于白菜( a a ，2 n = 2 0 ) 和甘蓝( c c ，2 n = 1 8 ) 的天然杂交与染色体组加倍【1 1 。 油菜是世界四大重要油料作物之一，也是食用油和饲用蛋白质的最主要来源之一。 其种植面积及产量位居第二。中国、欧洲、加拿大和印度是世界油菜的主产区，我国是 油菜栽培大国，种植面积和总产均居世界首位，主要栽培种包括白菜型油菜、芥菜型油 菜、甘蓝型油菜3 个，由于甘蓝型油菜株型高大，枝叶繁茂，抗寒及抗病毒能力相对较 强，产量较高且比较稳定，育种潜力大，因而成为我国目前最具经济效应的一个栽培种， 种植最为广泛，而白菜型油菜和芥菜型油菜的栽培面积相对较少。在我国，油菜是继大 豆( g l y c i n em a x 阻m e r r i l l ) 、水稻( o 哆z as a t i v al ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 、玉米( z e a m a y sl ) 后的第五大农作物，其可作为食用油、重要工业原料及和未来可再生能源的主 要来源，因此在社会经济发展中扮演着重要的角色。 近2 0 多年来，我国的油菜产业发生了革命性的变化，其产量和品质都有了大幅度 的提升。品种遗传改良研究是推动这种变革的关键因子，尽管如此j 与发达国家相比我 国油菜产业仍然相对较落后，譬如单产水平较低、含油量低、抗逆性差、育种手段相对 滞后等一系列问题【2 l 。所以要结合当前国际发展趋势和我国油菜生产发展的需要，针对 生产上存在的重大问题，不断进行油菜种质改良，选育出产量更高、品质更好、抗逆性 更强的油菜品种，进一步促进油菜产业的健康发展。 1 2 油菜重要基因的研究进展 1 2 1 与抗逆性有关的基因 干旱、盐碱、高温、缺素、重金属污染、病虫害等生物和非生物逆境胁迫严重影响 植物的正常生长发育。通过长期的进化，植物形成了相应的应急调控机制，表现出一定 的抗逆能力，这些响应是通过启动染色体上特定的基因表达来调节的。油菜栽培面积广， 但霜霉病、菌核病、易倒伏、含油量低、籽粒小等生产问题严重制约了油菜产业的健康 西南大学硕士学位论文 发展。常规育种结合分子辅助育种技术可以达到提高油菜种质抗逆性的目的。 目前已克隆到多个与抗病虫、抗胁迫有关的基因，b r m t l l 3 基因已在白菜型油菜中 被克隆，分为i 、i i 、l i d 种类型，与重金属铬的吸附与分解有关。分离得到的油菜抗冷 相关基因b n c o r ，与拟南芥及荠菜等c o r 蛋白同源性较高，且b n c o r 蛋白具有典型 的翻蛋白序列特征，暗示b n c o r 在油菜体内抵抗冷胁迫的响应中具有重要作用【4 】【5 】。 植物体内s o d 是在活性氧( r o s ) 清除系统发挥重要作用的抗氧化酶【6 】，分为c u z n s o d 、 m n s o d 和f e s o d3 种类型，相关基因已在芥菜型油菜、甘蓝型油菜等品种中被克隆 【6 】m ，研究发现茵核病抗性强和易感油菜品种叶片中c u z n s o dm r n a 的表达量明显不 同i s 。柠檬酸合酶是糖代谢的关键酶，其编码基因的表达与抗水渍、干旱、高温、低温 及抗铝害胁迫有关系 9 1 。w u 等利用染色体步移技术从芥菜型油菜中分离出b j c h l l 基因， 它在伤信号、高浓度n a c i 、p e g 6 0 0 0 等胁迫中起作用，进一步研究发现该基因启动子 中的保守的t g b o x ( a a c g l g ) 对胁迫响应尤为关键【l o l 。其他如o x a l a t eo x i d a s e ( 草酸氧 化酶) 基因，防御素( p d f ) 基因等也与油菜抗病虫有关【1 1 】【1 2 】。a d c 基因是植物多胺的限 速酶精氨酸脱羧酶的编码基因，通过对芥菜a d c l 、a d c 2 、a d c 3 中3 个同源基因的研 究，认为a d c 基因的表达与植物在冷胁迫、高盐等逆境中生长密切相关【1 3 】。 1 2 2 油脂代谢相关基因 油菜籽油脂合成受多个基因控制，由数量性状的遗传因素决定，控制基因同时具有 加性和显性效应，存在基因型与环境间的互作。调控油脂代谢的分子机理研究是当前油 菜基因组学的热点之一。 目前已克隆到不少油菜脂肪酸合成代谢相关基因，如乙酰辅酶a 羧化酶( a c c a s e ) 基因，脂肪酸延长酶基因渊剧) ，脂肪酸脱氢酶基因( f a d 2 ) 、l 4 c 基因、尸e p 基因等【l 纠川。 f a e i 基因是第一个被发现的编码k c s 酶的基因【1 9 】，f a e l 基因编码b 酮酰辅酶a 合酶， 其也是控制油菜芥酸合成的关键基因之一，已分离到的野生甘蓝型油菜厨尉基因的全 长1 5 2 1 b p ，无内含子，编码5 0 6 个氨基副2 0 1 。研究表明f a e l 基因表达时空达特异性强， 只在胚中有表达，且在子叶、下胚轴及根上部表达量最为丰富【2 1 】。 f a d 2 基因编码f a d 2 去饱和酶，此酶定位于内质网【2 2 1 。f a d 2 基因是控制油酸转化 为亚油酸的关键基因，该基因功能与种子储存油脂中多不饱和脂肪酸的含量密切相关。 目前人们已经在拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、 花生( a r c h i sh y p o g a r e al ) 、玉米等很多植物中成功克隆。且除拟南芥含一个f a d 2 基因 外，其余植物中大多含有2 个以上的f a d 2 基因拷贝，如芝麻( s e s a m u mi n d i c t u nl ) 有1 到2 个拷贝，花生含2 个拷贝，白菜型油菜有2 4 个拷贝，玉米中至少含有3 个，甘蓝 型油菜可能具有4 6 个直向同源基因圆。f a d 2 基因在5 r l j t r 区均具有内含子，有些还 具有t a t a 框、螺旋环螺旋结构域等基因启动相关重要元件唧j ，另外该基因还具有a g 2 第一章文献综述 曼曼曼曼量曼曼曼量皇皇曼量曼量曼寡i i 皇量皇曼篡曼曼罾曼皇量曼鼍 框、同源g t - 1 基序( g r w a a w ) 等典型的光感元件【2 习。f a d 3 基因也编码一类去饱和酶， 它在控制亚油酸转化为亚麻酸的过程中发挥关键作用。其功能与厨三1 2 基因类似，位于 内质网膜上，存在多个拷贝，组成性表达。在拟南芥 2 6 1 、豇豆- o q g n au n g u i c u l a t a l ) t 2 7 1 、 亚麻( l h u mu s i t a t i s s i m u ml ) 刚、油菜【2 9 1 等多种植物中均已分离到该基因。 l a c s 基因属l a c 基因家族，它们在油脂合成与分解代谢中起关键作用，a m p 绑 定基序【3 川和连接域【3 1 】是其主要的两个分子特征，它们在代谢中如何发挥功能还不明确。 目前已经在甘蓝型油菜中分离出3 个l a c s 基因，此外还有3 个l a c s 类似基因。其中 a c s 6 蛋白在胚乳发育过程中大量堆积，并且在于花和花芽中也有大量表达。这暗示 a c s 6 可能参与油脂合成【3 2 】【3 3 】。 乙酰辅酶a 羧化酶( a c c a ) 是脂肪酸合成的第一关键酶1 3 4 1 1 3 5 1 ，通过构建真核表达 载体在油菜中过量表达a c c a s e 基因可使种子得含油量上升5 蚶3 6 l 。然而种子油脂合成 是受多基因控制的，单个酶调控种子含油量效率低【3 7 】，油脂代谢过程转录水平的调控因 子研究逐渐成为热点，n i c o l e 首先在拟南芥中采用图位克隆技术分离到一种编码d n a 结合转录因子基因w r l l ，鼢蛆i 或过表达分别使种子含油量降低8 0 或提高2 0 ，目 前已成功克隆到油菜b n w r l l 基因 3 8 1 。w r l l 是油积累、糖代谢的关键基因，因此在调 控种子油脂含量方面将会发挥巨大的作用1 3 9 l 【柏l 。 1 2 3 裂果相关基因研究 油菜及其他的荚果类植物的果实成熟后会自然开裂，这是植物在长期进化过程中形 成的保证种子散布和繁衍后代的遗传机制，但对油菜等一些荚果作物的生产造成极大的 损失【4 1 1 。因此有关果荚开裂的调控机理的研究也越来越受到重视。 关于裂果的生物学机制在模式植物拟南芥中研究比较明晰，许多与裂果相关的基因 已被鉴定，如s h p l ，s h p 2 ，f u l ，g t l 4 0 、i n d l ，a l c ，尸g 等1 4 2 - 4 6 1 ，主要涉及到离 区( d z ) 分化、裂区特异表达等，多采用经典突变体及反向遗传学技术等研究手段1 4 2 1 。 油菜和拟南芥同属十字花科植物，两物种的许多功能基因具有同源性，因此由基因参与 调控的裂果机制可能比较相似，这为油菜的相关研究提供了理论基础。 目前在油菜中已经成功克隆到与荚果开裂有关的一些基因，多聚半乳糖醛酸酶基因 驴g ) 调控胶质的主要成分的降解反应，其在甘蓝型油菜角果的裂区中表达1 4 7 1 ，p g 酶活 性在角果开裂阶段呈现增加趋势【4 8 1 1 4 9 。r d p g l 与其它在角果开裂中表达的p g 酶功能 相似，具有可裂的n 末端域，n 末端多肽抑制p g 酶向植物细胞壁中的分泌，当其通过 一个未知信号触发，使其活性被移除后，成熟的蛋白才会在胞外发挥功能i 矧，r d p g l 的表达模式也已在转基因拟南芥中被详细地解析1 5 1 】。研究发现纤维素酶活性在油菜荚果 开裂过程中上升，相应的基因分离鉴定研究正在进行中1 5 2 j 。影响细胞壁结构的另一种酶 3 西南大学硕士学位论文 是木葡聚糖转葡糖苷酶e 天z 乃p 3 1 ，在对甘蓝型油菜的研究中发现荚果发育晚期离区x e t 基因的表达上调【5 4 1 。s a c 2 9 基因可能也参与了甘蓝型油菜角果开裂的调控，并在角果裂 区中特异性过量表达，编码的蛋白与应答调控蛋白的受体域同涮”】。此外，乙烯、生长 素等植物激素分子在油菜角果开裂过程中可能也扮演着重要的调节因子【5 6 1 。 1 2 4 雄性不育和育性恢复相关基因研究 植物雄性不育根据遗传特点分为胞质不育( c m s ) 和核不育( g m s ) 两种类型，其中油 菜c m s 又分为p o l i m a 胞质不育系、甘蓝型油菜胞质不育系和陕2 a 胞质不育系、萝卜 胞质不育系、b t o u m e f o r t i i 胞质不育系、b o x y r r h i n a 胞质不育系等类型【5 7 】。油菜雄性 不育的利用在杂交制种生产中具有重要的指导意义。 近年来，分子生物学技术突飞猛进，许多学者对油菜雄性不育的分子机理开展了深 入的研究。b u d a r 等通过实验证明线粒体d n a 及表达产物与c m s 直接相关，与此前认 为c m s 相关基因位可能存在于叶绿体d n a 上的推论不刚镯，目前已经报道的油菜c m s 相关的m t d n a 基因位点有：p o lc m s 的o r f 2 2 4 a t p 6 5 叭、n a pc m s 的o r f 2 2 2 6 0 1 、o g u c m s 的o , 刀3 8 t 6 1 1 、k o sc m s 的o r 刀2 5 t 6 2 1 、陕2 ac m s 的o r f 2 2 4 1 a t p 6 位点和t o u rc m s 的 唧粥等。 h a n d a 提出正常可育胞质的油菜线粒体基因组中存在不育基因( o r f 2 2 2 ) 引。通过s s h 技术和c d n a m i c r o a r r a y 技术研究发现甘蓝型油菜显性核不育材料中与d n a 修复相关 的r a d 2 3 基因表达异常，导致花粉母细胞不能正常完成减数分裂过程，引起败育现象 州。h o d g e 等根据彪韶基因序列设计探针，从甘蓝型油菜e d n a 文库筛选到其同源基 因m s 2 b n a p ，其序列与s i m m o n d s i ac h i n e n s i s 酯酰还原酶基因的核酸序列相似，因此可 能与孢粉素合成相关【6 卯。h u 等利用同源克隆技术从两个甘蓝型油菜的双基因互作显性 核不育近等基因系扩增到与已报道的m s 2 b n a p 基因同源的核基因m s 2 b n a p - d n a 。该基 因全长为2 5 8 0 b p ，两个序列中单核苷酸变异可能直接引起蛋白功能的丧失，从而表现不 育性。而s n p 发生在内含子，则表现相反的性状【6 6 1 。另外一个重要的发现就是输入蛋 白基因a ，研究发现油菜m d g m s 不育系的输入蛋白a 存在2 个谷氨酞胺的缺失，进而 引起此蛋白空间结构的变化和功能的改变。输入蛋白a 基因与配子发育关系密切，揭示 细胞核雄性不育的新机错j j t 6 7 。 育性恢复基因对c m s 相关d n a 位点的表达有着重要的调控作用。目前对油莱育 性恢复基因研究涉及以下几方面：彤基因如何影响c m s 相关d n a 位点的转录、转录 后加工、r n a 编辑、翻译；矽基因的分子标记与定位；彤基因的克隆。在p o lc m s 系 中，彤基因增加1 1 妨大小m r n a 转录本丰度，产生1 4 k b 和1 3 k b 特异转录本，降低 2 2 和1 9k b 转录本的丰度，而在可育胞质中只产生1 个a t p 6 转录本【5 9 1 。m e n a s s a 等应 用鸟苷转移酶戴帽实验认为1 1k b 、1 3k b 和1 4 k b3 种m r n a 转录本是由2 2k b 和1 9 4 第一章文献综述 k bm r n a 酶切而来。且上述3 个转录本具备一共同特点，即在其加工位点附近均有 5 u u g u u g3 或5 u u g u c j g 3 的基元序列 6 s l ，甘蓝型c m s 恢复系中彤钰的特异转录本 5 端邻近区域也存在5 - 1 3 u g u g g 3 序列，因此推测这两种序列可能为r n a 转录后加工 提供的识别位点，r f n 和肋基因所编码的蛋白质因子可识别并参与线粒体转录产物的 加工例。而在p 0 lc m s 的o r f 2 2 4 基因研究表明r n a 编辑对油菜的育性无影响 7 0 1 ，但 r 0 基因可能在蛋白水平上调节o r f i 2 5 基因的表达【7 1 1 。 不断发展的分子标记技术为高精度的分子遗传图谱构建提供了技术支撑。多采用近 等基因系( n i l ) 分析法和集团分离分析( b s a ) 法2 种方法进行基因定位，目前已对油菜许 多雄性不育基因进行了克隆、定位。黟基因的克隆也取得了一定的进展，b r o w n 等通过 图位克隆方法克隆到o g uc m s 恢复基因r j 0 ，其编码的蛋白质序列中存在线粒体定位前 导序列及1 6 个阱 r 基序【7 2 1 。而i m a i 克隆到的k o sc m s 的职j 基因1 ，拍8 7 ，其结 构与o g uc m sr 0 基因相似【7 3 1 。通过d n a 序列推定两基因同属于p p r 基因家族【7 4 1 。 1 3 植物彳d c 基因的研究进展 1 3 1 植物a d c 基因及编码蛋白的基本特性 多胺是生物体中广泛存在具有生物活性的小分子量脂肪族含氮碱。主要有腐胺、 精胺和亚精胺3 种。多胺在控制形态建成、胚胎发生，提高植物抗逆性、延缓细胞衰老 等多方面扮演关键角色【7 卯。植物中多胺的合成受a d c ，o d c ，s a m ) c 基因的调控( 见 图1 1 ) 1 7 6 1 ，因此被视为关键限速酶。 图1 1a d c 基因在植物多胺合成代谢中的作用 f i g l 1 t h er o l eo f a d cg e n ei np l a n tp o l y a m i n em e t a b o l i s m 5 西南大学硕士学位论文 学者们已经通过各种技术克隆到多种植物的精氨酸脱羧酶编码基因，如在拟南芥、 葡萄( v i t i sv i n i f e r al ) 、豌豆( p i s u ms a t i v u ml ) 、大_ 豆_ ( g l y c i n em a xl ) 、烟草( n i c o t i a n a t a b a c u ml ) 、番茄( s o l a n u ml y c o p e r s i c u ml ) 、燕麦( a r e n as a t i v al ) 、盐芥( t h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l a 贮a m e y ) d es c h u l z ) 、康乃馨( d i a n t h u sc a r y o p h y l l u sl ) 等多种植物中分离 到a d c 同源基因f 7 7 1 。已公布的植物a d c 基因内部都没有内含子，基因核苷酸长度变化 大，如凯尔盖朗甘蓝( p r i n g l e aa n t i s c o r b u t i c a ) a d c 2 基因全长3 6 7 9 b p ，其核心编码区2 l 3 5 b p ，从8 7 b p - - 3 0 2 2 b p t 7 s l 。而芥菜的a d c 3 基因只有2 6 4 9 b p ，核心编码区长2 0 4 2 b p t 7 9 1 。 已获得的一些c d n a 全长序列中5 q 3 t r 、3 刚r r r 均较长，且5 u t r 中存在一段2 1 b p 长 的u o r f 序列，豌豆5 q j