（食品科学专业论文）短小芽孢杆菌生物合成D核糖及代谢通量分析的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本文对短小芽孢杆菌转酮酶缺失突变株( b a c i l l u sp u m i l u ss y - 6 ) 的生理生 化特性及培养基配方、溶解氧浓度等发酵条件对b p u m i l u ss y - 6 生物合成d 一 核糖的影响进行了较为详细的研究，构建了对该突交株迸行代谢通量分析的 平台，并利用此平台对不同发酵条件下b p u m i l u ss y - 6 的代谢网络进行了分 析，对d 核糖提取精制的条件也进行了较为细致的探讨。 考察了无机氮源对b p u m i l u ss y - 6 菌体生长和d 核糖发酵的影响，结果 表明该突变株不能以无机氮源为唯一氮源进行d 核糖发酵。以玉米粉糖化液 为底物进行d 核糖发酵，考察了玉米粉不同酶解方式和不同初糖浓度对发酵 的影响，在以玉米粉双酶酶解液为底物进行摇瓶发酵时最高产量达到 6 3 4 9 l 。应用响应面分析法( r s a 。r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ) ，设计了葡萄 糖、玉米浆、硫酸铵三因素三水平的实验方案，对发酵培养基进行了优化， 并确定了b p u m i l u ss y - 6 生长和发酵最佳c 蹦比。结果表明，6 撑和1 5 # 培养基 配方分别在d 核糖产量和转化率上优于其它培养基配方，摇瓶发酵结束后 d 核糖产量分别为8 0 9 l 和7 1 9 l ，转化率分别为3 3 3 和3 7 9 ，对照实验 中d - 核糖产量和转化率为5 8 9 l 和3 2 2 。同时还确定了该突变株生长和发 酵最佳c n 比分别为1 9 ：1 和1 1 ：l 。在5 l 发酵罐中对不同溶解氧浓度下d 核 糖发酵的过程参数进行了分析，探讨了溶解氧浓度影响d 核糖发酵的机理， 提出了在d 核糖发酵过程中0 至1 0 h 控制溶解氧浓度为6 0 ，1 0 h 至发酵结 束控制溶解氧浓度为8 0 的分阶段供氧的控制模式。 本文在分析了胞内e m p 途径、h m p 途径、t c a 循环和生物大分子合成 途径之后，基于化学计量平衡方程，构建了b p u m t l u ss y - 6 菌株生物合成d 核糖的代谢网络。应用代谢通量分析法，得到了不同培养基配方和不同溶解 氧浓度下b p u m i l u ss y - 6 的胞内代谢通量分布，对g - 6 p 、r - 5 p 、p e p 三个关 键节点进行了节点分析。 本文确定了d 核糖发酵液预处理、脱色、脱盐、浓缩等工序的具体参数， d 核糖总提取收率达到7 9 。 关键词：d 核糖短小芽孢杆菌，代谢通量分析 摘要 a b s t r a c t p h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e so f d r i b o s ep r o d u c i n gs t r a i nb a c i l l u sp u m i l u ss y - 6 w e r ec o m p r e h e n s i v e l ys t u d i e d ，a n dt h ee f f e c to fm e d i u mc o m p o s i t i o n , d i s s o l v e d o x y g e nt e n s i o n o no v e r p r o d u c t i o no fd r i b o s eb yb , p u m i l u ss y 二6w e r ea l s o i n v e s t i 【g a t e d b a s e do n t h e s es t u d i e s am o d e lo fm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ( m f a ) w a sc o n s t r u c t e da n du s e d t o a n a l y z e m e t a b o l i cn e t w o r k su n d e rv a r i o u s c o n d i t i o n s 1 1 1 ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fd - r i b o s ef r o mf e r m e n t a t i o nl i q u o rw a s a l s od i s c u s s e d s t u d yo f e f f e c t so fi n o r g a n i cn i t r o g e ns o n r c eo n b p u r a i l u ss y - 6g r o w t ha n d d r i b o s ep r o d u c t i o nr e v e a l e dt h a tt h i ss t r a i nc o u l d n tg r o ww e l lo nm e d i u mw i t l l s i n g l ei n o r g a n i cn i t r o g e ns o u l e w h e nc o r ns y r u pw a su s e da s f e r m e n t a t i o n s u b s t r a t e ，t h eh i g h e s to u t p u to fd - r i b o s er e a c h e d6 3 4 e g l r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ( r s a ) i n c l u d i n gt h r e ef a c t o r sa n dt h r e el e v e l sw a su s e dt oo p t i m i z e m e d i u ms u c ha sf e r m e n t a t i o nc nr a t i oa n dg r o w t hc ，nr a t i o t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a t6 捍a n d1 5 # m e d i u mf i r eb e t t e ra n dd r i b o s eo u t p u to f8 0 9 ，la n d7 1 9 ，lw e r e a t t a i n e dr e s p e c t i v e l y a f t e rc o m p a r i n gt h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e r si nb a t c hc u l t u r eu n d e rd i f f e r e n t d i s s o l v e do x y g e nt e n s i o nb y 丑p u m i l u ss y 6a n d a n a l y z i n gt h em e c h a n i s mo f t h e e f f e c to fd i s s o l v e do x y g e nt e n s i o no nf e r m e n t a t i o no fd - r i b o s e ，at w o - s t a g e o x y g e n s u p p l yc o n t r o lm o d e ( 0 1 0 h ，d o t6 0 ：1 0 h - e n d ，d o t8 0 ) w a s p r o p o s e da n de x p e r i m e n t a l l yp r o v e d t ob eu s e f u l 。 b a s e do ne m p ，h m p ，t c aa n do t h e ra n a b o l i cr o u t e so f b i o l o g i c a lm o l e c u l e s a n ds t o i c h i o m e t r i cb a l a n c ee q u a t i o n s m e t a b o l i cn e t w o r k s o f 丑p u m i l u s s y - 6w e r e c o n s t r u c t e d b ym f a ，t h em e t a b o l i cf l u x d i s t r i b u t i o ni nc e l lu n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n sw a so b t a i n e da n dn o d ea n a l y s i sw a sm a d eo nt h et h r e ec r i t i c a ln o d e s g 6 p , r 5 p a n dp e p t h e o p t i m a lp a r a m e t e r s i n p r e t r e a t i n g ，d e c o l o f i z a t i o n ，d e s a l t i n g a n d c o n c e n t r a t i o nw e r ea l s od e t e r m i n e d t h ef i n a le x t r a c t i o nr a t er e a c h e d7 9 k e yw o r d s ：d - r i b o s e ，b a c i l l u s p u m i l u s ，m e t a b o l i c f l u x a n a l y s i s 2 灭津科技人学顺f + 学位论立 1 、前言 d 一核糖又称为异性树胶糖或d f 一) 胞核糖，英文名称为d r i b o s e ， d r i b o f u r a n s e 。它最早于1 8 9 1 年被k o s s e l a 从酵母r n a 水解液中得到鉴定哆 是一种具有醛基的五碳糖，分子式为c 5 h l 0 0 5 ，分子量1 5 0 1 3 ，其结构式如图 1 - 1 所示。 c h o h 卫o h h 一j d h h j 0 h c h 2 0 h a 图1 - 1d 核糖的分子结构式 b o h 1 1d 核糖的理化性质 d 核糖纯品为斜方晶体，微有香气，极易吸潮，溶于水和甲醇，微溶于 乙醇，不溶于乙醚、苯、丙酮和氯仿，熔点为8 6 8 7 ( 2 ，【q 哿= 一2 3 7 + 2 3 7 ( c = 4 ，于水中) 。由于核糖分子中具有手性碳原子，因而它具有光学异构现 象，即具有d 型和l 型两种构型，自然界中以d 核糖为主要存在形式。 1 2d 核糖的生产方法 从1 8 9 1 年鉴定出d 核糖到本世纪7 0 年代实现d 核糖的工业化发酵生 产，其间经历了8 0 年左右的时间。在这段时间里出现了许多d 核糖生产方 法，其中包括化学法或酶法水解r n a 2 , 3 】；以其它糖或有机酸为原料化学合成 d 核糖f 4 “】；使用芽孢杆菌突变株生物法合成d 核糖等多种方法。但水解r n a 法不易进行规模化生产，化学法生产使用汞电极，环境污染严重，且得率较 低，利用特定微生物突变株生物合成d 一核糖以其工艺简单、成本低廉等特点， 已成为当前世界上最经济有效的d 一核糖生产方法。 生物法合成d 一核糖包括利用生物酶在生物体外合成d 一核糖和童接利用 生物体新陈代谢在其体内合成d 核糖两种方式。前一种方法的报道不多，只 有s a n o o j 利用枯草芽孢杆菌佃口c f 池ss u b t i l i s ) 等微生物产生的酶水解5 一氨基 - 4 咪唑羰基核苷酸得到d 核糖，t a k s a 1 1 】利用链霉菌，印幻，”y c 舀s p ) 产生的 异构酶，将核酮糖异构化为d 核糖。第二种方法是利用微生物发酵法合成 d 一核糖，它经历了几十年的时间发展起来，是目前d 核糖生产最可行的方法。 由微生物发酵合成d 一核糖的最早报道是在1 9 5 1 年，s i m o n a r t 和g o d i n 前高 等【1 2 人用纸层析法在短密青霉f p e n m c f ，f f “mb r e v i c o m p a c t i u m ) 的发酵液中检 测到了生成的d 核糖，从此丌始了微生物发酵法合成d 一核糖的进程。迄今为 止，利用野生型微生物合成d 。核糖的主要报道如表1 - 1 所示。 表1 1 利川野生烈微生物合成d 核糖的主要报道 七十年代，人们开始了以代谢控制理论为指导，利用微生物营养缺陷型 突变株进行发酵法合成d 一核糖的研究，主要研究进展如表1 2 所示。 由表1 - 1 和表1 2 可见，特定的微生物代谢突变株具有在发酵液中大量积 累d - 核糖的能力，其d 核糖产量远远高于野生型微生物，并且高产菌种多集 中在短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp “m i f “s ) 和枯草芽孢杆菌( 8 d c f z f “5 删6 肌s ) 代谢突 变株上。 2 天津科技人学顺l 。学位论文 表1 - 2 利州微生物突变株台成d 一核糖的t 要报道【1 2 一h _ “+ _ 十“- h * h _ “h ”一。一一， 曲种 bs u b t i l 西a t c c 2 1 3 6 0 b p u m i m sa t c c 2 1 3 5 7 b p u m i & s a t c c 2 1 9 5 1 b p u m i l u sa t c c 2 1 9 5 1 b p u m i h t sa t c c 2 1 9 5 2 bs u b t i n sa r c c 3 1 0 9 2 b p u m i m sa t c c 3 1 0 9 4 c o r y n e b a c t e r i u m b 印e m p 5 8 b p u m i t u sa t c c 2 1 9 5 1 b p u m i & sa t c c 2 1 9 5 1 b s u b k f i si f 0 1 5 1 3 8 b p u m i l u sa t c c 2 1 9 5 1 b ，s u b f i f i sa ：r c c 3 1 0 9 3 b p u m i l u sa t c c 2 1 9 5 1 bs u b f i f i s9 7 0 4 d 2 0 2 b p u m i m st 1 0 1 b s u b t i l u s f b l 0 4 - 5 3 1 葡萄糖 ( g l ) 1 0 0 1 2 5 i 0 0 1 5 0 1 5 0 1 5 0 1 5 0 1 0 0 1 4 0 2 0 0 2 0 0 1 6 0 1 0 0 1 0 0 2 0 0 2 0 0 1 0 0 5 0 1 4 0 1 8 0 d 一核糖 ( l ) 3 0 3 l 3 5 6 0 5 6 6 7 7 1 2 0 6 4 9 1 9 5 6 2 6 0 1 1 8 8 4 0 6 5 3 9 5 5 8 发酵时间 研究者 一殳一一， 6 8 y o n e d a & s a s a j i m a ( 1 9 6 9 ) y o n e d a & s a s a j i m a ( 1 9 6 9 ) s a s a j i m a & y o n e d a ( 1 9 7 1 ) s a s a j i m a & y o n e d a ( 1 9 7 4 ) s a s a j i m a & y o n e d a ( 1 9 7 4 ) s a s m a e ta 1 ( 1 9 7 5 ) s a s a j m ae ta 1 ( 1 9 7 5 ) m a t s u i ( 1 9 7 5 ) a s a e ta 1 ( 1 9 7 8 ) k i n t a k ae ta 1 ( 1 9 8 6 ) k i s h i m o t oe ta 1 ( 1 9 9 0 ) m i y a g a w a e ta 1 ( 1 9 9 2 ) d e w u l fe ta 1 ( 1 9 9 6 ) 显野等( 1 9 9 6 ) 2 3 1 d e w u l fe ta l ( 1 9 9 7 ) 高树红，邱蔚然( 1 9 9 9 ) 2 4 王树庆等( 1 9 9 9 ) 【2 5 】 顾晓波，王吕禄( 2 0 0 1 ) 1 2 1d 核糖生产菌株的选育 1 2 1 1d ，核糖的生物合成及相关代谢途径 用于d 核糖合成的芽孢杆菌转酮酶( t k t ) 缺失突变株的筛选建立在对 磷酸戊糖途径( h m p ) 的认识基础之上，h m p 及其相关途径见图1 - 2 【2 ”。该 途径可分为氧化阶段和非氧化阶段：在氧化阶段中，6 一磷酸葡萄糖经脱氢、 脱羧生成5 一磷酸核糖，参加核酸代谢和组氨酸生物合成；在非氧化阶段中， 磷酸戊糖分子重排，产生不同长度的磷酸单糖，可进入糖酵解途径和三羧酸 循环，其中赤藓糖+ 4 一磷酸与糖酵解的中间产物一磷酸烯醇式丙酮酸是合成芳 香族氨基酸的前体。从图l 一2 中可以看出，要使微生物积累d 一核糖，必须使 d 一核糖一5 一磷酸以下的代谢发生阻断，使d 一核糖5 磷酸积累，脱磷酸成d 一核 3 拍 如 记 他 跖 他 他 他 圳 攒 他 记 他 刚鬲 糖分泌于培养基中，并解除此中间体的反馈抑制。有两种酶缺失可以达到这 一效果，一种是催化5 - 磷酸核糖与5 磷酸木酮糖反应生成7 一磷酸景天庚酮糖 的转酮酶( t k t ) ，另一种是催化5 磷酸核酮糖异构化为5 - 磷酸木酮糖的5 一磷 酸核酮糖一3 一差相异构酶( r p e ) ，或者两种酶都缺失。 图1 - 2d 一核糖的生物合成途径 在d 核糖生物合成途径中包括葡萄糖酸途径( 即d 葡萄糖经葡萄糖酸到磷 酸戊糖) 见图1 - 3 ，该途径可能也是菌种选育高产d 核糖的出发点之一。 d - 葡萄糖 苎竺! 些墨竺 ，d - 葡萄糖酸 j 葡萄帮澈酶l 韧萄槠酸撖酶 d - 葡舀糖一6 磷酸 ! ：竺竺兰! 竺竺苎竺 ，6 磷酸。d 萄糖酸 0 审磷酸葡铺糖酸旋氢酶 d 。核酮糖，5 磷酸 0 5 一磷酸核鞲异杓酶 d 。核糖5 磷酸 l d 核糖 图1 - 3d 核糖的葡萄糖酸途径f 卅 1 2 1 2d 一核糖生产菌株应具备的主要特征 转酮酶缺失突变株最早于1 9 6 9 年由j o s p h s o n 等 2 8 1 在研究h m p 途径的代谢 天津科技人学删! f 学位论文 规律时从大肠杆菌中获得，但该菌株并不积累d 一核糖。其后，e i d e l s 等口w 报道， 以鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) 为亲株，选育出的转酮酶缺失突 变株也不能积累d 核糖。这些具有转酮酶缺陷的革兰氏阴性菌都缺乏合成庚糖 的能力，而庚糖是细胞外膜糖脂的组成部分，结果造成这些突变株具有不完整 的细胞表面，进而影响其代谢 2 9 _ 3 0 】。多年的研究证明，只有枯草芽孢杆菌和短 小芽孢杆菌的转酮酶缺失突变株才能够大量积累d 核糖。 另外，要使微生物大量积累d 一核糖还应当增加d 一核糖前体物的合成，即 增加d 一葡萄糖脱氢酶和d 一葡萄糖酸激酶的活力。d 一葡萄糖脱氢酶是d 一核糖 合成途径的调节酶，催化由d 葡萄糖至d 一葡萄糖酸的不可逆反应，其活力大 小决定了d 一核糖产量高低。据报道【”】，芽孢杆菌中的d 一葡萄糖脱氢酶与芽孢 形成有关，在芽孢形成过程中被诱导产生。在野生型枯草芽孢杆菌中，该酶 是在芽孢形成的第四阶段合成的，它仅存在于微生物产芽孢前期，细胞生长 的其它阶段不存在。然而，从枯草芽孢杆菌中分离得到的d 一核糖高产菌株， d 一葡萄糖脱氢酶的合成不受抑制，能够独立存在于营养细胞中。s a s a j i m a 等 人【3 1 j 的实验也证实了这一点，他们对d 一核糖生产菌株进行反复诱变处理，在 维持转酮酶缺失的情况下，寻找高d 葡萄糖脱氢酶活力和丧失芽孢生成能力 的突变株，选育出一株d 核糖产量为7 0 l 的高产菌株。 在d 核糖合成途径中，d 葡萄糖酸激酶也非常重要，提高该酶活力也能 够提高d 一核糖产量。1 9 9 2 年，m i y a g a m a 等人【3 2 】从一个芽孢杆菌属的染色体 中分离到操纵子，克隆到表达载体中，将操纵子的调节基因去掉或用一个更 强的增强子序列代替原有增强子，用这种质粒转换产d 一核糖和d 葡糖酸的枯 草芽孢杆菌i f o - - 1 5 1 3 8 ，以1 6 0 9 l 葡萄糖为底物时d 核糖的产量由3 9 l 提高到6 2 9 l 。 除此以外，还可以选育不能利用d 葡萄糖酸、l 阿拉伯糖、d 木糖、d 一 核糖的突变株。由于这些碳水化合物只能经过h m p 途径进行代谢，如果转酮 酶缺失，势必阻断h m p 代谢途径，菌体自然也就不能利用这些物质生长。可 以选育耐高浓度d 一核糖突变株，d 核糖对这类菌株的反馈抑制较弱，因而它 们能够大量积累d 一核糖。可以选育丧失芽孢形成能力的突变株。芽孢形成将 改变微生物体内酶的种类和数量，影响其正常代谢活动，而且会影响d 一核糖 合成关键酶一d 一葡萄糖脱氢酶和d 葡萄糖酸激酶的活力，丧失芽孢形成能力 将有利于d 核糖的积累。 1 2 2 转酮酶缺失突变株的基因多效性 微生物发酵法合成d 一核糖的转酮酶缺失突变株不仅不能利用磷酸戊糖途 径中的分解代谢产物作碳源，还需要在培养基中加入生长所需要的芳香族氨 1 、前若 基酸。此外，d 核糖产生菌显示出其它生理特性，这与转酮酶缺陷有基因多 效性相关。 l ，2 21 依赖烯醇式丙酮酸的磷酸转移酶系统的缺陷 转酮酶缺失突变株不能利用d 葡萄糖作为唯一碳源，突变株优先利用培 养基内的其它物质作为其生长和代谢所需的碳源与能源，然后才能代谢d 一葡 萄糖合成d 一核糖。研究表明 3 3 , 3 4 ，这是由于烯醇式丙酮酸( p e p ) 依赖型的磷酸 转移酶系统是缺陷的，特别是p e p 的d 。葡萄糖磷酸转移酶系统的酶i i ( 磷酸 组氨酸蛋自一己糖磷酸转移酶) 的转移功能是缺陷的。 1 2 2 2 去调节的碳代谢物阻遏 在转酮酶缺失突变株中，降解代谢d 甘露醇的酶f d 甘露醇烯醇式丙酮酸 磷酸依赖的磷酸转移酶系统，d 一甘露醇1 一磷酸脱氢酶) 的合成被d 。葡萄糖、 d 一葡糖酸、d 木糖和l - l j g 拉伯糖高度阻遏。相反，转化d 山梨醇的酶f d 一山 梨醇透过酶、d 山梨醇脱氢酶) 和转化甘油的酶( 甘油透过酶，甘油激酶，甘 油脱氢酶) 的合成对d 葡萄糖的阻遏不敏感。这种阻遏酶合成的不同敏感性 与转酮酶缺失突变株中细胞表面结构的缺陷有关。核糖醇胞壁酸的合成可能 被干扰，大概是由于胞壁酸是d 核糖一5 磷酸的衍生物【3 5 】。 枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株a t c c 2 1 9 5 1 能生长在d 葡萄糖加d 葡 糖酸，d 木糖，l - n 拉伯糖，d 木糖醇或d 一半乳糖的培养基中，证明浚菌株 对葡萄糖的降解代谢物阻遏不敏感。而转酮酶未缺失的b s u b t i 拯a t c c 6 0 5 1 在相同的双基质中培养，却发生二次生长现象。究其原因，可能是b s u b t i l i s a t c c 2 1 9 5 1 能将d 葡萄糖经由h m p 氧化支路转化成d 核糖。胞内的d 果 糖一l ，6 - - - 磷酸的浓度太低不至于弓i 发分解代谢物阻逯1 3 6 】。 1 2 2 3 细胞膜与细胞壁成份的变化 转酮酶缺失突变株的细胞壁在生长过程中逐渐变厚，在对数生长期中形 成细胞链，而亲本仍保持瘦长，菌体形态变化清晰可见。突变株对噬菌体s p 0 1 和s p l 0 更敏感。转酮酶缺失突变株是非运动型的( 无鞭毛) ，溶菌过程比亲本 慢得多。芽孢形成率大大降低1 3 7 1 。 鉴定和分离回复突变株证明，基因多效性只发生在转酮酶缺失突变株中。 膜成份的化学变化研究揭示了亲本与突变株闯膜蛋自的s d s 聚丙烯酝胺凝胶 电泳与膜脂的薄层层析的差异。由于启动细菌芽孢生长的磷酸化核苷酸是由 细胞膜上的酶合成的，不正常的膜组成可用来解释突变株不产芽孢的特性1 3 4 】。 1 3d 核糖的应用 d 一核糖是m r n a 、t r n a 、r r n a 等各种核糖核酸和核糖体的组成成份， 存在于所有动物、植物和微生物细胞之中，具有十分重要的生理意义【1 】。其 6 灭；# 科技人学坝l j 学位论文 还原型衍生物核糖醇作为维生素b ：及细胞壁重要成分一磷壁酸的组成成份， 也具有非常重要的生理作用。 7 0 年代以来，d 一核糖最先被用于半合成法生产维生素b ! ，进入9 0 年代， 随着d 核糖生产i ：业的发展及其应用研究的深入，人们逐渐认识到d 核糖在 食品工业、医药工业等方面都具有非常广阔的应用前景。 1 3 1d 核糖在食品工业中的应用 在食品工业中，d 一核糖可用于生产核苷酸类风味增强剂，如5 7 肌苷酸、 5 7 鸪苷酸等，与普通风味增强剂相比，这类物质具有更强的增味效果【3 8 “】。 此外，利用d 核糖与其它原料可以合成多种食用香精，这些香精可以用于果 汁、饮料、冰淇淋、果酱、巧克力、蛋糕、罐头等食品的生产加工中。 1 3 2d 核糖在生化工程中的应用 d 一核糖可作为生产某些高附加值生物制品的碳源。例如，它可以用于发 酵法生产景天庆酮糖，该方法采用转酮酶缺失突变株利用葡萄糖为碳源生产 景天庚酮糖，但产率较低，若同时加入d 一核糖，则可以提高产率，使发酵液 中景天庚酮糖的积累量达到2 0 9 l f 4 “。 1 3 3d 核糖在医药工业中的应用 1 3 3 1 半合成法生产维生素b 2 d 一核糖是维生素b 2 的重要合成原料。维生素b 2 ( 化学名为核黄素， r i b o f l a v i n ) ，是动物生长发育的必需因子，人体不能合成，必须从外界摄取， 人体缺乏时易患神经性疾病和皮肤病，如口角炎、舌炎、眼结膜炎等。维生 素b 2 广泛地应用于医药、食品、化妆品和饲料工业上。以d 一核糖为原料半合 成法生产维生素b 2 是目前世界上最经济也是最先进的生产方法。据报道【4 2 j ， 采用半合成法生产维生素b 2 的成本一般为2 6 0 2 8 0 元k g ，比直接发酵法能降 低成本2 0 。 1 3 3 2d 一核糖的医疗作用 d 一核糖本身具有一定的医疗作用，如护心、养心、缓解心血管病变疾病 ( 高血压、冠心病等) 造成的心脏受损的病情等【4 3 1 。d 一核糖能加速心肌中a t p 的合成，使因心肌梗塞、心脏缺血受到损伤的心脏中a t p 含量不再下降，细 胞损伤也大大降低。通过摄取d 核糖维持心肌中a t p 的高水平，可以促进受 损的心脏恢复丁f 常。同样，当运动员及其他体力消耗大的人群进行耗能运动 时，体力上的压力可以使心脏和骨骼肌中的核苷酸( a t p 、a d p 和a m p ) 大量 流失，d ，核糖能够及时代谢成为5 一磷酸核糖1 一焦磷酸盐( p r p p ) ，补充缺失的 核苷酸，满足肌肉对a t p 的需要。 d - 核糖还可用于治疗运动引起的肌肉酸痛：肌腺苷脱氢酶缺失引起的肌 1 、前高 肉僵硬以及细胞内缺乏磷酸化酶引起的肌肉疼痛等症状。同时，d 。核糖还可 以增强维生素c 的生物活性，与其共同作用，可提高人体免疫系统活力i 4 。 因此，在临床上，d 一核糖可被用作辅助治疗心脏局部缺血、，t l , 肌梗塞等疾病。 实验证明【4 ”，在短期内服用d 核糖对人体淋巴细胞的增殖没有影响。 1 ，3 3 3 合成多种新药 由于d 一核糖具有的特殊立体分子结构，使它成为制备多种药物的前体物。 如合成类固醇、前列腺素类物质、维生素d 的结构类似物、萜类化合物以及 修饰的芳香族氨基酸、凝乳酶抑制因子等。二萜类药物一红豆杉醇是卵巢癌 化疗的必需品，利用d 一核糖可以通过简便的方法合成该类药品【4 6 】。二羟二肽 等配物作为血管紧张肽抑制剂被用于治疗高血压等疾病，在医学界受到普遍 关注。但其在合成过程中由于手性中心的影响，产生很多非对映体，使产物 成为多种非对映体的混合物，利用d 一核糖的手性中心，可以很容易地解决这 一药物合成中的问题【4 7 j 。 d 一核糖还可用来合成抗病毒和抗癌药物，如间型霉素、吡唑呋喃菌素以 及它们的些关键中间产物的结构类似物。软海绵素是一种强效抗癌药，但 这种海洋大环内酯聚酯很难从自然界中获得，而d 一核糖所具有的同源手性五 元环，可以帮助合成软海绵素的具有3 2 个不对称碳原子的骨架【4 8 】。 1 4d 核糖的检测 目前d 一核糖的检测方法主要有两种：第一种方法是根据苔黑酚与五碳糖 的显色反应原理，利用标准样品建立对应关系测定d 核糖，其测定结果是所 有血碳糖的总和，这是一种广泛使用的检测方法，其操作相对简单，检测成 本也较低，但当发酵残液中葡萄糖含量商及培养基中玉米浆含量高时，所得 结果会略高；第二种方法是高效液相色谱法，通过离子色谱柱或氨基色谱柱 进行分离，使用示差折光检测器检测，这是一种现代化的检测手段，其结果 准确，不受杂质干扰，但样品的处理稍复杂，检测成本高，当需要检测大量 样品时不宜采用。张津枫等【4 9 j 曾对高效液相色谱检测d 核糖的条件进行了研 究，确定了基本色谱操作参数，包括保留时间、柱温、流速等，并在检测发 酵液中d 一核糖含量时比较了苔黑酚法与色谱法。 1 5 国内外d 核糖生产现状及应用 国际上d 核糖生产以日本最为领先，从七十年代起日本就丌始研究利用 细菌发酵合成d 核糖，目前其工业化发酵合成d 一核糖使用的是芽孢杆菌属的 短小芽孢杆菌突变株，其发酵水平达到以1 5 葡萄糖为原料，发酵结束后发 酵液中的d 一核糖含量为7 0 8 0 l 的程度，原料转化率达5 3 6 0 ，并已开始 了以淀粉为原料发酵法生产d 一核糖的研究。随着d 核糖发酵技术的日益发 天津科技大学坝 学位论文 展，世界上由发酵法生物合成的d 核糖年产量已超过2 0 0 0 t ，国际市场价格 为3 0 $ k g 。 我国在九十年代才开始微生物发酵法合成d 核糖，目前其发酵7 2 h 后摇 瓶最高产量达8 1 7 5 9 l ，提取收率7 6 以上，随着d 一核糖作为药物用于抗癌 制剂，改性核苷抗病毒制剂等研究应用，其市场前景广阔。 目前国内进行d 核糖工业化生产的企业主要有：天津太河制药有限公司、 江苏宏达集团有限公司、杭州达康化工有限公司、郑州拓洋生物制品有限公 司等，这些企业的发酵水平一般在5 0 9 l 左右，所得产品有两种：9 9 食品级 d 一核糖和9 9 9 以上分析纯d 一核糖，前者价格为4 0 $ k g 左右，后者则高达 6 0 0 $ k g a 1 6 生物合成d 核糖存在的主要问题 目前，国内对代谢突变株生物合成d 核糖的研究主要集中在以下几个方 面：添加物对d 核糖发酵的影响( 无机离子、碳源、前体物质及芳香族氨基 酸等) ；培养条件的研究( p h 值、溶解氧等) ；培养方式的探索( 分批发酵、 补料发酵等) 以及d 核糖的提取精制( 树脂脱色、树脂脱盐、结晶) 等。应 该说国内的研究日趋深入和全面，利用发酵过程优化原理，以提高d 一核糖产 率为目标，围绕高产率、高生产效率、低成本的相对统一做了大量工作，但 目前d 核糖的生物合成仍存在以下问题： 1 、发酵水平有待提高：目前，日本工业化发酵生产d 核糖使用的菌种是 芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) 突变株，其发酵水平如前所述。而我国 工业化生产中发酵液d 核糖产量仅有5 0 9 l 左右，转化率为2 6 左右。由此可 见，提高d 核糖发酵生产水平，是目前我国医药、食品工业亟待解决的重要课 题之一。 2 、发酵过程操作与发酵参数的确定：生物法合成d 一核糖国内外已有许 多报道，多数集中在菌种选育及发酵工艺方面，对d 核糖发酵过程中的特殊 现象没有进行深入的考察。如溶解氧浓度、p h 值如何影响d 核糖的发酵， 能量代谢在发酵过程中所起的作用等。 3 、发酵机理的探讨：在利用微生物发酵法合成d 核糖的生化反应过程 中，通常采用条件优化的方式来得到最佳发酵条件，以便获得最高产量的最 终代谢产物。但微生物在正常代谢的情况下，一般不过多地积累代谢产物。 为了使微生物过量合成某种有用代谢产物，需要在进一步确定代谢过程中各 种关键酶的基础上，探讨提高某些酶活性的具体措施，并研究d 一核糖产生菌 的生理特性与转酮酶缺失突变株的独特性对d ，核糖合成途径及酶系的影响。 4 、新方法新理论的应用：单单采用优化发酵条件、菌种选育等手段来提 1 、前言 高产量，存在着定向性差、工作量大等缺陷。为了更深入研究微生物体内代 谢规律，有目的地采取措施指导微生物过量合成代谢终产物，有必要应用多 学科知识，采用新方法、新理论进行研究。 1 7 代谢工程简介 微生物的生理代谢活动涉及由多种代谢途径组成的网络，其中有上千种 酶参与，这些酶的活性在野生型菌株中受到严格的控制，为了适应环境，它 们能及时调整自身的生理代谢机能，使之合理的利用养分，以求生存。在自 然界中，微生物从不过量合成些它所不需要的物质，因此，过量合成某些 化合物对生产菌来说是一种病态过程，其固有的调节机制随时可能恢复 到有利于其生长繁殖的方向上来，这可能是生产菌种经多次传代，其生产性 能容易蜕变的原因之一。如果人们掌握了微生物内在的调节规律、各种生理 机能、代谢网络的调控机制，便能操纵微生物，充分满足生产菌种过量合成 某些代谢产物的环境需求，让它始终按人们需要的方向发展。 代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 作为研究改造代谢途径、改善微生物 性能、提高代谢终产物产量的- f 新兴学科。已被广泛应用于微生物过量合 成代谢产物这一领域中来【。代谢工程又称途径工程，是基因工程的一个重 要分支( 关于代谢工程的不同表述见表1 3 ) 1 5 u 。其目标是有目的地对细胞代 谢进行操作，生产有价值的产品。作为- f l 学科，它包括途径分析、评价和 控制体系，其理论中心就是将每个反应当作网络的一个环节而不是单个的反 应舻引。它的研究多集中在一些小分子上，如只有十多个碳的儿茶酚( 合成香 草的前体) 到几百个碳的抗生素。因为合成小分子往往要经过更多的反应步 骤，所以代谢工程常需要同时对一个和多个反应进行操作，包括采用基因工 程在内的多种方法和技术。它与生物化学、遗传学、分子生物学、细胞生理 生化、化学工程及系统分析等学科相互渗透，逐步趋于完善。 近几年来，代谢工程学科得到迅猛发展。1 9 9 1 年左右处于资料积累阶段， 1 9 9 6 年在美国召开了第一届代谢工程大会，至今已举办三届。美国著名的生 物技术杂志b i o t e c h n o l o g yb i o e n g i n e e r i n g 和b i o t e c h n o l o g yp r o g r e s s 分别在 1 9 9 8 年和1 9 9 9 年出版了有关代谢工程的专辑。专门登载代谢工程方面论文的 期刊m e t a b o b c e n g i n e e r i n g 也于1 9 9 9 年创刊发行。 代谢工程的应用领域主要有：提高细胞已有的代谢产物的产量：生产细 胞本身不能合成的新物质；扩展细胞的底物利用范围；产生降解毒性物质的 新催化活性；修饰细胞的其它生物学性状。研究方法有：详细生理学研究、 代谢通量分析( m f a ) 5 3 , 5 4 1 、代谢控制分析( m c a ) 5 5 , s 6 1 、生化系统理论 5 7 s s 、 动力学模型【5 9 1 和途径热力学分析方法f 5 9 1 。随着代谢工程与各种学科知识的融 i o 灭律科技人学坝j 学位论义 合，越来越多的研究方法和策略被应用于代戮工程的研究。如利用分予生物 学手段构建基因，改造物种；用牛化分析及检测手段来评价改造生物的功能： 通过数学及计算机手段模拟、设计及预测改造生物的功能等。 表1 - 3 代谢一l ：程的不同表述方法 名称 途径i 槔 ( m i c r o b i a lp a t h w a ye n g i n e e t i n g ) 代i 勇j 上群 ( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 代谢途径工程 定义 ( m e t a b o l i cp a t h w a ye n g i n e e r i n g ) 代谢， 程 ( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 途释r 箨代谢设计 ( p a t h w a ye n g i n e e r i n g ，m e t a b o l i cd e s i g n ) 代谢。程 ( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 代谢，i 稃 ( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 代谢，i v _ 程 ( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 利用d n a 重组技术修饰各种代谢途径( 包括生物 体t p , 誊i 有的代谢途径) ，提高特定代游物的产嚣。 利用d n a 重组技术优化细胞的酶活、运输和调控 功能，提高细胞活力 生化途径的修饰、设计雨i 构建 利用d n a 重组技术对代谢进行目的性修饰 改造细胞代谢途衽，提赢夭然最终产物产量或台成 新产物( 包括中间产物绒修饰型最终产物) 对生化反应的代谢网络进行目的性修饰 为达刘所需目标对活细胞的代谢途径进行修饰 利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理 的遗传修饰战略从而优化细胞生物学特性 1 8 代谢通量分析 1 8 1 代谢通量分析简介 在代谢工程研究中一个重要内容是尽可能弄清细胞中的代谢网络，确定 整个代谢网络的通量分布，进而通过基因重组技术改变代谢流、扩展和构建 代谢途径；或者由细胞合成和分解代谢，了解到其代谢需求，合理设计培养 基，选择培养方式，进行下一步研究。这一工作称之为对细胞胞内进行代谢 流分析。目前，能够定量阐明代谢流的方法主要有以下几种：同位索示踪法 ( 放射性元素测量或核磁共振技术) 【6 0 1 、代谢通量分析【6 。l 和基于代谢信号图 的代谢流分析 “ 。在测定胞外物质变化的基础上，通过细胞内各种生化反应 的化学计量可以计算出胞内各物质的流量分配，最终得到一个包括由各相关 反应组成的完整代谢途径以及各代谢物在稳定态时流量精细分布的代谢流 1 、前言 图。该图既能显示出某一时刻某一条件下各代谢途径在整个代谢过程中对底 物利用和产物形成的贡献，又可以通过比较不同条件下或不同突变株的代谢 分配情况，确定整个代谢途径中具有特殊地位的途径或反应，因此对理解细 胞的许多生理特性也大有帮助。要提高微生物某一方面的代谢和细胞功能， 应从整个代谢网络的反应而不是个别反应来考虑，重点应放在代谢流的放大 或代谢流量的重新分配上。 代谢通量分析的基础是质量守恒( c o n v e r s a t i o no fm a s s ) 和准稳态假设 ( p s e u d o 。s t e a d y s t a t e ，p s s ) ，准稳态假设就是指由于胞内反应周转速度特别 快，假设胞内代谢物没有积累，均处于稳定状态，浓度变化为零。除此以外， 还有一个重要前提是要具备表示底物转化为代谢产物及生物体自身组成详细 过程的化学计量式，也就是在整个发酵过程中涉及的全部生化反应，反应系 数就是化学计量系数。把所有这些与菌体细胞组成、底物消耗速率方程、产 物副产物生成速率方程、维持能量需求等信息结合起来，构建化学计量模型。 图1 4 为通量分析的简单图解。 图1 - 4 代谢通量分析示意图 进行代谢通量分析的作用主要有以下几个方面： 1 、判断节点刚柔性：比较不同条件下的通量分布，若在某一节点处流量 变化很大，说明是挠性节点，可对之进行设计、改造：若无变化则说明是刚 性的，不能对其进行改变；若有变化，但变化微弱，则为弱刚性，介于刚性 和挠性之间。 2 、确定不同分支途径的存在：对许多菌体而言，我们并不清楚代谢途径 计量关系的细节知识，而且许多细胞中含有很多别构酶，其功能不明。计算 不同的胞内途径通量，就可以确定哪一条途径最有可能存在，或者得到不同 别构酶途径的功能信息。 3 、验证其它途径对代谢网络通量分斫i 的影响；人类需要最大限度生产目 的产物，与之相联系，代谢通量分析可以确定增加转化率或通量的几个约束 条件。例如：插入消除新途径或别构酶能否增加目的产物通量。 4 、计算最大理论转化率：假设没有菌体生长和多余副产物，碳源以最大 可能转化为产物，此时的转化率为最大理论转化率。以计量系数为模型，如 果指定所给约束条件，就可以计算出给定代谢物的最大理论转化率。 1 8 2 代谢通量分析理论 对于所有胞内反应：d x d t = r m x 一一胞内代谢物的浓度 卜一胞内代谢物的净转化速率 代谢物进行胞内外运输的净传输速率 由准稳态假设可知： r = o 即r = - z 对那些与环境有交换的小部分物质，如底物、产物、c 0 2 、h 2 0 等，等式依 然成立；而对于大部分留在胞