（食品科学专业论文）豆渣曲制备工艺及其提取物抗氧化性研究.pdf

i 。 豆渣是大豆制品加工中的主要副产物，占全豆干重的1 5 2 0 ，并含有丰 富的蛋白质等生理活性物质。米曲霉是生产酱油等发酵的重要微生物，且具有多 种酶系。本文研究以豆渣为基质，制备豆渣曲，并利用豆渣曲中多种酶水解曲料， 以获得具有抗氧化的活性提取物，为揭示酱油的抗氧化性奠定基础。研究得到的 以下主要结论： 1 优化了以豆渣和麸皮为基质的固态发酵条件：在3 0 ，麸皮豆渣比为1 ：9 ， 培养时间为4 8 h ，接种量为0 1 5 ，水分含量为5 0 水分，米曲霉在此条件下， 生长较好，米曲霉蛋白酶活力达到3 2 8 3 u g 。同时考察了添加葡萄糖和硫酸铵可 以提高豆渣曲的蛋白酶活力。 2 利用豆渣曲自身酶系水解曲料可获得具有较强抗氧化的提取物，添加纤维 素酶和果胶酶可以有效提高抗氧化生理活性物质溶出。直接提取：提取时间为 3 h ，提取温度：4 0 ，固液比为l ：2 0 ，在此条件下，测得豆渣曲蛋白质溶出率为 6 9 。分子量大多小于1 0 0 0 ，大部分为二肽、三肽及氨基酸。外加纤维素酶提取 条件为：加酶量为0 3 9 l ，提取温度为4 0 ，固液比为1 ：2 5 ，提取时间为4 h 。 在此条件下，测得豆渣曲蛋白质溶出率为7 7 3 ；外加果胶酶提取抗氧化液最优 条件：固液比为l ：2 0 ，提取温度为4 5 ，提取时间为4 h ，加酶量为l g l 。提取 液的抗氧化活性分别为：0 2 0 m l 提取液清除d p p h 能力为6 7 5 ，3 0l ll 提取液 清除a b t s + 能力为7 2 1 。 3 外加纤维素酶和果胶酶，不同程度的提高曲料中小肽，多酚，多糖以及 黄酮抗氧化物质溶出速率和溶出量，从而提高了提取液的抗氧化能力，其中果胶 酶效果最好，制得提取液具有最高的抗氧化活性。当含有7 5 m g m l 多肽，1 4 m g m l 多糖，多酚含量为2 0m g m l ，以及6 5i ig r r a 黄酮，具有清除a b t s + 和d p p h 自 由基的i c 5 0 分别是2 1 5i ll 和0 2 1 m l ，0 1 m l 的提取液就具有4 9 2 的羟基自由基 清除能力，而邻苯三酚半数抑制率i c 5 0 为0 4 9 m l ，0 2 m l 其还原能力就很强，还 原产物吸光值就达到0 7 2 3 。 关键词：曲豆渣抗氧化活性米曲霉 a b s t r a c t s o y b e a nr e s i d u e ，t h em a i nb y - p r o d u c to fs o yp r o d u c t s ，i sn o to n l ya c c o u n t i n gf o r 15 0 旷2 0 i nd r i e ds o y b e a n , b u ta l s or i c hi np r o t e i na n dp h y s i o l o g i c a la c t i v ee l e m e n t s a s p e r g i l l u so l y z a ei s au n i v e r s a ls t r a i ni nt r a d i t i o n a lf e r m e n t e di n d u s t r y , w h i c h c o n t a i nc o m p l e x e d e n z y m e s u s i n gs o y b e r nr e s i d u ea sr a wm a t e r i a l ，k o j iw a s p r o d u c e db yf e r m e n t a t i o no fa s p e r g i l l u so r y z a e t h ec o m p l e x e n z y m e sf r o m a s p e r g i l l u so r y z a ew e r eu s e dt oh y d r o l y z ek o j i ，a n t i - o x i d a n te l e m e n t sw a so b t a i n e d i nt h i s p a p e r , u s i n gs o y b e a nr e s i d u e a sam e d i u m ，k o j ii s o b t a i n e d ，a n dt h e n h y d r o l y z et h ek o j it oo b t a i nt h ea n t i - o x i d a n te l e m e n t s t h er e s u l t sc o n c l u d e df r o m e x p e r i m e n t sw e r ea sf o l l o w s 1 o p t i m i z e dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no fe n z y m eb ya s p e r g i l l u s o r y z a eu n d e rs o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw e r eo b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sa sf o l l o w e d ：a t3 0 ，w h e a tb r a n ，b e a nd r e g sr a t i o1 ：9 ，i n c u b a t i o nt i m e 4 8 l l ，i n o c u l u md o s a g e0 15 ，m o i s t u r e5 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o l l 8 ，t h ep r o t e a s e a c t i v i t yr e a c h e d3 2 8 3 u g i na d d i t i o n ，g l u c o s ea n da m m o n i u ms u l f a t ec a ni n c r e a s e t h en e u t r a lp r o t e a s ea c t i v i t yo ft h ek o j i 2 b yt h ek o j ia u t o l y s i s ，t h ee x t r a c t 、) l ，i ma n t i o x i d a n t sw a so b t a i n e d w h e n t e m p e r a t u r ei s4 0 ，t h es o l i d l i q u i dr a t i oi s1 ：2 0 ，t h eh y d r o l y s i st i m ei s3 h ，t h e d i s s o l u t i o nr a t eo fp r o t e i nw a s6 9 p o l y p e p t i d e sa r em o s t l yl e s st h a n10 0 0m w t h e yw e r et r i - p e p t i d e s ，d i p e p t i d e sa n da m i n oa c i d s t h ec e l l u l a s ea n dt h ep e c t i n n a s e w e r eu s e dt oi m p r o v et h ea n t i o x i d a n tc o m p o n e n t s t h ed i s s o l u t i o nr a t eo fp r o t e i nw a s 7 7 3 ，a tt h ed o s a g eo fc e l l u l a s e ：o 3 9 l ，t e m p e r a t u r e ：4 0 ，t h es o l i d - l i q u i dr a t i oo f 1 ：2 5f o r3 h ；0 2 m lo ft h ee x t r a c tc a ns c a v e n g e4 9 2 d p p h f r e er a d i c a l ，3 0i ilc a n s c a v e n g e7 2 1 a b t s + ，a ta m o u n to fp e c t i n n a s ea d d e dlg l ，s o l i d - l i q u i dr a t i oo f k o j it ow a t e r1 ：2 0 ，t e m p e r a t u r e4 0 c ，f o r4 h 3 t h ea d d e dc e l l u l a s ea n dp e c t i n n a s ec a ni n c r e a s e dt h ee x t r a c tr a t ea n dc o n t e n t o f a n t i o x i d a n tf r o mt h ek o j i ，a n dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f t h ee x t r a c ti m p r o v e d a s p e c t i n a s ew a sa d d e d , t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fe x t r a c t a r et h eb e s t t h ee x t r a c t c o n t a i n e d7 5m g m lp o l y p e p t i d e s ，1 4 m g m lp o l y s a c c h a r i d e ，2 0 m g n dp o l y p h e n o l ， 6 5l ig m 1f l a v o n e s ，w h i c hh a sh i g ha n t i o x i d a n ta c t i v i t i e si nd i f f e r e n ts y s t e m , t h e j l ：钿w e r e2 1 5pl ，0 2 1 m la n d0 4 9 m li na b t s + ，d i p p h f r e er a d i c a la n dp y r o g a l l i c a c i da u t o o x i d a t i o ns y s t e m ，r e s p e c t i v e l y 0 1m lo ft h ee x t r a c tc a ns c a v e n g e d4 9 2 o h f r e er a d i c a l ，a n dt h er e d u c ep o w e rr e a c h0 7 3 2w i t h0 2 m lo f t h ee x t r a c t 。 k e yw o r d s ：k o j is o y b e a nr e s i d u e s a n t i - o x i d a t i o n a s p e r g i l l u so r y z a e h 目录 摘要l a b s 仃a c t i i 目j i 乏i 1l 者论1 1 1 豆渣的研究现状1 1 2 豆渣功能性物质简介1 1 3 抗氧化性介绍2 1 4 米曲霉发酵法制备抗氧化物质3 1 5 立题依据及意义3 1 6 本论文研究主要内容3 2 材料与方法。5 2 1 主要材料5 2 2 主要仪器。5 2 3 豆渣曲制备及多肽、抗氧化液提取工艺流程5 2 4 以豆渣与麸皮为基质制各豆渣曲5 2 4 1 制备种曲5 2 4 2 制备豆渣曲。5 2 4 3 豆渣曲蛋白酶活力测定5 2 5 豆渣曲提取蛋白质和抗氧化物研究6 2 5 1 豆渣曲，外加纤维素酶、果胶酶提取蛋白质和抗氧化物的影响6 2 5 1 时间对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响6 2 5 2 温度对对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响6 2 5 3 固液比对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响7 2 6 玎? l c 测定小肽分子量分布7 2 7 抗氧化能力测定方法7 2 7 1d p p h 自由基清除能力的测定7 2 7 2a b t s 自由基清除能力的测定8 2 7 3 羟自由基( o h ) 清除能力的测定【4 3 1 。8 2 7 4 抑制邻苯三酚自氧化速率m 8 2 7 5 提取液还原能力测定【4 卯8 2 8 豆渣抗氧化成分的测定方法9 2 8 1 蛋白质及多糖的测定9 2 8 2 黄酮的测定方法f 4 刀9 2 8 3 多酚的测定方法：9 3 结果与讨论ll 3 1 豆渣的基本组成成分1 l 3 2 豆渣曲的制备研究l l 3 2 1 单因素实验l l 3 2 1 1 培养基组成及培养时问对酶活的影响1 1 3 2 1 2 培养基水分对产酶酶活的影响1 2 目录 3 2 1 3 接种量对产酶酶活的影响1 2 3 2 2 添加葡萄糖和硫酸铵对产酶酶活的影响o 1 3 3 2 2 1 添加葡萄糖对产酶酶活的影响1 3 3 2 2 2 添加硫酸铵对产酶酶活的影响1 4 3 2 3 正交实验及结果分析1 4 3 3 豆渣曲提取可溶性多肽及和提取液抗氧化性研究。1 5 3 3 1 不同酶对豆渣曲蛋白质溶出率和提取液抗氧化性研究1 6 3 3 2 豆渣曲提取蛋白和提取液抗氧化性研究16 3 3 - 3 豆渣曲水解液小肽分子量分布1 9 3 3 4 外加纤维素酶、果胶酶提取蛋白质和提取液抗氧化性研究2 l ， 3 3 4 1 加纤维素酶量对蛋白质溶出率和提取液抗氧化性的影响2 1 3 3 4 2 提取时间对蛋白溶出率和提取液抗氧化性的影响2 2 3 3 4 3 提取温度对蛋白溶出率和提取液抗氧化性的影响2 2 3 3 4 4 固液比对蛋白质溶出率和提取液抗氧化性的影响2 3 3 3 5 正交实验2 4 3 3 6 添加果胶酶助溶提取研究。2 5 3 3 6 1 加酶量对豆渣曲水提取物抗氧化活性的影响2 5 3 - 3 6 2 提取时间对豆渣曲水提取物抗氧化活性的影响2 5 3 3 6 - 3 提取温度对豆渣曲水提取物抗氧化活性的影响2 6 3 3 6 4 固液比对豆渣曲提取液抗氧化活性的影响2 6 3 3 7 正交实验2 7 3 4 豆渣曲抗氧化成分分析。2 8 3 5 提取液抗氧化活性2 9 主要结论与不足3 3 致谢3 4 参考文献3 5 绪论 l 绪论 1 1 豆渣的研究现状 豆渣是豆腐、豆腐皮、腐竹、豆奶等大豆制品加工中的主要副产物，占全豆 干重的1 5 - 一2 0 。我国是大豆的故乡，每年大豆食品加工约耗用大豆1 0 0 0 万t ( 不包括油用) ，约生产2 0 0 0 万t 湿豆渣【l 】。豆渣作为大豆制品生产中的副产物， 长期以来仅作为饲料使用，附加值低，造成主产品成本高，经济效益低，困扰 着加工企业的发展。近年来，人们从营养学角度对其有了新的认识。根据研究表 明，干的豆渣中含有1 8 0 2 8 4 粗蛋白，9 3 1 0 9 脂肪、4 0 2 4 3 6 不 溶性纤维、1 2 6 1 4 6 可溶性纤维和3 8 5 3 可溶性碳水化合物f 2 3 】。国内 外已经开始综合利用豆渣开发功能性保健食品，如制取膳食纤维【4 】、粉末蛋白质、 大豆多糖【5 】等。此外豆渣中还含有一定的微量成分：如维生素、矿物质、异黄酮、 多酚类化合物等，经常食用豆渣能降低血液中胆固醇含量，还有预防肠癌、骨质 疏松症、抗肿瘤、抗氧化及减肥的功效【6 j 。 1 2 豆渣功能性物质简介 随着对豆渣的深入研究，发现豆渣富含其它产品无法比拟的、对人体有益的 功能性物质：大豆多肽、大豆低聚糖、大豆膳食纤维、大豆异黄酮等。这些特殊 成分具有延年益寿、延缓衰老、抗氧化、降血压、降血脂、抗癌等功能【_ 7 1 。从大 豆加工副产品豆渣中提取功能性物质，不仅有利于提高豆渣的综合利用，并且可 以增加企业的附加值，降低成本。 已有很多研究，采用化学、酶解、发酵的方法，从豆渣中提取多肽以及具有 各种生理活性功能的物质。主要有以下一些物质： 蛋白质：豆渣中含有2 0 左右的蛋白质，采用酶解，发酵提取豆渣中的蛋白 质，制备有生理活性和功能性的小肽。多肽具有易消化吸收性和低抗原，现代生 物代谢研究表明，人类摄食蛋白质经消化道酶作用后主要是以肽形式( 二肽、三 肽) 吸收，并且比氨基酸更易更快被机体吸收利用，同时多肽的低抗原性使食后 不会引起过敏反应；其中一些小分子多肽还能在一定程度上消除机体内多种生理 功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生，并且可以阻止食品的 氧化变质，提高食品稳定性和延长食品贮存期，因此可作为食品抗氧化添加剂和保 健食品因子，同时大量多肽能抑制血管紧张素转换酶a c e 的活性，降压和阻止 胆固醇水平升高【8 l 。 多糖：多糖是指由1 0 个或l o 个以上单糖聚合而成的一类生物大分子。随着 2 0 世纪7 0 年代后期对多糖研究的开展，发现部分多糖具有广泛的生物活性，加之 多糖本身低毒、来源广泛，已成为近年来的研究热点。各种多糖所具有的抗肿瘤、 江南大学硕士学位论文 免疫、抗凝血、降血糖、抗病毒和抗氧化等活性已相继被发现【9 ，0 1 。豆渣中国含 有大约5 0 的碳水化合物，是很好的制备多糖的来源。 黄酮类物质：异黄酮是一种生物活性物质，在大豆中含量丰富，大豆异黄酮对 人体具有多种生理功能，其自身不但具有抗氧化作用，还可以作为雌性激素治疗的 替代品用以改善妇女更年期综合症，并且还具有抗癌，防止心血管疾病，抗菌等多 种功能，是目前治疗心血管疾病的最佳原料药物【1 1 d 2 】。 多酚：亦称多元酚，是指分子量数百到1 0 0 0 左右，含有多个酚羟基的植物 成分。其中包括原儿茶酚、桔酸类、羟基桂皮酸类及其酯苷类衍生物、苯丙素和 异黄酮等，这些多酚物质都具有抗氧化活性、清除活性氧、金属离子螯合作用， 同时还发现可以抑制动物肿瘤、预防心血管疾病以及抗突变作用【1 3 1 。 膳食纤维：膳食纤维是指在小肠中不能被消化和吸收，在大肠中能部分或全 部被微生物发酵利用的植物性食品成分、碳水化合物及其类似物质的总和。上世 纪7 0 年代以来，研究发现，大量摄入膳食纤维( d f ) 含量高的食品与低的西方文 明病发病率有关的水平。近年来的研究表明，膳食纤维能调节血压、增加组织对 胰岛素敏感性等，甚至于严重威胁生命的结肠癌都与d f 的摄入量不足有关i l 引。 1 3 抗氧化性介绍 在人体生命活动过程中，存在多种生物化学反应，不管是酶促反应还是非酶 促反应，都会产生自由基。人体内比较重要的自由基有超氧自由基( 0 2 ) 、轻自 由基( n o ) 、氢过氧基( h 0 2 ) 、过氧化氢分子( h 2 0 9 、烷氧基( r o ) 、烷过氧 基( r o o ) 等。人体内自由基产生过多或是清除过慢，都会对人体造成严重伤害。 自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，能通过氧化作用攻击体内 的生命大分子，如核酸、蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、 交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织破坏和器官退化， 从而引起人体衰老【l 引。 因此，凡是能够清楚自由基和干扰自由基链式反应、清除活性氧的物质都可 以用作抗氧化剂。合成抗氧化剂已经在生产生活中广泛的应用，但是其生物降解 后，可能产生有毒有害物质，正日益限制它的应用。出于对健康的考虑，研究已 经转向天然抗氧化剂1 1 6 1 。 随着研究的深入，人们发现越来越多的天然抗氧化物质。蛋白质经酶解后得 到多肽，不仅有更好的营养性，更好的吸收性，同时由于蛋白质中的具有抗氧化 分子段暴露出来，更有利于发挥其抗氧化特性，这些小肽通常含有疏水性氨基酸 0 7 - 1 9 。而从不同食品中分离得到的多酚、黄酮，以及小分子的低聚糖等，也具有 2 绪论 很强的抗氧化性。这些物质在植物组织中，常常互相或者和其他物质结合在一起， 形成聚合物，而不溶于溶剂中，其提取率常常是非常低的! 采用不同的提取方法， 如酶解【2 0 】、超声口1 1 、发酵 2 2 之习等，降解聚合物，从而提取到这些高活性的抗氧 化物质。 1 4 米曲霉发酵法制备抗氧化物质 随着人们对健康的日益关注，合成抗氧化剂在食品生产中，应用将越来越少， 天然抗氧化剂将会得到更多的利用。在提取天然抗氧化剂的过程中，有直接提取 法【2 6 j ，酶水解法【2 7 捌，以及微生物发酵法 2 9 , 3 0 。直接提取法，有水提取法和有机 溶剂法，由于其提取率较低，现很少利用。酶水解法和微生物发酵法，是通过微 生物产生的酶或纯酶水解目标物质，降解提取出来。相对于酶水解法，微生物发 酵具有成本更低，并且能够产生多种酶系，是单一酶或是几种酶水解所不具有的 水解优势。 微生物生产的酶已有4 0 以上，而传统菌种如米曲霉生产的酶是很安全的 1 3 1 1 。已有许多研究表明，米曲霉固态发酵不同基质，并提取曲料中抗氧化物质获 得很好的效果。如m j g a r c i a - g 6 m e z l 3 2 】利用副产物鱼粉接种米曲霉发酵，提取 粗酶提取物水解蛋白，并与f l a v o u r z y m e5 0 0m g 对比，发现其具有更好的水解 度。d y a hh w a r d h a n i t 3 3 】直接利用米曲霉发酵大豆提取抗氧化物质，并建立了多 酚和清除d p p h 自由基二次旋转模型，分析了抗氧化物质溶出与抗氧化的关系。 已有大量研究从不同发酵物中提取了大量的抗氧化物质，如从辣白菜【3 4 】、酱油 3 5 - 3 6 、豆鲥3 7 1 、谷物【3 8 】、荞麦【3 明中，这些物质都具有很好的抗氧化性。 1 5 立题依据及意义 微生物发酵法制备具有抗氧化活性的提取物，分为液态发酵和固态发酵。液 态发酵由于其所产酶活相对固态发酵是很低的1 2 6 1 ，但是利用固态发酵产生最大酶 活，此时加入水，发挥酶的最大作用，从而结合了固态发酵和液态发酵的优点。 豆渣中含有丰富的营养成分和具有很多生理功能的物质，利用微生物米曲霉 发酵，利用其中的多酶体系水解曲料，优化提取具有多种抗氧化活性的物质，为 生产天然抗氧化剂在食品中应用提供依据。 1 6 本论文研究主要内容 本文的主要目的是研究利用豆渣固态发酵制取很好酶活的豆渣曲，利用此豆 渣曲中多种酶水解曲料提取抗氧化物质，并初步分析其抗氧化成分。本论文主要 从以下几个方面进行研究： 1 、以豆渣曲为底物，进行米曲霉固态发酵制曲，以蛋白酶活力为指标，制 3 江南大学硕士学位论文 备豆渣曲； 2 、利用豆渣曲中的多种酶进行水解，外加纤维素酶和果胶酶助溶水解曲料， 提取抗氧化物质； 3 、分析提取液中抗氧化物质组成，及其对抗氧化能力的影响，并用不同方 法评价提取液抗氧化能力。 4 材料与方法 2 材料与方法 2 1 主要材料 豆渣( 大豆制得) ，市购；麸皮，市购；米曲霉菌种，江南大学微生物中心 保存；无水乙醇、氯化钠、碳酸钠、浓硫酸、盐酸、硝酸、钼酸铵、抗坏血酸、 磷酸二氢钾、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、钨酸钠、钼酸钠、酪氨酸、 碳酸钠( 分析纯) 、硫酸锂、8 5 磷酸、甲醛等为分析纯，购于国药集团。1 ， 1 二苯基苦基苯肼( d p p h ) 、2 , 2 连氮基双( 3 乙基苯并二氢噻唑啉6 磺酸) 二铵盐( a b t s ) ：s i g m a 公司，超级纯。果胶酶纤维素酶。 2 2 主要仪器 可见分光光度计v 1 8 0 0 ：上海美谱达仪器有限公司；电子天平奥豪期 a r b l 2 0 ，电热恒温水浴锅d k $ 2 4 ，隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器 械一厂；台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限责任公司。 2 3 豆渣曲制备及多肽、抗氧化液提取工艺流程 菌种活化_ 接种麸皮一种曲_ 原料( 主要是豆渣卜接种- 成曲_ 成曲加水加 酶水解提取，离心_ 取上清液即为豆渣曲水提取液。 2 4 以豆渣与麸皮为基质制备豆渣曲 2 4 1 制各种曲 米曲霉菌种在c z a p e k 8 培养基培养活化2 d 制得米曲霉黄绿色孢子后，按 麸皮1 0 0 - h 2 01 0 0 混匀后，取3 0 9 于2 5 0 m l 三角瓶中，灭菌冷却接种2 3 环， 培养2 天长出黄绿色孢子即为种曲。 2 4 2 制备豆渣曲 配制不同豆渣与麸皮比的条件下，将原料按照配比进行充分混合( 其中豆渣 事先进行润水) ，1 2 1 ，2 0 m i n 灭菌、蒸料。在超净工作台上将蒸好的曲料均匀 地摊于金属盘中降温，4 0 下接入曲精，混匀后盖上湿润的纱布，放入恒温恒湿 箱中3 0 培养，并定时翻曲两次。在不同时间、水分含量、接种量测定蛋白酶 活力、孢子数，确定豆渣曲质量 2 4 3 豆渣曲蛋白酶活力测定 采用福林试剂法，参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法( s b t 5 江南大学硕士学位论文 1 0 3 1 7 1 9 9 9 ) ：取样5g 研磨成粉状，用1 0 0m l 蒸馏水4 0 ( 2 浸提1k 得到粗酶液。 取该酶液体1m l 于试管中，4 0 ( 2 预热2m i n , 力n 入同样预热的2 酪蛋白溶液lm l ， 保温1 0m i n , 力l2m l 0 4m o l l 的三氯乙酸终止反应，4 0 0 继续保温2 0r a i n , 过滤或 离心去除蛋白沉淀，取lm l 滤液于试管中，加5m l0 4m o l l 的n a 2 c 0 3 溶液和l m l 福林试液，摇匀，在4 0 0 水浴中保温2 0m i n , 取出后在6 6 0n n l 处测定其光密度 值。空白先加2m l0 4m o l l 的三氯乙酸，保温1 0l i l i l l ，加入同样预热的2 酪蛋白 溶液1m l 。在4 0 0 下每分钟水解酪蛋白产生l | lg 酪氨酸，定义为1 个蛋白酶 活力单位 样品蛋白酶活力单位( 干基) 2 而a 4 x n 两1 式中a 由样品测得o d 值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数( 或o d 值k ) ； 4 _ - 4 毫升反应液取出l m l 测定( 1 14 倍) ； n 二酶液稀释的倍数； 1 0 一反应1 0 m i r a w 一样品水分百分含量 2 5 豆渣曲提取蛋白质和抗氧化物研究 2 5 1 豆渣曲，外加纤维素酶、果胶酶提取蛋白质和抗氧化物的影响 豆渣曲磨碎后，取1 9 ，在不加酶，添加不同量的纤维素酶、果胶酶，固液 比l ：2 0 、温度4 0 0 下进行酶解，酶解过程中不同时间取样、灭酶后1 0 0 0 0 r p m 离 心1 0 m i n ，测定蛋白溶出率，h p l c 测定分子量分布，d p p h 自由基和a b t s + 自由基清除率。 2 5 1 时间对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响 豆渣曲磨碎后，取l g ，在固液比l ：2 0 、温度4 0 0 下进行酶解，酶解过程中 不同时间取样、灭酶后1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，测定蛋白溶出率，d p p h 自由 基和a b t s + 自由基清除率。 2 5 2 温度对对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响 豆渣曲磨碎后，取1 9 ，在固液比1 ：2 0 、时间3 h 下，分别在3 0 0 、4 0 0 、 5 0 、6 0 、7 0 水解灭酶后1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，测定蛋白溶出率，d p p h 自 由基和a b t s + 自由基清除率。 6 材料与方法 2 5 3 固液比对提取液蛋白溶出率及抗氧化性的影响 豆渣曲磨碎后，取1 9 ，在时间3 h 、温度4 0 。c 下，分别按照固液比1 ：1 5 ，1 ：2 0 ， 1 ：2 5 ，1 ：3 0 ，1 ：4 0 加水酶解提取，灭酶后1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，测定蛋白溶出率， d p p h 自由基和a b t s + 自由基清除率。 2 6h p l c 测定小肽分子量分布 仪器：w a t e r s6 0 0 高效液相色谱仪( 配2 4 8 7 紫外检测器和e m p o w e r 工作站) 色谱条件： 色谱柱：t s k g e l2 0 0 0s w 3 0 0 m m x 7 8 m m 流动相：乙腈水三氟乙酸，4 5 5 5 0 1 ( v v ) 检测：u v 2 2 0n m 流速：0 5m l m i n 柱温：3 0 样品制备：吸取样品2m l 于1 0m l 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，用微孔过 滤膜过滤后供进样。 分子量校正曲线所用标准品： 1 ) 细胞色素c ( m w l 2 5 0 0 ) 2 ) 杆菌酶( m w l 4 5 0 ) 3 ) 乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸( m w 4 5 1 ) 4 ) 乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸( m w l 8 9 ) 仪器操作方法及计算： 操作参照中华人民共和国药典2 0 0 0 版，第二部附录v d ； 数据处理及计算由w a t e r sm 3 2g p c 软件自动进行。 2 7 抗氧化能力测定方法 2 7 1d p p h 自由基清除能力的测定 按照文献【4 n ，取0 0 4 9 d p p h 试剂，用无水乙醇溶解后，定容为1 0 0 0 m l ，摇匀 得o 1 m md p p h 溶液。取定容为2 5 m l 提取液0 2 5 m l ，加水2 2 5 m l 到2 5 m l0 1 m m 的d p p h 溶液中，避光保存3 0 m i n 后，在5 1 7 n m 测定吸光度值。 7 江南大学硕士学位论文 清除率( ) = 【( a 螂删一a 。a m p i 。) a 。嗍臼d l 】1 0 0 。 式中：a 。咖广乙醇溶液的吸光度l e _ 样品与d p p h 反应后的吸光度 2 7 2a b t s 自由基清除能力的测定 按照文献【4 2 】，采用7 m m o la b t s 用过硫酸钾( 最终浓度为2 4 5 m m ) 定容。 在黑暗中存放1 2 , - - ，1 6 h 。生成a b t s 离子( 可储存4 d ) 。然后将上诉溶液用0 i m 的磷酸钠缓冲液( p h7 4 ) 稀释至吸光度值为0 7 0 0 - j = 0 0 2 。取定容为2 5 m l 提取液 3 0 u l 样品于3 m l 上诉溶液中，准确反应6 m i n 后在7 3 4 n m 处测定吸光值。 清除率( ) = 【( i a 姗p k ) a 伽删 x 1 0 0 。 式中：a 伽仃。广乙醇溶液的吸光度a s 帅p l 广样品与a b t s 反应后的吸光度 2 7 3 羟自由基( 0 a ) 清除能力的测剧4 3 】 h 2 0 2 和f e 2 + 发生f e n t o n 反应，生成具有很高活性的o h ，其能被水杨酸捕捉， 并生成有色物质，但若加入具有清除作用的物质，与水杨酸竞争，从而使生色物 质减少。在1 0 m l 试管中依次加入6 m m o l l 的f e s 0 4 溶液l m l ，不同量提取液并 加水补足l m l ，6 m m o l l h 2 0 2 溶液l m l ，摇匀，静置1 0 m i n ，再加入6 m m o l l 的 水杨酸溶液l m l ，摇匀，静置3 0 m i n 后，于5 1 0 n m 处测定吸光值。清除率计算 公式为： 清除率( s ) = 【1 - ( a i - a j ) a 0 】x1 0 0 其中a 0 为空白对照； a i 为某一定量的提取液的吸光值； 硝为无水杨酸时提取液的吸光值； 2 7 4 抑制邻苯三酚自氧化速率m 】 在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，因此可根据提取液抑制邻苯三酚自 氧化能力测定抗氧化能力。在试管中力i a p h = s 2o 1 m o l l 的碱s h c l 缓冲溶液 2 3 5 m l 和蒸馏水1 8 m l ，在2 5 c 下保温2 0 m i n ，然后加入2 5 预热过的0 1 5 m l 的邻苯 三酚溶液，迅速摇匀，立即倾入比色皿中，在4 2 0 n m 波长处测定吸光值，6 0 s 后 读数，要求自氧化速率控制在每分钟的吸光值为0 0 6 - 0 0 7 。 2 7 5 提取液还原能力测定【4 5 】 取不同浓度提取液0 3 m l ，加入等体积的磷酸盐缓冲液( p h6 6 ) 和铁氰化 钾( 1 ) ，置于5 0 水浴保温2 0 m i n 后，依次加入0 3 m lt c a ，1 2 0 m l 超纯水，以 及0 2 4 m lf e c l 3 ，在7 0 0 n m 处测定吸光值。 8 材料与方法 2 8 豆渣抗氧化成分的测定方法 2 8 1 蛋白质及多糖的测定 蛋白质采用凯氏定氮法； 多糖采用硫酸苯酚法，以葡萄糖做标准曲线m 。 2 8 2 黄酮的测定方法【4 7 1 采用硝酸铝显色法以芦丁为标准物，绘制标准曲线的绘制。准确吸取一定 量的提取液，置于2 5 m 1 比色管中，各加入5 n a n 0 2l m l ，混匀放置6 m i n 后，再加 入i o a i ( n 0 3 ) 3l m l ，摇匀；放置6 m i n ，再加入4 n a o h1 0 m l ，加水至刻度，混 匀，1 5 m i n 后用分光光度计在波长5 0 0 n m 处测定吸光度值a 。根据标准曲线计算得 到黄酮含量。 2 8 3 多酚的测定方法： 根据文献 4 1 1 1 ，采用采用f o l i n - c i o c a l t e u 法测定提取液总酚含量。以焦性没 食子酸做标准曲线，取用1 5 0ul 加入1 5 0ulf o l i n - c i o c a l t e u 酚试剂，准确反应 3 m i n 后，加入3 0 0 ul 的1 n n a c 0 3 室温放置2 h 后，在7 2 5 n m 处测吸光值。 9 江南大学硕士学位论文 1 0 结果与讨论 3 1 豆渣的基本组成成分 3 结果与讨论 表1 豆渣的基本组成成分 t a b 1t h eb a s i cc o m p o s i t i o no fs o y b e a nr e s i d u e 做为发酵底物的麸皮，其用量较少，根据文献，麸皮中大约含有蛋白质1 6 4 ， 灰分6 5 ，脂肪含量为3 5 8 ，纤维含量为4 0 。 3 2 豆渣曲的制备研究 3 2 1 单因素实验 3 2 1 1 培养基组成及培养时间对酶活的影响 豆渣营养不全面，在微生物发酵初期较难被微生物直接利用。麸皮中含有较 多淀粉，并含有未知的生长因子，其中淀粉和生长因子均能促进菌体生长。因此，添 加麸皮利于发酵。在自然p h 值，加水比为5 0 ，3 0 c 恒温，接种量为0 0 5 ( 种曲含 有1 4 x1 0 9 个儋) ，考察不同豆渣与麸皮比例及发酵时间对蛋白酶活力的影响。 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 o o81 62 43 24 04 85 66 4 时间( h ) + 9 ：1 + 8 ：2 + 7 ：3 卜6 ：4 _ 卜全豆渣 图1 豆渣和麸皮比例以及培养时闻对米曲霉中性蛋白酶活力的影响。 f i g 1t h ee f f e c to ft h ec o m p o s i t i o no fs o y b e a nr e s i d u ea n dw h e a tb r a na n d f e r m e n t e dt i m eo nt h ea c t i v i t yo fn e u t r a l p r o t e a s e 图l 反映了添加麸皮可以有利于米曲霉生长，并在4 8 h 酶活力较高。从图中 可以看出，不加麸皮的全豆渣，米曲霉生长不好，蛋白酶活力较低。其可能原因 翁把= 8 n v r 鋈 江南大学硕士学位论文 是由于米曲霉生长中，碳源来源不足。添加麸皮后，随着麸皮量的增加，在9 ：l 和7 ：3 产酶酶活相当，而在8 ：2 处，产酶酶活较低，而又添加麸皮，在6 ：4 时， 其生长更好，蛋白酶活力提高，其可能原因是由于豆渣粉吸水，同时淀粉水解， 使得培养基结块，通气和传热不足，不利于米曲霉生长，而后麸皮量增加，麸皮 增加了孔隙，通风和传热改善，有利于米曲霉生长。同时从图中可得，米曲霉在 4 8 h 小时，活力达到一个较高的水平，实验中在4 8 h 测定酶活力。 3 2 1 2 培养基水分对产酶酶活的影响 在自然p h 值，3 0 。c 恒温，接种量为o 0 5 ( 种曲含有1 4 1 0 9 个g ) ，豆渣与麸 皮比例为9 ：1 ，发酵时间4 8 h ，考察培养基水分对蛋白酶活力的影响。 3 0 0 0 仓2 5 0 0 已2 0 0 0 r 1 5 0 0 藿1 黧 7 ：32 ：11 ：1l ：23 ：7 固液比( g g ) 图2 培养基固液比对中性蛋白酶酶活的影响 f i g 2t h e e f f e c to ft h es o l i d l i q u i do fs u b s t a n c et ow a t e ro nt h ea c t i v