（食品科学专业论文）红凤菜抗氧化性及其中红色素的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文采用邻苯三酚自氧化法和d p p h ( 1 ，卜二苯基一2 一苦肼) 法测定红 风菜提取物抗氧化能力，并分别对溶于水和乙醇的活性物质进行了提取，并 对同时溶于水和乙醇的一种色素进行了定性和稳定性研究。 i 本文以动态的方式，采用邻苯三酚自氧化法测定红凤菜各种溶剂提取 物对超氧阴离子自由基的清除作用，确定了水提物具有最强的清除超氧阴离 子自由基的能力，并通过单因素及正交实验确定了红风菜水提物中活性物质 的最佳提取工艺参数为：浸提温度5 0 、同液比i ：6 0 、浸提时间2 5 h 。 2 文章采用d p p h 法测定了红风菜的甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯提取物 的抗氧化能力，得出甲醇提取物清除d p p h 自由基的能力最强，但由于甲醇 有毒，且其提取物的抗氧化能力仅仅略强于无水乙醇提取物的，所以以无水 乙醇提取其中的活性物质，并确定了最佳提取参数为浸提温度5 0 、固液比 l ：4 0 、浸提时间6 0 m i n 。 3 本文分别利用f o l i n 酚比色法和n a n o ：- - a i ( n o d 。比色法测定了红风 菜中的总酚和总黄酮含量，结果为含有5 6 2 的总酚，总黄酮含量为2 3 5 。 4 本文对其中的红色色素进行了定性实验，根据其溶解性、特征峰的波 长范围以及色素随p h 而发生的颜色变化等理化性质初步确定该色素属于花 色苷类色素。 5 本文通过测定p h 对色素溶液的热稳定性和光稳定性，金属离子对色 素溶液稳定性的影响和氧化剂、还原剂对色素溶液稳定性的影响，确定了红 风菜红色素溶液在酸性条件下对热和光比较稳定；在测定的金属离子中， f e ”、a 1 “、c u ”对色素溶液有较大影响，而其它金属离子的存在对其产生 的影响不大；并且该色素对氧化剂和还原剂不稳定，应避免其与氧化剂和还 原剂接触。 关键词：红凤菜抗氧化自由基花青素 前言 国内外对自由基的研究现状 自由基是指外层轨道上带有不配对电子的系子、分子或基团。氧分子 轨道上有两个未成对电子，很容易转变为自由基和活性氧，人体内的自由 基以氧自由基( o x y g e nf r e er a d i c a l ，0 f r ) 为主，包括超氧阴离子( 0 2 - ) 、 羟自由基( 0 h ) 、过氧化氢分子 葡萄皮 千葡萄籽。国外对葡萄提取物的 抗氧化性研究及应用亦十分活跃，法国等不少国家已将葡萄籽作为原料制 备葡萄籽提取物，并将其加入到红葡萄酒中，以提高其抗氧化活性物质的 含量。并且国外许多科学家实验发现葡萄籽中的天然抗氧化剂能防止动脉 粥状硬化、抗凝血( b l o o dc l o t t i n g ) 、增加高密度脂蛋白或高密度脂蛋白 胆固醇( h d l - c ) 、抑制低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化，清除自由基( f r e e r a d i c a ls c a v e n g i n g ) 。防癌抗肿瘤等多种功效。张佃志等对1 0 种蔬菜抗 氧化性的比较研究中发现茄子对町的抑制率最高。国外? t a n g 等、c a o 等测定了1 1 种水果对r 0 0 的清除能力，表明大蒜、羽衣甘蓝，菠菜等最 强。郭长江对坚果类食物清除r 0 0 作用研究发现，葵花子具有较强的清 除r 0 0 的作用，花生、核桃次之。因此以天然植物抗氧化剂取代合成抗 氧化剂是今后食品工业发展的趋势，同时从天然植物中寻找清除体内自由 基的物质也将是现代医药、保健行业的趋势。 二、花青素研究进展 花青素( a n t h o c y a n i d i n ) 是一类广泛存在于植物中的水溶性色素， 属于类黄酮化合物，也是植物的主要呈色物质。自然条件下游离的花青素 极少见，而常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等 通过糖苷键形成花色苷( a n t h o c y a n i n ) ，花色苷中的糖苷基和羟基还可以 与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和 9 删嗣 脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷。已知天然存在的花色苷有2 5 0 多种， 存在于2 7 个科，7 3 个属的植物中。 ( 一) 花色苷的结构特点 花色苷是花青素的糖苷衍生物，基本结构如图l 。 r 4 图i 花色苷基本结构 f i g 1 b a s a ls t r u c t u r eo fa n t h o c y a n j n 注：r i 和是h 、o h 或者o c b ，r ，是糖基或n ，r 。是糖基或o h 表1 六种常见色素的结构特点 型垒墅! ! 唑兰垡蜜墅型唑! 取代物 名称 英文名称 缩写s u b s t i t u t 。 n a m e e n g l i s hn a m e a b 了了r 了_ 天竺葵色素p e l a r g o n i d i a p g o ho h ho hh o hh 矢车菊色素q j d j c y o h o hho h o ho hh 飞燕草色素d e l p h i n l d i nd po ho hh o ho h o h0 h 芍药色素p e o n i d l n p no h o hh o ho m eo hh 牵牛花色素p e t u n i d l n p t o ho hh o h0 m co h0 h | 墼l 竺型! 竺：竺竺! 竺翌竺竺! 竺旦! 竺! 已知有2 0 种花青素，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素( p g ) 、 矢车菊色素( c y ) 、飞燕草包素( d p ) 、芍药色素( p n ) 、牵牛花色素( p t ) 和锦葵色素( m v ) ，结构如表l 。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 二) 花色苷的生理功能 花色苷最突出的作用就是使植物呈现五彩缤纷的颜色，同时花色苷也 是一类具有保健功能的活性成分，大量研究表明：花色苷具有很强的抗氧 化作用，可以清除体内的自由基；降低氧化酶的活性；可以降低高血脂大 鼠的甘油酯水平，改善高甘油酯脂蛋白的分解代谢：抑制胆固醇吸收，降 低低密度脂蛋白胆固醇含量；抗变异、抗肿癌、抗过敏、保护胃粘膜等多 种功能。 研究发现法国人心脏病的发病率相对较低，分析其原因是与法国人比 较爱喝含有葡萄皮色素的红葡萄酒有关，从红葡萄中提取的花色苷能有效 地清除町和o h ，在体外实验中，花色苷能明显抑制低密度脂蛋白的氧 化和血小板的聚集，这两种物质是引起动脉硬化和心血管疾病的主要因子。 从红葡萄中提取的花色苷还能抑制胃癌细胞t i c t - 1 5 的生长，并且效果要比 其它药物好的多。j a n k o w s k i 用从红葡萄酒中提取的花色苷和链唑霉素饲 喂患有糖尿病的大鼠，发现患病大鼠尿和血浆中的含糖量明显降低，同时 由链唑霉索引起的大鼠体重降低现象也不复存在。日本的t s u d at 等用矢 车菊素一3 一葡萄糖苷进行大鼠饲喂实验，表明此花色苷可以降低血清蛋白和 脂质体的过氧化作用，并且对重灌流诱发的局部贫血肝脏的氧化性损伤具 有保护作用：o b i 研究了从植物花瓣中提取的花色苷能够防止四氯化碳引 起的大鼠的急性肝脏损伤：n o 是由l 一精氨酸产生的双原子自由基，它在 人体的组织和细胞中合成大量的氮的氧化物( c n o s 和i n o s ) ，导致多种慢 性炎症的发生，w a n g 和m a z z a ( 2 0 0 2 ) 研究发现花色苷能非常有效的抑制 n o 的产生。 最新研究发现花色苷和d n a 之间具有相互作用，牛的c z d n a 和花色苷 能形成一种复合花色营一d n a ，并且当花色苷与牛的c t d n a 混合时，其最大 吸收波长会向红波方向移动1 5 - 2 0 n m ，如果将花青素或牛的c t d n ( 单独置 前言 于由二价铁离子反应产生o h 的体系中都受到不同程度的损坏，若将复合 的花色苷一d n a 置入时则都不会造成氧化损坏，因此，他们认为花色苷一d n a 复合体可能是一种抵制d n a 氧化损伤的机制和在活体内有可归因于花色苷 抗氧化能力的生理功能。并且在2 0 0 0 年，m s 提出花色苷稳定d n a 三维结 构的功能机理图j 如图2 所示? h o 花色苷d n a花色苷d n a 图2 花色苷与d n a 的作用机制 f i g 2 t h em e c h a n i s mo f r e a c t i o nb e t w e e na n t h o c y a n i na n dd n a ( 三) 花青素的提取和鉴别 花青素分子中存在高度分子共轭体系，具有酸性与碱性基团，易溶于 水、甲醇、乙醇等极性溶剂中。通常用含有少量盐酸或甲酸的甲醇做溶剂 提取，其中的酸能防止非酰基化的花色苷的降解。然而在蒸发浓缩时这些 酸会导致色素的降解。在一些植物中，少量的酸会使酰基化的花色苷部分 或全部的水解。r e v i l l a ( 1 9 9 8 ) 对从葡萄中提取花青素的多种方法进行了 比较实验，证明当溶剂中的h c l 达到0 1 2 m o l l 时就能使酰基化的花色苷 部分水解。后来，用丙酮提取花青素，与用酸性甲醇相比，用丙酮提取效 一b opibf斡i c o 沈阳农业大学硕士学位论文 果更好，消除了果胶的影响，并且提取温度低。对于花色昔的精制，方法 很多，( 1 ) 树脂法精制，葡萄皮色素的提取就是用离子交换树脂出去糖类 和有机酸。r e v i l l a ( 2 0 0 2 ) 用树脂x a d - 7 纯化了自荔枝皮中提取的花色苷。 ( 2 ) 膜分离精制，利用各种类型的超滤膜和反渗透膜以过滤得形式将色素 精制，花青素也可被超滤醋酸纤维膜纯化浓缩。 对于混合的花色苷，应该将其分离并收集有效成分，用核磁共振( n 脓) 和快原子轰击源为离子源的质谱( f a b - n s ) 仪研究其三维结构。也可以用 液相色谱与质谱( i c - l 临) 联用仪，用选择性宽的液相色谱分离组分，然后 用灵敏度高的质谱检测器对其进行结构和成分分析。g l a s s g e n 在1 9 9 2 年 用以电喷雾电离源为电离方式的液相色谱一质谱联用( l e - e s i - m s ) 对白印 度黑萝卜中提取的花色苷进行了鉴别，证实了几种花青素，包括酰基化的 未酰基化的，另外也可以用离子源为电子轰击源的液相色谱一质谱联用仪 ( l c - e i - m s ) 。近来，科学工作者多用高效快速、样品用量极少、溶剂消耗 极少的毛细管电泳( c e ) ，1 9 9 7 年b r i d l e 用毛细管区带电泳( c z e ) 使得混 有草莓和接骨木浆果花色苷获得了分离。1 9 9 8 年w a t a n a b e 用胶束电动毛 细管色谱法( m e k c m e o c ) 分析了糖果、果汁、果冻等食品中的接骨木色素， 不到l o m i n 分钟所有的花色苷都得到分离。 ( 四) 来源及应用 花青素在植物中广泛存在，葡萄是花色苷类色素的主要来源，含量一 般在3 0 一? 5 0 m g l o o g 鲜重，因栽培方式、季节、生长环境的不同而异。而葡 萄酒酒厂的废料葡萄渣更是花色苷类色素的廉价来源；接骨木浆果 ( e l d e r b e r r i e s ) 中含大量的花青素，并且都是矢车菊色素，含量在 2 0 0 1 0 0 0m g l o o g 鲜重：2 0 世纪8 0 年代日本就从紫甘蓝中提取分离出4 种花青素并将其作为食品着色剂，紫甘蓝在4 环境中贮藏8 4 天后，其中 前言 的矢车菊素一3 一葡萄糖苷含量仍然保持在6 9 9 4 m g l o o g 鲜重：另外红橙、 红莓、草莓、桑椹、山楂皮、蓝靛果、茄子皮、紫薯、洛神蔡( r o s e l l e ) 、 黑( 红) 米、牵牛花等都含有大量的花色苷类色素。 史上最早最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的脱糖葡萄花青素， 1 7 8 9 年在意大利上市。现允许使用并已投入生产的有葡萄皮色素、玫瑰茄 红、高粱红、紫玉米色素、紫苏色素等，花色苷类色素最突出的特点在于 它的颜色密度和颜色色泽，在酸性环境中呈现红色，并且这些色素( 除葡 萄皮色素外) 对光、热、氧稳定性好，多用在( g t ) 饮料、冰淇淋、果酱、 糖果、糕点中，用量0 0 3 - 0 5 ，且在微酸( p h _ 4 ) 条件下糖度可提高花 青素的颜色强度，当用量为0 3 - 0 5 时即可使冰淇淋呈现紫黑色。另外也 可用于化妆品。 目前我国允许生产和使用的天然食用色素有4 0 余种，生产厂家愈百， 年产量超万吨。生产和使用的主要品种是焦糖色素，约占天然食用色素总 产量的7 0 。由于其他天然食用色素的成本高，不稳定等原因，很少使用， 主要用于出口。除焦糖色素外，产量较大的品种还有：姜黄色素、辣椒红 色素、高梁红色素等。国内生产厂家虽多，但大多规模小而且分散，并且 存在重复建设，原料综合利用率低、成本高、资源浪费严重等问题。为了 扩大天然色素的使用范围和增强国际竞争力，今后应制定相应的经济政策 和规划，组织横向协作，研制并定点生产新的食用天然色素：另外还要利 用天然色素的性质，协同发挥其优势，如利用黄酮类物质的存在可以减少 氧化作用等因素对花青索的破坏作用，使花青素类色素含有适量的黄酮既 可以改善色素的稳定性又可提高其营养保健作用，并且要在提取工艺、分 离精制等方面加以改进。要利用超临界萃取、膜技术、分子蒸馏、柱层析 等先进技术，对天然色素进行提取与分离提纯，制备纯度高、性能稳定、 附加值高的产品才具有国际竞争力，这是未来天然色素发展的主要方向。 1 4 鎏里奎兰查芏坚主兰竺望三 三、立题依据和研究内容 红凤菜( c y n u r a b i c o l o r d c ) 为菊科多年生草本植物，别名紫背天葵、 红苋菜、血皮菜、观音苋、红背菜、水前寺菜等，属菊科，三七草属生 于平原及低山阴湿处或栽培于住宅附近、菜园，在我国南方大面积生长， 全年均可采收，资源极为丰富，富含铁、锰等元素，营养全面，人们素来 喜欢食用，以嫩茎叶做菜，多凉拌或炒食。据记载，该植物全草有清热凉 血，活血，止血，解毒消肿的功效，治咳血，崩漏，外伤出血，痛经，痢 疾，跌打损伤，溃疡久不收敛，根茎止渴、解暑等功效，对儿童发育、老 年人保健有独特作用。药理实验结果表明，红凤菜地上部分煎剂，可明显 缩短兔、小鼠和豚鼠的正常出血和凝血时间。有对抗肝素的作用，对x 线 照射及环磷酰胺处理引起的大鼠白细胞及血小板降低有一定的保护作用。 国外有文献报道红凤菜含有花青素，它是具有重要生理活性的物质。因此， 它作为一种潜在的食品功能基料，具有很好的开发前景。就红风菜而论， 国内外的研究始于近十年，主要集中在红凤菜的营养品质，常、微量元素含 量等领域，并且红凤菜仅是作为菜肴摆上餐桌，所以除了少数几篇有关红风 菜的种植方法介绍性文章外，目前尚未见有关红风菜功效成分和加工应用 方面的报道。开展红凤菜活性成分的研究，其意义大概有二：其一。由于我 国城乡人民生活水平的不断提高，各种工业污染和生活压力的加剧，城市文 明病和各种癌症患病率急剧上升，寻找具有预防和治疗城市文明病和癌症 功能的新型食物资源及其活性成分便显得更有重要意义。其二，由于红风 菜很适合在我国大多数省区种植，且产量高、色素含量丰富，并且红凤菜红 色素的稳定性、水溶性优于其它天然植物红色素，如葡萄和草莓色素，它可 用作安全无毒的着色剂，广泛用于食品、化妆品、医药等方面。红风菜良好 的生物活性预示其在这些领域必将会大有作为。 本实验拟进行以下实验研究： 前言 ( 1 ) 测定红风菜的抗氧化能力，提取其中的活性物质并选择最佳的提 取参数。 ( 2 ) 分析测定红风菜中总酚和总黄酮的量。 ( 3 ) 对红风菜中的红色物质进行提取、定性和稳定性的考察。 通过上述实验研究，为红风莱的开发和利用提供理论指导。 沈阳农业大学硕士学位论文 一、材料 材料与方法 红风菜( 鲜) 国家蔬菜工程技术研究中心特菜组提供。 二、主要仪器设备 f w l 0 0 型高速万能粉碎机 c r 2 0 8 2 型高速冷冻离心机 s h i m a d z uu v 一2 4 0 紫外分光光度计 旋转蒸发仪 p c 一3 5 1 一r c 型磁力搅拌器 m t v 一1 2 5 d c 电子天平 d l 3 0 2 型红外线烘干仪 c f i n 0 6 0 p h 计 d z k w _ d 水浴锅 三、主要试剂 石油醚 乙酸乙酯 阳削 乙醇 甲醇 焦性没食子酸 v c 沸程6 0 1 2 - - 9 0 c 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 天津市泰斯仪器有限公司 日本日立公司 g r a p h t c o r d 上海申生科技有限公司 日本日立公司 北京市菲姆斯科技开发公司 上海吴淞五金厂 美国奥立龙公司 杭州星宇公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化上j 北京化工厂 北京化工厂 遵义建强化工厂 东北制药厂 材料与方法 d p p h 亚硝酸钠 对羟基苯甲酸 硝酸铝 芦丁 盐酸 t r i s 四、试验方法 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 ( 一) 红凤菜抗氧化能力的测定 1 红凤菜中活性物质的粗提 北京化工厂 北京市旭东化工厂 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化工厂 北京化学试剂公司 ( 进口分装) ( 进口分装) 提取工艺流程：鲜红风菜一洗净沥干红外线烘干一一粉碎 加入一定比例的溶剂一定温度下搅拌浸提一定时间一一4 0 0 0 r m i n 离 心15 m i n 一收集上清液旋转蒸旋一烘干备用。 2 邻苯三酚自氧化法测定红凤菜提取物抗氧化能力 邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间物( 在3 2 5 n m 处 有最大吸峰) 和0 z 一，0 z 一对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生 成量的多少，可判断町生成量的多少。当有自由基清除剂存在时，有色 产物的生成量减少，可测定该自由基清除剂的活性。 3 d p p h ( 1 ，1 一二苯基- 2 一苦肼) 法测定蔬菜提取物抗氧化能力 1 8 d p p h 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在5 1 7 n m 处有强 沈阳农业大学硕士学位论文 吸收( 显深紫色) 。当自由基清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或 减弱，通过测定吸收或减弱的程度，可评价该自由基清除剂的活性。 ( 二) 红凤菜中活性物质的提取 1 浸提法的单因素实验 为了选取最佳提取条件，针对与浸提效果直接相关的几个因素做单因 素实验。各因素分别是：浸提时间、浸提温度、固液比。 提取方法：将预处理过的红风菜粉末5 o g 于烧杯中，加入一定体积 的石油醚，使其浸没红风菜粉末，搅拌脱脂3 0 m i n ，过滤( 滤液回收石油 醚) ，将滤渣晾干，自然挥发驱除石油醚。加入一定量的水，封口浸提。浸 提一段时间后，4 0 0 0 r m i n 高速离心，收集上清液，旋转蒸发，烘干至恒 重称量。 2 红凤菜中活性物质浸提条件的正交实验 ( 1 ) 水提法 根据单因素实验结果，以浸提温度、时间、固液比为因素，并安排三 水平做正交实验。 研究因子及其水平见表2 。 通过各因素作用显著性检验确定及验证最佳工艺条件。 ( 2 ) 醇提法 1 9 材料与方法 表2 正交试验方案 t a b l e2 d e s i g no fo r t h o g n n a le x p e r i m e n t 根据水提法单因素实验方法做醇提的单因素实验，确定实验参数。 根据单因素实验结果，以浸提温度、e a r 、固液比为因素，并安排三 水平做正交实验。 研究因子及水平见表3 。 表3 正交试验方案 一 ! ! 坚! ! 里! ! 塑垡! 兰坠：翌竺竺! 竺竺兰兰竺 因素水平 浸提温度( ) 固液比浸提时间( m i n ) 一f a c t o r l e v e l s o a k i n g k m 。p c r a t u r e 。s o f i d t o f i q u i d 。s o a k i n g t i m 。a 一 1 柏 1 ：2 5 2 0 2 5 01 ：3 0 3 0 36 0 l ：4 0加 通过各因素作用显著性检验确定及验证最佳工艺参数。 ( 三) 红凤莱中酚类物质含量测定 现代研究表明，多种植物具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、增 强毛细血管抵抗力等作用，且以上生物学效应大多与其所含的酚类化合物， 尤其是黄酮的作用密切相关。所以本实验测定了红风菜醇提物中的总酚和 总黄酮的含量。 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 四) 红凤莱中红色素的定性识别 利用色素的理化性质确定色素类型。 色素提取方法：各取红风菜粉末5 o g ，分别加入0 1 h c i 一水、0 1 h c i 一乙醇、0 1 h c l m 甲醇l o o m l ，混匀并不断搅拌一定时间， 4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，收集上清液，旋转蒸发至干，置于4 c ，供色素性 质研究用。 1 测定红凤菜红色素的溶解性 将所提取的色素各取微量于不同有机溶剂中，观察在其中的溶解性。 2 p h 值对色素颜色的影响 分别用柠檬酸一磷酸氢二钾缓冲液配制p h 值分别为0 8 、1 0 、3 0 、 5 + 0 、7 - 0 、9 。0 、1 1 。0 、1 3 0 的色素溶液，观察溶液颜色的变化，分析p h 值对色素颜色的影响。 3 红风菜红色素的特征吸收光谱 配制定浓度的色素水溶液用s h i m a d z uu v 2 4 0 型紫外可见分光光 度计扫描，绘制红风菜红色素的紫外可见光光谱。 ( 五) 红凤菜中红色素的提取 红风菜红色素浸提条件的正交实验：根据花色苷类色素的性质和多数 花色苷类色素的浸提实验，确定实验因素。 ( 1 ) 固定条件：提取级数均为一级：溶剂为6 5 的酸性乙醇：提取的 色素均用紫外可见分光光度计在5 1 0 n m 处测定吸光值。 材料与方法 ( 2 ) 研究因素及其水平见表4 。 表4 正交试验方案 t a b l e2 d e s i g no f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( 3 ) 以浸提温度、时间、料液比为因素，并安排三水平作正交实验， 以吸光度值表示浸提结果，选择最佳实验参数。 ( 六) 红凤菜红色素稳定性考察 对实验所提取的色素的稳定性进行考察。 1 p h 值对色素溶液热稳定性的影响 取p h 值为3 0 的色素稀释溶液l o o m l 于4 0 c 、6 0 、9 0 。c 的恒温水 浴中加热，定时测定色素溶液在5 1 0 h m 下的吸光度值，以吸光度保留值r ( r = 在时间t 时色素溶液的吸光度在时间0 时的吸光度值) 对时间 作图，再取p h 值为5 0 和7 0 的色素稀释液重复上述操作，分析p h 值对 色素溶液稳定性的影响。 2 p h 值对色素溶液光稳定性的影响 分别将p h 值为3 0 、5 0 、7 0 的色素稀释液置于日光下，定时测定 色素溶液在5 1 0 n m 下的吸光度值，计算r 值，分析p h 值对色素溶液光稳 定性的影响。 沈阳农业大学硕士学位论文 3 金属离子对色素稳定性的影响 配制含有不同浓度的a 1 ”、c a ”、n a + 、f e ”、f e ”、c u “、m g ”、z n ”的色 素稀释液，放置l o m i n 后测定色素溶液在5 1 0 n m 下的吸光度值，计算r 值，并观察溶液颜色变化，分析各种金属离子对色素溶液稳定性的影响。 4 氧化剂、还原剂对色素稳定性的影响 分别取3 0 h 2 0 2 、n a , s ：o a m j , 色素稀释溶液中，隔一定时间测定吸光 度，计算r 值，并观察溶液颜色变化。分析氧化剂、还原剂对色素稳定 性的影响。 结果与分析 一、红凤菜提取物抗氧化能力的测定 ( 一) 邻苯三酚自氧化法测定红风菜提取物的抗氧化能力 邻苯三酚自氧化法就是根据邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧 化过程中产生0 2 - 町又加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间 产物，中间产物的积累在滞后3 0 4 5 s 与时间成良好的线性关系，一般维 持4 m i n 左右，随后减慢，有色产物在3 2 5 n m 处有强烈的光吸收。由于自氧 化速率依赖于0 2 一的浓度，清除町则抑制自氧化反应，从而可以评价红 风菜清除0 ：。的能力。 ( 1 ) p h8 2 的t r i s h c l 缓冲液的配制：2 5 m l0 2 m o l lt r i s 与2 2 5 m l 0 1 m o l lh c l 混匀。 ( 2 ) 邻苯三酚溶液的配制：准确称取0 0 4 4 1 9 邻苯三酚用p h4 9 的纯 水溶解定容至5 0 m l ，即可得7 m o l l 的浓度的溶液。 扣才( 6 9 5 乙醇 ”x 一丙酮 * 一乙酸乙酯 + 乙醚 + 石油醚 图3 红风菜不同溶剂提取物对0 2 一的清除作用 f i g 一3 f r e eo x y g e nr a d i c a ls c a v e n g i n gc a p a c i t yo fe x t r a c t si ng y n u r a b i c o l o r !簦筏：； 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 3 ) 红风菜提取物抗氧化能力的测定：取4 o m lt r i s h c i 缓冲液，一 定体积蒸馏水，一定提取物，最后加入0 3 m l 邻苯三酚溶液启动反应，总反 应体系为9 m l 。空白管用l o m m o l lh c l 代替0 3 m l 邻苯三酚。室温下静置 3 0 m i n 后测其吸光度变化，样品对町自由基的清除率r l ( ) = i 一 ( a b ) a o j ) x1 0 0 这里a 。为未加样的邻苯三酚的吸光度；a 为样品与邻苯三酚反 应后的吸光度；b 为样品的吸光度。 本实验以动态的方式，即每隔3 0 s 测一次a 值，根据所测a 值计算1 1 ，绘 制时间一f i 值曲线，如图3 所示。 由图3 可以看出水提物对的清除作用最强，其它几种提取物在测 量时间内对町基本上没有清除作用。 ( - - ) d p p h ( 1 ，1 - 二苯基2 苦胼) 法测定蔬菜提取物抗氧化能力 ( 1 ) d p p h 乙醇液的配制：准确称取0 o l gd p p h 溶于l o o m l 无水乙醇。 ( 2 ) 红风菜提取物抗氧化能力的测定：取0 5 m ld p p h 乙醇液，取定 体积的提取物，最后加入无水乙醇使反应液体积达到3 m l ，空白以提 取溶剂代替予以定体积的提取物溶液。室温下静置3 0 m i n 后在5 1 7 n m 处测 8 0 芒7 0 詈6 0 s o 皇如 23 0 2 0 2 l o e0 1 5 03 0 04 5 06 0 07 5 0 提取物浓度( u g m l ) c o n c e n t r a t i o n ( u g m l ) - 一无水乙醇提取物 i 一甲辞提取物 扣乙馥乙醣提取物 图4 红风菜不同溶剂提取物对d p p h 的清除作用 f i g 4 d p p h s c a v e n g i n gc a p a c i t yo fe x t r a c t si ng y n u r ab i c o l o r 结果与分析 其吸光度变化。清除率n ( ) = ( 卜b ) a 1 0 0 ，这里a 为空白的吸光度， b 为与提取物反应后的吸光度。结果如图4 所示。 由图4 可以看出：这三种溶剂的提取物都具有很强的清除d p f h 的能 力，尤其是甲醇和乙醇提取物，在含量为7 5 0 9 m l 时，清除率即可达7 0 以上，可见醇提物中含有大量的抗氧化性物质。但是由于甲醇提取物清除 d p p h 的能力仅略高于无水乙醇提取物，且甲醇有毒，d p p h 又难溶于水， 所以选用无水乙醇提取红凤菜中的活性物质。 ( - - - ) 红风菜水溶性活性物质的提职 利用多种溶剂对红风菜中的活性物质浸提，结果如表5 所示。 表5 各种溶剂的提取率 t a b l e5t h er a t i oo fe x t r a c t i o ni nd 谴f e r e n ts o l v e n t s 由表5 可以看出：水提取得率最高，可达到2 7 6 7 ，并且水提物中有 少量的红色物质。但是水提物粘度较大，不易提取，可能与其含有大量糖、 胶体等物质有关。 1 水浸提法 ( 1 ) 浸提温度选择实验 确定固液比为l ：2 5 ，浸提时间为2 h ，浸提温度在1 0 。c 一8 0 之间， 以浸提温度对提取率作图，比较不同浸提温度对其活性物质浸出率的影响， 结果如图5 所示。 沈阳农业大学硕士学位论文 ；3 5 i 3 0 1 5 1 0 ： 1 02 0 3 0 4 0 5 06 07 0 8 0 提取温度( ) 图5 浸提温度对提取率的影响 f i g 5t h ee f f e c to fo ns o a k i n gt e m p e r a t u r eo ne x t r a c t i o n 从图5 可知，温度在4 0 c 时，提取率达到最高值2 9 5 。温度在达到 4 0 c 以前，提取率迅速升高，而在4 0 c 以后提取率又逐渐降低。可见温度 过高或过低都不利于活性物质的提取，因此正交实验中温度选择3 0 c 、4 0 、5 0 三个水平。 誊 c 2 暑艺 料黑 罄g 裂u o 暑 暑 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 0 母移母母母毋 、 、j、。、。 固液比 s o l i dt oi j q u i d 图6l 胡液比对提取率的影响 f i g 6 t h ee f f e c to fr a t i oo fs o l i dt 0l i q u i do ne x t r a c t i o n ( 2 ) 固液比选择实验 i _ i_ i 一 i- |i 一 - 一_一一h一一 结果与分析 在上述实验确定的浸提温度为4 0 c ，以浸提时间为2 h ，选择固液比 分别为i ：1 0 、l ：1 5 、l ：2 0 、1 ：2 5 、l ：3 0 、1 ：4 0 、1 ：5 0 、l ：6 0 ，以 固液比对提取率作圈，比较不同固液比对其活性物质浸出率的影响，结果 如图6 所示。 由图6 可以看出，在固液比达到1 ：4 0 时之前，提取率升高迅速，而 在此后变得缓慢，尤其在l ：5 0 后提取率基本不变，另外。水在沸点较高 不易挥发，从活性物质的浓缩干燥角度考虑，正交实验应将固液比选为i ： 4 0 、i ：5 0 、1 ：6 0 三个水平。 ( 3 ) 浸提时间选择实验 根据以上实验，确定固液比为1 ：4 0 ，浸提温度为4 0 c 不变的条件下， 在0 5 h 一4 h 之间傲浸提实验，以提取时间对提取率作图，分析不同时间对 对红风菜中活性物质浸出率的影响，结果如图7 所示。 从图7 可以看出浸提时间在0 5 - 2 h 范围内，随时间的延长提取率不 g 9 3 0 2 2 5 萎z o 营1 5 - 1 0 ：5 i0 0 5i i 5 2 2 533 54 提取时闻( h ) r i k i n gt i c ( h ) 匦亟习 图7 提取时间对提取率的影响 f i g 7 t h ee f f c c to f t i m eo l lc x t n c t i o n 断提高。浸提时间达到2 h 后，提取率基本没什么变化，因此正交实验选 2 h 、2 5 h 、3 h 三个水平。 ( 4 ) 红风菜中水溶性活性物质提取的正交实验结果 鎏里垒些查兰璧圭兰垡笙苎 表6 正交试验结果 t a b l e6 o r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l t s 试验号12 3稃率佴) n u m b e r r a t i o 1 111 2 1 2i 23 2 4 5 31 32 3 1 4 21 32 5 52 22 2 7 5 62 3 13 0 5 7 3 12 2 3 5 83 21 2 8 9 3 33 3 2 5 k l 2 5 5 2 3 1 7 2 6 5 k 2 2 7 6 7 2 6 6 7 2 7 3 3 马 2 8 3 1 3 3 2 7 3 3 表7方差分析表 t a b k7 a n a l y s i so fv a r i a n c e 方差来源 平方和自由度 均方 f 凡。临界值氏。临界值 显著性 s o u r c eo f s s ef r e e d o m a v e r a g e fv a l u e c r i t i c a lc r i t i c a l s i g n i f i c a n c e v a r l a c e s q u a r ev a l u e v a l u e a 8 5 0 8 92 4 2 5 4 51 0 9 3 49 0 0 0 1 9 0 0 0 b 1 0 0 5 5 1 22 5 0 2 7 5 6 1 2 9 2 0 79 0 0 0 1 9 0 0 0 显著 c 1 3 7 7 82 0 6 8 8 90 1 7 7 9 0 0 01 9 0 0 0 误差7 7 8 2 l 23 8 9 1 1 总合1 1 8 2 22 由表6 和表7 可以看出，影响红风菜水溶性活性物质提取率的因素主 次顺序为b ( 固液比) a ( 浸提温度) c ( 浸提时间) ，影响较大的是b ， 即浸提时的固液比。由正交实验结果得出，红风菜串水溶性活性物质提取 的最佳工艺参数为a 3 8 3 c 3 ，即在5 0 c 浸提，固液比为l ：6 0 ，浸泡2 5 h 。 结果与分析 2 醇提法 提取方法：称取干燥红风菜粉末5 o g ，加入一定量无水乙醇，密封浸 提，并不断搅拌，一定时间后高速离心，收取上清液，残渣冲洗并离心， 合并上清液，烘干至恒重称量并计算提取率。 ( 1 ) 浸提温度选择实验 确定固液比为1 ：2 5 ，浸提时问为o 5 h ，由于乙醇易挥发选择浸提温 度在2 0 c 一6 0 之间，比较不同浸提温度对其活性物质浸出率的影响，结 果如表8 所示。 表8 温度对提取率的影响 t a b l e8t h ee f f e c to fs o a k i n gt e m p e r a t u r eo de x t r a c t i o n 由表8 可以看出，浸提温度从2 0 y ：升到6 0 c ，提取率总体呈上升趋 势，即随温度提高，提取的效果越好，但是提取温度过高时，由于乙醇的 挥发会给操作带来不便，并且5 0 以后提取率也已趋于平缓，所以正交实 验选取4 0 c 、5 0 、6 0 ( 2 - - 个水平。 ( 2 ) 固液比选择实验 在上述实验确定的浸提温度为5 0 c ，以浸提时问为0 5 ，选择固液比 表9 固液比对提取率的影响 分别为l ：1 5 、l ：2 0 、l ：2 5 、1 ：3 0 、l ：4 0 、l ：5 0 、l ：6 0 ，比较不同 固液比对其活性物质浸出率的影响，结果如表9 所示。 沈阳农业大学硕士学位论文 由表9 可见：随固液比的增加，提取率的值也逐渐增大。但是在料液 比大于l ：4 0 时提取率的升高已不明显。所以从节约溶剂和收集活性物质 的难易角度考虑应选取l ：4 0 为最佳固液比，正交实验选择i ：3 0 、1 ：4 0 、 l ：5 0 三个水平。 ( 3 ) 浸提时间选择实验 根据以上实验，确定固液比为1 ：4 0 ，浸提温度为5 0 不变的条件下， 在1 0 i n 一1 2 0 r a i n 之间做浸提实验，分析不同时间对对红风菜中活性 物质浸出率的影响，结果如表1 0 所示。 表1 0 浸提时间对提取率的影响 i j 出l e1 0t h ce f f e c to ft i r a e0 1 1e x t r a c t i o n 浸提时问( m i n ) 1 02 03 0 卯 9 0 1 2 0 s o a k r i gt e m p c 抟“h 提取率( )5 7 28 6 59 7 6i 0 0 21 0 1 1 1 0 1 6 r a r i o 表1 l 正交试验结果 t a b l e1 1 o r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l t s 从表1 0 可以看出：浸提时间从1 0 m i n 到1 2 0 m i n 的提取率依次升高， 3 1 协著m嘶三|嗡m麟慨 。3 2 3 2 。2 。弘m m 舯舯 8 “9 2 。2 3 。2 3 。2 3 m 朋 9 “9 l ，2 2 2，熙懈舯斯 8 9 l 1 2 3 粤5 6 7 8 9 n 心r 结果与分析 随这时间的延长可提高红风菜中醇溶性活性物质的浸出率。其中从l o m i n 到3 0 m i n 之间时升高较为显著，之后并不明显。选择3 0 m i n 、6 0 m i n 、9 0 m i n 三个水平。 由表1 1 对实验结果进行极差分析可得出影响浸提结果的各因素依次 是c ( 浸提时间) b ( 固液比) ( 浸提温度) ，以提取率为衡量最佳工 艺的条件，最佳因素组合为a 国：，即浸提温度为5 0 ，固液比为i ：4 0 ， 浸提时间为6 0 r a i n 。 二、红凤菜中酚类物质含量的测定 ( 一) 总酚含量测定一f 跳i n 酚比色法 酚类物质提取方法： ( 1 ) 采用热回流提取：称取干燥红风菜粉末5 o g ，加入无水乙醇 l o o m l ，热回流提取2 h ，过滤，残渣用无水乙醇洗涤，过滤，合并滤液， 定容至2 0 0 r a l 备用。 簦 8 3 41 l f1 2 1 3 91 6 6 81 9 4 6 浓度( u g m l ) c o n c e n t r a t i o n ( u g = l ) 幽8 对羟基苯甲酸的总酚标准曲线 f i g 8 s t a n d a r dc u i 、，eo f p h e n o l s ( 2 ) 醇提物得率测定：精确吸取提取液l o m l 于称量皿中，8 0 c j r 浴 沈阳农业大学硕士学位论文 挥去乙醇，1 1 5 烘箱中恒温l h ，冷却后称重，计算醇提物得率。 ( 3 ) 标准曲线的制作：精确称取0 1 3 9 9 对羟基苯甲酸，用少量无水 乙醇溶解后，加蒸馏水定容至5 0 0 m l 。取六支具塞试管，分别加入0 、0 6 、 0 8 、i 0 、1 2 、i 4 m l 的对羟基苯甲酸标液，用水稀释至l o m l ，各加i m l f o l i n 试剂及2 m l2 0 9 6 的n a c 0 3 ，沸水浴加热i m i n ，冷却并稀释至2 0 m l ，室温放 置3 0 r a i n ，测定o d ，。值，制作标准曲线，如图8 所示。 ( 4 ) 样品测定：将红风菜醇提液稀释一定倍数，取稀释液0 6 - 0 8m l 测定，每一试样重复测定三次，取o d ，。的平均值，从上述标准曲线计算相 应的总酚含量。 ( 二) 总黄酮含量测定- n a n 0 2 一a l ( n 0 3 ) 3 比色法 标准曲线的制作：精称芦丁0 0 2 1 9 ，用3 0 7 醇溶解定容至l o o m l ， 备用。取七支具塞试管，分别加入0 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 o m l 芦丁标液用3 0 乙醇李 足体积5 m l ，混匀，各加入o 3 m l0 5 的n a n 0 2 ， 混匀后静置5 m i n ，加0 3 m ll o 的a 1 ( n 0 3 ) 。，混匀后静置6 m i n ，再加入 世 鬟 昏 y = 0 - 1 2 8 5 , 一o 1 2 5 6 0 1 0 52 l3 l54 25 2 56 3 浓度( u g m l ) c o n c e n t r a t i o n ( u g m l ) 图9 芦丁的总黄酮标准曲线 f i g 9 s l a n d a r dc l i r v eo ff l a v o n o i d s 4 m i ，l m o l ln ao j ，以3 0 l 醇补足体积为l o m l ，混匀后静置l o m i n ，在波长 o o o_嚣口酗勘o o o 结果与分析 5 1 0 n m 处测定吸光值，制作标准曲线，如图9 所示。 根据实验所得吸光度计算红风菜中总酚和总黄酮含量，如表1 2 所示。 表1 2 红风菜中酚类物质含量( 干基计，) t a b l e1 2c o n t e n to fp h e n o l si ng y n u r ab i c o l o r ( b a o l id r ys u b s t a n c e ) 由表1 2 可知，红凤菜中含有较多的酚类物质，结合图4 可以得出， 酚类的含量与其清除自由基能力并没有明显得线性关系，表明酚类物质不 是红凤菜清除自由基的唯一关键物质。红风菜中含有的有效成分除黄酮、 酚酸类外，还可能有有萜类、内酯和多糖等组分，也具有相当的抗自由基 和抗氧化活性，有必要对它们进行深入研究。 三、红凤菜红色素的定性实验 1 色素的提取 各取红风菜粉末5 0 9 ，分别加入0