（分析化学专业论文）基于纳米au的几种新型葡萄糖生物传感器的研究.pdf

基于纳米a u 的几种新型的电 流型葡萄糖生物 传感器的研究 学科专业:分析化学研究方向:电化学与生物传感器 指导教师: 袁若 教授研 究 生: 钟霞 ( 2 0 0 2 3 9 6 ) 摘要 本文工作主要研究了基于纳米a u的几种新型的电流型葡萄糖生物传感器， 全文由两部分组成。 第一部分对近年来电 流型葡萄糖酶生物传感器及纳米粒子的发展与应用进 行了综述。 第二部分是实验部分，由四章组成。 在第一章里，采用自 组装技术首先在电 极表面形成二维 ( 2 d - m p s )结构， 再将纳米金溶胶固定在二维 ( 2 d - m p s )结构上， 最后利用纳米金属颗粒所具有 的生物兼容、比表面积大、 表面自由能高等性能， 使酶在纳米颗粒表面得到强有 力的固定， 在被测溶液中加入高氯酸. 三一 2 , 2 一 联毗睫合钻 ( m) 作为电子媒 介体， 从而制得了性能优良 的葡萄糖酶生物传感器。 在最优的实验条件下， 电极 在 葡萄搪浓度为4 .0 0 . 1 0 。 一5 .2 8 x 1 0 8 m o l / l 的范围内， 氧化峰电 流 值与 葡萄 糖 呈良 好的线性关系，线性相关系数r为0 .9 9 . 在第二章中， 我们用纳米金溶胶与聚乙烯醇缩丁醛 ( p v b ) 构成复合固酶基 质，以溶胶一 凝胶法固定葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 于电 聚合制备的普鲁士蓝 ( p b ) 膜修饰铂丝电极表面， 制备葡萄糖传感器. 第三章在电聚合制备普鲁士蓝 ( p b ) 膜修饰金电 极基础上，再聚合一层邻 苯二 胺 ( 1 , 2 - d a b ) ， 利用邻苯二 胺上自 由的 一 n h z 固 定 纳米金 颗粒， 最后纳米 金作为作固酶基质固定葡萄糖氧化酶 ( g o d ) ，从而制得了 性能优良 的新型葡萄 糖 传 感器。 实 验结 果 表明 聚合 邻 苯 二 胺的 最 佳p h值 为6 .0 , 酶 传感 器的 最 佳的 测 试 温度3 0 c , 测 试 液的 最 适宜 的p h值为6 .0 。 在 选 定的 工作 条 件下， 传感 器 的测定范围为2 .0 x 1 0 6 一 6 .o x 1 0 3 m o l / l ， 检出下限为1 x 1 0 6 m o t / l . 在第四章里， 通过离子交换牢固地固定在n a f i o n 膜中的硫茧来结合纳米金， 制 备了以 硫董和纳米 金为介体的电 流 型 葡萄 糖生 物传感器，固定 在n eo n 膜中的 硫荃能 有效 地在酶 和金电 极之间 传 递电 子。 探讨了p h值、 温度和抗坏血酸等物 质对此传感器生物的影响。此生物传感器选择性好、灵敏度高， 对葡萄糖线性响 应范 围 为2 .0 x 1 0 ， 一 4 .0 x 1 0 3 m o l/ l . 关键词:葡萄糖生物传感器，循环伏安法，电子媒介体，普鲁士蓝，纳米a u , ( 3 - 琉基，丙基)3甲氧基硅烷，邻苯二胺 abs t ract s e v e r a l n o v e l ty a m p e r o m e t r i c g l u c o s e b i o s e n s o r b as e d o n g o l d n a n o p a rt i c l e s a re d e s c r i b e d i n t h i s w o r k . t h e d i s s e rt a t i o n c o n s i s t s o f t w o p a rt s . p a r t i r e v i e w s t h e d e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f t h e a m p e r o m e t r i c g l u c o s e b i o s e n s o r a n d n a n o p a r t i c l e s i n r e c e n t y e a r s . p a r t i i i s e x p e r i m e n t s w h i c h h a v e b e e n d i v i d e d i n t o f o u r c h a p t e r s . c h a p t e r 1 s t u d i e s a g l u c o s e b i o s e n s o r s f a b r i c a t e d b y s e l f - a s s e m b l i n g o f d o u b l e l a y e r 2 d - n e t w o r k o f ( 3 - m e r c a p t o p r o p y l ) - t r i m e t h o x y s i l a n e ( mp s ) , g o l d n a n o p a rt i c l e s a n d g l u c o s e o x i d ase ( g o d ) o n g o l d s u b s t r a t e . a c l e a n g o l d e l e c t r o d e w a s f i r s t i m m e r s e d i n s o l u t io n o f n i p s i n e t h a n e l t o p r o d u c e a s e l f - as s e m b l e d m o n o l a y e r , t h e n t h e s i la n e u n i t e w e r e p o l y m e r i z e d i n t o a 2 d - n e t w o r k b y d i p p i n g i n t o a q u e o u s o f n a o h . t h e s e c o n d s i l a n e la y e r w a s t h e n f o r m e d b y i m m e r s i o n b a c k i n t o t h e mp s s o l u t i o n o v e r n i g h t , a n d t h e n t h e g o l d n a n o p a r t i c l e s w e r e c h e m i s o r b e d o n t o t h e t h i o l g r o u p s o f t h e s e c o n d s i l a n e la y e r . f i n a l l y , g o d w a s a d s o r b e d o n t o t h e s u r f a c e o f t h e g o l d n a n o p a r t i c l e s . t h e m o d i f i e d p r o c e s s w a s c h a r a c t e r i z e d b y e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y ( e i s ) a n d c y c l i c v o l t a n u n e t ry ( c v ) . a n a ly t ic a l p a r a m e t e r s s u c h a s p h , t e m p e r a t u r e w e r e a l s o s t u d ie d . w it h t h e a i d o f c o ( b p y ) 3 3 + a s a m e d ia to r in t h e s o l u t i o n , t h e e l e c t r o d e d i s p l a y e d e x c e ll e n t e l e c t r o c a t a l y t i c a l r e s p o n s e t o t h e g l u c o s e . t h e p e a k c u r r e n t s w e r e p r o p o r t i o n a l t o t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n i n t h e r a n g e o f 4 .0 0 x 1 0 t o 5 .2 8 x l 0 8 m o l/ l w i t h a c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f 0 .9 9 . mo r e o v e r , s u c h a m o d i f i e d e l e c t r o d e e x h i b i t s a g o o d s t a b i l i ty a n d s e n s i t i v i ty . c h a p t e r 2 r e p o rt s a g l u c o s e s e n s o r p r e p a r e d b y i m m o b i l i z i n g o f g l u c o s e o x i d a s e a n d n a n o p a r t i c l e s i n p o l y v i n y l b u t y r a l ( p v b ) o n a p r u s s i a n b l u e - m o d i f i e d p l a t i n i u m e l e c t r o d e w a s d e s c r i b e d . t h e p r o p e rt i e s o f t h e s e n s o r w e r e in v e s t i g a t e d . c h a p t e r 3 re p o r t s a n o v e l g lu c o s e b i o s e n s o r im m o b i l i z e d b y s e l f - as s e m b l in g p o l y m e r o f p r u s s i a n b l u e a n d 1 , 2 - d i a m i n o b e n z e n e s ( 1 , 2 - d a b ) , g o l d n a n o p a r t i c l e s a n d g l u c o s e o x id a s e ( g o d ) o n g o l d s u b s t r a t e . a c l e a n g o l d e l e c t r o d e w a s f i r s t i m m e r s e d i n s o l u t i o n t o p r o d u c e a s e l f - a s s e m b l e d l a y e r o f p b , t h e n e l e c t r o s y n t h e s i s o f p o l y - 1 ,2 - d i a m i n o b e n z e n e o n t h e s u r f a c e o f p r u s s i a n b l u e m o d i f i e d e l e c t r o d e , a n d t h e n t h e g o l d n a n o p a rt i c l e s w e r e c h e m i s o r b e d o n t o t h e f re e a m in e s o f t h e p o l y 1 , 2 - d i a m i n o b e n z e n e s m , fi n a l l y , g o d w a s a d s o r b e d o n t o t h e s u r f a c e o f t h e g o l d n a n o p a rt i c l e s . t h e m o d i f i e d p r o c e s s w a s c h a r a c t e r i z e d b y y c l i c v o l t a m m e t ry ( c v ) . a n a l y t i c a l p a r a m e t e r s s u c h a s p h , t e m p e r a t u r e w e r e a l s o s t u d i e d . t h e e l e c t r o d e d i s p l a y e d e x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i c a l r e s p o n s e t o t h e g lu c o s e . t h e p e a k c u r r e n t s w e r e p r o p o rt i o n a l t o t h e g lu c o s e c o n c e n t r a t io n in t h e r a n g e o f 2 .0 x 1 0 6 t o 6 .0 x 1 0 3 m o l/ l w i t h a c o r r e l a t i o n c o e ff i c i e n t o f 0 . 9 9 3 9 . mo r e o v e r , s u c h a m o d i f i e d e l e c t r o d e e x h i b i t s a g o o d s t a b i l i t y a n d s e n s i t i v i t y . c h a p t e r 4 d e s c r i b e s a n o v e l a p p r o a c h t o f a b r i c a t e a n a m p e r o m e t r i c b i o s e n s o r f o r t h e d e t e c t i o n g l u c o s e . i t h a s b e e n d e v e l o p e d b y m e a n s o f s e lf - a s s e m b l e d t e c h n i q u e a n d t h e o p p o s it e - c h a r g e d a d s o r p t i o n t o i m m o b i l i z e g o d o n g o l d n a n o p a rt i c l e s , w h i c h w e r e im m o b i l i z e d o n g o l d e l e c t r o d e m o d i f i e d n a f ) o n a n d t h i o n i n e ( t h ) i n t h i s s t u d y . t h e s e n s o r d i s p l a y s a n e x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i c r e s p o n s e t o t h e g l u c o s e . l i n e a r c a lib r a t i o n f o r g lu c o s e w a s o b t a in e d in t h e r a n g e 2 .5 x 1 0 5 t o 1 .8 x 1 0 3 m o l/ l w i th a c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f 0 .9 9 4 9 u n d e r t h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s k e y w o r d s : g l u c o s e b i o s e n s o r , c y ( 3 - m e r c a p t o p r o p y l ) - t r i m e t h o x y s i l a n e , g o l d p o l y - o - d i a m i n o b e n e c l i c v o l t a m m e t ry ,me d i a t o r , n a n o p a r t i c l e s , p r u s s i a nb l u e , 第一部分电 流型葡萄糖酶生物传感器、 纳米粒子的 发展与应用 第一章 电流型葡萄糖酶生物传感器 一、绪言 1 9 6 2 年， c la r k 和 琢o n s 在 纽 约自 然 科学 学 会的 论 文 集中 首 次 提出 了“ 在 化学 电 极 的 敏 感 膜中 加 入 酶以 实 现 对目 标 物 进 行 选 择 性 分 析” 的 设 想 1 o u p d ik e 和 h i c k s 于1 9 6 7 年报道了 测定生物组织和溶液中 葡萄糖的第一支酶电 极2 1 。该电 极 的问世标志着生物传感器的诞生。国际上从8 0年代初开始对生物传感器进行广 泛的 研究 ， 从 那以 后又开发了 生 物传感 器与 流动 注射分 析 ( f i a ) 及微机联用的 新 技术以及微型化的生物传感器13 1 生物传感器由两部分组成:其一是分子识别元件或称感受器，由具有分子识 别能力的生物活性物质( 如酶、 微生物、 动植物组织切片、 抗原或抗体等) 构成; 其二是信号转换器， 称基础电极或内敏感器( 如电流或电 位测量电极、 热敏电阻、 压电 晶 体、 场 效 应晶 体 管、 光 纤 等) ， 是一 个电 化学 或光 学 检 厕元 件。当 分 子识 别元件与底物 ( 待测物) 特异结合后， 所产生的复合物 ( 或光、 热等) 通过信号 转 换器转变为 可以 输出 的电 信号、 光 信号， 从 而达到 分析检 测的目 的 14 1 生 物传感器 有不同 的分 类法 (5 . 6 1 。 依照分 子元件可 分为: 酶传感器、 免 疫传 感器、 酶免疫传感器、 细胞器传感器中、 微生物传感器、 组织传感器等; 按所用 换能器可分为电极式生物传感器、场效应晶体管生物传感器、光学生物传感器、 热敏电阻式生物传感器等:按检测对象的多少又可分为单功能型和多功能型两 类。 在生物传感器中， 与电化学基础电极相结合的电化学生物传感器始终占 有最 重要的地位， 这类传感器又称为生物电极，它发展早，普及快， 研究内 容丰富。 而众所周知， 糖尿病是工业化国家里不容忽视的 死亡因素之一。 糖尿病患者必须 根据自身的血搪浓度来决定注射胰岛素的量以维持生命。 因而， 血液中的葡萄糖 浓度的测定在医学上有着极其重要的意义. 所以生物电极中能简便快速准确测定 葡萄糖浓度的葡萄搪氧化酶电极的研究自 第一支葡萄搪氧化酶电极诞生之日 起 一 直为人们关注的热点。 酶电 极是一种把酶膜固定在电 化学传感器表面构成的 最 1 普通的 酶基电 化学生物传感器。 酶选择性的催化生化反 应， 生成或消耗一种可被 电极测定的物质， 当反应达到稳态时， 电活性物质的浓度可以通过电 位或电流模 式 进 行 测 定 。 故 酶 生 物 传 感 器 分 为 电 位 型 和电 流 型 两 类 传 感 器 7 1 电 化学式酶生物传感器把固定化酶和电 化学传感器结合在一起， 因而具有独 特的优点: i它既有不溶性酶体系的优点， 又具有电 化学电极的高灵敏度: 2 . 由 于酶的专属反应性， 使其具有高的选择性， 能够直接在复杂试样中进行测定t8 1 因此，酶电极在生物传感器领域中占 有非常重要的地位。 酶电极的基础电极可采用碳质电极 ( 石墨电极、 玻碳电 极、碳糊电极) 、金 属电 极 ( p t , a u , c u , a g ) 、 金 属 / 非 金 属 氧 化 物电 极( a 1 2 0 3 , s i 0 2 ) 及 相 应的 修 饰 电极等等。 当酶电极浸入被测溶液， 待测底物进入酶层的内部并参与反应， 大部 分酶反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质， 当反应达到稳态时， 电活性 物质的浓度可以通过电 位或电流模式进行测定。 因此， 电 化学式酶生物传感器可 分 为电 位型 和电 流 型 两 类 9 1 电 位型传感器是指酶电 极与参比电极间输出的电位信号， 它与被测物质之间 服从能斯 特关系 1 0 。 而电 流型传感 器是以 酶促反应 所引 起的 物质量的 变化转变 成电 流信号输出， 输出电 流大小直接与底物浓度有关i i i 。 电 流型传感器与电 位型 传感器相比 较具有更简单、 直观的 效果， 且灵敏度也高， 是生物传感器领域中 研 究 最 多 的 一 种 类 型 12 - 2 0 1 电流型酶生物传感器的电极反应包括酶化学反应和异相电子转移反应。 其所 要解决的中 心问题就是使反应能 够在恒电位下快速进行， 将电子从反应中心转移 到电 极表面，形成响 应电流。电子转移的难易和速度决定着这类传感器的性能。 一般的氧化还原酶，它们都含有一个或几个氧化还原中心，但在绝大多数酶中， 氧化还原中 心一般处于内 部， 有的 酶外部还有一层糖蛋白 2 1 , 2 2 1 。 这种结构特点 阻碍了反应中心与电 极表面间的电 子转移及还原性辅酶的 有效循环2 3 1 。因此， 解决生物活性中心与电极表面间的电 子转移问题是电流型生物传感器成功的关 键。 二、葡萄糖氧化酶 制备电化学生物传感器的主要方法是使用生物成分作为换能器的酶电极。 有 少量 报道 是 利用 葡 萄 糖 脱 氢酶 制备 葡萄 糖传感 器 (2 4 1一 般 来讲葡萄 糖生 物 传 感 器是以葡萄糖氧化酶 ( g o d )作为生物识别成分. 葡萄糖氧化酶对0 - d - 葡萄糖具有高度专一的催化氧化作用。其主要的两种 来 源为 黑曲 霉 菌( a s p e r g i ll u s n i g e r ) 和 灰 绿霉 菌( p e n i c i l li u m g lu o u c u m ) 葡 萄 糖 氧化酶分子量为 1 5 0 至 1 8 0 k d a 的二聚体，其结构包括5 8 0 个氨基酸残基，f a d 辅因子， 6 个n 一 乙酞氨基葡萄糖残基， 3 个甘露糖残基和1 5 2 个溶剂分子、 压单 元的解离可能只在变性条件下发生，并伴随着辅酶f a d的损失。辅酶在氧化还 原酶中起重要作用。 氧化还原酶进行催化作用的过程中， 辅酶实际上起到电子和 质子中间体的作用，即辅酶f a d通过它的氧化态和还原态的不断循环而实现其 功能氧化还原中心f a d在拓扑学上与其他f a d键合蛋白非常相似。 分子氧催化氧化 葡萄糖 产生 葡萄糖酸内 醋和过 氧化氢2 5 1 ， 它是这类氧化酶 典型的两步酶反应过程。这个过程包括酶引起的葡萄糖氧化，辅酶黄素腺嗦吟- 二核昔酸 ( f a d ) 还原成f a d h 2( 反应 1 . 1 ) , 然后辅酶被氧分子氧化 ( 生物催 化剂的再生)并产生过氧化氢 ( 反应1 .2 ) : 0 - d - g l u c o s e + g o d ( f a d ) g l u c o s e - s - l a c t o n e + g o d ( f a d h 2 ) ( 1 . 1 ) g o d ( f a d h 2 ) + 0 2一 g o d ( f a d ) + h 2 0 2 ( 1 .2 ) g l u c o s e - s - l a c t o n e + h 2 0 g l u c o n i c a c i d ( 1 .3 ) 反应 1 . 1 产生的葡萄糖酸内醋在水媒质中水解为葡萄糖酸 ( 反应 1 . 3 ) ， 所以 总反应通常表示为: s - d - g l u c o s e + 0 2 + h 2 0 -g l u c o n i c a c i d ( 1 .4 ) 三、葡萄糖传感器发展历程 基于所涉及的电化学 ( 电荷传递) 机理，电流式葡萄糖传感器通常分为三代 第一代电流型葡萄搪酶生物传感器是通过氧来传递电子， 在这种情况下过氧 化氢浓度的增加或氧浓度的降 低都与葡萄糖浓度成正比， 因此检测酶反应过程中 氧的消耗和过氧化氢的产生2 7 1 ，即 可以 确定其含量。第一代酶电极基本上膜电 极，酶通过半透膜固定在电极表面附近，其机理如下: g l u c o s e + g o d ( f a d ) g l u c o n o l a c t o n e + g o d ( f a d 珑) g o d ( f a d h 2 ) +0 2 g o d ( f a d ) + h 2 0 2 ( 1 . 5 ) ( 1 . 6 ) h 2 0 2 0 2 + 2 h + 2 e( 1 .7 ) 这类传感器具有背景电流大、 响应特性差、 受环境中氧或过氧化氢浓度变化的影 响 、 干 扰 大 等 缺 点 2 81 电流式酶电极发展中存在的一大障碍就是氧化还原酶在未修饰的金属电极 上不能以实用装置需要的足够快的速度进行氧化还原反应。 酶电极的性能是由酶 的催化活性、酶活性中心和导电 基质之间电子交换速率决定的。g o d含有一个 核黄素 ( f l a v i n ) 辅基， 核黄素 辅基与酶牢固的结合在一起，根据核黄素辅基的 状态， g o d相应有氧化和还原两种状态。 电流型g o d酶电极的最主要的问题是 寻找一种能够将酶重新氧化， 从而避免氧依赖的方法， 这一问题很困难， 因为核 黄素辅基深埋在蛋白质内部， 不容易到达， 因而传统的金属电极使用性很差。 为 了克服这一问题，出 现了第二代电 流型酶生物传感器。 第二代电流型酶生物传感器以一些电子媒介体如二茂铁及其衍生物等代替 作为电子受体的氧， 这些电子媒介体 ( m) 能够从酶的氧化还原中心迅速传送电 子到工作电极的表面， 并往复传递电 子加强了酶与电极间的直接电子传输， 起到 了酶与电极间的电子开闭器作用， 加速了电极反应。 这样的媒介体首先必须要有 迅速的异相 ( 电极反应) 动力学和迅速的均相 ( 酶反应) 动力学动力学， 而且媒 介体要对氧稳定， 无毒性， 具有一适宜的氧化还原电势。 电 子媒介体加强了 酶与 电极间的直接电子传输， 起到了酶与电极间的电子开闭器作用， 加速了电极反应， 降 低了 环境干扰， 克服了 第一代电 流型传感器的 上述缺点 2 9 .3 3 1 。 在这些传感器中 反应 ( 1 .2 )由涉及媒介体的过程代替: g o d ( f a d h 2 ) + f e 3 ( c p ) 2 se - 一 i g o d ( f a d ) + f e 2 + ( c p ) 2 ( 1 . 8 ) f e e + ( c p ) 2 一f e 3 ( c p ) 2 ( 1 .9 ) 二茂铁的氧化 ( 产生信号的反应)可以在很低的电位下 ( 通常+ 0 . 1 5 v至 + 0 .2 5 v ) 发生， 而不一定需要催化的或贵金属电 极。 在如此低的电位下， 其他可 氧化化合物的干扰是很小的。 由于氧与产生信号的过程无关， 传感器的信号不依 赖于 氧的 浓度3 4 -4 3 1 . 二茂铁 基的 葡萄 糖传感器如图 所示: f e ( c p ) , 口 入 。 fe=+(c pu 四 v g l u c o s e g l u c o n i c a c id 图1 . 1二茂铁媒葡萄糖传感器工作原理 以 二茂铁及其衍生物为媒介体的葡萄糖传感器是一个非常成功的办法4 4 -4 6 1 起初二茂铁及其衍生物媒介体只是己 包埋的方式固定在酶膜中， 这样其性能不稳 定而且渗漏很严重。 一些 研究 人员 4 7 1 通过共价结合 氧化还原 媒介体修饰膜， 来 改善媒介体的性能。把 1 2 个二茂铁梭酸分子一个 g o d分子表面偶合。这样就 能有效地将电子传递至金属电极， 但这种修饰方法使酶的稳定性变差。 用二茂铁 醋酸来修饰g o d则酶的稳定性能有所改善。此外，也有用四氰基喳琳并二甲烷 c t c n q ) 等 媒 介体 的 报道 4 8 1 。 长 链的 媒 介 体， 由 较大的 静电 斥力 引 起的 灵 活 性 较大， 因而能 够渗入到g o d活性中 心内部， 这样的媒介体性能较好4 5 1 。 一系列 表面活性饿的无机金属复合物的电 子媒介体4 9 1 ， 通过改变w - 官能团可得到饿的 不同的表面活性，它可以与石墨电极表面及g o d共价结合。但这种媒介体与氧 的竟争作用明显，氧饱和溶液中传感器响应仅为氮饱和的 5 0 % - 6 0 %。也有报道 5 0 ! 亲和性粘合糊和亲水性阳离子媒介体比 憎水性粘合糊及憎水媒介体性能 优越 得多， 这种传感器可连续工作1 2 小时，电流降低至最初的5 0 %。除了媒介体与 氧的竞争， 使得第二代生物传感器仍受空间氧的影响外; 由于媒介体自 身的体积 较小， 因而使得这种传感器存在媒介体的渗漏和毒性问题。 通过吸附到电极上或 者包埋其至一种惰性高分子 膜x 4 .3 7 或者是蛋白 基质【4 0 -4 2 中固 定化制备的 传感器 用于体内时， 渗漏媒介体和传感器损坏可能产生严重的副作用， 这就限制了它在 体内的使用。 第三代电流型酶生物传感器中酶与电极之间电子交换不经过动态媒介参加， 而直接进行酶与电极之间的电子传递。 蛋白 质电 化学表明， 电子交换速率依赖于 蛋白 质的性质、电 极材料和电 极/ 电 解质界面的状态5 1 ， 只有一些分子量相对低 的电 子级体 如姻胞色素c 、 细胞色素c 5 . 铁氛化还琢蛋白、 黄素氧化还原蛋白 和一些其它蛋白 质， 可以 在金 属酶电 极上观测到电 子的 直接传递5 2 1 。 高分子量 酶的活性中心深埋在多肤结构内部， 因而很难发生直接电子传递。 有机金属具有 许多其它导电材料不具有的特性， 这种酶电 极具有一个基本特征。 首先， 能够在 现场产生媒介体， 有机金属成分的 变化可以改变媒介体的性质和它的溶解性， 而 且有机金属的耐腐蚀性也很重要。第二，有机金属的表面张力远低于金属电极。 因而酶吸附在有机金属上时的变性会很少。 而且有机金属成分变化可以改变它的 静电位， 这样就可以吸附大量活性的酶。 第三， 有机金属的结构与半导体聚合物 一样可以 在高导电 基质上引入生物催化剂1 5 3 1 ， 在导电 有机盐 ( 具有电 子导电 性 的电荷传递有机复合物) 构成的电极上由葡萄糖氧化酶引起的葡萄糖氧化反应与氧浓度无关。 这种电 极作用的机理还不 清楚， 不清楚 还原 态的 酶的 氧化是 在电 极表面5 4 1 进行还是通 过低浓度的电 极溶解产物的媒介体5 5 而进行的， 一个假说是在电 极表面 g o d ( f a d h 2 ) 直接电 氧化而不是由 氧分子引 起的 氧化 ( 反应1 .2 ) 5 6 1 : o o d (、 o h z o rg an ic s altg o d (f a d h 2) -10 g o d (f a d )+ 2 h -+ 2 e ( 1 .1 0 ) 方程 ( 1 . 1 0 ) 假定酶和电 极间存在直接的电子传递。 第三代传感器工作电势 较低 ( 通常+ 0 .2 一 + 0 .4 v ) ， 具有媒介体传感器的所以 优点， 而且它们是典型的固 体状态的传感器。 在制备过程中没有可溶或部分溶解的化合物。 基于这种原理制 成的 传感 器己 成功的 用于 检测鼠 大 脑中 的葡 萄糖浓 度1 5 7 ,5 8 1 。 最常见的 第三代传感 器 是 使 用 聚 毗 咯 5 9 ,6 0 1 ， 四 氰 基 哇 琳 并 二甲 烷( t c n q ) 和乙 炔 聚 合 物 6 1-6 4 等， 通 过恒电位或循环伏安法制备. 利用有机导电盐固定葡萄糖氧化酶有两种方式， 用其作为新的电极材料， 或 者将酶固定在有机聚合物中。 酶包埋在电合成的聚合物中而制备的电流式酶电极 是典型的第三代传感器制备方法。 这种方法通常涉及一种较适宜的单体在含有酶 的支持电解质中的电化学氧化， 从而在电极表面形成一层聚合物膜。 这样可以更 好的利用有机导电盐的性能。 这种方法的优点是: 一步就能 完成所有化学物质的 制备，可以控制酶的空间分布和酶层厚度，有可能制备多层和/ 或多酶结构。但 是，电化学固定酶具有一些缺点:导电聚合物基酶膜对于阴离子内源 ( e n d o g e n o u s )电活性物质缺少选择性透过性 ( 如抗坏血酸、尿酸) ，这些电 活 性物质能直接在聚合物表面直接氧化， 因而抗干扰性较差。 在体内的进一步应用 受到所涉及的电 极材料的生物相容性的限制。 一些底物和酶事实上与一定的聚合 基 质或电 聚 合过 程中 的电 极 表面 产生 的 化学 环 境不 相 容 6 5 1 。 并 且 似乎 只有 酶 在 电 极表面表现出 有效的非变性吸附 时，电 化 学固 定才是成功的 6 6 1 。 甚至在形成 较厚的导电聚合物时， 将酶包埋至生长的膜中也要求聚合物和酶间具有静电亲和 力。 例如， 正电 荷蛋白 质不能 有效 地包埋聚 毗咯膜中6 7 1 。 而且包埋酶聚合物的 老化 ( 即扩散分离性能的改变)和固定酶量较少 ( 典型是一个单层) ，会显著地 减少这些生物传感器的长期稳定性。 克服上述问题的一个方法是“ 杂化” 生物传感器设计。 导电聚合物常常与导 电 媒介体结合使用。 较为成功的是在聚阴离子搀杂聚毗咯修饰的电极上生长垂直 于表面的四 硫富瓦烯一 四氰基哇琳并二甲 烷) ( t t f - t c n q ) 树状晶体结构， 并通 过戊二醛将g o d交联于其中 6 8 1 o g o d与电 极的牢固结合使传感器性能非常稳 定。 工作电压较低 ( 0 .2 5 v v s . a g / a g c l) ， 使用寿命较长， 连续使用1 0 0 天仍保 留最初电流的4 0 %， 受氧及其体液中的电活性物质干扰较小。 将电合成非导电聚 合物的选择透过性优点，与经典酶固定方法相结合也得到了较好的结果。 t o s h i o y .等 6 8 1 在聚1 ,2 一 二 氨基苯膜修饰的 电 极 上通过溶 胶一 凝胶 法固 定g o d 。 这样可以 利用聚 1 ,2 一 二氨基苯的选择透过性，以及溶胶一 凝胶法的高酶负载。 a .g u e r r i e ri 等 7 0 1 通过戊二醛将葡萄糖氧化酶与牛血清蛋白 交联至过 氧化聚毗咯修饰的电 极 上。 交联过程保持了固定化酶的高负载和长期稳定性， 同时保留了底层过氧化聚 毗咯的选择透过性。 这样制备的葡萄糖传感器具有高灵敏度、 较宽的线性范围( 达 1 2毫摩尔) ，完全避免了干扰，响应时间仅为几秒钟。连续工作 2 4小时，响应 无明显变化， 储存寿命超过3 个月。 但是， 在这些情况下，电聚合物只起选择透 过性膜的作用。 而未作为酶电子传递发生的部位。 利用聚毗咯制备的生物传感器， 工作电位仍很高( 0 .6 5 一 0 . 7 v ) 。 这样很难说聚毗咯所起的作用是直接电子传递。 因而用导电 有机材料制备第三代传感器很困 难。 需要寻求其它新型的材料和方法 制备直接传递电子的传感器。 近年来一些文献中 报导了在金溶胶、 石英玻璃、石墨、多孔二氧化硅7 1 - 7 2 1 以 及 粘土 1 7 3 1 等无机材料中固定酶， 它为生 物传感器的发展 翻开了 新的 一页。 金 溶胶纳米颖粒由于吸附生物大分子后仍能保留其生物活性， 因而最初广泛用于电 子 显 微镜中 标记生 物分子 1 7 a 7 s a a .l .c r u m b l i s s 7 7 1 等人 研究了 碳酸脱水 酶( b c a ) . 黄嗦吟氧化酶 ( x o ) 、辣根过氧化氢酶 ( h r p ) .葡萄糖氧化酶可以 牢固地吸附 在3 0 或5 0 n m的 金纳米颗粒表面，实 验表明固定化酶的活性与天然酶活性基本 相同。所以九十年代初开始，金纳米颗粒溶胶被用于固定化酶制备生物传感器。 a .l . c r u m b l i s s e t a l j7 8 使用5 0 nn 的金纳米颗粒 溶胶吸附 碳酸脱水酶， 黄嗦吟 氧化 酶 ( x 0 ) . 辣根过氧化氢酶 ( h r p ) 或者葡萄糖氧化酶， 然后电沉积在铂盘电极 或玻碳电极表面。 这些电 极可以有效的保留固定化酶的活性; 并能对酶底物产生 电化学响应。但是文中未对生物传感器的电化学性能进行深入的研究。 j .c .s t o n e h u e m e r e t a f 7 9 1 报导 用3 0 - 5 0 n m的 金纳米颗粒溶 胶吸附 辣根过 氧化氢 酶 ( h r p ) 。 这种酶电极的 线性范围为:0 . 1 - 2 0 0哪 ， 测定下限小于。 l g m o l / l , 并且稳定 性和重现性也很好。 j . z h a o e t a l . 8 0 1 用相似的方法制备了黄嗓吟氧化酶 ( x o ) 一 金纳米颗粒电极。 这种传感器的灵敏度高于当时其它文献报道的x o电 极的 灵 敏度。 也有 报道 8 i 利 用金纳米颗粒制 备出 直接电 子 传递的 过氧化氢电 极。 这 种电 极可以 工作 在。 v ( a g / a g c l ) 下。 因此 纳米颗粒将很可能 是制备直接电 子传递的第三代生物传感器的 新型材料。 但是目 前国内外对纳米可以 固定化酶的 研究还很少， 而且所使用的纳米颗粒只有金、 二氧化硅两种， 颗粒的粒径也比较 大 ( 几十纳米) 。很有必要对此进行深入的研究。 四、电子媒介体 电子媒介体是指能将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表 面， 从而使电 极产生 相应电 流 变化的 分子导电 体in ) 。 现就目 前国内 外研究的电 子 媒介体的种类、 特点及由其修饰的生物传感器的性能进行综述。 1 .二茂铁及其衍生物 二茂铁及其衍生物之所以能在生物学、 医学、 微生物学等方面得到广泛应用， 这是由它们结构和性质的 特殊性决定的8 3 , 8 4 1 。首先，二茂铁及其衍生物的亲油 性， 使得这些化合物能顺利地通过细胞膜， 从而与细胞内的各种酶、 d n a . r n a 等物质起作用， 因而有可能作为治疗某些疾病的 药物。 其次， 二茂铁及其衍生物 具有氧化还原可逆性， 这一 特点使其在生物酶的作用下，能参与各种代谢作用。 第三， 二茂铁及其衍生 物的芳香性使得这些化合物能像简单的芳环一样， 容易发 生取代反应， 但是， 它们又不同于一般的芳香化合物， 二茂铁及其衍生物的夹心 结构使这类分子具有一定的厚度， 这一特点能阻止二茂铁及其衍生物接近某些酶 的活性部位，因而具有选择性 8 5 1 。 另外，二茂铁及其衍生物的低毒性也是人们 对其感兴趣的原因。 二茂铁及其衍生物是酶生物传感器良 好的电 子媒介体8 6 . 9 1) , y a b u k i 用离子 聚合物将葡萄糖氧化酶 ( g o d )和二茂铁物理包埋于玻碳电极上，制成了葡萄 糖 传感器 9 2 1 . 该传感 器具有突出 的 灵 敏度， 其检测上下限 分别 为0 .2 m m o l / l 和5 i mo l / l e y 2 . 3 p r膜修饰铂电极 ( p b / p t )制备 p b / p t 的 制备采用 恒电 位电 沉 积的方 法 ) i i 。 在电 沉积p b 膜之前， 将直 径为 1 m m的铂丝电极， 用金相砂纸将其抛光， 再用1 : 1 的硝酸煮沸5 m i n ， 经二次水 洗净后在二次水中煮沸， 待铂丝冷却后用滤纸擦净， 然后将其分别在乙醇、 二次 水中 超声洗涤. 然后， 将已 处理好的电 极放入新鲜配制的2 .5 m m o l / l k 3 f e ( c n ) 6 + 2 .5 m m o l/ l f c c 1 3 + 0 . 1 m o l / l k c 1 + 0 . 1 m o l / l h c l 溶液中， 在+ 4 0 0 m v ( v s s c e ) 电 沉积 l o o s ， 再在0 . 1 m o l / l k c i + o . i m o l/ l h c 1 溶液中一 5 0 m v -3 5 0 m v范围内进 行 循 环 扫 描 使得电 极稳 定. 制 得 的电 极 于1 0 0 下 恒温1 h ， 再 于p h 5 .5 的 缓冲 液中一 5 0 m v还原6 0 0 s ， 最后在该缓冲液中 一 5 0 m v - + 3 5 0 m v进行循环扫描5 0 圈. 取出电极用蒸馏水冲洗后备用。 2 . 4 酶电极的制备: 将配 好的 葡萄 糖氧化酶 溶液1 0 川 和0 .3 m l 纳米 金溶 胶混 合， 几分 钟后再 将3 m l 的2 % ( w / v ) p v b的无水乙 醉溶液倒入混合液， 并用铂丝搅拌浸涂其中1 0 m i n , 使 葡 萄 糖氧 化酶 吸附 组 装到 铂电 极 上， 取出 晾 干 后， 悬 于p h 7 .0 磷 酸缓 冲 液上 方在4下保存过夜。 2 .