（农产品加工及贮藏工程专业论文）电刺激和延迟冷却对牛背最长肌中Calpains影响的研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 接要 大量的试验调查证实：消费者可以将不同嫩度的肉区分出来，并愿意 购买较好的牛肉。在一定程度上，嫩度的高低决定牛肉食用品质的优劣( b o l e m a ne ta l ，1 9 9 7 ) 牛肉嫩度除了受牛品种、年龄等生理因素影响外， 牛屠宰后的处理方式包括冷却速度、电刺激处理等都对牛肉的嫩度有显著 影响。肉类科学的大量研究已经证实，c a l p a n 9 依钙蛋白酶或钙激活中 性蛋白酶是肉成熟嫩化的主要蛋白酶。本试验在前人研究的基础上，通过 d e a e 离子交换层析对牛背长肌中钙激活酶( c a i p a i l l s ) 分离纯化的研究，确 定了c a l p a i l i s 分离纯化的条件，并分析了电刺激和延迟冷却对c a l p a i n s 活性的影响，探讨其嫩化枫理。 本研究的主要实验结果如下： l 通过d e a e 离子交换层析对牛背长肌中钙激活酶( c a l p a i n s ) 的分离研 究，比较了d e a e s e p h a r o s e f f 和d e a e s e p h a c e l 对钙激活中性蛋白酶( c a l p a i n s ) 的分离效果。结果表明：两者对c a l p a i n s 的分离效果，没有显著 差异( p o 0 5 ) ，但是d e a e ：s e p h a c e l 不耐压，分离时间长，重现性不稳定， 因此选择d e a e s e p h a r o s e f f 分离纯化c a l p a i n s 。 2 d e a e - s e p h a r o s e - f f 分离c a l p a i n s 时，通过试验表明，选用柱高2 0 c m 、流速2 0 m v m n 、两步的线性的梯度、第一步线性梯度浓度为o 2 1 5 m m 、0 2 3 5 m m 能较好的分离纯化c a l p a i n s 。 3 将4 组杂交黄牛按标准屠宰工艺屠宰，通过测定不同处理组的c a l p a i n s 的活性，结果显示：牛背最长肌在宰后l h ，电刺激和延迟冷却处理组 显著的提高了l _ t - c a l p a i n 的活性，即电刺激和延迟冷却对牛背最长肌中的“ - e a l p a i n 的活性有明显积极的作用( p o 0 5 ) 。当t - c a l p a i n 被激活以后，随 着宰后时间的延长，牛背最长肌中的r t - e a l p a i n 的活性迅速降低，宰后2 4 h 与宰后1 h 相比，电刺激组、延迟冷却组和对照组的活性都显著降低， 但与对照组s t - e a l p a i n 的活性降低的速度相比。电刺激和延迟冷却组i _ t - e a l p a i n 的活性降低的程度更大些。表明在宰后贮存中，1 1 - e a l p a i n 的活性发生 更大的程度的降解。 4 牛背最长肌在宰后1 h ，延迟冷却和电刺激处理对牛背最长肌中的n l - e a p a i n 的活性也有明显的作用( p o 0 5 ) ，但随着宰后时间的延长，除e s & d c 的活性略有降低外，d c 、e s 组的活性变化不大。以上结论表明宰后 l h 至2 4 h 的过程中m - e a l p a i n 自身并没发生自动降解，因此m e a p a i n 在宰 后蛋白水解中并不起主要作用。 5 在宰后1 h ，延迟冷却和电刺激处理组显著的提高了c a l p a s t a t i n 的活 性，即延迟冷却和电刺激处理对牛背最长肌中的c a l p a s t a t i n 的活性有明显 积极的作用( p o 0 5 ) 。随着宰后时间的延长，牛背最长肌中的c a l p a s t a t i n 的活性迅速降低，与图2 8 、2 9 相比，c a l p a s t a t i n 的活性的降低速率比肛c a l p a i n 降低的慢，从而导致了肉的嫩化。 6 电刺激和延迟冷却处理的结合对牛肉中c a l p a i n 和c a l p a s t a t i n 的活力 影响比电刺激组显著，表明电刺激效果与冷却程序有显著相关性。 关键词：电刺激：延迟冷却；c a l p a i n 活性；分离与纯化；离子交换层析； 牛肉嫩度 i i 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t m a n ys t u d i e ss h o wt h a tc o n s u m e rc a nc o m eo u tm e a td i s t i n c t l ya n d w o u l dl i k et op u r c h a s et h eg o o db e e f o nt h ec e r t a i nd e g r e e ，g o o da n d b a df o rm e a tt e n d e r n e s sd e c i d eb e e fe a t i n gq u a l i t y e x c e p tf o rp h y s i o l o g i c a lf a c t o r si n c l u d i n gb r e e da n dy e a r sa f f e c tt e n d e r n e s so fb e e p r o e e s s i n gm o d e sa f t e rs l a u g h t e rs u c ha se l e c t r i c a ls t i m u l a t i o na n dc h i l l i n gs y s t e ma l s op l a yi m p o r t a n tr o l e si nm e a tt e n d e r i z a t i o n m o s tr e s e a r c h e r sh a d p r o v e dt h a tc a l p a i n sa r gt h ep r o t e o l y t i es y s t e mt h a tc a u s e sp o s t m o r - t e m p r o t e o l y s i sa n dt e n d e r i z a t i o ni nm e a t b a s e do np r e c e e d i n gr e s e a r c h e r s ，t h ep u r p o s eo ft h i sr e s e a r c hi st os t u d yc a l p a i n sa c t i v i t i e so fb o v i n em 1 0 n g i s s i m u sa n df i n dc o n d i t i o n so fp u r i f i c a t i o no fc a l p a i ns y s t e mb yi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y d e a e - s e p h a c e l a n dd e a e s e p h a r o s e f fw e t ec o m p a r e dt oq u a n t i f yc a l p a i n sa c t i v i t i e sf o rc o m p a r a t i v ep u r p o s e e f f o c co fe l e c t r i c a ls t i m u l a t i o na n dd e l a yc h i l l i n go nc a l p a i n so fb o i n el o n g i s s i m u sw e r ea n a l y z e da n dt h em e c h a n i s mo fb e e fa g i n gw a sd i s c u s s e di nt h i sp a p e r t h em a j o rt e s t i n gr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 c a l p a i u sa c t i v i t i e so fb o v i n em 1 0 n g i s s i m u sb yi o n e x c h a n g ec l a m m a t o g r a p h yw a ss t u d i e d d e a e - s e p h a e e la n dd e a e - s e p h a r o s e f fw e r e o o m p a r e dt oq u a n t i f yc a l p a i n sa c t i v i t i e sf o rc o m p a r a t i v ep u r p o s e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a td e a e - s e p h a r o s e - t tw a ss u ) e t i o rt od e a e s e p h a e e l 2c a l p a i ns y s t e mp u r i f i e db yd e a e - s e p h a r o s e - f fc o l u m nw a ss t u d i e d i t s h o w st h a th e i g h t4 0 e m 2 0 m l so fv e l o c i t ya n dt w ol i n e rg r a d i e n t , 0 2 1 5 r a m 、0 2 3 5 m mo f d e n s i t yo f o n es t e pc a ns e p a r a t ea n d p u r l 母c a l p a i n s b e t h , 3f o u rg r o p ec r o s s b r e dy e l l o wc a t t l ew e r es l a u g h t e da c c o r d i n gt os t a n d a r ds l a u g h t i n gp r a c t i c e s 1 1 l er e s u l t ss h o w e dt h a te l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n a n dd e l a yc h i l l i n ge x e r t e dp o s i t i v ee f f e c t s0 1 1 i t - e a l p a i na c t i v i t y ( p 0 0 5 ) s ob o t hf a s t e db e e fa g i n gp r o c e s ss i g n i f i c a n t l y ( p o 0 5 ) b u ti _ t - c a l p a i n i i i g r a d u a l l yl o s ti t sa e t i v i t yw i t l lp o s t m o r t e ms t o r a g e ， 4a f t e rl hp o s t m o r t e m ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a te l e c t r i c a ls t i m u l a t i o na n dd e l a yc h i l l i n gi n c r e a s ei nt h el e v e lo fm - e a l p a i nc o m p a r e dt ot h e i n i t i a lv a l u e ( p 0 0 5 ) 5a f t e re l e c t r i c a ls t i m u l a t i o na n dd e l a y c h i l l i n gt h e r ew a sas l i g h ti n e r e a s ei nt h el e v e lo fc a l p a s t a t i nc o m p a r e dt ot h ei n i t i a lv a l u e ( p 0 0 5 ) ， s u b s e q u e n t y , t h ep o s t - m o d e ml e v e lo fc a l p a s t a t i nd e c l i n e dr a p i d l y , t h er a t eo fl o w e r i n go fc a l p a s t a t i nw a sm o r es l o w e rt h a ni u - c a l p a i nl e v e rf o rb e e fl d s ob o t hf a s t e db e e fa g i n gp r o c e s ss i g n i f i c a n t l y f p o 0 5 ) h o w e v e r , t h ee f f e c t so fe s & d ce x e r t e dm o r ep o s i t i v ee f f e c t so nc a l p a s t a t i na c t i v i t yc o m p a r e dt oe l e c t r i c a l s t i m u l a t i o na n dd e l a yc h i l l i n g ( p o 0 5 ) 6t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c t so ft h ee s & d co ne a l p a i na l l de a l p a s t a t i no fb e e fw a sc o n c e r n e dt ot h ec h i u i n gs y s t e m d e l a yc h i l u n g s y s t e mi m p r o v e dt h ee f f e c to fe l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n k e yw o r d s ：e l e c t r i c a ls t i m u l m i o n ；d e l a yc h i l l i n g ；c a l p a i na c t i v i t i e s ；i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ；a b r u p t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；b e e ft e n d e r n e s s i v 符号或缩略词说明 e s ：e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n , 电刺激 d c ：d e l a yc h i l l i n g , 延迟冷却 e s & d c ：e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o r & d e l a yc h i l l i n g ，电刺激延迟冷却 c k ：c h e e k , 对照组 h ：h o u r , d , 时 d ：d a y 天 p o 4 5 ：硫酸铵分级 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体；均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：耻聋 导师签髫墨蟛 日 期：垒塑u j 1 山东农业大学硕士学位论文 引言 嫩度是决定肉品品质的重要指标( l a w r i e ，1 9 9 8 ；b r o o k s ，2 0 0 0 ；l o n e r g a n ，2 0 0 1 ) ，同时也是消费者最为关心的肉的食用品质之一。k l h u f f m a n 等的 调查发现，9 8 的消费者所能接受的牛肉的剪切力值( w b s v ) 小于4 1 千 克。由于肉质的嫩度过硬，极大制约了牛肉产业，特别国内肉牛产业的发 展。此外，即使经过相同的标准屠宰程序，不同牛个体嫩度之间存在很大 不一致性和可变性。如何提高牛肉嫩度和产品质量的一致性? 这给牛肉产 业的发展提出了更高的要求。从根本上解决牛肉产业发展的先决条件是要 了解肉类的嫩化机制。 肉类科学的大量研究已因此经证实，c a l p a i n s 一依钙蛋白酶或钙激活 中性蛋白酶是肉成熟嫩化的主要蛋白酶。它主要是通过对肌原纤维细胞骨 架蛋白的降解作用来改善肉的嫩度。由于嫩度的产生、影响因素和嫩度改 善的方法一直是肉类科学研究的热点问题，因而c a l p a i n s 能水解肌原纤维 的观点一经提出就成为肉类科学研究中最为关注的问题。因此研究 c a l p a i n s 在牛肉中的嫩化机理和促进嫩化的方式方法对提高牛肉的食用品 质具有重要意义! l 肉的成熟杌理研究进展 1 1 肉中的c a l p a i n s 家族 迄今为止，通过基因分析发现在动物中存在的c a l p a i n s 超家族共有 1 3 个成员，这些成员广泛存在于高、低等动物和人类组织中。对c a l p a i n s 的最初研究是在生物化学和医学领域内进行的。2 0 世纪6 0 年代后期，肉 类科技工作者发现肉的嫩化是肉中蛋白分解的结果后，肉嫩化机制的研究 焦点才从研究结缔组织的含量和交联转移到对肉中各种骨架蛋白起降解 作用的物质研究上。经过近2 0 年的研究，肉类科学家终于确定在溶酶体 组织蛋白酶( l y s o s o m a lc a t h e p s i n s ) 、钙激活中性蛋白酶( c a l p a i n s ) 和蛋白酶 体( p r o t e o s o m e ) 上，( 3 0 l l 认为作为嫩化的蛋白酶必须满足以下几个条件： 这种酶必须是肌肉内源存在的： 此酶在离体条件下对肌原纤维的降解必须与肉成熟过程中蛋白降解的 方式相同或相似： 这种酶必须可以与肌原纤维充分接触。 研究发现在这几种候选酶中，只有c a l p a i n s 完全复合以上三点要求。 肉类科学领域划时代的成就( 也称为肉类科学上的第二次革命) 是弄清 i t e a l p a i n 是尸僵后肉类嫩化的关键酶，使人类对肉类科学的认识从本质上 前进了一步。与肉类嫩化有关c a l p a i n s 家族成员主要包括和m - c a l p a i n 、 i i - c a p a i n ：c a l p m n 3 、c a p a i n l o ( 如图1 ) 及m - c a p a i n 和l _ t - e a l p a i n 的内源性 抑制剂c a l p a s t a i n ( 如图3 、。 1 1 1c a l p a i n l 和c a l p m n 2 的结构 1 9 6 4 年，研究发现c a l p a i l l s 具有一定的蛋白分解活性，1 9 7 6 和1 9 8 0 年先后分离得到m c a i p a m 、i i - e a l p a i n 及两种酶的内源性抑制剂，1 9 8 1 年 被正式命名为m c a l p a i n 、i t c a p a i n 和c a l p a s t a t i n ( e c 3 4 2 2 1 7 ) c a l p a i l l s 为半胱氨酸肽链内切酶( e l c e ，1 9 9 6 ) ，主要分布于z 盘附近， 最适p h 为7 5 ( 7 2 8 2 ) 当有e g t a ，e d t a 等钙离予络合剂、锌离子或 酶的抑制剂e 斟。p m s f 等存在时会抑制其活性( d e l g a d o , 2 0 0 1 ) 。c a l p a i n s 有两种活性形式，一种可被g m o l 水平的c 2 + 激活，称 l - e a p a i n ( c a l p a i n i ) ；另一种可被m m o l 水平的c a 2 + 激活，称m e a p a i n ( c a l p a i n i i ) 。达到 最大活性的1 也时，两者被激活所需要的钙离子浓度分别为3 5 0 u m 和4 0 0 8 0 0 p m ，c a p a i n 的活性又受其所处环境p h 、温度、离子强度、抑制 剂和激活剂等多种因素的影响( v o i l e ，1 9 9 9 ；k e n d a l l ，1 9 9 3 ) 。 自从c a l p a i n s 家族的两个成员m - c a p a n 和p c a l p a i n 被分离纯化以后， 学者们就开始了对其性质和结构的研究。两者在脊椎动物所有组织中都存 在，是一种广泛存在的蛋白酶。在非活化状态下，t - c a l p a i n 和n l c a p a i n 都是异二聚体，小亚基分子量约3 0 k d a ，两种c a p a n 的小亚基是同一基 2 山东农业大学硕士学位论文 图1 c a l p a i n s 迄今为止发现的所有成员的家族 f i g la l lm e m b e r so fc a l p a i n su pt ot h ep r e s e n td i s c o v e r s 图2 人类非活化形式m - e , a l p a i n 四级结构 f i 醇c r y s t a l l o g r a p h i cs t r u c t r co f n o n a c t i v em - c a p a i n 因( e a p n 4 ) 编码的，主要起调节作用；大亚基分子量约8 0 k d a ，两种c a l p a i n 的大亚基( c a p n l 和c a p n 2 基因编码) 的序歹l j 只有5 0 的同源性，主要起 催化作用。大亚基上包括c a 2 + 结合位点、疏水片段和特定蛋白结合位点， 小亚基包含有4 个结合位点的钙调素样结构和对膜上磷脂酯( 包括作为第 3 二信使的磷脂酰肌醇二磷酸1 起决定作用的富含甘氨酸的序列。 随着x - 射线衍射技术的应用，c a l p m n l 和c a l p m n 2 的高级结构( 如图 2 ) 也被阐明，如图3 所示，大亚基中含有结构相似的四个结构域，即结构 域i ，小亚基包括两个结构域，即结构域v 和。结构域i 是c a l p a i n 中较短的前结构域，当钙离子最初激活c a l p a i n ( 1 、2 ) 时，酶在结构域i 间 断裂，成为活化状态：结构域i i ) 又由两个亚结构域d - i i a 和d i i b 组成，其作用可能是在钙离子结合后使c a l p a i n 重新定位形成半胱氨酸活 性位点：结构域是八股的b 三明治结构，与钙结合的c 2 结构域有一定 的相似，而结构域通过e f 手形结构结合钙离子。结构域i i i 与其他已知 的蛋白质无同源性，推测可能是起连接作用；结构域v 可能是c a p a i n 与 膜结构上的磷酸脂相互作用必须的：结构域和都包括5 个e f 手形结 构，是钙离子结合部位( s m i t h ，2 0 0 0 ；e l e e ，1 9 9 6 ) ，前4 个e f 手形结构结合 钙离子的方式与钙调素相似，而第5 个e f 手形不结合钙离子，而是作为 结构域和之间同源缔合位点( h o m o p h i l i c - a s s o c i a t i o ns i t e s ，图3 ) 。与钙 调素不同，与钙离子结合后，结构域的三维结构只发生微小的变化，因 此，有人提出e f 6 手形结构和结构域i n 末端富含g l u 和a s p 的酸性区域 是钙离子结合、调节酶活性的位点。 1 1 2c a l p a i l l 3 圈3c a l p a i n l 和c a l p a i n 2 的高级结构 f i 9 3h i g hc l a s sc o n s t r u c t i o no fc a l p a i n l a n dc a l p a i n 2 山东农业大学硕士学位论文 另一个可能与肉类嫩化有关的c m p m n s 成员是骨骼肌特异性 c a l f i a i l l 3 ( 又称n d l 、p 9 4 、c a p n 3 ) 。骨骼肌分离出的p 9 4 只含有分子量 为9 4 k d a 的催化亚基，无调节亚基。氨基酸序列与妒c m p a i n 相比具有5 4 同源性在低或无钙离子存在的情况下容易发生完全降解，半袁期小于 l o 分钟有的学者认为p 9 4 的活化不需要钙离子，并对p 9 4 的依钙性提 出质疑：p 9 4 在e d t a 存在时也可以迅速降解，在e g t a 中可以稳定存 在最近的研究却表明，p 9 4 的蛋白酶中心在钙离子存在时可自动降解。 1 1 3c f l p a m 0 最近的研究表明，新型c a l i n l o 可以在小鼠、老鼠和人类组织包括骨 骼肌中表达。在肌肉中c a l p a i n l 0 主要分布于细胞膜结构上，且与其它普遍 型c m p m n 不同的是它缺少与钙离子结合的结构域4 ，存在非钙离子结合的 结构域t ，这表明c f l p f i n l 0 的活性可能不依赖于钙离子的存在( m ae ta 1 ， 2 0 0 1 ) 目前的研究发现，c a l p a i n l 在肉类成熟过程中迅速发生降解，而 c a l p a i n 2 在成熟过程中，至少在宰后的前2 0 天没有发生降解。由于天然形 式的c m p a i n s 没有活性，只有与钙离子结合后，大小亚基发生一定程度的 降解作用，才能对蛋白质起到分解作用。因而对于c r o p , n 2 在肉类成熟过 程中的作用还存在一定的争议，但是对c a l p a m i 在肉类程度中起到的关键 嫩化作用已经达成共识。 由于c m p a i n 3 降解迅速，目前还没有分离出其天然形式，只分离出分 子量为9 4 k d a 或更小的降解片段，所以还不能在离体条件下单独研究c a l p a i n 3 对肌肉蛋白的降解作用。c m p a i n l 0 虽然存在于肌肉组织中，但它是 否参与肉的嫩化这方面的研究还没有进行。 1 i 4c f l p a s t a t i n 另外在肉中还存在一种c a l p m n 抑制蛋白c a l p a s m f i n ，c a l p a s t a t i n 是迄 今为止发现的唯一c a l p a i n 专一性内源抑制剂，对其它半胱氨酸为活性中 心的蛋白酶无作用。尽管在人类、猪和牛这些物种中c a l p a s t a t i n 的基因只 有一种，但是由于转录，翻译的起始位点不同，或不同的剪接机制，这 种单一基因可产生分子量由4 6 3 5 k d a 到8 4 k d a 的不同产物：通过核磁 共振研究发现c a l p a s t a t i n 多肽链在溶液中以随机卷曲的形式存在，在利用 排阻分析测定随机卷曲分子时，不容易估算分子量大小，c a l p a s t a t i n 结构 中包括重复结构域，每一结构域中含有结合c 却a i n 的特定位点。耳前发 现了c a l p a s t a t i n 的两种同型物，分别含有五个和三个结构域的c a l p a s t a t i n 1 和c a l p a s t a t i n 2 。据推测，c a l p a s t a t i n l 可能是磷酸化形式抑制剂，而c a l p a s t a t i n 2 可能是去磷酸化抑制剂。c a l p a s t a t i n 阻止天然c a l p a i n s 的自动降 解( 活化过程) ；抑制自动降解形式的c a l p a i n ( 活性形式) 的催化作用；竞争 性抑制c a l p a i n s 与细胞膜结构结合。因此c a l p a s t a t i n 的存在对c a l p a i n 在 肉成熟过程中发挥蛋白分解作用起到一定的限制作用。c a l p a i n c a l p a s t a t i n 的比例是决定肉嫩度的一个重要的指标，研究表明c a l p a i n c a l p a s t a t i n 比例比c a i p a i n 活性本身更能作为衡量嫩度的指示指标。牛、羊、猪肉中 c a l p a s t a t i n c a l p a i n 的比例分别为4 ：1 、2 5 ：1 和1 5 ：l ，因此牛、羊、猪肉 的嫩度依次增大。 型匝咖 b ) c q l p 出3o r p 9 4 d c 嘶斑 图4 肌肉c a l p a n s 成员及其内源性抑制荆 f i 9 4m u s c l ec a l p a i n sm e m b e ra n di t si n h i b i t o r s 1 2c a l p a i n s 在肉嫩化过程中的作用机理 6 山东农业大学硕士学位论文 1 2 1c a l p a i n s 在肉嫩化过程中的作用模式 活体内c a l p a n 和特意性抑制剂c a l p a s t a t i n 形成复合体以非活性的形 式存在，当胞内钙离子升高时，c a l p a s t a t i n 通过与c a l p a i n s 的活性中心和 钙离子结合中心结合而抑制c a l p a i n s 的活性，骨骼肌的肌肉中存足够数量 的能抑制c a l p a i n s 活性的c a l p a s t a t i n 。c a l p a i n s 和c a l p a s t a t i n 作用模式见 图4 。肌肉内的c a l p a i n s 被钙离子激活对，钙离子与c a l p a i n 结合，又形 成与c 出p a s t a t i n 分离后转位到细胞膜上，与膜上的活化因子结合，发生自 动降解，c a l p a i n s 由酶原形式变为活化形式，然后与底物结合，从而分解 蛋白底物：当胞浆内钙离子浓度降低时c a l p a i n 与膜结构分离，然后c a l p a s t a t i n 结合上来又形成非活性形式。 图5c a l p a i n s 在肉嫩化过程中的作用模式 f 9 5f u n c t i o nm o d eo fe a l p a i ni nm e a tt e n d e r i z a t i o np r o c e s s 1 2 2c a l p a i n s 在肉嫩化过程中的作用机理 在肉的成熟过程中，i _ t - e a l p a i n 降解肌肉的结构性蛋白质和细胞骨架蛋 白，导致肌肉的结构脆化，从而完成肉的嫩化过程。不同的肉，其最终嫩 度的差异在于肌肉中所含有的g - e a l p a i n 的活性不同。在肉的成熟过程中， g - e a l p a i n 要想完成肉的嫩化过程，必须经过下述三个过程： 肌浆中游离钙离子浓度的升高； c a l p a i n s 被钙离子激活； 7 激活的c a l p a i n s 分解蛋白质，脆化肌肉的结构，完成肉的嫩化过程。 在活体内，肌肉中游离的钙离子浓度约为0 2 u m 。远低于激活i u - c a l p a i n 所需要的浓度。家畜被屠宰以后，随着糖酵解的进行，肌肉内的a t p 数量降低，肌浆网内贮存的钙离子被大量的释放到肌浆中，使得肌浆中的 钙离子浓度上升到约1 0 0 a m ( 最大尸僵时) ，这个游离的钙离子浓度足以有 效的激活p c a l p a i n ，但不能激活m e a l p a i n 。因此尽管1 4 - e a l p a i n 和m c a l p a i n 为同工酶，但大多数学者认为”c a l p a i n 在肉嫩化中起更重要作用。d r a n s f i e l d ( 1 9 9 2 1 证实，肌肉硬度变化的6 8 是由i t - e a l p a i n 所引起的，且6 6 的i t - e a l p a i n 存在于z 盘，1 4 在a 带，2 0 在i 带。 由于c a l p a i n s 需要一定浓度的游离钙离子激活才能发挥其作用，因此 肉的嫩化作用在尸僵过程中就开始了，随着尸僵的进行，游离钙离子浓度 的进一步升高。嫩化作用加速，直到达到最大尸僵。到目前为止，尚没有 直接的证据显示c a l p a i l l s 在活体内或刚刚屠宰的肌肉中具有活性。当肛c a l p a n 被激活以后，随着贮存时间的延长，其活性逐渐降低，部分的c a l p a i m 将发生降解，就是说被激活的c a l p a i n s 的活性将随时间的延长呈指数 性降低。经2 4 小时的贮存后，冷却牛肉中i t - e a l p a i n 的活性将降低5 0 ， 而c a l p a s t a t i n 的活性降低约3 0 ( d r a n s f i e l d ，1 9 9 9 ) 。温度对c a l p a i n s 的活 性有影响，模拟实验的结果发现，c a l p a i n s 分解蛋白质的最适温度范围在 中温区，亦即在1 0 2 0 c 的范围内，c a l p a i n s 分解蛋白质的数量大于低温 ( o ) 和高温( 4 0 ) 时。 1 3 c a l p a i n s 在肉类成熟中的作用 c f l p a i m 已经被证实是肉类成熟过程中的关键酶( k o o h m a r i e 1 9 8 6 、i 9 8 8 、1 9 9 6 ；d r a n s f i e l d ，1 9 9 9 ) 。研究表明，c a l p m m 的底物主要是三类细胞 骨架蛋白，而尸僵后肉类成熟嫩化过程中也恰恰主要是降解这三种细胞骨 架蛋白。 1 3 1 c a l p a i l l s 降解细胞骨架蛋白t i t i n 和n e b u l i n ，使肌原纤维i 带和z 盘 结合变弱或断裂。 t i t i n 以n 未端和z 盘结合，其多肽链分别从i 带延伸到a 带，起着 使粗丝、细丝和z 盘的牢固连接功能。 t i t i n 是一种不溶性的巨型分子，w a n g ( 1 9 7 4 ) 等人发现了该种蛋白， 8 山东农业大学硕士学位论文 t i t i n 分子长度大于l u m ，有一个球状头部和一个尾部。t i t i n 位于z 线和 m 线之间，在a 带和租丝结合，可伸缩性较差，而在i 带有较强的伸缩 性( i o t h , 1 9 8 8 ) 。在宰后肌肉中，啊t h l 可能会被钙激活中胜蛋白酶降解，造 成肌原纤维结构的破坏( b o y 昏b 耐，1 9 9 8 ；p r a t e s ，2 0 0 2 ) 。t i t i n 的降解程度和 肉的品质特别是嫩度呈正相关。另外还有人试验发现宰后成熟的肌肉中t i f i n 的变化与肉的保水性有关( p a t e r s a n , 1 9 8 8 ) 。 一。 i 竹； _ ￥广一 嚣| 幽呷豳础r r i 叩“、? 烈。 - 工二1 v - 之? 彘毫凳鹜蠹蠕昆囊i 赠蹿 一 。_ 一瓣攀端弹，夕 + 胞营鲤融盏嶝$ 曲诤酸随 图6 t i t i n 和n e b u l i n 的位簋示意图 f i 9 6t h ep o s i t i o no ft i t i na n dn e b u l i n t a y l o r ( 1 9 9 5 ) 发现，宰后肌肉在4 0 c 下存放7 2 h 后，n e b u l i n 几乎完全 降解，都分t i t i n 也由分子量约为2 6 0 0 2 8 0 0 k d a 的t l 型降解为分子量约 为1 2 0 0 2 4 0 0 k d a 的t 2 型。t 2 型f i f t h 缺乏和z 盘相连的n 未端，从而 丧失了和z 盘的连接功能。以上两种变化，明显弱化了细丝和z 盘的相 互作用，促进了肌原纤维小片化指数( m f i ) 的增加，从而有助于提高肉的 嫩度。 n e b u l i n ( 分子量约为6 0 0 9 0 0 k d a ) 以c 末端与z 盘结合，起着使细丝 与z 盘的牢固连接和稳定细肌丝的空间稳定性的功能( r o b s o n , 1 9 9 5 ) 。因 此肉的成熟过程中n e b u l i n 的降解将导致肉的韧度的降低( g e e s i n k ，2 0 0 1 ) 1 3 2c o s t a m e r e s 和d e s m i n 及f i l a m i n 的降解 9 图7c o s t a m e r e s 的位置示意图 f i 9 7t h ep o s i t i o no fc o s t a r n e r c s t - - - a c t i n i n + c t l ， 图8 相邻肌原纤维z - d i s c 问d e s m i n 微丝的位置示意图 f i g st h ep o s i t i o no f d e s m i ni nz - d i s ci nc l o s et o g e t h e rf i b e ri nc l o s et o g e t h e rm u s c l e s k e t c hm a p c o s t a m e r e s 通过连接肌原纤维和肌膜，起到稳定肌细胞结构功能( 如 图7 ) ，主要组成蛋白由a n k y r i n ，d e s m i n ，d y s t r o p h i n ，p - s p e c t r i n , 7 a c t i n , t a l i n ，v i n c u l i n 等组分组成。在骨骼肌肌细胞中，位于肌膜附近的肌原纤维 1 0 山东农业大学硕士学位论文 在每一i 段水平上都有c o s t a m c r c s 结构t a y l o r 等( 1 9 9 5 ) 通过电镜发现在 4 0 下存d e s m i n 在此期间也几乎完全降解。另外一种重要组成蛋白d y s t r o p h i n 在7 2 小时后也被大量降解，而体外实验发现c o s t f l l t l e l e s 的构成蛋白 都是e a l p a l n s 的良好底物，很容易被降解肌原纤维间连接蛋白有d e s m i n 和f i l a m i n ，起着固定肌原纤维，保持整个肌细胞内肌原纤维排列的有序 性等作用( k o o h m a r a i e ，1 9 9 1 ) 而d e s m i n 和f i l a m i n 也会很快被e a l p a i n s 降 解，以致肌原纤维的有序结构遭到破坏。 d e s m i n 为肌原纤维间z 线与压线的一种细胞骨架蛋白，直径为1 0 n m ，每一分子有4 个亚基组成，其亚基的分子量约为5 3 k d a ，是不溶性蛋 白质。在肌细胞发育过程中，d e s m i n 可能起着帮助邻近肌原纤维正确的 定位与排列的功能，而在成熟的肌细胞中则起着连接肌原纤维，进而维持 整个骨骼肌细胞的有序性和完整性等作用，d e s m i n 的降解对成熟过程中 肉的嫩化有贡献( h o ，1 9 9 6 ；r o b s o n , 1 9 9 1 ) 。 1 3 3 肌钙蛋i 刍( t r o p o n i n ) 的降解。 t r o p o n i n 由三个亚基构成，即钙结合亚基( t n - c ) 、抑制亚基( t n ) 和原 肌球蛋白结合亚基( t n - t ) ，其中t n - t 分子量为3 0 5 3 7 k d a ，能结合原肌 球蛋白，起联结作用。宰后肌肉成熟过程中通过s d s p a g e 发现t r o p o n i n t 消失，而出现了分子量为3 0 k d a 的降解产物( k o o h m a r a i e ，1 9 8 4 ；o l s o n , 1 9 7 7 ；w h e e l e r , 1 9 9 4 ) 。t n - t 的降解弱化了细丝结构，有利于肉嫩度的提高。 肉的嫩化过程是c a l p a i n s 蛋白酶系统分解骨架蛋白的结果，从理论上 讲人们可以通过对c a l p a i n s 动力学的分析来预测肉的最终嫩度。然而d m n s f e l d 利用c a l p a i n s 活性建立的数学模型却只能够准确地预测正常p h 肉 的最终嫩度，但在预测高p h 肉的嫩度时却无能为力。这表明动物死后嫩 化过程除c a l p a i n s 系统对细胞骨架蛋白的降解外，可能还存在其它一些复 杂的机制。 2 加快肉品嫩化的技术 肉的嫩度主要取决于肌动蛋白( a c t i n ) 和肌球蛋