（食品科学专业论文）甜高粱茎秆汁液酒精发酵高产菌株的选育及发酵条件研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 甜高粱茎秆汁液酒精发酵高产菌株的选育及发酵条件研究摘要 研究生：张晓霞导师：刘长江教授 本论文从出发菌株的特性开始，对影响南阳酵母原生质体形成和弭生的条件，如预 处理、菌体前培养时间、酶浓度及酶作用时间、酶解温度等进行了研究，获得了原生质 体形成和再生的最佳条件：用l ，4 二硫苏糖醇和e 叭a 的混合液对菌体进行2 0 m i n 的预 处理，以2 的蜗牛酶进行酶解破壁，3 0 酶解2 h ，原生质体形成率达9 9 2 ，再生率 达8 6 。 制作紫外线对原生质体的致死率曲线，确定照射1 5 s 、2 0 s 、2 5 s 、3 0 s 、3 5 s 后的再 生菌落进行初筛经过1 1 平板初筛后得到照射时间为2 5 s 和3 0 s 且效果较好的菌株 l o 株，进行发酵性能测定，其中高产菌株占6 0 ，从中筛选出一株酒精产率为1 2 5 ( v v ) 的高产菌株。 通过对影响突变株n y 二0 6 滔精发酵的各种因素进行了研究。确定了适合n y - 0 6 酒 精发酵的条件。试验结果为：甜高粱汁液的处理以1 1 0 ，高温高压灭菌1 0 m i n 为宜； 接种量l o ：装液量1 0 0 m l ；发酵温度3 0 ；最适发酵初始p h 值5 o 。无机元素硫和 磷对发酵有显著的影响，金属离子如k + 、m 9 2 + 、c a 2 + 的添加对酒精发酵影响明显：通过 正交试验设计，确定了甜高粱茎汁酒精发酵最适无机元素和金属离子的使用量：硫酸镁 o 0 0 7 5 1 0 0 m l 、磷酸二氢钾o 2 0 9 ，1 0 0 m l 、氯化钙0 3 0 1 0 0 m l ，在该优化条件下经发 酵铡得酒精产量为1 3 4 。发酵培养基中的氮源以添加尿素、酵母膏和蛋白胨为宜，每 1 0 0 m l 发酵液添加o 6 5 9 尿素，酒精产量可达到1 5 1 ( v ) 。 关键词：南阳酵母，原生质体，紫外线诱变，选育，甜高粱茎汁酒精发酵 英文摘要 a b s t r a c t ” t h eb r e e d i n go fah i g h e ry i e l d l i q u o r1 y b a s ts t r a i ni nt h ea l c o h o l f e r m e n t a t i o no fs w e e ts o r g h u ms t e mj u i c ea n ds t u d yo n c o n d i t i o n so f a l c o h o lf e r m e n t a t i o n c a l l d i d a t e ：z h a n gx i a o x i a s u p e r v i s o r ：p m fl i uc h a n 西i a i l g b e g i 删n g 、v i t i lt l l ec l t l r a c t c r so f n 卸y a n gy e a s t ss 仃a i n ，t h ef k t o r sw e r cs t u d i e dp 聆s e n t p a p c ro np r o t o p l 私招p 硎u c 虹o n 孤d 聆p r o d u c t i o n ，s u c h 船p r e 骶a t l t l e m ，i l l i t i a lc m t u r e ， e m ：y m ec o n c e n t r a t i o n ，吣 出0 l y z et i m ea n dh y d i d l y z et e m p e f a t u r e t h eo p t i m u mc o m l 妯d n s a b o u tp r o t o p l a s tg e r a t i o na n dr e g e i l e r a 垃a nw e r eg o t ：w i 也p t c t r e a t m e n tb yi n t e r m i x t u r e w h i c hi sm a d eu p 、v i m1 ，4 - 咖s u l f u rs o v e ts u g a ra l c o h o l 趾dm ee d t af o r2 0 r n i 耳t om e o r i g i n a ls 打a i n ，b r o k e n - d o w nw a l lb y2 s n a i le 啮啊e ，3 0 ，h y d r o l y z e dw a l li nt w 0h o l l r s ， m e p r o t o p l a s t sf o 珊a t i o nr a t e a c h e d9 9 2 ，t i l er e g e n e r a t i o nm t er e a c h e d8 6 t h el e t h a l i t yc u r v eo fp m t o p i a s tb yu i 艄w i o l e tw a sg o t ，a n dt h er e g e n e r a t i o ns t m i n s e x p o s e du n d e ru i t r a v i o l e tf o r1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5s e c o n d sw e r es e l c c t c dt ob es c r e e n e d ，a r e r i n i t i a l i z e dr i d d i n gi nn 摇t t cp l a t e ，t c ng o o ds 砌f l sw e r eo 执l i n e dw h i c hi l l u m i n a t i o nt i m e w 器2 5 sa n d3 0 s t h e i l ，c a r r i e dt 1 l ed e t e 衄i n a t i o no ff e m i e r 她t i o n 口e r f o n r l a n c e t h en u m b c ro f h i g hp r o d u c t i o ns 媳ma c c o u n 泓f o r6 0 柚dah i g hp 刚u c t i o ns 虹a i nw a ss c r e t m e da n di t s a l c o h o lp r o d u c t i o nr a t ew 鹬1 2 5 ( v ，v ) t h r o u g hn 他s i n g l e f 如t o r e x 耐m e n 招， t l l ec o n d m o 璐m a ti n n u e n c e da l c o h o l f b n n e n t a t i o no fm u 诅t i o ns 慨nw e r es t l l d i e d ，s u c ha s t e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，t h ec “b o n s o u r c ec o n c e n t r a t i o l l ，t l l en i 仃t 唱e ns o u r c et y p c ，i n o c u i a t i o nq u a n t i t y ，q u a l l t u r n 鹬、v e l la sh o w m u c ht l l a ti n o r g a n i ce l e m e n ta 1 1 dm e t a l l i ci o nw a su s e d ，t h e nt l l eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r ed e t e r h l i n e d t h r o u g l lt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa i l dt h eo n h o g o n a le x p e r i m e m s ，t h e b e s tc m f tc o n d i t i o n so fn y - 0 6a l c o h o lf b r n l e n 诅t i o n 、v a sd e t e 仃n i n e d ，t a i ( i n gt h es w e e t s o 唱h u ms t c mj u i c e 勰m ef e r m e 砒a t i o ns u b g t r a t e ，b a s i n go nt h ef o u n d a t i o na b o v e i tw a st h a t s w e e ts o r g h u ms t e mj u i c ei n i t i a lp hw a sc o n t r o l l e d5 o ，1 1 0 a n t i s e p t i cc o n t i n u e dl o m i n ， a d d e du 代a6 5 l ，m g s 0 4 。7 h 2 0o 0 7 5 9 ，l ，k h 2 p 0 42 9 ，l ，c a c l 2 3 l ，i n o c u l a t i o nq u a n t i t y w a s1 0p e r c e n t ，f e h n e n t a t i o nt i m ew 越4 0 ha t3 0 ，t h es t r e n 舀ho f a l c o h o im a y r e a c h1 5 1 ( v 厂v ) i nt h ef e 珊e n t a t i o nf l u i d t h i st i m et h eb e s tc r a nc o n d i t i o n sw e r ed e t e m l i n e d a sw e l l a sa b o v ec o n d i t i o t l s ，a f t e fs t a b i l 时t e s t 1 ( e y w o r d s ：n a ny a n gy e a s t ，p r o t o p l a s t ，u v - m u t a g e n i c ，b r e e d i n g ，s w e e ts o r g h u ms t e m j u i c e ，a i c o h o lf e r m e n t 叠t j o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：懒 导师魏i 1 扣 ，r 时间：跏f 年占月f 。日 时间： 鼬i 年多月f 。同 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： ；枷魄 主1 驴 时间： 印g 年彳月，。r 时问：加；年z 月f o 闩 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 酒精应用概况 酒精学名乙醇，英文名a l c o h o l ，分子式c 2 h 5 0 h ，属于一种分子结构简单的醇类。 为无色透明的液体，极易挥发，有酒的气味和刺激的辛辣滋味，燃烧生成二氧化碳和水， 同时放出大量热量。酒精化学性质十分活泼，既可与醇类、乙醚、甘油、苯等多种有机 溶剂混合，又可与盐类、碳氢化合物、脂肪酸等起化学反应，可作为许多化工产品的生 产原料，在食品工业、医药工业和医疗事业以及农业甚至国防各方面都有广泛的应用( 姚 汝华与赵继伦，1 9 9 9 ) ，例如，在食品工业中，酒精是配制各类白酒、果酒、葡萄酒、 露酒、药酒和生产食用醋酸及食用香精的主要原料；在医药工业和医疗事业中，酒精用 来配制、提取医药和作为消毒剂：酒精工业从农业获得原料，农业需要酒精来配制农药， 此外，酒精工业的下脚料酒糟是良好的饲料和肥料：酒精作为种绿色燃料对保护 环境、减缓温室效应具有重要意义( 高寿清，2 0 0 0 ) 。总而言之，酒精工业在我国的国 民经济中占有重要地位。 随着全球能源紧缺和可持续发展的需要，科学家提出了以酒精代替石油燃料的呼 吁，因为作为替代燃料的酒精与传统的化石燃料( 煤和石油) 相比显现出很多优势：可 随太阳的光合作用再生，从而减少人类对不可再生资源的消耗，增加人类可持续发展的 能力；减少对进口石油的依赖；净化汽车尾气，增加汽车动力性能；所以酒精被称作是 一种绿色燃料，更是种战略物资。 目前燃料酒精已经占世界酒精总产量的6 6 ，并且还有进一步增加的趋势( 高寿清， 2 0 0 0 ) 。发展燃料酒精这项技术在国外已十分成熟。美国和巴西等国家己成功地使用了 2 0 多年，走在了世界的前列，其中，巴西燃料酒精年产量达l 1 0 0 万吨，位居世界第一： 美国燃料酒精年产量达5 0 0 万吨，位居世界第二。另外，巴西的“酒精汽油计划”和美 国的“汽油醇计划”，对2 0 世纪8 0 年代中期持续到9 0 年代来世界酒精产量的迅速增长， 起到了决定性的推动作用( 章克昌，2 0 0 0 ) 。荚国和西方一些国家已经普遍使用添加了 酒精的汽油，如美国规定在3 7 个大城市的汽车所用的汽油中必须添加5 的燃料酒精： 欧共体自2 0 世纪9 0 年代初也开始生产和使用燃料酒精。但是在我国，酒精在燃料方面 的应用尚未形成规模，为此，中国政府正大力推进燃料酒精研究计划的进行，2 0 0 1 年我 国已经将“大力发展燃料酒精”产业列入“十五”计划当中，并在国民经济和社会发 展第十个五年计划纲要中做了明确的要求。国务院已批准在东北、中原等粮食基地建 设几个十万吨以上的无水酒精生产基地，并在交通运输行业中推广使用燃料酒精( 章克 昌，2 0 0 0 ) 。 1 2 发酵法生产酒精的意义 酒精工业生产的方法可分为发酵法和化学合成法两大类( h i n 曲，2 0 0 1 ) 。发酵法是 利用淀粉质原料或糖质原料，在微生物的作用下生成酒精；化学合成法是利用生产焦炭、 裂解石油的废气为原料，经化学合成反应制成酒精。 石油资源的短缺使得发酵法生产酒精日益成为酒精工业的主导。由于发酵法生产酒 精利用的是农作物原料，它解决了化学合成法生产酒精的原料问题，即对不可再生资源 石油的依赖问题，而且推动了农产品的加工和转化。目前世界酒精的9 3 是由发酵 法生产的，用发酵法生产的酒精，具有和矿物燃料相似的燃烧性能，还因为其生产原料 来源于生物物质，属于可再生燃料。此外，酒精燃烧过程所排放的氧化碳和含硫气体 的量均低于汽油燃烧时的排放量，所产生的二氧化碳和作为原料的生物羹生长所消耗的 二氧化碳的数量基本持平，这对减少大气污染及控制“温室效应”有重要意义。 1 2 1 酒精发酵的菌种及发酵机制 目前，酒精生产工业的菌种主要以酵母菌为主，常用酒精发酵菌株有k 字酵母，南 阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、拉斯2 号、古巴i 和古巴i i 等等，均属于酿酒酵母 ( & 钟撑1 ，捃e 甜) 。酒精生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求：( 1 ) 发酵力强而且 迅速，有较强的滔化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的繁殖能力；( 3 ) 耐酒精能力强，能 在较高浓度的酒精发酵醪中发酵；( 4 ) 耐温性能好，能在较高温度下发酵：( 5 ) 抵抗杂 菌能力强；( 6 ) 耐酸能力强；( 7 ) 生产性能稳定，变异性小，发酵时产生气泡小。 酒精发酵主要由酵母菌在厌氧条件下通过e m p 途径将葡萄糖降解为丙酮酸，然后 在丙酮酸脱氢酶的作用下将丙酮酸脱羧形成乙醛，乙醛在乙醇脱氨酶的作用下生成乙 醇，表达式为： c 出1 2 0 6 + 2 a d p + 2 h 3 p 0 4 2 c h 3 c h 2 0 h + 2 c 0 2 + 2 a t p 则l m o l 葡萄糖生成2 m o l 乙醇，理论转化率为 2 4 6 0 5 1 8 0 i = o 5 1 l l o o = 5 1 1 式中4 6 - 0 5 为乙醇的相对分子量，1 8 0 1 为葡萄糖的相对分子量。但是在生产中约有 5 葡萄糖用于合成酵母细胞和副产物，实际上乙醇生成量约为理论值的9 5 ，则乙醇 2 沈阳农业大学硕士学位论文 对糖转化率约为4 8 5 。 淀粉质和纤维素等多糖物质则需经过淀粉酶和糖化酶的转化形成葡萄糖，再经e m p 途径生成酒精，而细菌的酒精发酵主要是经过e d 途径形成酒精。 在酵母菌代谢生成酒精的过程中，研究人员对何种条件下酵母菌能最大量地形成酒 精以及在高浓度酒精中酵母菌的耐受性等问题极为关注。随着高浓度酒精发酵技术在生 产中的广泛应用，尤其是出于对产品质量和经济效益的考虑，更增加了人们对酵母菌在 这两方面的兴趣。耳前工业生产中用酵母菌生产酒精的研究重点集中在两个方面：一是 拓宽酵母菌可利用的底物。找到更廉价的原料；二是选育高产酒精酵母培育出酒精产 量高并能耐受高浓度酒精的新菌株。 1 2 2 酒精生产的原料 目前酒精生产所利用的原料主要有三大类： ( 1 ) 糖质原料，包括甜菜、甘蔗、瓜千、糖蜜、乳清和甜高粱等( 谢林，1 9 9 9 ) 。 ( 2 ) 淀粉原料，包括玉米、小麦、木薯、马铃薯等( 张继福，1 9 9 9 ) 。 ( 3 ) 纤维素和半纤维素产品，包括甘蔗渣、农作物废料、林产品等( 杨斌，1 9 9 7 ) 。 各国根据本国的实际情况选用不同的原料来进行发酵，如巴西主要利用甘蔗汁和废 糖蜜生产酒精，美国更多的是采用玉米为原料。我国乙醇生产试点项目暂定位在消耗陈 化粮为主，目前国内生产乙醇的原料主要是玉米和薯干，但是我国农业靠天吃饭的局面 没有根本改变，粮食过剩的出现是阶段性、结构性的，为避免乙醇耗粮对粮食市场供求 造成冲击，应扩大原料来源。 1 2 3 酒精酵母的选育研究方法及进展 自从发酵技术被应用于酒精生产中，人们就开始了致力于酒精发酵高产菌株的选育 研究工作，采用了不同手段，从不同的角度来改进酒精酵母的生产性能，取得了一定的 进展( 王滨等，2 0 0 1 ) 。 ( 1 ) 传统育种技术 传统育种方法因操作设备简单，目前乃至今后相当长的时间内仍将被广泛使用。目 前，利用传统技术培育菌种的育种目标是：选育耐高温，耐高糖，耐高酒精浓度、发酵 周期短，能直接利用淀粉以及直接利用纤维素和半纤维素的菌株。传统的酵母菌育种技 术主要有直接筛选、杂交育种和诱交育种等。在工业生产中，经这些方法选育出的菌种 具有生产稳定性好、实用性强、菌种适应性强等优点。目前工厂中使用的菌株大多是采 用这种方法选育的。 目前，从发酵基质中真接筛选耐高浓度酒精的酵母茵是获得高产酒精酵母的一种最 经济实用的方法。在发酵液或自然界中长期进化。使得这些酵母菌在遗传性状以及高产 和耐高浓度酒精方面相当稳定，国内外已有许多成功的例子。1 9 9 0 年，研究人员从酵母 样品中分离得到两株酵母菌e t 2 和e t _ 4 ，能利用3 5 的蔗糖发酵生产酒精，产生的酒精浓 度分别是1 8 4 ( v ) 和1 8 5 ( v ，v ) 。1 9 9 1 年b e n o i i l l i 等人( 1 9 9 1 ) 从巴西的酒精厂 中分离到两株既耐高渗又高产酒精的酵母菌o s m o 1 和o s m o 5 ，在3 0 的蔗糖糖浆中发 酵，最终酒精产量达到1 9 5 ( v ，v ) 和1 9 6 ( v ) 。 从不同的原料中分离出的酒精酵母最适合用此原料发酵生产酒耩。曹俊峰等( 2 0 0 1 ) 采用负染色法从甜高梁汁中直接分离出一株以甜高梁汁为原料发酵生产燃料酒精的酵 母菌，其产量可达1 2 8 ( v ) 。吴伟祥等( 2 0 0 1 ) 从木薯粉中筛选得到株可用于 木薯淀粉酒精发酵的耐高温酵母，并对该菌株的形态及部分生理和发酵特性进行了研 究，该萄可以在3 4 、2 5 木薯糖化醪中进行发酵，4 8 h 酒精产率为1 0 6 7 ( v ) ，可 直接用于木薯淀粉的酒精生产。王瑞明等( 2 0 0 2 ) 人从白酒酒酪中分离到一株酿酒酵母 ( c 肿眺) ，最适发酵温度为3 5 - 3 7 p h 2 8 时可正常发酵，在含水量6 5 的固态 基质上发酵酒精度达到1 2 ( v ，v ) ，其淀粉利用率为8 9 。 利用诱变剂对酵母进行处理是一种简便有效的育种方法。王滨等人( 2 0 0 1 ) 利用筛 选出的酵母菌y 3 1 6 作为出发菌株。经紫外线诱变原生质体，选育出酒精高产菌株 y 3 1 6 之3 。当料水比为l ：1 8 时，发酵6 0 h ，成熟醪的酒精体积分数在1 3 5 ( v ) 以上。 另外，刘建军等人( 2 0 0 3 ) 利用热冲击、紫外线和射线联合作用获得株高产酒精酵母 y 4 q 6 ，以玉米淀粉为原料，采用边糖化边发酵工艺( s s f ) ，3 2 发酵6 0 巧8 h ，该 酵母菌株可产酒精度在1 7 5 ( v ) 以上，耐酒精度在2 0 ( v ) 以上。 ( 2 ) 现代育种技术 现代酵母菌育种技术是以原生质体融合和d n a 重组技术为依托的。近年来，运用原 生质体融合和遗传工程等育种新技术来改良菌种，克服了远缘菌种间基因重组的不亲和 性，提高了重组频率，已培育出了一批工程菌，对于拓展酒精生产原料和提高产量及质 量有很大的促进作用。然而，在生产上这些工程菌仍然缺乏良好的稳定性，因而大多数 还没有达到工业应用的程度。此外，培育集两个或多个优良性状于一身的工程菌的研究 也将是酵母菌选育工作的一个热门方向。如，集能直接利用淀粉与耐高温性状于一体的 4 沈阳农业大学硕士学位论文 酒精酵母必将在酒精工业上有广阔的应用前景。 原生质体融合技术 原生质体技术起源于2 0 世纪5 0 年代。1 9 7 7 年s i p i c z k i 和f e r e n c z y 首次实现了酵母 菌的原生质体融合。原生质体融合技术是将双亲细胞通过酶解脱壁，制成原生质体，然 后在高渗条件下加入助融剂，使双亲的原生质体发生凝聚，通过细胞质融合、核融合， 发生基因间的交换重组，进而在适当的条件下再生出细胞壁，形成重组子的过程( 孙剑 秋与周东坡，2 0 0 2 ) 。这项技术主要包括制备原生质体、原生质体融合和检出融合子三 个步骤，具有杂交频率高、受接合型的限制较小和遗传物质保持完整的特点。原生质体 融合是一种更为广泛更随机的基因重组方式，重组的频率达到1 0 4 左右，可以轻易实现 大规模遗传物质重组，打破种属晃限，实现远缘菌株间的基因重组( 孙剑秋，2 0 0 3 ) 。 它也可以和其他育种方法相结合，将多种优良性状组合到个单株中，大大缩短育种周 期。 原生质体融合技术已广泛应用于工业用酵母菌株的优良性状改造( f e 磁l c 巧，1 9 7 7 ， s o l i n g e n ，1 9 7 7 ；m a r 配，1 9 7 8 ) 。例如c h i 等利用原生质体融合技术使酵母菌株w y _ - 2 和酿酒酵母1 2 0 0 ( 勋卯 舢醪嚣8 工驴，2 ) 的细胞融合，与亲本相比，得到四倍体菌株 c 4 能明显提高发酵速度( c h i ，1 9 9 1 ) 。目前，实现淀粉原料直接发酵生产酒精是酒精 发酵工业需要迫切解决的问题( p e f b e r d y ，1 9 8 0 ：c e c i l a ，1 9 8 4 ：a l f o n s o ，1 9 8 6 ) 。酵 母糖化酶基因的表达受多种基因的调控，因此很难分离到与之相适应的基因产物。用原 生质体融合技术进行糖化酵母育种则显现出了更大的优势。通过遗传物质重组，可选育 出具有淀粉糖化酶活性的酵母新菌株，或进一步改良亲本菌株，实现淀粉直接发酵成酒 精的一步生产法。目前国内外已通过此方法实现了酿酒酵母( s c p r 。协妇p ) 和其他酵母 菌或霉菌种间或属阃的融合庞小燕等人以酿酒酵母( s f e r p v 扭面e ) 和热带假丝酵母 ( c 行印f c 讲括) 为亲本，通过单亲灭活，进行属问原生质体融合技术，获得了既具有糖 化酶活性又高产酒精的融合株，在一定量的淀粉培养基中发酵，酒精产量可11 5 ( v ，v ) ( 庞小燕等，2 0 0 1 ) 。黎碧莲等人( 1 9 9 8 ) 在酿酒酵母( s c e r e v 砸a e ) 和扣囊拟内孢霉 ( 勘面彬印s 捃6 耐i 妒阳) 属问的融合产物中获得两株融合子p 5 0 1 和p 5 1 9 ，并进行了木 薯粉糖化醪发酵试验，酒精产量可达6 9 ( v ) 和7 7 ( v ) 。王建玲等人( 1 9 7 7 ) 利用p e g 诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体和耐高温酒精酵母单倍体的同型 原生质体融合，培育出既有较强的糊精利用能力，又耐高温和高产酒精的融合子，使用 前言 该菌发酵可减少4 0 的糖化酶用量。 另外，采用原生质体融合技术也有利于扩大酒精酵母可利用底物的范围和特殊性状 的改良。f 蜘妇l a k ( 1 9 8 6 ) 利用原生质体融合技术，构建了脆壁克鲁维酵母( 五肛捌捃) 和酿酒酵母( & c p 阳v 扫妇) 的融合予，能在乳清中利用乳糖生产酒精，最终产量达到1 3 ( v ) 。清酒酵母( 棚妇) y a k c 具有能耐高达2 2 ( v ) 酒精的特性，而k 氏酵母 ( s 脚妇k ) 具有较好的发酵能力。侯红漫将清酒酵母y a l c e 与k 氏酵母融合，选育出产酒 精量高而且耐酒精力强的融合子，酒精产量为7 4 ( v ，v ) ，酒精耐量1 5 ( v ) ( 侯 红漫，1 9 9 5 ) 。l e 鲷姗( 1 9 8 6 ) 将酿酒酵母( 甜，卵扫j 口e ) 和能耐4 0 以上葡萄糖的 蜜蜂酵母( & 聊e 脑) 作为亲株进行原生质体融合，提高了酿酒酵母的葡萄糖耐性，在3 5 的葡萄糖培养基中产酒精的速度为亲株的3 倍和7 倍，最终产量也有大幅度的提高，融合 株可产生1 3 6 ( v ) 的酒精，而酿酒酵母( 馏旭协面p ) 和蜜蜂酵母( & m p 肌，) 只能 产生9 ( v ，v ) 和4 ( v ，v ) 的酒精。 d n a 重组技术。 指用人工方法把所需的特定基因从供体生物的d n a 中切割下来，与基因载体连接 在一起，通过转化，把这一外源胁舱片断引入新的生物体内，实现生物遗传特性的转 移，从而使生物的遗传性状发生改变的一项技术。随着d n a 重组技术的发展，科学家 已能将很多种其他生物的基因引入酵母菌，并在酵母菌基因调节系统的控制下合成和分 泌异源基因产物( 周涤平，1 9 9 6 ) 。自上世纪8 0 年代，黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉等 糖化酶基因先后以不同的方式和载体导入酿酒酵母，构建能直接利用淀粉的工程菌 ( h l n i sma ，h o l l a n dk j e t a l ，1 9 8 5 ) 。唐国敏等( 1 9 9 6 ) 人用黑曲霉糖化酶c d n a 构 建整合型质p k gi ，转化酿酒酵母y 3 3 ，得到转化子可以使淀粉转化率达到8 6 。用基 因重组技术，罗进贤等人( 2 0 0 0 ) 将黑曲霉糖化酶g a i c d n a 重组到大肠杆菌一酵母菌 穿梭质粒上，并用原生质体转化法导入到酿洒酵母g l 强1 8 中，实现了糖化酶的高度表 达，构建的工程菌在2 0 的淀粉培养基中培养4 8 小时，淀粉水解率达9 6 1 ，酒精产 量达8 4 ( v ) 。同时，他们将黑曲霉糖化酶c d n a 重组到酵母整合型质粒y 1 d l a c l 2 8 上，转化酵母g r f l 8 ，获得整合型酵母转化子g r f l 8 ( y ，2 8 d 7 ) 糖化酶基因在 该菌株可获得高效表达，淀粉转化率 9 8 ，在台2 0 淀粉培养基中培养2 4 h ，可获得 9 5 ( v ) 的酒精；在含2 5 淀粉培养基中培养2 4 h ，可获得i o 2 ( v ) 的酒糟泡 盛曲霉( 爿妒e ，g _ f j ：f 淞硎，册女 f ) 产生的葡萄糖淀粉酶具有扣1 ，4 和p l ，6 糖苷酶活性，广 6 沈阳农业大学硕士学位论文 泛应用于淀粉的糖化工艺中。王永吉等人( 1 9 9 7 ) 利用e 玎一p c r 技术克隆了泡盛曲霉葡 萄糖淀粉酶i 基因，将其置于酵母菌烯醇酶启动子与终止子之间，构建了表达载体，并 转化到酒精酵母a s 2 1 3 6 4 ，获得了将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵 母菌株。 1 3 本论文的选题依据、目的及主要研究内容 1 3 1 选题依据 本文选择甜高粱作为酒精生产的原料原因如下： ( 1 ) 生物学产量高，茎秆含糖量高，制取乙醇产量高。 甜高粱是c 4 植物，有光合速率高，生长速度快，糖份积累快，生物学产量高等优 点。一般茎秆产量为4 5 0 0 0 7 5 0 0 0 k 咖m 2 ，其茎秆汁液达6 0 7 0 左右，汁液中含糖 1 5 2 0 ，可与甘蔗相媲美。而且甜高粱的糖最易发酵转化成酒精。 ( 2 ) 原料易获取。 甜高梁适应性强，具有抗旱，抗涝，耐盐碱，耐瘠薄等优点，易于栽培。 ( 3 ) 比粮食原料有更大的优越性。 目前，我国酒精生产大部分是以粮食作为基础原料，而我国人多地少，耕地面积逐 渐减少，潜在的粮食供需矛盾必将会突显出来，用大量的粮食制酒精是不经济的也是不 可持续的。而甜高粱茎秆多汁多糖。经简单发酵就可制取酒精，是最好的替代原料。男 外，用甜高粱生产酒精比用粮食生产酒精成本低5 0 以上，所产乙醇汽油的价格比汽油 便宜l o 左右，是环保型动力燃料。 1 3 2 研究目的 用于酒精生产的菌种已有很多种，但大多数都是以玉米和薯类为原料的生产菌种， 而有关发酵甜商粱茎汁生产酒精的高产菌株的相关研究还鲜见报道。本研究旨在选育出 适合以甜高粱茎汁生产酒精的高产菌株，为拓宽甜高梁的研究和综合利用开辟新的途 径。 1 3 3 主要研究内容 ( 1 ) 南阳酵母原生质体制各及再生最佳条件的研究。 ( 2 ) 利用原生质体紫外线诱变育种技术选育酒精发酵高产菌株。 ( 3 ) 影响高产菌株酒精发酵的条件研究，并优化发酵培养基组分。 出发菌株生理特性的研究 第二章出发菌株生理特性的研究 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料 ( 1 ) 菌种 南阳酵母由沈阳农业大学食品学院微生物实验室提供。 ( 2 ) 培养基 完全培养基( y p d ) ；葡萄糖2 ，蛋白胨2 ，酵母膏1 ，固体培养基加琼脂 2 。 种子培养基：葡萄糖1 0 ，酵母膏o 8 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o o l ，k h 2 p 0 4 0 1 0 ， c a c l 2 0 0 6 ，p h5 5 ，“5 灭菌1 5 i n i n 。 发酵培养基：蔗糖1 7 ，酵母膏0 8 5 ，蛋白胨0 1 5 ，k h 2 p 0 4o 1 0 ， m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 c a c l 2 0 2 8 h 2 01 0 0 n l l ，p h 5 o ，1 1 5 灭菌1 5 m i n 。 麦芽汁培养基：取一定量的大麦芽，粉碎，加4 倍于麦芽重量的6 0 热水，在 5 5 6 0 条件下保温糖化3 4 h ，并不断搅拌，r 然后用纱布过滤，滤液经煮沸后再用滤纸 或脱脂棉过滤一次，即得澄清的麦芽汁，加水稀释成l o 1 2 0 b 淑麦芽汁。 ( 3 ) 溶液 美蓝染色液：a 液：取荚蓝0 3 9 ，用酒精( 9 5 ) 3 0 m l 溶解；b 液：k o h ( o 0 1 溶液) 1 0 0 m l ：混合a 、b 二液即成。 ( 4 ) 主要仪器设备 无菌操作台 苏州净化设备公司 u v - 1 1 0 0 紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司 恒温培养箱 上海精宏试验设备公司 h z s h 水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 h z q - f 1 6 0 全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 o 【脚u s 显微镜 日本 h i t a c mh i m c r 2 l g 高速冷冻离心机 日本 酒精计( 标准温度2 0 ) 武强县滏阳玻璃浮计仪表厂 d w 4 0 0 ，5 0 l 型立式电热蒸气两用灭菌锅上海光华机械厂 8 沈阳农业大学硕士学位论文 p h s - 2 5 型数字式精密p h 计 上海理达仪器厂 8 5 2 恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司 糖度计 上海医用仪表厂、 电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司 2 1 2 试验方法 ( 1 ) 最适生长温度的确定 将菌株接入y p d 液体培养基中，分别在不同温度下培养，摇床转速2 0 0 r r n i n ，2 4 h 后取出，用血球计数板计数，确定最适生长温度。 ( 2 ) 最适生长p 酲的确定 将菌株接入不同p h 的y p d 液体培养基中，于最适生长温度下培养2 4 h 。摇床转速为 2 0 0 r m m ，每隔2 h 测定菌液的o d 6 1 0 值，以p h 为横坐标，o d 值为纵坐标绘图，确定最适 生长d h 。 ( 3 ) 生长曲线的测定( 郝林2 0 0 1 ) 不同的微生物其生长曲线不同，即使是同一种微生物，在不同的培养条件下，其生 长曲线也不同。所以测定在一定条件下的微生物生长曲线是必要的。为了使做出的生长 曲线对原生质体制各条件有参考价值，故采用和原生质体制备时相同的接种量和培养条 件。 生长曲线的测定方法主要有三种：血球计数板法、菌落计数法和o d 值法。本文采 用o d 值法，因此法所需仪器不多，操作简便、迅速。 从出发菌株斜面取二环接入4 0 m l 液体完全培养基中，2 8 培养，摇床转速 2 0 0 r m i n ，接种后的第o 、2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、1 8 、2 0 、2 4 h 至3 6 h 分别用无 菌移液管从瓶中吸取菌液2 m l ，用分光光度计，在6 1 0 啪下以液体完全培养基为空白， 测定o d 值。以培养时间为横坐标，o d 值为纵坐标，绘图。 ( 4 ) 最适发酵温度的确定 将种子液按l 0 的接种量接于发酵培养基中，使其在不同的温度下进行发酵，发酵 结束测发酵液的酒精度，酒精度最大时的发酵温度即为最适发酵温度。 ( 5 ) 最适发酵初始p h 的确定 将种子液按1 0 的接种量接种于不同初始p h 的发酵培养基中，发酵结束后分别测 发酵液的酒精度，其中酒精度最大时的p h 即为最适发酵初始p h 。 9 出发菌株生理特性的研究 ( 6 ) 耐糖能力试验 将活化后的菌种接种于不同葡萄糖浓度的y p d 液体培养基中，于3 0 下培养，观 察各试管的产气量。 ( 7 ) 耐酒精能力试验( 杜连祥，1 9 9 2 ) 杜氏小管注满培养基后倒置于盛满麦芽汁( 1 0 0 b r i x ) 的试管中。灭菌后加入不等量 的无水乙醇，制成不同的浓度梯度，接种待测菌株于3 0 的条件下培养。随时观察发酵 现象，气泡产生的时间越早，产气量越大，说明酵母的耐酒精能力越强。 2 2 结果与分析 2 2 1 最遥生长温度的确定 将待测菌株分别在不同的温度( 2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 、3 6 ) 下进行液体培养，2 4 h 后计数。结果见图2 1 。 2 6 2 83 03 23 43 6 温度( ) t 1 p 玎曩t ) 田21 不向量度下蕾数的变化 f i g 2 1c h a n g co f t 锄p c 咖t c 彻n 啪b c ro f y e 如t 最适生长温度是指细胞的最高生长率所需的温度，在此温度下能获得最大的细胞 量。而且在此温度下，细胞生长过程中所需的有关酶的活性最好。出图2 1 可以看出， 在2 6 培养的菌体，菌体生长速度慢，菌体数量少，显然，这个温度不利于菌体的大量 繁殖；在2 8 - 3 4 ，菌体生长保持在一个较高的水平，而当温度从3 4 升到3 6 时，细 胞数从2 2 5 1 0 8 个，m l 下降到1 6 5 x 1 0 8 个，m l ：说明温度对菌体的生长影响较大。在2 8 时细胞数量最多，为2 5 4 x 1 0 8 个，m l ，镜检结果显示2 8 培养2 4 h 的菌体细胞不仅数量 多，而且细胞形态一致，由此确定出发菌株的最适生长温度为2 8 。 1 0 5 2 5 5 o ：3 2 o 一，i墨兽ixv量鼍_舄曲 (1乓兽lxi)瓣租 塑堕垒些查兰堡主兰垡笙兰 2 2 2 最适生长p h 的确定 分别将待测菌株接入p h 为3 5 、4 o 、4 5 、5 o 、5 5 的液体培养基中，于2 8 下恒温 培养2 4 h 。摇床转速为2 0 0 r m i n ，前8 h 每隔2 h 测定菌液o d 6 l o 值，之后每隔4 h 测定菌液的 o d 值，以p h 值为横坐标，o d 值为纵坐标绘图，确定最适生长p h 值。结果见图2 2 j 型 o o 生长时间( h ) c u l l u r et 缸嘣h ) 圈2 2p h 值对蕾伴生长的影响 f g2 2e 侬斌o f p hv 以u eo ng r o 州ho f y e a s t s 从图2 2 可以看出，在各个p h 下，菌体生长无明显的差异，在各个p h 下进入对数期 的时间都比较一致，用了6 小时就进入了对数期。p h 为5 5 时，菌体在2 4 h 内生长速度最 快，而且菌体数量最多，从而确定了南阳酵母的最适生长p h 为5 5 。 2 2 3 出发菌株的生长曲线 生长曲线是微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律，酵母 菌的生长曲线也分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。 选择菌体处于对数期的生理状态对一系列的生理生化试验，如糖类发酵试验，原生 质体的制备以及紫外线诱变等都有十分重要的意义。处于对数期的菌体，其个体形态， 化学组成，生理特性等均较一致，生长旺盛，代谢活力强，细胞繁殖快，所以般要选 择对数期的细胞进行试验。因此需要对出发菌株的生长规律进行测定，进而得到出发菌 株的生长曲线。 由图2 3 可见，该菌株的生长周期为：0 6 h 为生长延迟期，菌数增长缓慢；在6 h 进入对数期，这时菌体代谢活跃，消耗营养多，生长速率快；1 8 h 时对数期结束进入稳 定期；2 6 h 以后为衰亡期，菌体数量递减。 在原生质体制各时，出发菌株的活化应与作生长曲线时的培养条件一致，以保证收 出发菌株生理特性的研究 集到的菌体的生理状态能够同生长曲线相对应。 3 2 5 2 詈1 5 。 l o 5 0 024681 0 1 21 41 6 1 82 02 22 42 62 83 03 23 43 63 8 生长时问” g r o w t ht i n l e ( h ) 田2 ，3 出发株的生长翻线 f i 晷2 3g 附w t lc u oo f o r 啮l l a l 飒i n 2 2 4 最适发酵温度的确定 温度对酒精发酵的影响主要表现在发酵前期影响菌体的生长和在发酵中、后期影响 酒精的形成。由种子培养温度试验可知为2 8 。因此，分别设2 8 、3 0 、3 2 、3 4 、 3 6 几个温度进行发酵试验，以获得该菌株的最适发酵温度。 t 2 一之1 0 辫 蠢i ： 0 2 6 2 83 03 23 43 63 8 温度( ) t 舶i p 盯眦u r 呵) 圈24 温度对出发蕾株酒精雀酵的影响 f i g 2 4 e f i 酏t o f 址m p c 嘶他o n8 i c o h o i f e m k n 切畸o n o f o n g i n a 【啦r 越n 由图2 4 可以看出，温度对酵母酒精发酵影响很大，2 8 是菌体的最适生长温度， 但是在此温度下，菌体的酒精发酵水平却不是最高，酒精得率为8 4 ，发酵周期为6 8 h ： 使酵母菌酒精产量最高的温度为3 0 ，此时酒精得率为l o 1 ，发酵周期为6 6 h ；在3 2 、 3 4 时，菌株的发酵能力仍然可以保持很高的水平，当温度升高到3 6 时，酒精产率下 降幅度较大，发酵周期缩短为6 0 h 。因此，根据试验结果，确定3 0 为最适发酵温度。 t 2 沈阳农业大学硕士学位论文 2 2 5 最适发酵初始p h 的确定 将种子液接种于不同初始p h ( 3 o 、3 5 、4 o 、4 5 、5 o 、5 5 、6 o ) 的发酵培养基中， 3 0 进行发酵，发酵结束测定各个发酵液的酒精度。结果见图2 5 。 d h 圈2 5 州值对出发蕾株酒精发酵的影响 f i g 2 5e 仃孤o f p h 州u co na l c o h o l 蛔n e n 钏o no f o g i i i a is t r a i n 由图2 5 可以看出，试验