（食品科学专业论文）应用近红外光谱分析技术检测茶叶成分的研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 本研究以茶叶中的茶多酚、咖啡碱的含量为检测指标，结合化学计量学方法开展了 近红外光谱定量分析的研究，主要从预处理方法选择、建模方法优化、波长优选、最佳 建模数量的选择、相关分析、进口与国产仪器图谱比较等方面深入探讨了近红外光谱定 量分析技术的几个关键问题，旨在为茶叶品质的无损检测提供新的参考。 本研究共收集了1 8 0 个不同种茶叶样品，分别同步检测了茶叶中的茶多酚和咖啡碱 2 个主要成分含量的化学值并采用m p a 型傅立叶近红外光谱仪和w q f 4 0 0 n 傅里叶变 换近红外光谱仪两台不同生产企业的近红外仪器采集了近红外光谱。比较了一阶微分、 s n v 和小波等多种预处理方法的效果，找出了茶多酚和咖啡碱的最佳预处理方法。同时， 在最佳的预处理方法下比较了移动窗口偏最小二乘等4 种优化波长方法，结果表明在特 定的窗口宽度下采用移动窗口偏最d x - - 乘可以得到最佳的优选波长结果，此时1 8 0 个茶 叶样品茶多酚和咖啡碱组分的窗口宽度分别为7 1 和9 1 时，模型预测均方差最低，分别 为2 0 6 65 和0 2 8 81 。 本文在优化后的预处理方法和波长范围内建立了不同数量的校正集下的茶多酚和 咖啡碱组分的校正模型。结果表明：茶叶中茶多酚和咖啡碱组分模型的预测精度与建模 样品的数量存在一定的关系。随着校正集样品数量的不断增加，模型的预测均方差由大 变小逐渐趋于平稳。当茶多酚和咖啡碱的校正集数量分别为4 0 和5 5 时，模型预测精度 趋于平稳。在1 8 0 个茶叶样品中，当茶多酚和咖啡碱校正集样品数量分别为8 5 和7 0 时， 模型的预测均方差最小，分别为1 7 9 70 和0 2 5 78 。该研究对建模时选择校正样品数量 具有参考价值。 由于茶叶为天然样品，含有大量的复杂背景。本文在国产w q f 4 0 0 型仪器下采用 相关分析方法对光谱进行处理，增强了光谱信息，再以p l s 法对咖啡碱组分建立校正模 型，其预测结果与未经相关分析的模型进行比较，结果表明：经相关分析后，模型咖啡 碱组分预测相关系数提高了2 9 6 ，预测均方误差降低了1 2 7 。证明了相关分析技术 在天然复杂样品中具有提纯和加强有效信号的能力。 与进口仪器相比，国产仪器各键出峰不够明显，且光谱平移明显，噪声较多。本文 对不同的预处理方法的光谱进行了分析，结果表明：对于国产w q f 型仪器仅采用消噪 的办法仍达不到进口仪器的预测精度，但是采用相关分析后可以提高信噪比。 关键词：近红外光谱，茶叶品质，波长优选，校正集数量，小波分析，相关分析 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nc o m b i n a t i o n 丽也t h ec h e m o m e t r i c a lm e t h o d s ，t h en e a r - i n f r a r e da m ) s p e c t r o s c o p y a n a l y s i st e c h n o l o g yw a su s e df o rt e aq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，i nw h i c ht h ec o n t e n to ft e a p o l y p h e n o la n dc a f f e i n e w e r gi n s p e c t e d i no r d e rt op r o v i d en e wr e f e r e n c ef o r t h e n o n d e s t r u c t i v ee x a m i n a t i o nf o rt e aq u a l i 锣d e t e c t i o n ，s e v e r a le s s e n t i a li s s u e so nn e a r - i n f r a r e d s p e c t r o s c o p yt e c h n o l o g yi nb u i l d i n gt h en i r f o r e c a s tm o d e lw e r ei n v e s t i g a t e di nt e r m so ft h e s p e c t r a lp r e p r o c e s s i n gm e t h o d sc h o i c e ，t h em o d e l i n gm e t h o do p t i m i z a t i o n ，t h em o d e l i n g s a m p l en u m b e r so p t i m i z a t i o n ，c o r r e l a t i o na n a l y s i st e c h n o l o g y , t h ec o m p a r i s o no fw o f a n d m p a s p e c t r a l ，a n dt h eo p t i m a lw a v e l e n g t hs e l e c t i o n 1 8 0t e as a m p l e so fd i f f e r e n tp r o d u c t i o nw e r ec o l l e c t e df o rt h i ss t u d y c h e m i c a lv a l u e so f t w on u t r i t i o ni n g r e d i e n tc o n s i s t i n go ft e ap o l y p h e n o la n dc a f f e i n ei nt e as a m p l e sb o t hw e r e d e t e c t e db ys p e c t r o p h o t o m e t e r a n dt h en e a r - i n f r a r e ds p e c t r aw e r es y n c h r o n o u s l yd e t e c t e db y m e a n so fn e a r - i n f r a r e di n s t r u m e n t so ft w od i f f e r e n tt y p e sm a d eb yd i f f e r e n te n t e r p r i s e s ：o n e w a sm p af o u r i e rn e a r - i n f r a r e ds p e c t r o s c o p ya n dt h eo t h e rw a sw q f - 4 0 0 nf o u r i e r n e a r - i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y i no r d e rt of r e dt h eb e s tm e t h o do fp r e t r e a t m e n t ，v a r i o u sm e t h o d s w e r eu s e dt o p r e t r e a t t h e o r i g i n a ls p e c t r a m e a n w h i l e ，t h i s r e s e a r c h c o m p a r e d f o u r - w a v e l e n g t ho p t i m i z a t i o nm e t h o d s t h em o v i n gw i n d o w sp a r t i a ll e a s ts q u a r e s ( m w i l s ) c o u l dh a v et h em o s ts u p e r i o rm o d e lw i mt h eb e s tw i d t ho ft h ew i n d o w s w h e nt h ew i d t ho f t h ew i n d o w so ft e ap o l y p h e n o la n dc a f f e i n ew e r e7 1a n d9 1 ，t h en i rm o d e lv e r a c i t yw e r e m a x i m a lw h i c hr e a c h e d2 0 6 65a n d0 2 8 81 t h em e t h o d so fm w p l sw e r eu s e dt os e l e c tw a v e l e n g t ha n dt h e ne s t a b l i s h e dt h et e a p o l y p h e n o la n dc a f f e i n en i r m o d e lr e s p e c t i v e l yi nt h ed i f f e r e n tn u m b e r so fc a l i b r a t i o ns e t s b yt h eb e s tm e t h o do fp r e t r e a t m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en u m b e ro fc a l i b r a t i o ns e t sh a d a no b v i o u si n f l u e n c eo nt e ap o l y p h e n o la n dc a f f e i n em o d e l w i t ht h en u m b e ro fc a l i b r a t i o n s e t si n c r e a s e d ，t h er o o tm e a ns q u a r ee r r o ro fp r e d i c t i o n ( r m s e p ) r e d u c e da n db e c a m es t e a d y i nt h ee n d v t h e nt h en u m b e ro ft e ap o l y p h e n o la n dc a f f e i n ec a l i b r a t i o ns e t sw e r e 4 0a n d5 5 ， t h en i rm o d e lv e r a c i 哆b e c a m es t e a d y a n dw h e nt h en u m b e r sb e c a m e8 5a n d1 0 0 r e s p e c t i v e l y , t h en i rm o d e lv e r a c i t yw e r em a x i m a lw h i c hr e a c h e d1 7 9 70 a n d0 2 5 78 t h e c o n c l u s i o ni nt h i ss t u d yh a das i g n i f i c a n tr e f e r e n c e dv a l u ef o rs e l e c t i n gp r o p e rs a m p l e 江苏大学硕士学位论文 n u m b e r si ne s t i m a t i n gn i rm o d e l a sn a t u r a ls a m p l e s ，t e ac o n t a i n e dal a r g en u m b e ro fc o m p l e xb a c k g r o u n ds u b s t a n c e s a l l o ft h eo r i g i n a ls p e c t r ab yw q fa f t e rc o r r e l a t i o na n a l y s i s ，w e r eu s e dt ob u i l dc a l i b r a t i o n m o d e l so nc a f f e i n eu s i n gp l sr e g r e s s i o na n a l y s i s ，w h i c hp r e d i c t i o nr e s u l t sw e r ec o m p a r e d w i t ht h em o d e l sn o tp r o c e s s e db yt h ec o r r e l a t i o na n a l y s i s a f t e rc o r r e l a t i o na n a l y s i s ，t h e p r e d i c t i o nc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti n c r e a s e db y2 9 6 ，t h er o o tm e a ns q u a r ee r r o ro fp r e d i c t i o n d e c r e a s e db y1 2 7 t h ep u r i f i c a t i o na n ds t r e n g t h e n i n ga b i l i t yf o ra v a i l a b l es i g n a lo f c o r r e l a t i o na n a l y s i st e c h n o l o g yw a s p r o v e d c o m p a r e dw i t ht h ei m p o r t e de q u i p m e n t , d o m e s t i ci n s t r u m e n t sd i dn o th a v ea l lo b v i o u s p e a k ，a n dt h es p e c t r as h i f t e ds i g n i f i c a n t l ya n dh a dm o r en o i s e t h i sp a p e ra n a l y s e dt h es p e c t r a a f t e rd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a td o m e s t i ci n s t r u m e n tc o u l dn o tr e a c ht h e a c c u r a c ya st h a to fi m p o r t e de q u i p m e n tb u tt h es i g n a lt on o i s er a t i oc o u l db ee n h a n c e da f t e r t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i sw a sa p p l i e d k e yw o r d ：n e a ri n f r a r e ds p e c t r o s c o p yf r q m ) ；t e aq u a l i t y ；o p t i m a lw a v e n u m b e r ss e l e c t i o n ； n u m b e ro fc a l i b r a t i o ns e t s ；w a v e l e ta n a l y s i s ；c o r r e l a t i o na n a l y s i s m 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 靴敝储躲啊 年解密后适用本授权书。 一舢 知驴g 年i ) 月 i ie l 0 仞矿年，钞月厂日 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：9 p 蟠 日期：2 0 0 8 年1 2 月，1 1e l 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 中国是茶的祖国，对茶的种植、制造、审评等有源远流长的历史，是世界上茶园面 积最大、茶树品种最全的国家，中国的这些天时地利人和使中国成为世界上最有权威的 茶研究中心n 1 。唐人陆羽在其所著的茶经中说：“茶之为饮，发于神农氏，闻于周鲁 公”。茶从唐代传入东亚地区的朝鲜、日本，到十六世纪传入西方各国，成为世界性的 饮料，特别是近两三百年世界茶叶发展很快，销量迅速扩大口3 。 茶叶中含有多种具有生物活性的物质，如茶多酚、茶氨酸及咖啡碱等。随着科技的 发展，茶叶中所含的天然活性成分的抗氧化、抗癌、降血糖、增强机体免疫力、抗衰老 等功效的陆续被报道乜1 ，茶叶作为传统的天然饮料，更加受到了世人的欢迎。随着茶叶 消费的增长，茶叶品质的控制变得愈来愈重要。但当今在茶叶市场上评估茶品质的方法 主要是理化审评和感官审评。每当出现争论时多以感官审评作裁断。而在进行感官审评 的过程中，包含了许多主观因素。 因此，为了进一步满足日益扩大的销售需要，避免感官审评带来的弊端，寻找一种 快速，简便的茶叶品质评价方法已成为一个迫在眉睫的重要课题。 1 1 茶叶中主要成分及常规检测方法 1 1 1 茶叶的主要成分 茶叶是世界上传统的3 大饮料之一。茶叶中含有5 0 0 多种化合物，许多种化合物是 茶叶特有的，具有营养、保健和药理作用，增进人的身体健康。其中，最重要的是茶多 酚、生物碱、茶色素、芳香物质、氨基酸和维生素【3 】。 ( 1 ) 茶多酚( t e ap o l y p h e n 0 1 ) 茶多酚又叫茶单宁，是茶叶中多酚类物质的总称，约有3 0 多种化合物，主要由儿 茶素、类黄酮、花青素和酚酸等4 类物质组成。其中，儿茶素类占茶多酚总量的6 5 一8 0 ， 是决定茶汤颜色、味道的主要成分。茶叶中儿茶素有1 0 多种，含量较多的有6 种，分 为两类：简单的( 或非酯性) 儿茶素、复杂的( 或酯性) 儿茶素。儿茶素的结构至少包 括3 个环核，是2 苯基苯并吡喃的衍生物口3 。 茶多酚是淡黄色至茶褐色略带茶香的水溶液，粉状固体或结晶的形式存在，具有涩 江苏大学硕士学位论文 味。纯净的儿茶素为白色无定形粉末，在空气中很容易氧化成为黄棕色的物质。易溶于 水，其氧化产物能与蛋白质结合而沉淀；易于含铁物质反应，生成黑绿色的物质。茶多 酚具有2 一苯并吡喃的苯基碳架，含有两个以上互为邻位的羟基多元酚，故有酚类化合物 的通性，具有较强的供氢能力，如儿茶素b 环和c 环上的酚性羟基具有供氢能力，在 氧化过程中生成邻醌类及联苯酚醌，因此是一种理想的抗氧化剂，其活性高于一般非酚 类或单酚羟基类抗氧化剂脚。 ( 2 ) 生物碱( a l k a l l o i d ) 嘲 茶叶中的生物碱以嘌呤类为主。其中，含量最多的是咖啡碱( 2 5 ) 。咖啡碱易溶 于热水，1 0 0 以上的高温易升华挥发。咖啡碱对茶叶品质影响较大，是茶叶的重要滋 味物质，尤其是绿茶中的苦味往往与咖啡碱含量偏高有关。而在红茶茶汤中，与多元酚 类结合成为复合物，茶汤冷后形成乳化现象。咖啡碱具有兴奋和利尿作用，茶中特有的 儿茶素类及其氧化缩合物可使茶中咖啡因的兴奋作用减缓而持续，故喝茶可使长途开车 的人保持头脑清醒及较长耐力。 此外，茶叶中尚含有少量的茶叶碱和可可碱。 ( 3 ) 芳香物质( a r o m a t i cm a t t e r ) 这是茶叶中含量低而种类多的挥发性物质的总称。按照来源，少部分是茶叶自身代 谢过程中的产物，而大部分则是茶叶工艺加工过程中的产物；按照结构，这类物质可分 为烃、醇、醛、酮、酸、酯、酚、氧化物、硫化物、氮化物等，已分离出来的约有3 0 0 种。茶叶的香气主要决定于这类物质的组合与浓度。通常，红茶的芳香成分以醛、酮、 酸、酯等为主，多由茶叶自身的酶促氧化过程产生，具有天然的甜香气味；而绿茶则以 含氮化合物和硫物为主，多由加工过程的热转化而形成，具有典型的烘炒香【3 】。 ( 4 ) 茶叶色素( p i g m e n t si nt e a ) 茶叶中的色素可分为两大类：一是脂溶性色素。主要是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素， 不溶于水，而溶于有机溶剂，这类色素对于茶的色泽和叶底色泽具有很大的影响。二是 水溶性色素，主要是类黄酮，花青素，以及其他茶多酚的氧化产物( 如茶红素、茶黄素、 茶褐素等) 能溶于水，这类色素决定茶汤的颜色【3 】o ( 5 ) 氨基酸和蛋白质( 锄i i l oa c i d sa n dp r o t e i n ) 茶叶中2 0 以上为蛋白质，不溶于水。可溶性蛋白仅占1 - 2 ，对茶汤的滋味产 生良好作用。 2 江苏大学硕士学位论文 富含2 0 多种氨基酸，其中，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量较高，尤以 茶氨酸含量最高，占氨基酸总量的5 0 以上口3 。 ( d 碳水化合物( c a r b o h y d r a t e ) 茶叶中的碳水化合物包括3 类：一是单糖，含量在0 3 一1 0 ，溶于水，主要有果 糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木酮糖和阿拉伯糖等。二是双糖，含量在0 5 - 3 0 ， 溶于水，主要有蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖。三是多糖，占茶叶干物质的2 0 以上， 不溶于水，主要是淀粉、纤维素、木质素等。若这类物质偏高则是茶叶处于嫩度差、老 化状态，品质低劣【3 1 。 ( 7 ) 有机酸( i n o g a n i ca c i d s ) 茶叶中含有将近3 0 种有机酸，可分为两类：一是二羧酸和三羧酸；二是脂肪酸。 在这类有机酸中，有的是香气组分( 如乙烯酸) ；有的本身虽无香气，但可转化为香气( 如 亚油酸) ；有的则是香气成分良好吸附剂( 如棕榈酸) 【3 】。 ( 8 ) 维生素( v i t a m i n ) 这是一类含量低微、作用巨大的生理活性物质。茶叶中的维生素可分为两类：一是 水溶性维生素，如维生素b 类( b l 、b 2 、b 3 、b 5 、b 6 、b 1 1 ) 、维生素c 、肌醇等，其中维 生素c 含量最高( 高级绿茶含量可达0 5 ) 。二是脂溶性维生素，如维生素a 、维生素d 、 维生素e 和维生素k 。 ( 9 ) 矿质元素( m i n e r a le l e m e n t s ) 茶叶中的矿质元素总量在4 7 ，是茶叶出口检验项目之一( 通常，不宜超过 6 5 ) 。含量最高的是p 、k ；其次是c a 、m g 、a i 、f e 、m n 、s ；微量的有c u 、盈、 c o 、n i 、b 等。这些元素对人体的代谢活动具有重要作用。 1 。1 2 茶叶的常规品质评定 茶叶种类繁多，形状千姿百态，内质各具风味，中国各类新老名茶更是争奇斗艳。 茶叶作为农产品的一种，无论从质量管理角度、市场规范角度还是从消费角度来看，质 量评定及分级标准化都具有非常重要的意义。 ( 1 ) 感官审评【4 】 目前，茶叶品质的评定仍沿用传统的感官审评的方法。传统感官审评是通过评茶师 的视觉、嗅觉、味觉和触觉对茶叶的色泽、香气、滋味、外形进行分项评审，综合确定 3 江苏大学硕士学位论文 其质量和经济价值，因简便、快捷，能通过感官对茶叶的品质及特征迅速描述、评判。 因此，至今仍没有更好的办法替代它。但是，应该看到，感观审评是由茶师的感官经验 决定的，无法量化，人们可以从不同的水平来解释。在茶叶流通中，交易双方易产生矛 盾。因此，研究茶叶品质评定新方法的研究受到茶叶界的关注。 ( 2 ) 理化审评 应用物理及化学方法评定茶叶品质的方法简称理化审评。茶叶理化审评的研究已取 得进展，主要方法有：容重比容法；电导测定法；缓冲能曲线法；延迟光效应法；电容 值测定法；色差测定法；红碎茶内质化学鉴定法；绿茶滋味化学鉴定法；单相关回归分 析法；多元回归分析法；通径分析法：模糊综合评判法等。理化审评的研究虽已取得进 展，但因多种原因，目前仍无法完全替代感官审评。 在这种情况下，2 0 0 0 年黄继轸阻1 采用感官审评和理化审评相结合的方法，其中滋味、 嫩度评分用化学法，香气、劣变因子审评用感官评价法。对于绿茶类，品质总分m 滋味 分x 4 0 + 嫩度分x 4 0 + 香气分x 2 0 劣变分。其中滋味分m m 氨基酸总量m g g 数+ 多酚类 + 氨基酸多酚类x 3 0 ，嫩度分= 纤维素含量的倒数乘以7 3 0 。在此研究中，8 0 的品质 分来自化学审评，客观性较强。由于茶叶香气和劣变因子的审评目前只能依赖感官审评， 因此感官审评可弥补化学审评的不足，起把关作用。就上述推荐的绿茶品质评定式来说， 茶叶外形这里已没有优势，该法应是在外形合格的前提下计分的，外形只作为质量检验 中的产品规格合格与否进行检验。 1 1 3 茶多酚、咖啡碱的常规检测 ( 1 ) 茶多酚的常规检测方法口1 近年来茶多酚的分析检测方法以分光光度法、高效液相色谱法为主。其中分光光度 法除国标介绍的紫外一可见分光光度法外还有原子吸收分光光度法等，它们广泛应用于 茶汤中茶多酚的分析。另外，气相色谱法、毛细管电泳法、高锰酸钾滴定法等亦用于茶 多酚的分析测定。下面对本课题中使用的可见分光光度法和较为常见的紫外分光光度 法、高效液相色谱法进行具体介绍。 1 ) 可见分光光度法 可见分光光度法的原理之一是由于茶多酚所具有的多酚羟基结构有很强的还原性， 可以通过还原一些金属离子，利用金属离子与有机试剂的络合显色反应而间接地测定茶 4 江苏大学硕士学位论文 多酚的含量。如用茶多酚定量还原三价铁为二价铁，二价铁与l ，1 0 二氮菲显色生成稳 定的红色络合物，其颜色的深浅与茶多酚的含量成线性关系，从而用比色法间接地测定 茶多酚的含量。另外，还可以通过茶多酚还原一些有机物或无机化合物，通过显色反应 而间接测定茶多酚的含量。 该方法的原理之二是茶多酚结构中的邻酚羟基能与一些金属离子络合而显色。如将 茶叶水浸液用乙醇正丁醇( 1 ：1 ) 试液稀释约1 0 倍，依次加入n a n 0 3 、a 1 0 3 ) 、k o h ， 多酚类物质与三价铝即显示稳定的红色，在5 0 5 n m 处有最大吸收，茶多酚含量在 3 2 0 1 6 0 0 m g m l 浓度范围内，吸收度和浓度成良好线性关系。 2 ) 紫外分光光度法 。 直接紫外分析法的原理是由于茶多酚有不饱和结构，在3 2 0 3 8 0 n m ( 吸收带i ) 和 2 4 0 2 7 0 n m ( 吸收带i i ) 的两个区域有深度吸收峰。直接紫外分析法定量的依据是黄烷醇、 花白素和茶没食子素分别在2 0 5 r i m 和2 7 5 n m 处有最大吸收峰。绿原酸和黄烷醇的吸收 光谱不一致，且这些物质仅占多酚总量的极少一部分量，故在2 0 5 n m 和2 7 5 n m 波长出 的直接紫外测定可以认为是多酚总量测定的有用方法之一。但在2 7 5 n m 处进行测定时， 首要解决的问题是必须将咖啡碱全部除去，因为咖啡碱在2 7 2 n m 处亦有较大的吸收。 3 1 高效液相色谱法 由于色谱专一性强、灵敏度高，常用于茶多酚各组分的分离与测定。1 9 7 4 年美国 h o e f l e r a c 等人瞄1 提出了测定茶叶中多酚物质的h p l c 法，配合使用反向键合填充剂， 可将茶汤直接注入色谱柱，3 0 m i n 之内就达到了理想的分离效果，用紫外检测器就能迅 速准确地测定出多酚物质的含量；消除了气相色谱分析中样品萃取、浓缩、转溶、衍生、 内标等繁琐步骤，大大缩短了分析时间，减化了分析手续，提高了分析的准确性。 ( 2 ) 咖啡碱的常规检测方法【4 5 】 咖啡碱的定量方法有多种，主要有碘量法、重量法、定氮法、比色法、层析法、紫 外分光光度法、近红外分析法、气相色谱法、高压液相色谱法等【4 5 1 。与茶多酚相似，近 年来使用最多的也为分光光度法和高效液相色谱法，并已将这两种方法同时引入国标法 中，成为在茶叶中检测咖啡碱的最常规方法。下面将对本课题中使用的紫外分光光度法 和其他较为常见的几种方法进行详细介绍。 1 ) 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用咖啡碱结构中嘌呤环具有共轭双键体系，能强烈吸收紫外光 5 江苏大学硕士学位论文 的性质进行测定的定量方法，该法目前被确定为茶叶中咖啡碱总量测定的国家标准，波 长选用2 7 4 n m 。 2 ) 高效液相色谱法 高效液相色谱法对茶叶中的茶多酚、游离氨基酸、生物碱都有良好的分离效果。太 田敞子利用h p l c 法同时检测茶叶中游离氨基酸和咖啡碱的含量。原理是利用茶叶中的 游离的氨基酸与异硫氰酸苯酯( p l l ) 反应，生成苯基硫酸( p f c ) 衍生物，用紫外检 测器检测。分析条件：色谱柱w a k o p a c kw s p t c ( d 4 0 m m x 2 0 0 m m ) ，流动相1 ：乙腈 ( 6 0 m m o l l ) ，p h 6 0 醋酸钠缓冲液( 6 9 4 ，体积) ，流动相2 ：乙腈( 6 0 m m o l l ) ，p h 6 0 醋酸钠缓冲液( 6 0 4 0 ，体积) ，梯度洗脱，流速1 0 m i m i n ，柱温4 0 。c ，检测波长2 5 4 n m ， 进样3 0 9 l 。 3 ) 碘量法 碘量法是利用在酸性条件下加入一定量标定过的碘液，咖啡碱与碘生成不溶性过碘 化物，再用硫代硫酸钠滴定剩余的碘换算而得。 钔重量法 重量法是利用氯仿抽提纯化了的经水提取后的咖啡碱水溶液，蒸出氯仿，烘干称重。 5 ) 定氮法 定氮法是将茶与氧化镁共热，游离出咖啡碱，经酸化后用氯仿萃取、浓缩，以凯式 定氮法测定含氮量，再据含氮量换算成咖啡碱含量。 国层析法 层析法常用于茶叶中生物碱组分的分析。硅胶是常用的一种支持剂，该法最低检测 限为0 1 1 t g 。 7 ) 气相色谱法 该法分析条件为：色谱柱0 2 c m 1 5 0 c i n q v l 0 1 型玻柱。氩气流速为3 0 m l m i n 。火 焰离子检测器，检测温度2 5 0 。c ，柱温1 5 0 。c ，进样口温度2 0 0 。c ，衰减1 6 ，进样量2 皿。 用峰高法定量，咖啡碱含量在0 5 , , , 4 m g m l 范围内呈线性关系。 1 1 4 常规检测方法的应用现状 目前用于茶叶中的检测方法很多，上述介绍的方法均有采用。2 0 0 0 年魏泱1 等人采 用色谱分析法检测茶叶中茶多酚的主要成分几茶素，特别重点介绍了平板色谱法，气相 6 江苏大学硕士学位论文 色谱法以及目前出现的很多新的色谱分析方法。2 0 0 6 年唐仕荣口1 等采用h p l c 快速检测 茶叶中的茶氨酸，得出采用采用z o r b a xs b - a q 色谱柱( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 r t m ) ，乙腈： 0 1 磷酸溶液= 5 ：9 5 ( 体积比) 为流动相，流速l m l j m i n ，进样量1 0 皿，柱温2 5 ，检 测波长1 9 6 n m 。结果表明茶氨酸在0 0 2 m g m t , 4 ) 2 0 m g m l 浓度范围内线性关系良好，相 关系数r = 0 9 9 98 ，加样回收率为9 8 5 9 伽= 5 ) 。2 0 0 6 年张峻萍等人暗1 采用胶束电动毛细 管电泳技术，考察了不同分离电压、缓冲液p h 值对茶氨酸分离检测的影响，确定了茶 氨酸的适宜检测波长。结果表明，在3 0 m m o l l 磷酸盐、5 0 m m o l 胚d s 、6 甲醇的运行 缓冲液( p h 8 5 ) 条件下，分离电压为2 2 k v ，分离温度为2 5 。c ，检测波长为2 0 0 n m 。茶氨 酸可以得到很好的分离，并能与谷氨酸进行有效区分。同时，方法学考察结果显示，该 分离条件的精密度、加样回收率和最低检测限均符合对检测方法的要求，从而建立了一 种快速准确的茶氨酸直接定量方法。福建省南平市中心检验所姚青【9 】利用瑞利g c 3 4 0 0 气相色谱仪，o v l 7 0 1 毛细管柱子，f p d 检测器，同时测定茶叶中7 种有机磷农药。此 对7 种有机磷农药的回收率范围7 6 4 一1 0 3 8 ，变异系数为6 3 一1 0 6 ，检测限为 0 0 0 45 4 ) 0 0 85 1 t g g 。2 0 0 5 年高小红等人【1 0 】采用热水萃取茶氨酸，浓硫酸水解为乙胺， 建立了分光光度测定茶叶中茶氨酸含量的新方法。最大吸收波长为5 7 0 n m 。茶氨酸浓度 在1 6 。1 0 0 m g l 范围内与a 呈线性关系，检出限为3 x 1 0 1 9 m l 。该方法分析结果准确、 操作比较简单、可排除茶叶中其他氨基酸的干扰。江苏省金坛市卫生防疫站包青峰等人 采用微波消解、原子吸收法测定了这3 种茶叶中铅铜砷的含量。2 0 0 5 年汪东风等人【1 2 j 根据i c p m s 法分析的茶叶中稀土组成，以l a ：c e ：n i d ：y p r = 4 0 ：2 5 ：2 0 ：8 ：7 混合的稀土为标 样，采用湿法灰化和偶氮胂i i i 为显色剂，在紫外可见分光光度计6 5 6n l l l 处测定茶叶中 的稀土总量。该方法快速简便，适于基层卫生防疫部门大批量快速检测茶叶中稀土总量 时应用。 以上为目前检测茶叶中物质的含量的常用方法。由上可以看出色谱分析法、电泳技 术、分光光度法、微波消解、原子吸收法等方法均可达到检测要求。但是，也应该看到 采用这些方法含有样品需要预处理，检测过程复杂，技术要求高，成本高等缺点。因此， 选择一种不需要大量的化学试剂，安全性高，样品无需预处理，测试迅速的茶叶品质检 测方法是十分必要的。 7 江苏大学硕士学位论文 1 2 近红外光谱分析技术简介 1 2 1 近红外光谱分析技术的原理及特点 近红外光谱是由于分子振动能级的跃迁 ( 同时伴随转动能级跃迁) 而产生的( 图 黜篙凳鬻暑 1 1 1 2 0 1 。它记录的是分子中单个化学键的基 m o l e c u l a re n e r g yl e v e lt r a n s i t i o n s 频振动的倍频和合频信息，主要是由于x h 键( x 为c ，o ，n ，s 等) 的吸收。不同 基团产生的光谱在吸收峰位置和强度上有所不同，根据朗伯比耳吸收定律，随着样品 成分含量的变化，其光谱特征也将发生变化【3 l 】。近红外光谱分析正是根据这些不同的光 谱特征，进行定性和定量分析的一种技术。 ( 2 ) 近红外光谱分析的特点 近红外光谱技术之所以成为一种快速、高效、同时适合定性和定量分析的有利工具， 是由其技术特点决定的，近红外光谱分析的主要技术特点如下： 1 ) 样品无需前处理近红外光具有很强的穿透能力和散射效应，在检测时，样品不需 要进行任何前处理，可以穿透玻璃、石英和塑料包装进行直接检测，也不使用任何化学 试剂。 2 ) 分析方便快捷近红外仪器的测定时间短，傅立叶变换近红外光谱仪器的扫描一次 样品的速度一般在1 s 左右；传统的光栅型近红外光谱仪器的扫描速度在几分钟范围之 内。 3 ) 无损检测技术 近红外检测技术在测定光谱时不破坏或消耗样品，对样品的外观和 内在结构都不产生影响。可直接对样品进行活体测定。该特点可为生物学研究中对采样 技术、试验设计及果蔬等农产品自动检测分级节约大量的人力物力。 8 江苏大学硕士学位论文 舢无污染低成本近红外检测技术和常规分析方法相比由于不需要使用化学试剂或高 温、高压、大电流等测试条件，分析后不会产生化学、生物或电磁污染。既环保又可以 节约大量的试剂费用。 5 ) 多组分同时测定在同一模式下，该方法可以同时测定多种组分，比如在测小麦的 模式中，能同时测定其蛋白质含量、水分、硬度、沉淀值、快速混合比等指标，大大简 化了测定操作。不同的组分对测定结果都有一定的影响，因为在测定过程中，其它组分 对近红外光线也有吸收。近红外仪器的计算单元化学定量计算软件可以采用数学的 方法来消除这种影响。这是近红外技术得以大力推广的主要原因。 6 ) 在线检测和实时分析由于近红外技术能够及时快捷地对样品进行检测，并具有远 距离采集样品光谱和实时分析的能力，特别适用于在线分析。便于及时调控生产线上原 料及产品品质的变化，保证产品质量稳定。光纤导管和光纤探头的开发应用也使远距离 检测成为现实。远距离检测技术尤其适用于污染严重、高压、高温等对人体和仪器有损 害的环境下应用，也为近红外网络技术的发展奠定了基础。 n 近红外技术的重现性好，效率高，该技术的一个重要特点就是技术本身的成套性， 即近红外光谱仪、化学计量学软件和应用模型的三位一体性，性能优异的近红外光谱仪 是该技术的基础和前提【3 2 1 。光谱测量技术与化学计量学学科的有机结合，并溶入现代计 算机的催化作用，被誉为分析的巨人【3 3 】。 但是，近红外光谱分析技术是一种间接的分析技术，它必须依赖为光谱仪安装相应 的“软件”( 定量分析或定性分析数学模型) ，常规的化学分析方法测定出特定背景范围 内多个标样成分的化学值或性质，利用化学计量学方法建立数学模型，并通过数学模型 计算待测样品的成分含量或确定性质。数学模型的预测准确性与常规化学分析方法准确 性、建模样品是否有代表性、数学模型的校正和使用是否合理等因素有很大的关系。另 外，与常规化学分析相比，近红外光谱分析的测试灵敏度较低，待测样品的成分含量一 般不小于0 1 。 1 2 2 近红外光谱分析技术的发展及应用 近红外光谱分析技术的发展大体上可分为5 个阶段b 明。在近红外谱区被发现后的 一个半世纪中，受技术水平的限制，无法将光谱信息充分提取出来，其应用受到了很大 的限制p 1 1 。直到2 0 世纪5 0 年代以后，随着近红外光谱仪器的进步和n o r r i s 等所做的大 9 江苏大学硕士学位论文 量研究工作，近红外光谱分析技术首先在农产品品质快速分析的研究中得到了应用。到 2 0 世纪6 0 年代中期，经典近红外光谱分析存在灵敏度低、抗干扰性差的弱点，而当时 的技术水平无法克服这些弱点，使该项技术的研究和应用进入了一个沉默时期。在此期 间，由于美国农业部研究部门在农产品和食品品质分析上大力推广近红外光谱分析专用 仪器，使近红外光谱分析的研究和应用得以维持和延续。2 0 世纪8 0 年代以后，随着现 代计算机硬件和软件技术的飞速发展，带动了分析仪器的数字化和化学计量学 ( c h e m o m e t r i c s ) 学科的发展，很好地解决了近红外谱区谱峰重叠、提取光谱信息困难和 背景干扰等问题，使以弱信号和多元信息处理为基本特征的近红外光谱分析获得了坚实 的技术支持。在该时期近红外光谱分析技术在各个领域中的应用研究陆续展开。进入2 0 世纪9 0 年代，近红外光谱分析技术步入一个快速发展时期。在该时期计算机硬软件技 术同益成熟，数字化的光谱仪器与化学计量学方法的有机结合，形成了现代近红外光谱 分析技术。近红外光谱仪器数字化程度亦在不断提高，并配备有功能强大的计算机和化 学计量学分析软件，使其应用更为广泛。在欧美等发达国家中近红外光谱仪已被视为品 质管理实验中必备的仪器【2 7 】【3 l 】。 由于光学、计算机科学技术、化学光度理论和方法等各种科学技术的不断发展，近 红外光谱分析技术研究内容增多，其应用从农产品的实用技术扩展到其它许多领域。如 石油化工、高分子化工和基本有机化工、食品工业、纺织工业和制药工业及临床医学等 领域【2 7 1 。 在农产品的应用中，大多采用漫反射技术。最早主要是测定小麦中的水分含量，后 来又用于谷物及饲料中的淀粉、蛋白质、油脂、糖分、氨基酸及食用纤维、矿物质等含 量的测定【3 4 1 ，以及谷物中污染物的测定。此外，在烟草行业中，用近红外光谱分析技术 测定水分含量应用广泛，还用于烟叶中其它成分的分析，如烟碱( 0 。6 的范围内) 、总 糖( 0 3 0 的范围内，精度可达0 1 ) 和总氮【3 5 1 ( 精度可达0 8 以内) 。并且，r e y n o l d s 烟草公司在1 9 9 0 年申请了用n i r 在线检测烟草薄荷醇含量技术的专利【3 5 1 。 在石油化工行业，近红外光谱分析技术得到了广泛的应用，并且带来了巨大的经济 效益，如燃料油、润滑油的组成及性质分析和石油加工过程中的参数的检测等。近红外 光谱分析技术在高分子领域中可以测定单体的纯度、残余单体量、聚合度、相对分子量、 交联度、密度等诸多高分子化学和物理性质指标【3 1 1 。 在食品分析中，用近红外光谱分析技术测定肉类鱼类、奶和奶制品中的脂肪、蛋白 1 0 江苏大学硕士学位论文 质、氨基酸等含量及水分数据，进行产品质量监控【3 l 】；用近红外光谱分析技术监测水果、 蔬菜中各种营养组分含量和甜度、酸度、湿度及脆度的品质评价【3 l 】；近红外光谱分析技 术还可用于各种含醇饮料中醇含量、果汁中糖和酸含量的测定，如在啤酒生产中在线监 测发酵过程中酒精及糖分含量。江苏大学陈斌先后用近红外光谱测定了食醋中的总酸、 还原糖和挥发酸p 6 1 ，方便面中的含油率，酱油中的总氮和总酸以及啤酒中的酒精度等【3 7 1 ， 赵杰文等人利用近红外光谱检测技术对苹果的糖度进行了检测，取得较好的效果。近红 外定量分析因其快速、准确已被列入世界谷物化学科技标准协会( i c c 1 5 9 2 0 2 ) 和美 国谷物化学协会标准( a a c c n o 3 9 o o ) ，成为世界食品分析标准检测方法之一