（食品科学专业论文）纳豆菌产抗菌物质培养条件的研究.pdf

摘要 摘要 零硪究蓠惫戳不弱缡豆营抗蓥邃摄滚，辩不鼹懿攒示蕤骰捧蘸实羧，逸窭焱焦静辫 示菌大肠杆菌和金黄色黼萄球菌；利用不同纳鱼筒抗菌粗提液对这两种菌做抑菌实验筛 选毒绩藏藿产抗蕴穆质较多熬藏耪；对大翳耪惑帮金黄莰篱萄球釜遴费德嚣萤滚髂发酵 产抗菌物质的培养条件的优化；并对纳威菌抗菌粗提液的部分理化性质、与抗艇素及防 囊裁熬对照实验、最枣撵萤穗释嫠鼗避褥磷究；对抗莹貔蒺翅步分褰缝诬，臻定挠蓦黪 质分子鬣范围。 研筑绩暴裘甥，拭藏褪提渡瓣酵母落鞠霉蘩垮茏捧巍竣莱，辩致疯蘧大弱抒薤嚣金 黄色葡萄球菌掷菡效果较好。通过单囡豢试验对大肠秆黼霸金黄色葡萄球菌抑罄强宜径 豹测量必摆括确定了绒耍蓥滚髂发酵产生捷蓥物壤熬爱佳条终。捧裁金黄惫穰蘩球藏懿 缩豆翦教酵条傍；碳源为甘油2 ，氮源为0 。5 大豆分离蟹盘，装液鬃2 0 m l 1 0 0 m l ， 接糖量0 。5 ，秘始p h 7 + 0 ，培势辩闯7 2 h ，摇臻转速1 8 0 r m i n ，培羚遗发麓；捧铡大 肠抒菌嬲纳豆繁发酵祭彳孛：碳源为甘油3 ，氮源为0 5 大豆分离蛋自，装液鳖 2 0 m l 1 0 0 m l ，接狰量0 5 ，初娥p h 7 0 ，培养粒阙6 0 h ，摆床转速1 8 0 r m i n ，壤券滠度 3 0 。纳豆菌产生的抗菌物质舆有良好的热稳定性和酸碱稳定烛。即寇4 t2 4 h ，6 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 1 t2 0 m i n ，在p h 蓬从4 到1 2 的蘸围内，搏蘧效粜氇基零不变+ 鑫属离子对抑菌效果有促进作用的有c a z + 、a 1 3 + 、m 9 2 + 和f c “，丽c u = h 、m n 2 + 、z n 2 + 喇李枣翻抗菌携豢豹产生。经实验涯实缀露蕊静具有良好瓣遗传稳定瞧。缡耍麓产生懿摭 菌物质的抑菌效果优予抗生素( 庆大霉索) 及防腐荆的抑荫效果。纳豆菌抗菌粗掇液在很 小浓发下裁有熟德效果。当指示麓兔金焚色蘩莓球菌射，皴豆赘抗蘩粗提滚最小捧藏稀 释倍数为2 7 ；当指示菌为大肠秆菌时，纳豆菌抗菌粗摄液最小掷菌稀释倍数为2 0 。 纳甄菌抗菌粗提液经0 4 5 ，u m 的微孔滤膜过滤骺采用s e p h a d e x g 2 5 黼聚糖凝胶j 圭黠 缩豆藤产生豹抗菌物质避行分离，分离磁髂样液馓掷菌实辍，并通过做标准曲线求得挽 黼物质分子量范围为2 6 0 9 8 0 d a 。 关键词：纳厦菌，激体发酵。抗菌物质，璞化性质，分篙 a b s 拄a 雌 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , a n t i - m i c r o o g a n i s mt e s t sa i m i n ga tv a r i o u si n d i c a t i o n g e r m sw e r ed o n e 。t h e n t h eo p t i m u mi n d i c a t i o n - g e r m sw e r es e l e c t e d ，n a m e l ye s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u s a u r e u s + h i g ha n t i m i c r o b i a la c t i v i t ys t r a i no fa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sp r o d u c e db yb a c i l l u s n a t t ow e r ef i l t r a t e d f i r s t l y t h eo p t i m i z e de x p e r i m e n t sw e r em a d e o u tt o p r o d u c e a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sb yl i q u i df e r m e n t a t i o n 。a tt h es a m et i m e 。穗ec h e m i c a la n dp h y s i c a l c h a r a c t e r so ft h es u p e m a t a n t so fb a c i l l u sn 口f 加f e r m e n t a t i o nl i q u i d ，c o m p a r i n gw i t ht h e a n t i b i o t i ca n dt h ep r e s e r v a t i v ea n dt h el e a s tv o l u m eo fi n h i b i t i n gb a c t e r i u mw e r ea l s os t u d i e d t h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d ，t h e nt h er a n g eo fm o l e c u l a rw e i g h t w a sc o n f i r m e d 1 陲er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u p e m a t a n t so fb a c i l l u s 摊球# 招f e r m e n t a t i o nl i q u i dc o u l dn o t i n h i b i tm i c m z y m ea n dm i l d e w , w h e r e a sa n t i m i c r o b i a le f f e c t so i le s c h e r i c h i ac o l ia n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r ev e r yw e l l t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fb a c i l l u s 辩口f 口p r o d u c i n g a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sb yl i q u i df e r m e n t a t i o nw e r ec o n f i r m e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ， t h ea c t i v i t yo fi n h i b i t i o nw a sm e a s u r e db yt h ed i a m e t e ro fi n h i b i t i o nz o n e n a m e l y ，i th a s b e e ns h o w e dt h a tt h el i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fb a c i l l u sn a t t ow h i c h a i m e da t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r eg l y c e r i n2 ，s o y b e a na l b u m e n0 。5 ，2 0 m lm e d i u mp e r1 0 0 m l c u l t u r ef l a s k ，o 5 b a c i l l u s 瑚黝s u s p e n s i o n ，i n i t i a lp h 7 0 ，s h a k i n gb y1 8 0 r r a i na t2 5 。cf o r 7 2 h 。w h e r e a st h el i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f b a c i l l u s 抖矗纫w h i c ha i m e da te s c h e r i c h i a c o l iw e r eg l y c e r i n3 ，s o y b e a na l b u m e no 5 ，2 0 m lm e d i u mp e rl m lc u l t u r ef l a s k ，o 5 b a c i l l u s 村口坳s u s p e n s i o n , i n i t i a lp h 7 0 s h a k i n gb y1 8 0 r m i na t3 0 cf o r6 0 h i nt h ec o n d i t i o n o f4 c ，i fi t w a s 受e p l2 4 h ；a n da t 国，瓣，i 口c ，1 2 1 c ，i fi tw a sk e p t2 0 r a i n ， a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sh a dg o o dh e a t e ds t a b i l i t y + f r o m4t o1 2o fp h i th a dg o o ds t a b i l i t y o fa c i da n da l k a l i ，a n da n t i m i c r o b i a lf u n c t i o n sw e r es t i l ls t e a d y w h e nc a l c i u mi o n ，a l u m i n u m i o n ，m a g n e s i u mi o na n di r o ni o nw e r ea p p e n d e di n t oc u l t u r em e d i u m ，a n d m i c r o b i a lf u n c t i o n s w o u l db ee n h a n c e d ，w h e r e a sc a p m mi o n ，m a n g a n e s ei o na n dz i n ci o nw o u l di n h i b i t p r o d u c t i o no fa n t i m i c r o b i a is u b s t a n c e s ，b e s i d e s , t h ea n t i m i c r o b i a le f f e c tw a sp r o v e dt ob e h e r e d i t a r i l ys t a b l e c o m p a r e dw i t ha n t i b i o t i ca n dp r e s e r v a t i v eo nt h ee f f e c t so fa n t i m i c r o b i a l f u n c t i o n , a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw e r eb e t t e rt h a na n t i b i o t i c ( g a r a m y c i n ) a n dp r e s e r v a t i v e + o nt h el e s sc o n c e n t r a t i o no ft h es u p e m a t a n t so fb a c i l l u sn a t t of e r m e n t a t i o nl i q u i d ，w h i c hh a d b e t t e ra n t i m i c r o b i a l f u n c t i o n s n a m e l y ，t h e m i n i m u mi n h i b i t i o nv o l u m e a i m i n g a t a b s t r a c t s t a p h y l o c o c c u s a u r e u sw a s2 7 , w h e r e a st h em i n i m u mi n h i b i t i o nv o l u m e a i m i n g a t e s c h e r i c h i ac d 抒w a s2 6 t h es u p e m a t a n t so fb a c i l l u sn a t t of e r m e n t a t i o nl i q u i db yo 4 5 t mf i l mw e r e f i l t r a t e d ，t h e n a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw e r ei s o l a t e db ys e p h a d e x g - 2 5 a n t i - m i c r o o g a n i s mt e s t sw e r e d o n eb yt h ei s o l a t e ds a m p l el i q u i d t h em o l e c u l a rw e i g h to fa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e sw a s e d u c e db ys t a n d a r dc u r v e ，n a m e l yr a n g i n gb e t w e e n2 6 0a n d9 8 0 d a k e y w o r d s ：b a c i l l u sn a t t gli q u i df e r m e n t a t i o n ，a n t i m i c r o b i a is u b s t a n c e s ，t h e c h e m j c a ia n dp h y s i c a ic h a r a c t e r s is o l a t i o n i i l 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 麴嚣擅主摭菌翅魇擅菱象姓笪甄巍 本学谴论文作者完全了解大连轻工渡学院有关保留、锼溺学位论文的 烧定，大连轻工盐学浆畜投保磐并趣国家有关部f j 或规构送交论文熬复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据霹进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人毡子：筵档的肉骞帮纸凄论文魏海客耱致。 保密的学蕴沧文在鼹密爱龟遵守瑟麓定。 魑甭保密( 2 南) ，保密期至 年月匿为止。 学生签名：一细守导师签名：必盘 。年甲冀，岁基 第一章绪论 1 1 防腐剂简介 第一章绪论 在食品工业中，防腐剂是重要的添加剂之一，目前经常使用的有苯甲酸( 钠) 、山梨 酸( 钾) 等化学防腐剂。由于这些化学合成的防腐剂的使用有一定的限量，因此，越来越 多的科技工作者将注意力转向具有抑菌、健康等特点的天然或近似天然的食品防腐剂。 目前，天然食品防腐剂存在价格偏高、抑菌防腐效果较差等缺点而使其应用受到限 制，但从当前的发展趋势来看，天然食品防腐剂在将来会愈来愈受到食品界的重视。我 国现在已批准使用的天然防腐剂品种较少，应加强对这方面的开发应用【u 目前市场上销售及报道的天然防腐剂大致有以下几类：植物类防腐剂、微生物类防 腐剂、动物类防腐剂。其中植物类防腐剂包括果胶分解物、茶多酚、琼脂低聚糖、植物 提取物、香精油、大蒜素等；微生物类防腐剂包括溶菌酶、聚赖氨酸、乳酸菌细胞及其 代谢物、乳酸链球菌素、酵母的代谢产物、纳他霉素、曲酸等；动物类防腐剂包括鱼精 蛋白、壳聚糖、蜂胶等1 2 】。 1 2 天然防腐剂中微生物类防腐剂的介绍 食品工业中使用的防腐剂大多是化学防腐剂，对人体有一定的毒副作用，开发微生 物天然防腐剂是目前食品防腐研究的热点p 叫，新型微生物防腐剂也是今后防腐剂市场 的主要方向。其中，从传统发酵食品的微生物的代谢产物中寻找天然生物防腐剂更是一 个安全有效的方法。 天然防腐剂对人体健康无害，而且有些还具有一定的营养价值，有些天然防腐剂已 达到或超过人工合成防腐剂的效果，而价格也大大降低，新型天然防腐剂更是如雨后春 笋般出现，开发并利用天然防腐剂成为当今食品工业的一个热点。目前溶菌酶、聚赖氨 酸、乳酸菌细胞及其代谢物、乳酸链球菌素、酵母的代谢产物、纳他霉素、曲酸等天然 防腐剂现已被广泛应用在食品的防腐保鲜中。 纳豆菌产生的抗菌物质如能被开发利用，则属于新兴崛起的一类天然生物防腐剂。 第一章绪论 日本对纳豆菌的抗菌作用的研究较早，但相关报道甚少p 明由于纳豆菌产生的代谢物 不仅抗菌，而且纳豆菌具有很多对人体有益的作用，对其的开发利用具有一定潜在的价 值。 1 3 纳豆简介 纳豆是日本的一种传统大豆发酵食品，由纳豆菌( b a c i l l u s 加砌在一定温度、湿度 下发酵蒸煮大豆制各而成，距今已有两千多年历史，在民间一直作为药食兼用。成熟纳 豆色泽金黄，表面覆有一层粘性物质，挑起时有长长的拉丝状物质，它风味独特，营养 丰富，具有多种保健功能，深受日本人民的喜爱【9 翊纳豆与我国的传统食品豆豉相似， 但纳豆是由纯菌种发酵而成，时间较短，便于控制，其保健功能也远远高于豆豉。现在， 纳豆已逐渐成为各国喜爱的方便食品、健康食品我国是产豆大国，而纳豆是成本低廉、 营养丰富的功能性食品，我们应进一步利用丰富的大豆资源，发展纳豆生产，使纳豆成 为我国餐桌上的主要菜肴之一，以改善和提高膳食结构，促进国民健康 d i 。但是，纳豆 有一股特殊的氨臭味，还不能被我国大多数人接受，因而须对纳豆进行一定的改进，使 之成为国内比较受欢迎的一种绿色食品。 1 3 1 纳豆的制备工艺流程 纳豆生产较简单，它利用枯草杆菌( b e e i l u ss u b t i l s 或b a c i l l u sn a t t o ) 发酵大豆而成。 其工艺为：大豆一脱皮一浸泡一蒸煮一接种一发酵一后熟一纳豆【1 4 】 1 3 2 纳豆的营养价值 纳豆具有很高的营养价值，其蛋白质、纤维、钙、铁、维生素b 2 、维生素p p 维 生素e 的含量均高于煮熟的大豆嗍在l o o g 食品可食部分的营养中，纳豆比蒸煮大豆 的蛋白质高o 5 9 纤维高o 2 9 、钙高2 0 r a g 、铁高1 3 r a g ，钠高l i n g 、钾高9 0 m g 、维生 索b 2 高o , 4 7 m g 垌 1 3 3 纳豆的保健功能 1 3 3 1 溶解血栓 2 第一章绪论 1 9 8 7 年，日本富崎医科大学的须见洋行教授从2 0 0 多种食品中发现了只有纳豆可以 溶解血栓的事实，并且证实纳豆含有一种具有纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶 ( n a t t o k i n a s e ，n 目。它由2 7 5 个氨基酸残基组成，无毒、无副作用，是一种碱性丝氨酸 蛋白酶，存在于纳豆粘性成分中。通过人体实验发现纳豆激酶能使纤维蛋白溶酶原、尿 激酶原激活成纤维蛋白溶酶和尿激酶而促进溶血栓效果，同时发现纳豆激酶可激活血浆 中组织溶纤酶原激活剂( t p a ) 的产生，从而间接表现出其溶栓活性。其活性为每克湿纳 豆含有相当于现在临床使用的尿激酶1 6 0 0 i u 。若临床上治疗血栓病一次使用 2 0 0 0 0 0 i u 1 1 ，与食用1 盒湿纳豆具有同等功效。纳豆激酶在自然状态下较稳定、且在胃 肠环境中不会失活。实验发现它不仅作用迅速，而且疗效时间长研究证实，一包纳豆 ( ：0 0 9 ) 所具有的酶活性与相同酶活性的尿激酶相比，其成本只是尿激酶的1 1 5 0 0 0 ，相当 低廉。此外，尿激酶注射后，其纤溶活性只持续4 2 0 m i n ，而纳豆激酶活性持续达4 1 2 h i s 2 2 1 。 日本人食用纳豆已有二千多年的历史，由此可说明纳豆激酶是一种安全的食用血栓 预防刹2 3 , 2 4 1 。纳豆激酶具有溶栓效果好，分子量小，无抗原性，无毒副作用，长期服用 安全可靠，在体内半衰期长，价格低廉等优点，因此纳豆激酶极有可能成为新的溶栓药 物瞵2 7 l 。 1 3 3 2 抗菌消毒作用 研究表明纳豆菌对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、 伤寒菌、痢疾菌及大肠杆菌等致病菌作用，纳豆菌还可灭活葡萄球菌肠毒素，纳豆菌可 产生许多抗菌素，如杆菌肽、多粘菌素、2 ，6 吡啶二羧酸等1 1 5 1 ，因此纳豆菌产生的抗 菌物质包括多种成分，这就决定了纳豆菌的广谱抗菌作用。在抗生素使用前纳豆在民间 已被长期用于治疗痢疾、伤寒等的消化道疾病，因此常食纳豆可起到壮体防病功效。纳 豆菌可以杀死多种致病菌，起到抗生素的作用田1 除了抗菌，纳豆菌还能消化金黄色葡萄球菌肠毒素。被金黄色葡萄球菌肠毒素a 污 染的食物加入纳豆后3 7 c 下孵育1 h ，通过反向被动乳胶凝集试验( r p l a ) 发现，食物中 的抗金黄色葡萄球菌肠毒素a 的r p l a 效价明显降低，这是由于金黄色葡萄球菌肠毒素 a 蛋白分子被由纳豆菌产生的细胞外蛋白酶枯草杆菌蛋白酶分解断裂成小肽，而且 纳豆菌的蛋白分解活性对其他类型的金黄色葡萄球菌肠毒素也有效i 矧 1 3 3 3 防治骨质疏松症 3 第一章绪论 纳豆菌是目前世界上惟一发现的能产生维生素k 2 的细菌，其发酵大豆可产生相当 多的维生素k 2 ，1 0 0 9 纳豆中约含1 0 0 0 弘g 的维生素k 2 。维生素k 2 可生成骨蛋白质 o s t c o c a l c i n ，这种蛋白质可与钙共同生成骨质，增加骨的密度。 每天食用1 0 9 的纳豆就可提供机体足够的维生素k 2 。须见等实验证实，进食1 0 0 9 纳豆4 h 后血液中的维生素k 2 的浓度最高可达原来的5 4 倍。1 9 9 5 年，东京大学医学部 曾对6 0 0 0 名6 0 岁以上的骨质疏松患者进行了调查研究，结果表明，服用维生素k 2 不 仅可以减缓腰痛，而且骨骼的重量也增加了；易患骨折的人，其血液中的维生素k 2 的 浓度仅是健康人的1 2 左右。因此，常吃纳豆可预防和治疗骨质疏松症。 除维生素k 2 之外，异黄酮和多聚谷氨酸对于人体的钙的吸收，成骨蛋白的y 专圣基 化，抑制破骨细胞从骨骼中钙的再吸收都有一定的作用，而这些作用均有利于预防和治 疗骨质疏松症0 0 3 3 1 。 1 3 3 4 抗癌作用 1 9 6 7 年日本金泽大学药学院的龟田教授发表了有名的纳豆抗癌动物试验，结果表明 纳豆菌对动物的生长无害，却抑制了癌细胞的生长龟田教授将有这种抗癌效果的纳豆 菌命名为k m d l l 2 6 m3 5 1 。 还有报道说纳豆中含有染料木素和染料木甙嗍，类似枯草溶血素的脂肽，还含有丰 富的植物雌激素和一种叫i n f r a b i n 的类黄酮色素形成成分，这些物质有强烈的裂解功能， 抑制肿瘤细胞的增殖。据报道，1 3 本每人每天摄入的染料木素和染料木甙为1 5 4 1 m g 和6 3 8 3 m g ，其中染料木素是抗癌的主要活性成分。而欧美国家每人每天摄入的黄酮 总量仅为几毫克，调查表明，日本人乳腺癌、肠癌的发病率远远低于欧美国家，因此认 为常食用含染料木素高的纳豆，可有效降低癌症的发病率【明。体外细胞培养的实验，进 一步揭示了纳豆中含有的抗癌活性物质是个直链饱和烃，含3 0 3 2 个碳的烃，其中 三十一碳烃在纳豆中含量最多，活性也最高陬3 8 】有人在纳豆菌的培养液中发现了大量 的有细胞裂解性能的物质，经分析，其中一种能被碳吸收，分子量小，类似枯草溶血素 的脂肽闭。纳豆中的植物雌激素和类黄酮色素形成成分可以预防和治疗前列腺癌。纳豆 菌可以有效破坏或杀死癌细胞，还可以刺激免疫系统诱发干扰产生达到抗癌的目的。 1 3 3 5 降血压作用 日本的林右市等人观察比较了患有遗传性高血压的小白鼠在服用纳豆和蒸煮大豆 后血压的变化情况。结果小白鼠在食用蒸煮大豆后，血压在4 个月内波动最高值为 4 第一章绪论 0 0 3 3 m p a ；而食用含2 8 的纳豆饵料后，即出现血压降低现象，在4 个月内波动最高 值为o 0 2 t m p a 3 9 , 4 0 l 。o k a m o t o t 等1 4 1 棚】通过溶解和透析检测，发现在纳豆中发挥降血压 作用的物质是血管紧张素转换酶抑制剂( a n g i o t e n s i nic o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e - 1 ) ，通过 抑制血管紧张素的合成而起作用。这种抑制剂分水溶性和脂溶性两种，其中水溶性抑制 剂为高分子量的蛋白质，i c 5 0 为0 1 2 m g m l 脂溶性抑制剂为低分子量物质，具有两种 形态，抑制作用强于水溶性抑制剂，i c s o 分别为0 5 3m 咖l 和0 9 5m g m l ，其p h 和温 度很稳定。这两种形态的脂溶性抑制剂的抑制模型是不同的，一种是竞争性抑制，一种 为非竞争性抑制。 1 3 3 6 助消化、维持胃肠道健康 纳豆菌是对人体无病原性的安全菌株，经食用后在肠道中生长，能在肠道中生存几 周，分泌各种酶和维生素，促进小肠黏膜细胞的增殖。1 9 纳豆中含有1 0 0 万至1 0 亿个活 纳豆菌，因此，常吃纳豆可调节人体消化道内微生态平衡，保持肠道的正常功能，可预 防痢疾、肠炎和便秘等。此外，纳豆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和脲 酶等多种酶类，利用它发酵大豆不仅可保持大豆几乎不含胆固醇，必需氨基酸含量高， 营养平衡等的优点，而且使大豆蛋白的消化率从原来的5 0 增加到9 0 以上大豆蛋白 质将有5 0 0 * 6 0 转化为肽和氨基酸，其中1 0 是氨基酸，特别是谷氨酸较多，同时还 会产生独特的风味物质，如丁酸，丙酸和丁二酸等。此外，纳豆的粘性物质覆盖在胃肠 黏膜表面上，可保护胃肠，饮酒时可缓解酒醉m 矧。 1 3 3 7 抗氧化作用 纳豆中含有的抗氧化物质，如卵磷脂、异黄酮( i s o f l a v o n e s ) 、a 生育酚( 即v e ) 超 氧化物歧化酶( s o d ) 。其中卵磷脂经常食用可有效降低血脂、胆固醇及清除脑组织细胞 中过氧化脂质色素，调节皮肤细胞和皮肤表面水和脂肪的平衡。另外，纳豆对由过氧化 物细m e - h y d i o p c m l 【i d c ) 所引起的细胞伤害也有疗效。并且无论是对不饱和脂肪酸如亚 油酸、亚麻酸，还是对受伤细胞，纳豆的抗氧化作用都等同于甚至好过a 生育酚的效 果纳豆还含有大量的皂甙素，皂甙素是一种遇水溶解、遇热分解的物质，在豆腐、 豆浆中含量很少皂甙素不仅能改善便秘，还可减少血脂、预防大肠癌、降低胆固醇、 软化血管、预防高血压和动脉硬化、抑制艾滋病毒等【1 7 1 纳豆和未经发酵的大豆( s s b ) 对比试验可以看出，纳豆显示了比s s b 高得多的抗氧 化性，它可抑制脂肪氧化达9 l ，而后者只能抑制1 3 最新报道，纳豆中水溶性低分 5 第一章 绪论 子量粘性物质可能防止动脉硬化，降低脂类过氧化反应，加强脂类代谢m4 5 1 。 1 3 3 8 其它功能 纳豆菌产生的毗啶二羧酸具有很强的结合金属的能力，能够清除体内的放射性元 素，常吃纳豆可减少患白血病的几率。此外，常吃纳豆对糖尿病、肥胖，更年期综合症 和感冒等均可起到预防和缓解及治疗的作用，并可消除疲劳、增强机体活力，使肌肤光 泽嗍。日本是世界上最长寿的国家之一，原因之一就是日本人有吃大豆发酵产品的传统。 1 4 纳豆菌 纳豆菌是在2 0 世纪初期由日本学者发现并分离出来的m ，属细菌科，芽孢杆菌属， 其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种【档l 。纳豆菌能分解蛋白质、 碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品中富舍氨基酸、有机酸，寡聚糖等多种易 被人体吸收的成分，还能分泌各种酶和维生素，从而可促进小肠黏膜细胞的增殖，保证 肠功能的正常 4 9 - - 5 1 1 目前，国内针对纳豆菌的研究，主要集中在其代谢产物纳豆激酶 s l ， 对纳豆菌抗菌作用的研究很少 据报道纳豆中起抗菌作用的是纳豆菌及其代谢产物【5 2 l ，因此可以利用纳豆菌及其代 谢物的抗菌作用把其利用在食品的防腐保鲜方面。 1 4 1 纳豆菌生物学特性 纳豆菌菌落呈乳白或淡黄色，表面粗糙有皱折，边缘不整齐，无光泽，不透明，显 微镜下观察单细胞里杆状，两端钝圆，有明显的芽孢，芽孢中生，圆形或椭圆形，不明 显膨胀，革兰氏染色呈阳性，在发酵多种碳源、氮源等方面也都与己知枯草芽孢杆菌相 似盼s 4 1 ，电子显微镜测定为：0 5 - 0 6 x1 1 - 3 靴m 。其生长温度最高为4 5 5 5 c ，最低 温度5 2 0 c 5 5 1 1 4 2 纳豆菌的生长特性 纳豆菌很好地在蒸熟大豆上生长，其它豆类、谷物等植物食品也同样很好地生长， 肉类、鱼介类、乳制品等动物性食品上同样生长。但是仍以植物性蛋白上生长最好，产 生的粘丝也较多 6 第一章绪论 纳豆菌可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类为碳源，蔗糖是生成粘质物的必要成分 大豆约含2 0 碳水化合物，其中约有3 0 为蔗糖，可以充分供给纳豆菌的需要。 至于氮源，可用蛋白质及氨基酸，氨基酸中纳豆菌最能利用谷氨酸、组氨酸、脯氨 酸，而对苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸及色氨酸则较为困难，而大豆中的主要氨基酸均能 为纳豆菌所利用【矧。 1 4 3 纳豆菌抗菌作用的国内外研究现状 1 4 3 国外研究现状 纳豆的抗菌作用早就被人们了解，第2 次世界大战期间人们用纳豆来预防和治疗霍 乱、伤寒和痢疾o z a w ak 等人研究证实了纳豆菌对白假丝酵母具有抑制作用嗡7 ，5 2 l 。 最近，r oo s a w a 等研究发现，纳豆菌产生的枯草杆菌蛋白酶可降解金黄色葡萄球菌肠 毒素a ( s f a ) 。而且，该酶对其他的金黄色葡萄球菌肠毒素亦有作用晦7 钩。纳豆控制了 1 9 9 6 年在日本发生的0 1 5 7 大肠杆菌中毒事件，是因为纳豆菌分泌的一些代谢产物能 对一些重要肠道致病菌起杀灭或抑制作用研究表明纳豆菌对细菌、酵母菌和霉菌均具 有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及o - 1 5 7 、h 7 大肠杆菌等致病 菌作用。在抗生素使用前纳豆在民间已被长期用于治疗痢疾、伤寒等的消化道疾病，因 此常食纳豆可起到壮体防病功效p 7 。纳豆菌可以杀死多种致病菌，起到抗生素的作用 阴。须见洋行教授对纳豆的抗菌功能作了研究：将纳豆加进0 1 5 7 大肠杆菌4 天后，大 肠杆菌全部被抑制而死亡小泽恭辅0 9 8 3 ) 研究认为，纳豆菌的芽孢对病原性大肠杆菌 ( 如o - 1 1 1 ，o - 1 4 4 ) 及沙门氏菌具有抗菌作用，还能杀死肠道出血性大肠杆菌o 1 5 7 1 7 , 1 5 , 矧藤田昭二等采用纳豆菌防治仔猪腹泻取得了良好效果【5 2 】 1 4 3 2 国内研究现状 国内对纳豆菌的抗菌作用的研究的报道较少，钟青萍等人研究了纳豆菌对常见的污 染食品微生物的拮抗作用，结果表明纳豆菌具有广谱抗菌作用，对各种细菌包括革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用【5 踟。黄占旺等人研究了纳豆菌的生 物学特性例。贾力敏等人初步研究了纳豆菌对致病菌生长的抑制作用例。目前只报道过 对纳豆菌产抗菌物质的培养条件进行了优化【6 ，对产生的抗菌活性物质还没有人将其分 离纯化出来，需要进一步探讨、研究。 7 第一章绪论 1 4 4 纳豆菌产生的抗菌物质的种类 据报道纳豆菌可产生许多抗菌素，如杆菌肽，多粘菌素和2 ，6 - n l 啶二羧酸，这些 物质对痢疾杆菌、原发性大肠杆菌o 1 5 7 、o 1 1 1 、o 1 4 4 、伤寒菌、沙门氏菌等，都有 强烈的抑制作用旧，因此纳豆菌具有强烈的抗菌活性。有人通过混合培养试验，可确认 纳豆菌和纳豆成分对于病原性大肠杆菌o 1 5 7 具有很强的抑制生长繁殖之效果，并认为 2 ，6 毗啶羧酸是具有耐热性的物质【6 2 1 。在过去的几十年内，已经发现7 0 0 多种肽类抗 生素【6 3 s s l 。这些肽类物质被分为两类，一类是非核糖体合成的肽类抗生素，另一类是由 核糖体合成的天然肽类抗生素。杆菌肽和多粘菌素属于非核糖体合成的肽类抗生素。非 核糖体合成的肽类抗生素是由细菌、真菌和链霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽类物质 1 6 6 j 。杆菌肽和多粘菌素就是纳豆菌分泌的代谢产物，其具有抗菌活性 1 4 5 纳豆菌产生的抗菌物质的生理活性及抗菌机理 1 4 5 1 抗菌物质的生理活性 多粘菌素、杆菌肽和2 ，6 吡啶羧酸，它们有各自的抗菌活性和抗菌机理。 多粘菌素包括多粘菌素b ( p o l y m y x i nb ) 及多粘菌素e ( p o l y m y x i ne ) ，它们是多肽类 抗生素，二者具有相似的药理作用。对多数革兰氏阴性杆菌有杀灭作用。多粘菌素e 的 抗菌谱与多粘菌素b 相仿，但抗菌活性较多粘菌素b 稍差。多粘菌素的主要敏感菌有 大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等，尤其对绿 脓杆菌具有强大的杀菌作用嗣 杆菌肽主要作用于革兰氏阳性菌。杆菌肽对耐药的金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球 菌有效，对螺旋体和放线菌也有效，但对革兰氏阴性菌无效【醴1 。 纳豆菌的芽孢中存在着2 ，6 - 吡啶羧酸，有一定的抗菌作用，且对热具有较强的抗 性。 1 4 5 2 抗菌机理 多肽类抗生素具有表面活性，含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌细胞膜 的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，使细菌细胞膜面积扩大，通透性增加，细胞内的磷酸 盐、核苷酸等成份外漏，导致细菌死亡 多粘菌素是通过破坏细菌胞膜，改变细菌细胞膜的通透性而起到杀菌作用的嘲 8 第一章绪论 杆菌肽是通过抑制革兰氏阳性菌胞浆内的肽聚糖前体转变为焦磷酸萜醇，从而起到 抑菌作用的【6 7 l 。 2 ，6 - 吡啶羧酸对各类细菌广泛具有作用这一特征得到了说明，但其抗菌作用机理 还未完全弄清【6 2 l 。目前国内外还没有报道。 纳豆菌产生了多种抗菌物质，多粘菌素抑制革兰氏阴性菌的生长，杆菌肽抑制革兰 氏阳性菌的生长，正是因为存在着这些抗菌物质，所以它的抗菌谱较广，对多种菌均有 抑制作用。 1 4 6 纳豆菌抗菌物质在研究开发过程中存在的问题 国内只有钟青萍【6 1 l 等人研究了纳豆菌具有广谱抗菌作用，即对于纳豆菌产生的抗菌 物质的作用机理、抗菌谱和可应用的范围等的研究还不是很明了，导致无法分离出纯品 进行毒理学评价。应该首先提高纳豆菌产生的抗菌物质的抗菌活性，即优化它的发酵条 件，从而进一步分离提纯纳豆菌产生的抗菌物质，但对于它的分离提纯有一定的难度。 纳豆菌发酵液中存在着一种纳豆菌的一股特殊的味道，不易被大家所接受，所以应 该想办法去除这种异味而又不影响它的抗菌活性。 因此为了解决存在的问题，促进天然食品防腐剂的发展，需要大家的通力合作只 有这样，才能使安全、高效的天然食品防腐剂得到正确、合理的使用。纳豆菌是有益的 菌，就更应该充分发挥它的优点，来为人类更好的服务 1 4 7 纳豆菌开发前景与展望 由于纳豆菌具有芽孢，因而能耐酸耐碱，耐高温及耐挤压，在加工过程中及在酸性 胃环境中均能保持高度的稳定性嗍，因此纳豆菌是微生态制剂的理想生产菌株。耐高温 可能是因为杆菌肽和多粘菌素属于抗菌肽，抗菌肽一般都有很高的热稳定性，抗菌肽还 具有广谱杀菌作用，而且2 ，6 - 吡啶羧酸也是具有耐热性的物质利用纳豆菌生产微生 态制剂，国内已有单位着手研究，但尚未见相关报道，而国外也仅在日本有相关的研究 报道例 钟青萍等人研究表明纳豆菌抗菌蛋白具有较好的热稳定性和酸碱稳定性，这种抗菌 物质具有较高的耐盐能力，e d t a 可促进抗菌蛋白的抗菌作用【7 l 】，她们还研究了纳豆菌 的抗菌作用具有良好的遗传稳定性，纳豆菌抗菌蛋白抗菌谱广，抗菌作用较强，且其特 性适合于食品中的应用m 1 9 第一章绪论 纳豆菌产生的抗菌物质是经过微生物发酵而产生的，属于纯生物制剂，对人、畜均 无毒害作用。 随着各国对纳豆菌研究的不断深入，研究表明纳豆菌有较强的抗菌作用，它产生的 代谢产物2 ，6 吡啶二羧酸、杆菌肽，多粘菌素具有较强的抗菌作用，对常见的致病菌 具有很强的抑菌效果。因此可以通过生物纯化技术把这些抗菌物质分离出来，用来制取 天然生物防腐剂，把它用在食品添加剂方面，其作用可相当于防腐剂，且其无毒无副作 用，以此来满足消费者对天然食品防腐剂的要求。由此可见，其市场前景方兴未艾。进 一步大力开发安全、高效、经济的天然食品防腐剂不仅是国外发展的主流，也是我国今 后发展的主要方向。 目前对纳豆菌的抗菌物质的研究比较少，因此具有很大的潜在开发的价值。 1 5 本课题研究背景 食品工业中使用的防腐剂大多是化学防腐剂，对人体有一定的毒副作用，开发微生 物天然防腐剂是目前食品防腐研究的热点，从传统发酵食品的微生物的代谢产物中寻找 天然生物防腐剂更是一个安全有效的方法。 纳豆菌产生的抗菌物质如果能被开发利用，则属于新兴崛起的一类天然生物防腐 剂。纳豆菌产生的代谢物不仅抗菌，而且纳豆菌具有很多对人体有益的作用，对其的 开发利用具有一定潜在的价值。 1 6 本课题的研究内容 本文就纳豆菌的抗菌方面进行较为细致的研究。利用不同纳豆菌抗菌粗提液对于不 同菌做抑菌实验，选出进行优化实验的最佳指示菌；不同纳豆菌抗菌粗提液对最佳指示 菌做抑菌实验，筛选出纳豆茵产抗菌物质较多的菌种；对最佳指示菌进行纳豆菌液体发 酵产生抗菌物质的培养条件的优化，做纳豆菌抗菌粗提液与抗生素和防腐剂的抑菌对照 实验；并对纳豆菌抗菌粗提液的部分理化性质及最小抑菌稀释倍数进行研究，分离纯化 抗茵物质并确定抗菌物质的分子量范围。 1 0 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 实验材料、药品及仪器 2 1 1 实验材料 纳豆菌( b a c i l l u ss t u b t i l i s 加坳) 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r a ) 痢疾志贺氏菌( s h i g e l l ad y s e n t e r i a e ) 鲁氏接合酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i 0 异常汉逊酵母( h l aa n o m a l a ) 啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ae o l o 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l l i s ) 八叠球菌( s a r c i n al u t e a ) 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 根霉( = 鼬i z o p u s 印) 2 1 2 实验药品 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 可溶性淀粉 甘油 玉米淀粉 硫酸铵 分析纯 生化试剂 分析纯 三级 分析纯 高级 分析纯 i i 实验室保藏 中国科学院微生物研究所 中国科学院微生物研究所 中国科学院微生物研究所 中国科学院微生物研究所 实验室保藏 实验室保藏 实验室保藏 实验室保藏 实验室保藏 实验室保藏 实验室保藏 东北制药总厂一分厂 中国科学院上海生物化学研究所 北京化工厂 北京红星化工厂 国营长春市化学试剂厂 京华友食品有限公司 沈阳市试剂一厂 第二章材料与方法 谷氨酸 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 尿素 氯化钠 蛋白胨 酵母膏 大豆分离蛋白 牛肉膏 氢氧化钠 酒精 山梨酸钾 苯甲酸钠 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 交联葡聚糖s e p h a d e x g - 2 5 蓝葡聚糖2 0 0 0 l 酪氨酸 中性胰岛素 细胞色素c 杆菌肽 2 1 3 实验仪器 恒温振荡器 电热鼓风干燥箱 电热恒温培养箱 电子调温万用电炉 电子分析天平 电冰箱 架盘药物天平 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生物试剂 生化试剂 食用级 生物试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 h z o r 6 0 3 3 型 h h - b l l 型 g b 3 0 3 型 b d 1 3 2 型 j y t - 5 型 北京化工厂 天津市广成化学试剂有限公司 天津市天河化学试剂厂 北京红星化工厂 沈阳试剂厂 武汉市第二生物化学制药厂 北京奥博星生物技术责任有限公司 内蒙古豆都油脂集团有限公司 北京市海淀区微生物培养基制品厂 大连市华中试剂厂 长春市化工试剂厂 广西南宁食品添加剂厂 湖北大学化工厂 天津市天河化学试剂厂 大连市华中试剂厂 上海化学试剂采购供应站分装厂 p h a m z c i a 公司 上海试剂厂 重庆华邦制药厂 黑龙江生化试剂厂 s i g m a 公司 东联电子技术发展有限公司 大连第四仪表厂 上海市跃进医疗器械一厂 龙口市先科仪器公司 m e t t l e r - t o l e d oi n s t r ( s h a n g h a i j d 青岛海尔集团 上海医用激光仪器厂 第二章材料与方法 不锈钢手提式蒸气灭菌锅y x q s g 4 6 - 2 8 0 s 型上海市医疗仪器厂 高速微量离心机l g l 6 - w北京医用离心机厂 恒温水浴锅i - h - i 6 型江苏金坛市中大仪器厂 水浴恒温振荡器t h z - 8 2金坛市华峰仪器有限公司 精密p h 计p h s 3 c 上海雷磁仪器厂 微波炉w d 7 0 0上海雷磁仪器厂 镀铬游