（食品科学专业论文）酶解玉米蛋白提取ACE抑制肽的研究.pdf

中文摘要 摘要 血管紧张素转化酶( a c e ) 是存在于人体血管内皮细胞内的一种酶，它在血压调节 方面起着重要的作用，当其受到抑制时血压就会降低。目前已有许多合成的a c e 抑制剂 药物，但是这类药物药效持续时间不长，停药后会有反弹，使血压升高：并且，这类 药物对肾功能有一定损害。因此，寻找食物来源的安全、有效、无毒副作用的新型降 压药具有重要意义。玉米蛋白是玉米淀粉生产中提取淀粉后的主要副产物，大约含有 6 0 的蛋白质，主要为玉米醇溶蛋白。玉米蛋白质中含有高比例的疏水性氨基酸和脯 氨酸、谷氨酸等，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组成使玉米蛋白 水溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白质成为多种生理活 性肽，尤其是a c e 抑制肽的来源。本实验选择产量丰富，价格便宜的玉米蛋白粉为原 料，进行了提取a c e 抑制肽的研究。 在原料的预处理中，分别进行了脱色、脱除淀粉、增溶研究。在脱色处理中，研 究了五种有机溶剂对玉米蛋白的脱色效果，选择了9 5 乙醇作为提取溶剂，在脱除淀 粉的研究中，通过口一淀粉酶、糖化酶对玉米蛋白粉中的淀粉进行水解，抽滤分离， 使蛋白含量由原来的6 1 5 4 上升到了8 5 7 2 ，通过研究还原剂、p h 、温度对玉米蛋 白溶解性的影响，确定了在p h l 0 1 2 条件下加入0 1 0 n a 2 s 0 3 作为还原剂，9 0 预热 1 5 m i n 的增溶方法，使溶解度由原来的4 2 提高到3 0 9 6 。 以经过预处理的玉米蛋白粉为原料，选用7 种蛋白酶分别进行单一酶和复合酶水 解生产玉米蛋白a c e 抑制肽，用c u s h m a i l 紫外分光光度法测定水解液的a c e 抑制活 性。结果表明碱性蛋白酶水解液具有最大的a c e 抑制率，水解条件优化实验确定最佳 水解条件为：底物浓度2 5 ，加酶量4 8 a u l ( g ，p h 8 o ，温度5 5 6 0 。通过研究水 解液的a c e 抑制活性与玉米蛋白水解度的关系得出，在水解度1 5 9 6 时所得水解液对 a c e 抑制作用最强，i c 5 0 为o 2 4 7 m m l 。 采用截留相对分子质量为5 0 0 0 的膜将粗水解液经过超滤分离，收集流出液，水解 物的i c 。降低了1 7 6 ，达到了初步纯化的目的。将初步纯化的组分进一步通过b i o r a d p 一2 凝胶分离，得到了i c 5 0 为o 0 8 5 m g m l 的组分，其i c 5 0 是原水解液的i c 5 0 的3 4 4 ， 抑制活性显著提高。将此组分经r p - h p l c 分离，得到洗脱时间1 0 0 2 0 m i n 的组分a c e 抑制率最高。通过液质联用，氨基酸分析，证明该组分是单一组分，其氨基酸序列是 a l a t y r ，i c 5 0 为2 2 6 9 m o l l 。保温实验前后，a l a t y r 的i c 5 0 变化很小，认为a l a t y r 是a c e 抑带j i 剂。 关键词：血管紧张素转化酶a c e 抑制肽玉米蛋白粉碱性蛋白酶水解 v 英文摘要 a b s t r a c t a c e ( a n 2 i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e ) ，i sa ne n z y m ew h i c he x i s ti nt h ee n d o d e r m i s c e l lo fh u m a nb l o o dv e s s e l i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o i ei nt h ea d i u s t i n e n to fb j o o dp r e s s u r e w h e ni ti si n h i b i t e d ，t h eb l o o dp r e s s l l r ew i i ld r o p t o d a val o to fs y n t h e t i c a la c ei n h i b i t o r h a v eb e e nm a d e ，b u tt h e i ri n h j b i t o re f f 爸c to na c ea r er e v e r s j b i e s o 。t h ee f f b c tc a nn o tl a s t f o rl o n gt i m ea n dd m 2w i t h d r a w lc a nc a u s et h er e b o u n c eo fb 】o o dp r e s s u r e w h a t sm o r e ， t h es v n t h e t i c a lm e d i c i n ec a nd oh a 肌f o rr e n a lf u n c t i o n s o ，i ti sm e a n i n 2 f u lt of j n dan e w k i n do fm e d i c i n ef r o mf o o dr e s o u r c e sw h i c hi ss a f e e 色c t u a la n di n n o x i o u s c g mf c o m g l u t e nm e a l ) i st h em a i no u t g r o w t hj nt h ep r o d u c i n go fc o ms t a r c h i tc o n t a i n sa b o u t6 0 p r o t e i n ，m a i n l yo fz e i n t h e r ea r eh i g hp r o p o r t i o no fh y d r o p h o b ea m i n oa c i da n dp m ，g l u ， b u t1 0 wp r o p o r t i o no fa l k a l e s c e n c ea m i n oa c i ds u c ha sl y si nc o m s u c hi d i o g r a p h i c a m i n oa c i dm a l ( e u po fc g mm a d ei ti o wn u t r i t i o nv a l u ea n dl o ws o j u b i l i t y ，b u tg o o d r e s o u r c e sf o rm a i 】yk i n d so fb i o a c t i v ep e p t i d e s ，e s p e c i a l l yf o ra c ei n k b i t o r ) ，p 印t i d e s i n t h i sp a p e r ，c g mw a su s e da ss u b s t r a t et op m d u c ea c ei f l h i b i t o r yp e p t i d e s p r e t r e a t m e mo fs u b a t r a t ei sn e c e s s a r ya st h e r ea r es t i l lm a n yi n l p u r i t yi nt h ea 3 m f i v e o r 2 a n i cs o l v e n tw a st e s t e di nt h ed e c o l o re x p e r i m e n t ，a n d9 5 e t l a n o lw a ss e l e c ta sb e s t s o l v e n t a r e rh v d r o i y z e db y口一a r t l y l a s e ，卢一a m y i a s e ，m es t a r c hw a sm o s t l yr e m o v e d 舶mt h ec g m ，a n dt h ep r o p o n i o no f p r o t e i ni nc g mi n c r e a s e df r o m6 1 5 4 t o8 5 7 2 r e d u c t a j l t ，p ha n dt e m p e r a t u r ec a na l la f r e c tt h es o l u b i l i t yo fc g m t h es o l u b i l i t yo f c g mi n c r e a s e df 沁m4 2 0 t o3 0 9 6 a r e r h e a t e d1 5m i n u t e sa t9 0 o nt h ec o n d i t i o no f d h1 0 1 2w i t h0 1 0 n a 2 s o ， p r e t r e a t e dc g 】w a sh y d r o l y z e db ys i n g l ea n dc o m p l e xp r o t e a s er e s p e c t i v e l vi n7k i n d s o fp r o t e a s e sf o ra i l t i h y p e n e n s i v ep e p t i d e s p e p t i d e sa c t i v i t yw a sd e t e n n i n e db yc u s l m l a n u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e r t h eh y d r o l y t eo b t a i n e db ya l c a l a s e24 lp r o t e a s es h o w e d t h eh i 2 h e s ta c t i v i t y ，a n dt h eo p t n n u mc o n d i t i o n so fh y d r o l y s i so fc g mw a sd e t e n n i n d e d b ye x p e r i m e n tt ob e ：【s 】= 2 5 ，【e 【s = 4 8 a u l ( g ，p h = 8 o ，t = 5 5 6 0 t h eh y d m l ”ew i m h v d r o l y s i sd e g r e eo f15 9 6 b o a s tt h eh i g h e s tj n h i b i t o r ya c t i v i t yt oa c e ，a n di t si c 5 0w a s 0 2 4 7m g m l a r e rt h ed u r i 行c a t i o no ft h eh y d r o l y t ew i t hu l t r a f i l t r a t i o n ，b i o r a dp 一2g e ln l t r a t i o n c h r o m a t o g r a t p h y ，a n dr p h p l c ，a na c t i v ef r a c t i o nw i t ha ni c 5 0o f o 0 8 5m m lw a s o b t a i n e d ，t h ei c5 0o f w h i c hi s3 4 4 o f t h eo r ig i n a lh y d r 。l y t e t h es e q u e n c eo f l h ef r a c t i o n w a sf o u n dt ob ea l a t v ra r e rt h ea p p l i c a t i o no fa m i n oa c i dc o m p o s i t i o na s s a va n dt h e c o m b i n a t i o no fl i q u i dc h r o m a t 0 2 r a p h yw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y a n di t si cs ow a s 2 2 6 9 u m o l l t h ei c 5 0o f a l a t v rh a r d l yc h a n 叠e da r e ri n c u b a t e dw i t h3 0 m ua c ea t3 7 f o r3h o u r s s o i tw a sc o n s i d e r e dt ob ea c ei r l l l i b i t o r k e yw o r d s ：a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) ：a c ei r l h i b i t o r yp e p t i d e s ；c o m g l u t e nm e a l ( c g m ) ：a l c a l a s e24 l ： h y d r o l y z e v i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 塞i 蒸日期：d 6 年参月7 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 -， t 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 刻蕴 导师签名： 日期： 。6 年6 月夕日 第一章绪论 刖菁 第一章绪论 高血压是威胁成年人健康的一个主要因素，近年来，随着人们生活水平的提高，高 血压的发病率也呈上升趋势，全世界大约有2 0 的成年人受此威胁。高血压会引起患者 心、脑、肾等器官损坏，并与糖脂代谢紊乱和糖尿病有密切关系，严重时会危及生命。 因此，抗高血压药物的研究越来越引起国内外学者的重视。 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是存在于人体血管内 皮细胞内的一种酶，它在血压调节方面起着重要的作用，当其受到抑制时血压就会降 低。基于这种机理合成的降血压药物有卡托普利c 印t o p r i l ，依那普利e n a l 印m ，赖诺 普利l i s t i n o p m 等，这些药物己被广泛地应用于临床，但是这类药物具有作用时间短 停药后血压易反弹等缺点，而且人工合成药物吸收排泄速度快，会引起咳嗽，丧失味觉， 肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用1 2 j 。近年来，对天然a c e 抑制肽的研究表明，一些 来源于蛋白酶解产生的活性肽可以对a c e 起到有效的抑制作用，这些a c e 抑制肽对一些 血压正常的动物或人没有降压作用，说明其对正常状态下的肾脏、血管的作用很小， 具有安全性高，无毒副作用的特点。所以从天然蛋白中提取的a c e 抑制肽( 或称降血压 肽) 作为一种新的降压药物越来越受到人们的广泛关注，在这方面的研究也逐渐兴起。 研究发现，这些肽的共同特点是c 末端为p r o 或芳香族氨基酸，而n 末端往往是疏 水性氨基酸，这些特点给原料蛋白的选择提供了一定的信息。玉米醇溶蛋白中含有高 比例的i l e ，l e u ，v a l ，a l a 等疏水性氨基酸和p r o ，g 1 n 等，很少含l y s 等人类必需氨基 酸，这种独特的氨基酸组成使玉米蛋白水溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨 基酸组成使玉米蛋白成为多种生理活性肽，尤其是降血压肽的重要来源【3 l 。因此通过 酶法水解玉米蛋白提取a c e 抑制肽具有重要的研究价值。 1 1a c e 抑制肽的作用原理 1 1 1a c e 对血压的调节作用 a c e 是一种含锌二肽羧基肽酶，相对分子量为1 2 0 0 0 0 一1 5 0 0 0 0 ，在人体组织及血 浆中广泛存在，主要存在于血管内皮细胞内，在肺毛细血管细胞含量最为丰富。血管 紧张素转化酶在人体血压调节过程中起重要的生理作用。一方面，它使无活性的血管 紧张素i 转化为升压物质血管紧张素i i ，另一方面它能使降压物质舒缓激肽 分解成失活片段，从而使血压升高。其调节作用如图卜1 所示【4 】： 江南大学硕士学位论文 旦 i 肾素 i 回 激肽原 激肽释放酶一l 激肽 a c e l l 失活片断 血压升高 图卜la c e 的作用机制 在人的生理过程中，血压的调节主要是受到肾素一血管紧张素系统( r a s ) 和激肽 一激肽生成酶系统( k k s ) 一对拮抗体系相互作用控制的。r a s 是升压系统，由血管紧 张素原( a g t ) 、肾素、a c e 及血管紧张素酶原f a t r ) 组成。肾素进入血液，作用于血 管紧张素i 从其c 末端去掉h i s l e u 生成血管紧张素i i ，血管紧张素i i 是肾素一血管紧 张素系统中已知的最强的血管收缩剂，作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起 升压效应：同时血管紧张素i i 通过刺激醛固酮分泌和直接对肾脏作用( 减少肾血流量 及促进n a + 、贮的重吸收) ，引起钠贮量和血容量的增加，也能使血压升高。与此相 反，k k s 是降压系统，又称抗高压因子，其中激肽是降压物质，主要作用是扩张毛细 血管和增加其通透性，达到舒张血管的目的，使血压下降。a c e 具有催化激肽酶的作 用，作用于舒缓激肽使其失去c 末端的p h e a r 2 或s e r p r o ，从而使激肽降解为失活片 段，引起血压升高”j 。 r a s 和k k s 系统在血压调节方面是对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常 血压十分重要。r a s 产生具有升压作用的血管紧张素i i ，k k s 产生具有降压作用的舒 缓激肽。r a s 与k k s 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因之一。a c e 在这两者 系统中起重要作用，a c e 活力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，由于 a c e 在r a s 和k k s 系统中对血压调节起重要作用，抑制a c e 活性对降低血压有积极的 影响，因而寻找更有效的a c e 抑制剂一直是高血压药物研究中的热点课题。 1 1 2a c e 抑制肽的作用机制 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n i c o n v e “n ge n z y m e ，a c e ) 是含有z n 2 + 辅基的羧 二肽酶( e c3 4 1 51 ) ，它是内皮细胞浆膜的一个组分，由单一肽链组成，含大量的 低聚糖，z n “、c l 一是维持其活性所必需的。它含有两个结合z n 2 + 的位点，即所谓“必 第一章绪论 须结合位点”。此外，还含有一个或几个“附加结合点”。z n “结合位点是a c e 催 化反应的活性基团所在部位，包括降血压肽在内的各种a c e 抑制剂的共同作用是与 a c e 活性部位的z n2 + 结合，使之失活【6 】o c u s h m a i l 实验室根据竞争性抑制剂与a c e 活性的结合位点提出了模型假说【7 】，该 模型后来一直被许多研究者用来解释降压肽的作用机理。图1 2 所示就是该假设模型。 蛾h 抻叫刺 罡要飘 l 印：厂。自厂、i 一c 4 撂阜l 量袄锄 乌鼻。占k 抻翩埘 k 。囊卜心1 0 l 模型中的六角缺口是羧肽酶的活性点，表示酶的疏水袋。a c e 的环形缺口表示底物 和竞争性抑制剂的取代基r l 和r 2 与a c e 作用的活性点，x h 表示a c e 活性点的氢键。 该模型认为a c e 与羧肽酶a 的结构相似。a c e 活性点有个正电荷f 类似于羧肽酶 a 的a r g 1 4 5 ) 可能与底物肽的c 端羧基结合。与正电荷相距一个二肽残基的距离处有一 个z n ”( 与羧肽酶中相距一个氨基酸残基的距离相对) ，可能对肽键的断裂有作用。 a c e 对c 端的疏水性氨基酸没有专一性，因此在活性点不像羧肽酶有个疏水袋。但 是它有2 个环形缺口，可能对肽底物的两端氨基酸残基( r l 和r 2 ) 有亲和力。另外，a c e 还可能以氢键与底物末端不断裂的肽键结合。 源于食品蛋白质的降血压肽是一类对a c e 活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂， 它们对a c e 活性区域的亲和力大于血管紧张素i 和缓激肽对a c e 的亲和力，并且降血 压肽旦和a c e 活性区结合，就难于释放出来，从而阻碍血管紧张素i 转化为血管紧 张素i i 以及缓激肽分解为失活片段的两种生化反应过程，起降血压的作用【8 1 。 1 1 3a c e 抑制肽的构效关系 降血压肽的活性与其氨基酸结构和组成密切相关。c h e u n g 等人经研究认为a c e 江南大学硕士学位论文 抑制肽的活性主要取决于c 端氨基酸，c 端氨基酸为芳香族氨基酸( 包括色氨酸、酪氨 酸、苯丙氨酸) 和脯氨酸时其抑制活性较高【9j 。另外，n 端为疏水性的撷氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸或碱性氨基酸的肽与a c e 的亲和力较强，抑制活性较高，但是脯氨酸则例外。 最早从蛇毒液中分离提取的a c e 抑制肽含有许多脯氨酸残基，c 端为脯氨酸的抑制活 性最高。s a i t o i lu j 等人从酒糟中分离了9 种c 端含有t r p 或t ”的含5 个或更少氨基酸残基 的a c e 抑制肽，分析了1 1 e t y r _ p r o a r g t y r 和t y p g i y g 1 y t y r 两种肽段，认为a c e 抑制 肽序列中的疏水性氨基酸和肽段的c 端氨基酸对其抑制活性有着重要的作用。 但不少抑制活性较强的降血压肽的结构并不符合c h e u n g 等的降血压肽结构模式， 如来源于沙丁鱼的c ll 肽( t y 卜c y s s e 卜p h e i l e l y s g 1 y t y r - p r o v a l 一m e t ) ，来源于金枪 鱼的c 8 肽( p r o t y r - h i s i l e l y s t 叩g 1 y a s p ) ，m a t s u i 【l l 蹲用碱性蛋白酶酶解沙丁鱼获 得的a c e 抑制肽主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量很低。另外，s u e t s u n 1 2 j 分析了来源于1 5 种鱼贝类a c e 抑制肽的氨基酸组成，发现来源于鱼类的a c e 抑制肽含 有丰富的a s p ，g l u ，加g ，p r o ，i l e 和l y s ，来源于贝类的则富含a s p ，g 1 y 和l y s 。不同 的氨基酸结构和组成的短肽的抑制活性差别很大。a c e 抑制肽的氨基酸组成和结构与 其抑制活性的具体关系尚未研究透彻，有关机理尚不清楚，可能是不同氨基酸结构的 a c e 抑制肽与a c e 的活性中心有着不同亲和力的缘故。 1 1 4a c e 抑制肽活性的评价 评价a c e 抑制活性有两种表示方法：百比分抑制率和i c m 前者测定起来简单快 捷，但缺点是不能比较不同水解物之间的a c e 抑制活性大小，i c 5 0 又叫半抑制浓度， 是对a c e 抑制率达到5 0 时的抑制剂浓度，它是评价抗高血压肽体外a c e 抑制活性大小 的一个十分直观准确的指标。i c 5 0 值越小，a c e 抑制剂的活性就越强。 对于所获得的a c e 抑制剂，检测方法主要采取体外检测和动物实验( 体内检测) 。 体外测定，使用比较广泛的是1 9 7 1 年，c u s h m a n 和c h e u n g 建立的紫外分光光度法1 1 3 1 。 该方法的原理是：a c e 在3 7 ，p h8 3 条件下催化分解血管紧张素i 的模拟物h h l ， 产生马尿酸，该物质在紫外2 2 8 n i l l 处具有特征吸收峰。当加入a c e 抑制剂时，a c e 对 h h l 的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。通过测定加入抑制剂前后所生 成马尿酸紫外吸收的差别即可算出抑制活性的大小。但该方法对实验操作要求甚高， 实验易产生误差。体外检测的另一种方法是高效液相色谱法，此法是通过测定a c e 抑制剂加入前后，马尿酸的出峰面积的变化来计算抑制率的，该方法具有准确度高， 检测时间较短的优点，适合于降血压肽的快速筛选。但是测定成本高，不适于推广。 从目前世界上酶解食用级蛋白质所得的a c e 抑制肽来看，它们可分为以下三种类 型：其一是a c e 的抑制剂，它们经过a c e 保温3 h r 后，其i c 5 0 保持恒定，不会发生变化。 其二是a c e 的底物，这些肽是a c e 的天然底物，用目前各种体外检测方法检测时，都 会对a c e 产生一定的抑制率。其经过a c e 保温3 1 1 r 后，其i c 5 0 明显增加。其三是药物前 4 第一章绪论 体性降血压肽，这些肽也是a c e 的底物，经过a c e 保温3 h r 后，a c e 会对这些肽进行 酶解，会产生一些对a c e 具有更强抑制作用的活性肽，其i c 5 0 值明显小于未保温的i c 5 0 值。因此，通过保温实验来判断一种肽是否是a c e 抑制肽，也是一种有效的方法， 此法一定程度上可以代替动物实验，降低实验成本。 1 2a c e 抑制肽的制备 1 2 1 原料的选择 虽然降血压肽没有固定的氨基酸组成，但原料蛋白质的选择十分重要。降血压肽 生产的原料选择首先应考虑原料蛋白质的氨基酸组成，根据目前认为的a c e 抑制肽的 构效关系分析，疏水性氨基酸和芳香族氨基酸以及脯氨酸含量高的蛋白质比较适合作 为酶法生产降血压肽的原料。其次，要考虑原料的成本和来源，我国拥有十分丰富的 蛋白质资源，很多未能得到有效的利用，特别是一些低值蛋白质，如豆粕粉，玉米蛋 白粉，酒糟等等始终处于被浪费的状态。以这些蛋白质为原料提取a c e 抑制肽将极大 提高这些原料的附加值，有力地推动我国经济和农村的发展。 1 9 6 5 年由f e r r e i r a i ”j 首次从南美洲蝮蛇( b o t h r o p sj a r a r a c a ) 的毒液中发现a c e 抑制 肽，此后a c e 抑制肽的研究逐渐兴起。对食物降血压肽的研究开始于o s l l i m a 等1 9 7 9 年报道的从明胶酶解液中提取的a c e 抑制肽i l ”，这是第一次用体外蛋白酶降解得到的 由食品蛋白产生的活性肽，为后来研究生产食品蛋白质a c e 抑制肽打下了基础。1 9 8 2 年m a n l v a m a s 【1 7 】等从牛酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离出一种能抑制a c e 活性的1 2 肽。随后开始从更多的蛋白质源中获得了a c e 抑制肽，如大豆蛋白、乳蛋白、肌肉蛋 白、卵蛋白、血清蛋白等【1 ”。a c e 抑制肽还从蔬菜蛋白，麸皮玉米醇溶蛋白，大麦 醇溶蛋白，大蒜和油菜籽中被分离出来【2 。2 3 j 。国内的一些研究者在我国的特色食品， 如即墨老酒、腐乳汁中也发现了具有降压作用的肽【2 。近年来，海洋蛋白的酶解产物 中也陆续发现了大量的降压肽，如沙丁鱼、金枪鱼、鲣鱼、小虾、螃蟹、海藻的酶解 物中都发现了具有新的氨基酸序列的降压肽1 2 ”“。 玉米蛋白粉，俗称玉米渣，是玉米淀粉生产中提取淀粉后的主要副产物，大约含 有6 0 的蛋白质，主要为玉米醇溶蛋白( 6 8 ) 、谷蛋白( 2 2 ) 和球蛋白( 12 ) 【2 ”。玉 米蛋白质中含有高比例的亮氨酸、异亮氨酸、撷氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸和脯氨 酸、谷氨酸等，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组成使玉米蛋白水 溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白质成为多种生理活性 肽，尤其是降压肽的来源。我国玉米产量丰富，但是附加值不高，湿法成产玉米淀粉 后的玉米蛋白粉多用于饲料工业或向自然界排放，既浪费了宝贵的粮食资源，又造成 对环境的污染。利用玉米蛋白粉生产降血压肽能降低生产成本，同时变废为宝，大大 提高玉米蛋白粉的附加值和对玉米资源的综合利用率。 江南火学硕士学位论文 1 2 2 蛋白酶的选择 肽是蛋白质经酸、碱或蛋白酶作用后的水解产物。蛋白质的酸碱水解虽然工艺简 单、成本低廉，但是在生产过程中酸水解会生成有毒物质，碱水解产物有异味，并且 水解程度难于控制，所以在食品： 业中应用很少。相比之下酶水解条件温和，对蛋白 质的营养价值破坏小，水解过程容易控制，最重要的一点是能对蛋白质进行定位水解 而产生特定的肽类，所以一般以酶解法生产生物活性肽。 酶的选择是a c e 抑制肽生产的关键，从文献报道归纳，用于蛋白质水解的酶有细 菌胶原酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草 杆菌蛋白酶、蛋白酶一k 、木瓜蛋白酶、放线菌酶等。不同的蛋白酶对蛋白质的水解 方式不同，水解产物中的多肽也有区别，获取的a c e 抑制肽的数量与活性有较大的不 同。1 9 9 6 年，a m h a r 2 踟等人用7 种不同的蛋白酶对酪乳清蛋白进行水解，结果发现不同 的酶解产物，其a c e 抑制活性有很大的差异，其中嗜热菌蛋白酶和蛋白酶一k 的酶解产 物对a c e 的抑制活性较强，而胰蛋白酶和防线菌酶的水解物对a c e 的抑制活性较弱。 s e k i 等【2 9 1 用地衣型芽饱杆菌碱性蛋白酶酶解包括沙丁鱼、带鱼、牡砺、虾、蟹在内的 1 2 种食物蛋白，获得了较高活性的a c e 抑制肽；河村幸雄等”o j 人用胃蛋白酶酶解大豆 蛋白也获得了较高a c e 抑制活性的短肽。 从酶的分类看，应该选择内切酶，而不应选择外切酶，这样可以避免水解产物中 出现过多的游离氨基酸，从而提高产率并减少因氨基酸过多所带来的测定干扰及后续 分离难度。从a c e 抑制肽的构效关系看，在选择酶时最好选择水解位点是疏水性氨基 酸，芳香族氨基酸的酶，如胰蛋白酶主要水解精氨酸和赖氨酸羧基组成的肽键，碱性 蛋白酶( a l c a l a s e ) 有终端疏水性氨基酸的专一性，主要裂解的疏水性氨基酸有：亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸等的终端。考虑到食用的安全性及生物活性的正常发挥，应尽 量选择来自动物消化道的酶系如胃蛋白酶、胰蛋白酶。从经济角度看，应尽可能选择 来源广，生产成本低的酶，碱性蛋白酶( a l c a l a s e2 4 l ) 是微生物酶，来源广泛、成 本低，适合工业化生产，是较理想的工业用酶。 1 3a c e 抑制肽的分离纯化 建立一套适宜的分离提取技术工艺是将a c e 抑制肽推向商业化生产的必要条件。 分离提取的效率将直接影响到a c e 抑制肽的应用前景。由于a c e 抑制肽的氨基酸组成 和结构差别较大，没有一个固定或较特殊的氨基酸组成，并且食物蛋白质酶解产物成 分相当复杂，这就增加了它的分离提取难度。降血压肽的分离提取甚至结构鉴定是一 项最复杂，也是最有意义的工作。a c e 抑制肽的分离提纯大致可分为两种情况：一种 是从工业化的角度来考虑的，方案必须考虑到进样量大及成本低等因素，可采用的方 法有超滤，大孔吸附树脂等：另一种是进行性质研究的，主要分析其结构和功能之间 的关系，常用的方法有：离子交换层析、凝胶层析、高效液相色谱、毛细管电泳等。 第一章绪论 鉴于食物蛋白质经酶解后产生的a c e 抑制分子量一般在1 5 0 0 以下，用超滤除去不溶底 物、分子量较大的蛋白质和肽类以获得合理的氨基酸和短肽分布。然后用凝胶过滤层 析，将混合物通过多孔的凝胶床而达到分离目的，肽的回收率很高，活力不受破坏。 使用的凝胶种类主要有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。使用过程 中因其设备简单，重复性好，结果处理方便，因此应用非常广泛。河村幸雄用两种凝 胶( s e p h a d e xg 一2 5 和s e p h a d e xg l o ) 从大豆蛋白胃蛋白酶水解液分离得到了较高a c e 抑制活性的组分后，再进行两次高效液相色谱分离，获得了高纯度的a c e 抑制肽。由 于许多a c e 抑制肽氨基酸结构非常接近，分子量的差别甚微，在这种情况下，凝胶层 析的分离效果就不理想，往往需结合离子交换层析。结构差别很小的短肽，电荷性质 会有一定的差异，但是不同的离子交换树脂的分离效果是不同的，因此，离子交换剂 的选择十分重要。 川岛用0 d s 树脂分离提取较高活性的a c e 抑制肽混合物后，再用s ps e d h a d e x c 一2 5 进行离子交换层析，获得了较好的结果：a s t a w a n 【3 l 】等用凝胶层析s e d h a d e xg 一2 5 和s ps e p h a d e xc 一2 5 离子交换层析处理印度尼西亚干鱼酶解产物，获得了a c e 抑制活 性较高的短肽；s u e t s u n a 吲用离子交换树脂d o w e x5 0 w x 4 ( 5 0 一1 0 0 目，h + 型) 和 s e p h a d e xg 一2 5 凝胶从1 5 种鱼贝类的胃蛋白酶水解产物中分离提取了a c e 抑制肽。 j i u n m n gc h e n 俐等人先用d o w e n5 0 w ( 5 0 1 0 0 目) 除去杂质，然后用s e p h a d e x g 一2 5 ( 2 6 1 4 0 c m ) 分离，收集液再经s ps e p h a d e xc 一2 5 ( 2 5 0 ) 分离，得到了较好的分离 提纯效果。 1 4 国内外研究状况 玉米醇溶蛋白水解产物的a c e 抑制作用显著强于其他蛋白水解物，已经有很多学 者成功从中分离出许多a c e 抑制作用很强的多肽。其中以三肽居多，并且大部分c 末 端为脯氨酸。进一步的研究表明c 末端为pr o ，t ”或序列中含有疏水氨基酸是维持抑 制活性所必须的，而对于二肽n 末端的芳香族氨基酸与a c e 的结合是最有效的【3 4 3 5 】。 s y a n o 等从玉米蛋白中分离出3 0 余种玉米短肽，i c 5 0 值偏低【3 6 】。其序列及i c 5 0 见表 1 1 刚。1 9 9 1 年，日本学者报道y 一玉米醇溶蛋白中酶解得到的l e u p r o p r o 是迄今发现 的蛋白水解得到的最好的a c e 抑制肽，效果与c a p t o p r i l 相当【3 8 】。在日本现已开发出具 有降血压作用的玉米多肽混合物“缩氨酸”，作为功能食品使用。在国内，赵金兰等 人，用来源广泛，价格便宜的嗜热菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，也获得了抑制作用较 强的a c e 抑制肽，动物实验表明，其水解物以2 9 爪g 剂量口服3 5 h 后，可使受试动物的 血压显著下降，降血压作用维持了2 4 h 。但是未对混合物作进一步的分离，对于活性 肽段的结构未作鉴定。目前，玉米蛋白a c e 抑制肽的分离纯化在国内还是空白，是需 要继续研究的领域。 江南大学硕士学位论文 表l la c e 抑制肽序列及其i c 5 0 序列 i c 5 0 ( 肛m 0 1 l _ 1 ) l e u m g p r o l e u s e r - p r o v a l s e 卜p r o l e u g l n p r o l e u a s n p r o l e u l e u p r o v a i a l a - t ” l e u a l a t ” p h e t v r i l e a r g a i a v a l a l a a i a l e u g l n g l n 1 1 e - a r g a l a g l n - g l n p y r - g l y l e u p r o p m a r g p r o l y s i l e p r o p r o p y r g i y l e u p r o p r o - g 1 y p r o p r o 1 1 e p r o p r o 注：i c ，。指将a c e 活力抑制5 0 时抑制剂的浓度 1 5 立题背景和意义 高血压病是一种常见的多发病，全世界每年因高血压而死亡1 2 0 0 万人，在发达国 家和比较发达国家，其患病率可高达2 0 以上，就是在发展中国家，近年来高血压的 患病率也在不断增长。目前，我国高血压患者数量每年以3 5 0 万人的速度增加。高血 压的危害在于对心、脑、肾等器官的损害，明显地降低患者的生活质量，严重地危害 生命。脑卒中、心力衰竭、心肌梗塞、和尿毒症是高血压的三大并发症，也是高血压 的死亡原因，其死亡率占人类死亡的首位。来源于食物蛋白质的降血压肽的降压效果 虽然不及化学合成的a c e 抑制肽，但其无毒副作用，安全性极高，对血压正常者无降 压作用，除降压外往往同时具有免疫调节、减肥和易消化吸收等功能。其良好的安全 性能以及多方面的生理功能吸引了众多的研究者。日本在2 0 世纪8 0 年代就对降血压肽 进行了广泛深入的研究。他们从大豆蛋白、鱼贝类蛋白、清酒糟等廉价的蛋白质资源 中研究开发了众多的a c e 抑制肽，制成药片、口服液或作为功能因子添加到各种食品 中去，取得了良好的经济效益和社会效益。当今在国内主要将玉米蛋白粉用于饲料工 业或向自然界排放，既浪费了宝贵的粮食资源，又造成对环境的污染。考虑到玉米蛋 嘲m”钙卯m笛“ 北 巧 第一章绪论 白粉的主要成分是玉米醇溶蛋白，直接以玉米蛋白为原料可以大大降低成本。因此， 利用玉米蛋白粉生产降血压肽可变废为宝，大大提高玉米蛋白粉的附加值和对玉米资 源的综合利用率，具有现实意义。 1 6 本论文的主要研究内容 1 玉米蛋白的预处理： ( 1 ) 研究五种有机溶剂对玉米黄色素的提取效果。 ( 2 ) 研究口淀粉酶、糖化酶对原料中淀粉的脱除效果。 ( 3 ) 研究还原剂、p h 、温度对玉米蛋白溶解性的影响。 2 蛋白酶的筛选：通过研究不同蛋白酶单独以及复合水解所得的水解物的a c e 抑制 活性，确定最佳用酶。 3 水解条件的优化研究：通过研究酶解反应中底物的浓度、水解系统的口h 值、酶反 应的温度与时间对水解速度的影响，确定水解的最佳条件。 4 在最佳水解条件下研究玉米蛋白水解度和水解物a c e 抑制活性之间的关系。 5 建立一套适宜的分离提取技术工艺是将a c e 抑制肽推向商业化生产的必要条件。 实验研究了超滤，凝胶过滤色谱，反相高效液相色谱a c e 抑制肽的分离效果，并用 液质联用技术、氨基酸分析，鉴定分离所得的a c e 抑制肽的结构。 江南大学硕：e 学位论文 2 1 引言 第二章原料的预处理 玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的主要副产物，它是由玉米籽粒经湿磨法工艺制得 的粗淀粉乳经淀粉分离机分出的蛋白质水即麸质水，用浓缩离心机或沉淀池浓缩后， 再经脱水干燥制成口9 。，俗称黄粉子。 玉米湿法制取淀粉，在分离淀粉后，得到的玉米蛋白粉除含有蛋白质外，还含有 一定量的淀粉、黄色素、脂肪和糖类。在玉米蛋白水解之前，如果不把淀粉、色素等 杂质除去，会给以后水解物的制各和脱色工艺带来一定的困难，而且也大大地浪费了 玉米黄素资源。另外，在酶水解的温热条件下，一些氨基酸和还原糖之间易发生美拉 德反应，也给产品带来一些不良的影响，所以需要对原料进行预处理【4 。另外，由于 玉米蛋白主要是醇溶蛋白，醇溶蛋白是一种结构特殊的蛋白质，其分子中存在着大区 域的a 一螺旋结构，使之具有很强的疏水性，因此玉米黄粉中的蛋白大多数不溶于水 ，这种情况不利于玉米蛋白在水中的酶解，为此，有必要研究各种因子对玉米蛋白 溶解性的影响以提高玉米蛋白在水中的溶解度。试验研究了还原剂、p h 、温度对玉 米蛋白溶解性的影响，确立了原料预处理的条件。 2 2 材料与仪器 2 2 1 材料与试剂 材料名称 玉米蛋白粉 口一淀粉酶 糖化酶 牛血清白蛋白 半胱氨酸 亚硫酸钠 酒石酸钾钠 硼酸 9 5 乙醇 丙酮 正己烷 无水乙醚 规格 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生产产家 山东富源玉米开发有限公司 杰能科酶制剂有限公司 江阴星达生物有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 南京化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 第= 章原料的预处理 乙酸乙酯分析纯国药集团化学试剂有限公司 其他试剂均为分析纯 2 2 2 主要仪器 w f j 一2 0 0 0 可见分光光度计 w f z 一2 0 0 0 紫外可见分光光度计 电子精密天平 d e l t a3 2 0 sd h 计 t g l1 6 c 离心机 d s h z 一3 0 0 多用途水浴恒温振荡器 d z f - 6 0 2 l 真空干燥器 s h b i i i a 循环水式多用真空泵 2 3 实验方法 2 3 1 原料的成分分析h 2 l 1 蛋白质的测定：凯氏定氮法 2 淀粉的测定：酸水解法 3 脂肪含量的测定：索氏抽提法 4 水分含量的测定：常压干燥法