（环境工程专业论文）真菌漆酶的固定化及固定化漆酶对铬蓝黑r的脱色.pdf

y uy i n s h u i b e ( l a n z h o uun i v e r s i t yo ft e c h n o l o g y ) 2 0 0 6 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro f e n g i n e e r i n g e n v i r o n m e n t e n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f l a n z h o uu n i v e r s i t yo f t e c h n o l o g y s u p e r v i s o r a s s o c i a t ep r o f e s s o rz h a n g y i n g p e n g m a y , 2 0 1 1 咖j | 5 3 大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 寻与姚寸孑黼日期：如1 1 年占月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权兰州理工大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服 务。 日期：。i 晖月么日 日期：矽年多月名日 1 3 酶的固定化简介3 1 3 1 固定化酶的特点4 1 3 2 固定化酶的方法4 1 4 漆酶6 1 4 1 漆酶的来源和分布7 1 4 2 漆酶的分子结构和催化机理7 1 4 3 漆酶的研究和应用10 1 4 3 1 造纸工业1 0 1 4 3 2 有机合成1 0 1 4 3 3 医疗11 1 4 3 4 食品工业1 1 1 4 3 5 环保11 1 4 3 6 生物检测11 1 4 4 漆酶的固定化1 2 1 4 5 漆酶在染料脱色中的应用13 第二章真菌漆酶的固定化15 2 1 实验部分15 2 1 1 实验仪器和试剂15 2 1 1 1 实验仪器15 2 1 1 2 实验试剂1 6 2 1 2 实验方法16 2 1 2 1 树脂d 3 8 0 的预处理16 2 1 2 2 漆酶的固定化16 2 1 2 3 漆酶活性的测定17 2 1 2 4 漆酶的米氏常数k m 的测定19 2 2 结果与讨论2 0 2 2 1 漆酶固定化方法的选择2 0 2 2 2 漆酶固定化条件优化2 0 i 脱色 2 2 3 红外分析2 4 2 2 4 固定化漆酶的性质2 4 2 2 4 1 固定化漆酶的最适温度2 4 2 2 4 2 固定化漆酶的最适p h 2 5 2 2 4 3 两种形式漆酶的储存稳定性比较2 5 2 2 4 4 两种形式漆酶的米氏常数k m 2 6 2 3 本章小结2 7 第三章固定化真菌漆酶对铬蓝黑r 的脱色2 8 3 1 实验部分2 8 3 1 1 实验仪器和试剂2 8 3 1 1 1 实验仪器2 8 3 1 1 2 实验试剂2 8 3 1 2 实验方法2 9 3 1 2 1 漆酶的固定化2 9 3 1 2 2 固定化漆酶处理染料废水2 9 3 2 结果与讨论2 9 3 2 1 加酶量对脱色率的影响3 0 3 2 2 反应时间对脱色率的影响3 0 3 2 3p h 值对脱色率的影响3l 3 2 4 固定化漆酶对染料脱色的循环使用情况31 3 2 5 固定化漆酶对不同浓度染料废水的脱色情况3 3 3 3 本章小结3 3 结论3 4 参考文献3 6 到【谢4 2 附录h 攻读学位期间所发表的学术论文目录4 3 o 1 2 2 3 3 2 2 2 2 2 2 响 一 一 硕士学位论文 摘要 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，具有底物广泛、催化效率高的优点， 因此在生物制浆、食品加工、废水处理以及环境监测等方面的应用备受 关注。然而，漆酶成本高、难以回收利用的缺点制约了其在实际中的应 用。酶固定化技术，为降低漆酶的使用成本、实现循环利用提供了一种 有效的途径。 为寻求一种廉价高效的漆酶固定化方法，以树脂d 3 8 0 为载体、戊二 醛为交联剂，结合吸附法和交联法固定真菌漆酶，并研究固定化漆酶的 性质。最优固定化条件：1g 载体在2 0 m l0 7 的戊二醛溶液中交联2 h 后， 加入2 m l 稀释酶液和5 m lp h 为4 的醋酸一醋酸钠缓冲溶液，在2 5 下吸附 反应6 h ，最终获得的酶活回收率为6 5 9 4 。固定化漆酶的最适温度为2 0 ，最适p h 为4 ，在4 下保存14 天仍保持约8 0 的酶活力。自由漆酶 和固定化漆酶的k m 值分别为1 2 0 7 m m o l l 叫和1 616 m m o l l ，说明固 定后漆酶对底物的亲和力有所下降。 纺织、印染等工业的迅速发展，使染料废水处理成为一个世界性的 难题。在自然条件下，染料造成的污染很难被消除，用常规的物理、化 学和生物法还是难以达到去除的目的。生物酶法处理废水具有安全、清 洁、高效等优点，成为近年来关注的热点之一。由于能够降解多种酚类 化合物，漆酶在废水处理中的应用具有很大价值。 利用树脂d 3 8 0 固定化的真菌漆酶对染料铬蓝黑r 进行脱色条件的探 讨，考察常温下酶用量、反应时间和p h 值对脱色率的影响。结果显示： 在酶用量o 5 9 ，反应时间4 0 m in ，p h 值为5 的条件下，固定化漆酶对铬 蓝黑r 的脱色率可达9 6 85 。重复利用固定化漆酶处理铬蓝黑r ，第8 次使用后脱色率仍在9 4 以上。 关键词：真菌漆酶：固定化：树脂d 3 8 0 ：酶活回收率：铬蓝黑r ：脱色 率 l a c c a s ei sa p o l y p h e n o l o x i d a s ec o n t a i n i n gc o p p e r s ，a n di t sa p p l i c a t i o ni n b i o l o g i c a lp u l p i n g ，f o o d p r o c e s s i n g ，w a s t e w a t e r t r e a t m e n ta n d e n v i r o n m e n t m o n i t o r i n ga t t r a c t sg r e a ta t t e n t i o nb e c a u s et h em e r i t s o fw i d e s p r e a ds u b s t r a t ea n d h i g hc a t a l y t i e ef f i c i e n c y h o w e v e r ，l a c c a s e sp r a c t i c a lu s ei s p r e v e n t e db yt h e s h o r t c o m i n go fh i g hc o s ta n dd i f f i c u l tr e c y c l i n g e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g y s u p p l i e sa ne f f e c t i v ew a yt or e d u c et h ec o s ta n dr e a l i z et h er e c y c l i n g i no r d e rt os e e kac h e a pa n de f f i c i e n tw a yf o ri m m o b i l i z a t i o no fl a c e a s e ，r e s i n d 38 0a ss u p p o r ta n dg l u t a r a l d e h y d e ( g l u ) a sc r o s s l i n k i n ga g e n tw e r ee m p l o y e df o r i m m o b i l i z a t i o no ff u n g a ll a c c a s ec o m b i n i n ga d s o r p t i o na n dc r o s s l i n k i n gm e t h o d s ， a n dt h ep r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r ea l s os t u d i e d t h e o p t i m u m c o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z a t i o na r ea sf o l l o w s ：a f t e rc r o s s - l i n k i n gf o r2 hw i t h2 0 m l g l uo f0 7 ，1 9s u p p o r tw e r ec o n d u c t e di n2 m ld i l u e n tl a c c a s es o l u t i o na n d5 m l h a c n a a cb u f f e rs o l u t i o n ( p h = 4 ) t oa d s o r bt h el a c c a s ea n dr e a c tf o r6 ha t2 5 t h er e c o v e r yo fe n z y m e a c t i v i t y a t t a i n e d f i n a l l y w a s6 5 9 4 t h e o p t i m u m t e m p e r a t u r ea n dp ho ft h ei m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e2 0 a n d4 ，r e s p e c t i v e l y ，a n d a b o u t8 0 e n z y m ea c t i v i t yw a ss t i l lh o l da f t e rp r e s e r v a t i o na t4 f o r1 4d a y s m i c h a e i l sc o n s t a n to ff r e ea n di m m o b i l i z e d e n z y m e so f 1 2 0 7 m m o l l 1a n d 1 6 1 6 m m o l l 一1 i n d i c a t e dt h a tt h ea f f i n i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m et os u b s t r a t ew a s d e c l i n e d t h eq u i c k l y d e v e l o p i n g o ft e x t i l ea n d p r i n t i n g i n d u s t r i e sh a sm a d e d y e w a s t e w a t e rt r e a t m e n taw o r l d w i d ep r o b l e m i nt h en a t u r a lc o n d i t i o n s ，d y ep o l l u t i o ni s h a r dt oe l i m i n a t ea n da c h i e v et h e p u r p o s e o f r e m o v i n g w i t h r e g u l a r p h y s i c a l ，c h e m i c a la n db i o l o g i c a lm e t h o d s b i o l o g i c a le n z y m a t i cb e c o m e so n eo f r e c e n tf o c u sf o ri t s s t r o n g s u i to f s e c u r i t y ，c l e a na n de f f i c i e n t i nw a s t e w a t e r t r e a t m e n t l a c c a s ea p p l i c a t i o ni nw a s t e w a t e rt r e a t m e n th a s g r e a tv a l u e w i t hi t s a b i l i t yt od e g r a d ev a r i e t yo fp h e n o l i ec o m p o u n d s f u n g a ll a c c a s ei m m o b i l i z e dw i t hr e s i nd 3 8 0w a su s e dt od e c o l o r i z ee r i o c h r o m e b l u eb l a c kr ，a n dt h ei n f l u e n c eo ft h ed o s a g eo fi m m o b i l i z e dl a c c a s e ，r e a c t i o nt i m e ， p h 。v a l u e ，d e e o l o r i z a t i o nr a t ew e r ee x p l o r e da tn o r m a lt e m p e r a t u r e w h e nt h e i t k e y w o r d s ：f u n g a ll a c c a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；r e s i nd 3 8 0 ；r e c o v e r yo f e n z y m ea c t i v i t y ；e r i o c h r o m eb l u eb l a c kr ；d e c o l o r i z a t i o nr a t e ； i 益提高，但是随之而来的环境污染问题却越来越严重，尤其是近代工业 的巨大进步，产生了大量的有害性气体、固体废弃物和废水，对人赖以 生存的大气、土壤、水体及其中的动植物造成严重污染，极大地危害人 类的生存和生活。当前，环境污染已成为制约人类社会发展的重要因素 我国每年排放大量废水( 4 16 亿吨) 、废气和烟尘( 2 0 0 0 万吨) 以及固体废弃 物( 10 0 0 亿吨) ，污染达到相当严重的地步。环境污染的治理与防治是全 世界面临的重大问题，越来越受人类的关注。 在废水治理方面，传统的处理方法如微生物降解法已取得了很大的 进步，尤其是城市污水中可降解的有机质、氮、磷等污染物的处理技术， 已经非常成熟了。但是，城市污水尤其是工业废水中往往含有大量难降 解、有毒有害的物质，如酚类物质、染料、高分子聚合物、重金属等， 运用传统的处理方法处理往往达不到理想的效果。于是，探索适合各种 难降解物质的处理方法显然是当前废水处理所面临的一大难题。 1 1 染料废水及处理方法简述 一直以来，工业生产排放的废水是城市水污染的主要来源，而其中 来自染料行业和印染行业的废水是最难处理的工业废水之一，污染尤为 严重。我国是染料生产大国，常年生产的染料有1 1 大类5 0 0 多个品种， 年生产能力约30 万，占世界染料总产量的3o 以上【2 1 。在染料的生产和 使用过程中，大约有1o 15 的染料随废水排入环境【3 1 。 染料废水对环境有有很大的破坏作用，这是由于染料本身是一种化 学结构复杂的化合物，它含有人工合成的复杂的芳香烃分子结构，很难 被降解去除。染料具有高度的稳定性，难被生物降解，在自然环境中可 以存留很长时间。染料的颜色是造成印染和染料行业废水色度很高的根 本原因，它们使水体透明度下降，生物和微生物生长受阻，妨碍水体的 自然净化，破坏生态平衡。而且，许多染料是由一些致癌物质( 如苯胺 及其它芳族化合物) 合成，甚至染料及其反应的副产物也是有毒的或者 致癌的物质【4j ，对动植物和人造成很大危害。例如偶氮染料，分子结构 中含有可致癌的偶氮健( n = n ) ，这类染料与人体接触，会逐渐渗入， l 真菌漆酶的固定化及固定化漆酶对铬蓝黑r 的脱色 通过人体新陈代谢中产生的还原性物质的作用，偶氮键被还原断裂，产 生芳香胺”】，而某些芳香胺会导致人体产生膀胱癌。如果不加以处理就 排放，这些燃料能在环境中存留很长时间，如活性蓝19 ( r b 19 ) 在p h 为7 温度2 5 下的水解半周期约为4 6 年【6j ，这样就对环境造成持久的污 染。 通常，染料废水的特点有排放量大、色度深、浓度高、p h 变化大及 可生化性差。处理染料废水常见的方法有物理化学法和生物法，主要包 括吸附法、气浮法、混凝沉淀技术、化学氧化法、离子交换技术、超滤 膜技术、光催化技术等。物理化学法对废水色度的去除率较高，但c o d 去除率较低，并且存在处理费用高、产生大量难处理的污泥、可能引起 二次污染等问题。目前，国内外染料废水的处理以生物法为主【7 】，如生 物流化床、生物接触氧化池、表曝、生物转盘、生物滤池以及延时曝气 等方法。生物法主要是通过生物菌体对染料的吸附、絮凝和降解来达到 去除的方法。絮凝和降解属于物理过程，不能使染料分子发生化学变化， 而生物的降解作用是利用生物酶催化氧化染料分子，破坏其发色基团和 不饱和键，并且通过一系列生物化学反应，将染料降解或者转化为容易 降解的物质。在自然条件下，染料造成的污染很难被消除，用常规的物 理、化学和生物的方法还是难以达到去除的目的，因此染料废水的脱色 和降解成为了一个全球性的难点和热点。 1 2 酶在废水处理中的研究与应用 当今，化学、生物等学科与环境领域的结合越来越紧密，由此而诞 生的各种环保技术也愈加受到关注。酶是生物体内合成的，催化生物化 学反应，并传递电子、原子和化学基团的生物催化剂【8 】。由于酶催化具 有有良好的选择性，转化效率极高，且无毒无害，属于环境友好产品， 酶被广泛的应用于食品、医药、饲料和化工等领域。用生物酶来处理废 水，是近二十几年发展起来的一种技术。酶工程在环保中的应用体现在 很多方面，如能源和材料开发、环境监测、产品加工、污染物降解等【9 1o 】 o 早在2 0 世纪7 0 年代，固定化酶已被用于水和空气的净化。法国工业 研究所积极开展利用固定化酶处理工业废水的研究，将能处理废水的酶 制成固定化酶。处理静止废水时直接用酶布或酶片；处理流动废水时根 据废水所含污物的种类和数量，确定玻璃酶柱或塑料酶柱的高度和直径， 采用多酶酶柱或单一酶柱。 酶具有安全、清洁、高效等优点【1 1 1 ，尤其在处理废水中难降解物质 2 硕十学位论文 方面具有很大的潜力，将会有广阔的应用前景。芳香族化合物，包括酚 和芳香胺，属于优先控制的污染物，塑料厂、树脂厂、染料厂等企业的 废水中都含有这类污染物，很多酶已用于这类废水处理。乔彤森【1 2 】等以 辣根过氧化物酶为催化剂，过氧化氢为氧化剂，处理了来自石油化工厂 的含有苯胺、酚类等化合物的高浓度有机工业废水，在最优实验条件下， c o d c ，在l5 m i n 被去除50 。j o o n m o k 等【l3 】将酶氧化和电极反应相结合来 降解偶氮染料橙色i i ，连续操作3 6 h ，辣根过氧化物酶对橙色i i 的催化降解 率仍保持在9 0 以上。m g o m e z 等【1 4j 用大豆过氧化物酶和紫外光去除水 中5 0 5 0 0 m g l 。1 的4 氯酚，在5 9 0 m i n 内都表现出较好的效果。r u k h s a n a s a t a r 等【l5 】把白萝卜过氧化物酶固定在硅藻土上，处理活性染料：活性红 12 0 和活性黑17 l ，在p h = 5 ，温度为4 0 时的脱色率达到最高。 酶在食品工业废水的处理中，也具有很大的潜力。将蛋白酶应用于 粮食加工废水的预处理，其后续工艺可以采用任何一种生物处理法。因为 蛋白酶已将废水中不易生化降解的大分子转化为易于生物降解的小分子。 大大提高了废水的可生化性。淀粉酶是一类多糖水解酶，多糖转变为单 糖和发酵能同时进行，淀粉酶用于含淀粉废水处理，可使大米加工产生的 废水中的有机物转化为酒精。淀粉酶还可缩短活性污泥法处理废水的时 间。 传统的生物法对废水中低浓度污染物的去除率比较有效，但其往往 对负荷冲击敏感、需要长的水力停留时间以及形成大量固体残留物。这 些缺点有的可以通过酶反应器克服，因为酶能够在比较广的浓度范围内 操作。与传统处理方法相比，酶法处理废水的优点有：能够处理难降解 的物质；处理较低或较高浓度的污染物；适应比较广的p h 值、温度以及 盐浓度范围等等【16 1 。如今，研究酶在废水处理中的应用的报道非常多。 应用在废水处理中的生物酶常见的有辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ) 17 1 、漆酶( 1 a c c a s e ) 15 】、锰过氧化物酶( m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ) 【1 9 1 、木质素过氧化物酶( 1 i g n i np e r o x i d a s e ) 1 2 0 1 等。此外，含有多种酶的 白腐真菌也是废水处理中研究得比较多的 2 1 - 2 4 】。 1 3 酶的固定化简介 酶的开发利用在2 0 世纪得到了巨大的发展，但由于酶一般必须在温 和的条件下才有催化作用，在实际运用中也就带来了很多问题。目前在 实验室、工业生产中漆酶的应用主要有三种：游离酶、固定化酶和固定化 细胞技术。实际应用过程中，环境条件变化会导致漆酶变性失活，特别 是游离酶与反应物混合在一起，难以实现重复利用，限制了漆酶制剂 3 真菌漆酶的同定化及固定化漆酶对铬蓝黑r 的脱色 的产业化应用。固定化酶就是在这种情况下发展起来的。 1 3 1 固定化酶的特点 酶固定化技术是2 0 世纪5 0 年代开始发展起来的，经 探索，已经取得了很大进展，通过这种技术能改善酶的性 不同条件，如更加广泛的p h 和温度范围。 酶的固定化，就是运用物理或者化学的方法，把酶束 上，使它在定的区域内发挥作用，稳定性大大加强，能够实现多次循 环使用 2 5 】。但是固定后，酶的活性会相对减弱【26 1 。固定化后酶的性质不 仅与载体以及相关试剂有关，还受到时间、温度、p h 值等因素的影响， 对这些条件进行优化，可以的到较高性能的固定化酶。与其他应用游离 酶的过程相比，固定化酶有许多优点【27 j ： ( 1 ) 酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高，对热、p h 等的稳定 性提高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性， 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间； ( 2 ) 反应完成后经过简单的过滤或离心，酶就可以回收，而且酶活 力降低较少，这样就降低了生产成本； ( 3 ) 固定化体系适合于连续化、自动化生产，催化过程容易控制， 且产品中不会带进酶蛋白或细胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用 效率，降低了生产成本。 与此同时，固定化酶也存在一些不足，如在固定化过程中酶失活造 成的固定化效率低：固定化稳定性不够高；固定化所用试剂成本高，限 制了固定化酶的大规模应用；使用过程中酶从载体上掉落；由于底物必 须经扩散才能和载体中的酶接触，反应产物也要经过扩散进入液相，所 以固定化酶的催化速度一般低于相应游离酶的反应速度；由于化学反应、 空气或固态污染物堵塞酶的活力中心及载体结构而导致酶活力下降等。 搅拌反应混合物或增加反应混合物可以部分地消除扩散效应，提高反应 速度。 目前，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、 环保、能源和科研等领域。在环保方面，固定化酶技术作为一种高效的 生物酶催化技术，将在今后的工业废水处理中产生巨大的应用价值。 1 3 2 固定化酶的方法 固定化酶既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复 使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。经过5 0 多年的研究和发 展，酶固定化技术取得了长足的进步，采用这种技术不仅能改善酶的特性， 4 硕士学位论文 还能创造适应特殊要求的新酶。通常酶的固定化方法有载体结合法、交 联法、包埋法、膜法四种【28 1 。 ( 1 ) 载体结合法 载体结合法是将酶通过范德华力、疏水作用、离子键、共价键等结合 与水不溶性载体的一种固定化方法。这类方法在目前的固定化研究中应 用最多，许多已成功应用于工业化生产中，主要包括物理吸附法、离子 交换法和共价结合法。物理吸附法常见的载体有活性炭、多孔玻璃、高 岭土、硅胶、淀粉、合成树脂、陶瓷等；离子结合法的载体有多糖类离 子交换剂和合成高分子离子交换树脂；共价结合法所采用的载体有纤维 素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲克质等【29 1 。 物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化较少的优 点，但是它也有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点；离子结合法 操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易 被破坏，酶活回收率较高等优点，但是载体和酶的结合力较弱，容易受 缓冲液种类和p h 的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会 从载体上脱落；共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比，反应条件 苛刻，操作复杂，且由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白结 构的变化，破坏部分活性中心，因此往往得不到比活高的固定化酶，但 是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易 脱落【30 1 。 d e s s o u k i 等【3 l 】将支链淀粉酶用共价健结合法分别固定在由环氧氯丙 烷活化的琼脂糖和由坏氧氯丙烷活化的三氯三嗪酪蛋白上，并合成共聚 物丙烯酸盐丙烯酸。使用1o 次仅有轻微损失( 约2 0 ) 。使用5 10 0k g yy 射线作一次照射实验，游离酶在5 0k g y 时，活性完全丢失，而固定酶在5 m a r d 时仍对射线有很高抵抗能力。m o j o v i c 等【3 2 】将从e a n d i d a r u g o s a ( c a n d i d a 为念珠菌属) 中提取的脂肪酶吸附固定在孔共聚物载体上， 在最优条件下最大吸附量为1514m g g ，酶固定率为6 2 。动力学研究 表明，脂肪酶是通过局部化学反应选择固定在载体上。在卵磷脂异辛烷 存在下，用此固定酶水解椰子油，酶活力为游离酶的7 0 ，重复使用15 次后，固定酶活性仍保持初始活性的5 6 。 ( 2 ) 交联法 交联法亦称架桥法，游离酶的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联 剂反应而被固定化，可得到蛋白质浓度较高的固定化酶。常用的交联剂 有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。此法反应条件剧烈， 许多酶易在固定过程中失活，酶活回收率低，但是尽可能降低交联剂浓 度和缩短反应时 q u i n n 等【3 3 在石墨表面，用 糖水解接近7 0 ( 3 ) 包埋法 包埋法分为 制备工艺简单且 持其自然性质， 高分子凝胶网络 力学行为改变，从而降低酶的活力，所以该法对酶、底物和产物的分子 及溶解性能要求严格，不适合大分子和不溶性底物。 s 0 1 g e l 法( 溶胶凝胶技术) 是一种物理包埋过程，黄志心1 3 4 采用该方 法固定化漆酶，最佳固定条件为：聚乙二醇分子量p e g 6 0 0 、添加量1 5 ， 酶浓度15m g m g ，水前躯体质量比1 ：6 ，缓冲液p h 值4 5 。得到的固 定化酶在热稳定性、酸碱稳定性以及储存稳定性方面都有明显提高。 ( 4 ) 膜法 膜法是利用物理方法把酶限制在半透膜、超滤膜、中空纤维膜等组 件中而使酶固定的一种方法。底物和产物可透过酶组件而酶不能透过。 此法的优点是简单易行，可实现多酶同时固定化，酶作用时仍保持游离 状态活性没有损失等，但是该法与包埋法同样对底物或产物的要求较高， 不适合大分子底物和产物，并且不能用于溶解性差或不稳定的底物，否 则会造成膜阻塞。 n a s t i a 1 7 】等用改性丙烯腈共聚物膜固定化辣根过氧化物酶，实验表明 该材料是比较好的固定化材料，固定化酶的热稳定性以及操作稳定性均 比自由酶好，经过2 0 天的酶操作，仍保持初始酶活性的5o 。 以酶固定化为基础，多种新兴技术如细胞固定化技术、固定化多酶 技术及反应器、固定化微生物多酶反应系统、固定化酶微生物复合物等 相继发展起来。另外，酶固定化技术与微电子技术的结合，使生物传感器 的开发和应用迅速发展，已经开发出葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器、脱氧 核糖酶生物传感器等用于科研和生产。膜技术和固定化酶技术的结合，酶 膜反应器的研究也得到了较大发展，超滤膜因其孔径小和截留能力高而 成为研究热点，尤其对具有高通透率、易清洗的非对称性超滤膜和无机膜 的研究。 1 4 漆酶 6 硕十学位论文 1 4 1 漆酶的来源和分布 l88 3 年，田彦六郎在漆树的树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶， 但对它的真正本质并不清楚，他称之为“淀粉酶d i a t a s e 。后来贝特兰德 ( g e b e r t r a n d ，18 9 4 ) 详细地研究了东南亚产的漆中的酶，并将其命 名为漆酶。漆酶因最早发现于漆树而得名【”】，它广泛地分布于植物、微 生物、昆虫以及菌类中，可以是分泌的酶，也可以定位在细胞内，因物 种而异【36 1 。 按来源，漆酶可分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类。在漆树科植物中， r h u sv e r n i c i r e r a 主要分布在中国和日本，r h u ss u c c e d a n e a 主要分布在越 南、柬埔寨，r h u st o x i c o d e n d r o n 分布在美国，此外东南亚的芒果( m a n g i f e r a i n d i c a ) ，加州胡椒树( s c h i n u sm o l l e ) ，巴基斯坦黄连木( p i s t a c i a ) 和萜木 李( p l e i o g y n i u mt i m o r i e n s a ) 等都含有漆酶。漆树漆酶发现较早，机理研究 相对深入，虽然都叫漆酶，但真菌漆酶与漆树漆酶同源性较低。在真菌 中，漆酶大多分布在担子菌( b a s i d i m y l e t e s ) ，多孔菌( p o l y p o r u s ) ，子囊 ( a s o m y c e t e s ) ，脉抱菌( n e u r o s p o r a ) ，柄抱壳菌( p o d o s p o r a ) 和曲霉菌 ( a s p e r g i l l u s ) 等。漆酶的主要生产者是担子菌中的白腐真菌( w h i t e r o t 肛n g i ) ，也是目前研究最多的。 1 4 2 漆酶的分子结构和催化机理 漆酶的命名和分类号为e c1 10 3 2 ，它是一种多酚氧化酶，分子中 含有4 个铜离子，属于氧化酶的蓝铜家族，能够催化降解多种化合物【37 1 。 漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应，因此漆酶 能把分子氧直接还原为水，在没有过氧化氢和其它次级代谢产物存在 下，可催化大量的酚类和芳香胺类化合物的氧化。漆酶作用的底物相当 广泛，包括多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯以及 其他容易氧化的化合物。 漆酶分子中所含有的4 个铜原子，根据光谱学和顺磁特征，可分为三 种类型。一型铜与两个组氨酸( h i s ) 和一个半胱氨酸( e y s ) 配位；二型铜与 两个组氨酸( h i s ) 和一个水分子配位，形成t 型几何结构，这种结构对一价 铜比二价铜更有利；三型铜与3 个h i s 和一个氢氧桥配位，形成四面扭曲的 四方立体结构；一个二型铜和2 个三型铜形成三核铜簇。其中2 个三型铜 通过羟基相连，铜原子之间的距离是0 38 n m 。一型铜与三核铜簇距离大 约为1 2 5 n m ，中间通过一e y s - h i s 一联系起来，形成c u ( i ) c y s h i s c u ( i i ) 电子传递通道 3 8 】。漆酶分子中4 个铜原子构成铜簇作为催化核心见图1 1 7 真菌漆酶的固定化及同定化漆酶对铬蓝黑r 的脱色 ( a ) ，实施氧化还原过程。在催化核心中铜原子的相互作 的电子吸收，产生了典型的蓝色。图1 1 ( b ) 为漆酶催化 分子的氧被还原为2 分子的水，同时4 个底物分子氧化产生 些活性的中间物随后转变为二聚体、寡聚体和高聚物。 ( a ) h 2 0 h i “s 4 0 0 ，： il h i s3 9 6 跚h i s6 4 i： 6 乱 t 2t 3 ，h i s1 1 1 h i s1 0 9 t 1 用。漆 分子中 懈 懈 筘 k c p uc 栅 5 s sh h 硕士学位论文 c u + c u + c u 2 + 还原态 2 h + 。0 2 一h 2 0 。快 2 存在下，还原态漆酶被氧化，0 2 被还原为 2 的还原是通过四个铜离子协同地传递电子 1 2 。 c u + c u + c u 4 + 2 c u 2 + c u 2 + ( c u 2 0 ) 3 + 分子内 电子转移 2 h 。 一h 2 0 ，慢 2 e c u 2 + c u 2 + c u 2 + 2 底物 ，c u 2 * m c u “2 氧化态 ii i 。 图1 2 漆酶活性位点的催化分子模型 漆酶是单电子氧化还原酶，初步统计它可催化氧化不同类型的底物己 达2 5 0 个，按结构可归纳为六类：( 1 ) 酚及其衍生物，它们约占漆酶底物 总数一半。主要是多元酚及其衍生物，q 萘酚和某些一元酚的衍生物， 后者取代基多在酚经基的邻、对位，随着取代基的种类、数目和在芳环 位置不同，反应活性也有差异。( 2 ) 羧酸及其衍生物，一般指芳环羧基 邻或对位连有羟基、烷氧基或胺基等芳香酸，碳链上连有酚或芳胺基团 的非芳香酸。( 3 ) 芳胺及其衍生物，结构特点与酚类底物相似，主要是 多氨基苯及其衍生物。( 4 ) 甾体激素和生物色素，如雌甾二醇、q 卵胞 激素、巳烯雌酚、胆红素、苏木色精等。( 5 ) 金属有机化合物，如二茂 铁及其衍生物。( 6 ) 其他非酚类底物，除了亚铁氰化钾、抗坏血酸外， 近年来发现1 苯基2 ( 3 ，4 一二甲氧基苯基) 乙二醇，吲哚衍生物等也是漆 酶底物【4 1j 。 真菌漆酶是木质素降解酶的主要组成之一其在木质素降解过程中起 到重要作用，但是机制还不是十分清楚。漆酶对木质素的降解，通常认 为它在0 2 存在时能脱去羟基上的电子或质子形成自由基，从而导致酚型 木质素侧链的脱羧、脱氢，造成c c 键断裂。近年来发现漆酶还有通过催 化加氧导致c c 键断裂( 见图1 3 ) 以及氧化非酚型木质素模型化合物的 能力。 9 真菌漆酶的同定化及同定化漆酶对铬蓝黑r 的脱色 o m e o h m o m e c h o 图1 3 漆酶的作用机制推论 o h o m e o h o m e 1 4 3 漆酶的研究和应用 由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在纸浆生物 漂白、化学合成、食品工业、环境等领域具有重要应用价值【42 1 。尤其在 环保方面，漆酶常被用来降解水中酚类化合物、净化土壤以及环境监测 等 4 3 , 4 4 】，得到广泛的研究。 1 4 3 1 造纸工业 制浆过程是将植物纤维素从木质素中分离出来，这就必须去除纸浆 中的木质素。生物制浆主要是依靠微生物发酵产生的各种酶去除木质素， 从而达到降低化学药剂使用、环保、降低生产成本等目的。传统的造纸 工业中纸浆用烧碱或硫酸盐高温蒸煮原料，除去木材中的木质素，降低 纤维间的结合力使之离解成浆。这一工艺不仅会使部分纤维素和半纤维 素降解，影响纸浆得率，还会严重污染环境。近年来出现的氧、臭氧和 过氧化氢漂白工艺，虽然比起传统氯漂工艺减少了给环境带来的污染， 但得到的纸浆的粘度，抗张强度等指标不太令人满意，且成本也比较高。 漆酶可以选择性地降解木质素，并消除机械制浆工艺的弊端，使生产在常 温、常压的温和条件下进行，并能节约设备和能耗，缩短纸浆生产周期， 降低生产成本。最近，用木质素降解酶进行生物漂白已引起人们的广泛 关注。漆酶作为一种主要纸浆漂白的木质素降解酶，应用于纸浆漂白的 研究是最晚的，但研究最多、进展最显著，成为最具潜在应用前景的酶。 1 4 3 2 有机合成 漆酶除了可以有效降解大分子有机物质外，其合成有机物的能力也 1 0 硕十学俯论文 很强。一部分漆酶具有很强的生物合成能力，可以把两种小分子化合物 高效聚合成新的大分子化合物。利用漆这种能力可以在常温下生产高分 子聚合物，比目前高温高压的化学催化方法大大节约能源及成本。因此， 利用漆酶进行如抗生素、氨基酸、抗氧化物等大分子化合物的生产，是一 种环境友好型的新方法。 1 4 3 3 医疗 用过氧化物酶分析血清中的葡萄糖、胆固醇、尿酸等组分时，血清 中的胆红素有很大的干扰，将血清通过管状或柱状的固定化漆酶可减少 胆红素l8 2 4 ，能反复使用5 0 次，用戊二醛交联的固定化漆酶制成的模 型或网状电极，在脑神经组织成分儿茶酚的测定中能消除抗坏血酸干扰， 具有较高的灵敏度和稳定性，此法用于氢醌、对苯二胺、降肾上腺素等 分析，电极响应极快( 2 0 u m g s i g m a a l d r i c h ( 上海) 贸易有限 树脂d3 8 0 公天津南开和成科技有限公司 戊二醛分析纯上海中秦化学试剂有限公司 邻联甲苯胺分析纯上海中秦化学试剂有限公司 醋酸分析纯天津富宇精细化工有限公司 醋酸钠分析纯西安化学试剂厂 磷酸氢二钠分析纯广东汕头市红衡化工厂 磷酸二氢钠分析纯广东汕头市红衡化工厂 铬蓝黑r指示剂 北京化学试剂厂 3 1 2 实验方法 3 1 2 1 漆酶的固定化 按照第二章中得到的最佳条件制备固定化漆酶。取适量预处理过的 树脂( 用一定浓度的酸碱依次浸泡) ，抽滤去除表面水分，称取1g 置于 5 0 m l 圆底烧瓶中，加入2 0 m l 0 7 ( v ：v ) 的戊二醛溶液，在4 下搅拌反 应2 h 后静置过夜，再用蒸馏水洗涤多次( 至少5 次) ，去掉未交联的戊 二醛，然后加入5 m l p h 为4 的醋酸一醋酸钠缓冲溶液和2 m l 稀释酶液，置 于振荡器中在25 振荡反应6 h ，反应完成后放在冰箱、4 下静置一夜， 再次洗涤多次(