实验六 感受态菌的制备.doc

实验六 感受态菌的制备1目的学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。2原理 细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。3器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4试剂 E. coli DH5a，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water5实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌dd Water，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。6操作步骤 （1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入1.5 ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出DH5a菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375（0.40.6，细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（6）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。（7）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100mL分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。7思考 （1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？ （2）CaCl2溶液的作用是什么？实验七 细菌转化1目的学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。2原理 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。3器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。4试剂 LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。5实验准备 无菌dd water，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。6操作步骤 （1） 事先将恒温水浴的温度调到42。（2） 从-70 超低温冰柜中取出一管（100L）感受态菌DH5，插入冰上融化。（3） 加入10L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上30min。（4） 轻轻摇匀后插入42水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置12min。（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入1mL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1h。（6） 在超净工作台中取上述转化混合液100300L，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。（7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜。（9） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能