（应用化学专业论文）酶法从鲜猪皮中提取生物活性肽.pdf

摘要 鲜猪皮具有十分可观的营养价值，但是由于有特有的异味、不良的口 感、消化率低和加工不方便等特点使其被作为废弃物而大量的浪费。针对 这一点，研究了利用胰酶水解鲜猪皮提取生物活性肽的工艺。 、 首先研究了工艺过程中最为关键的步骤一一酶解过程的工艺条件。对 影响酶作用的各种因素进行了单因素和正交实验后，得到的最佳工艺条件 如下：酶水解的p h 值为8 ，酶水解时间是5 0r a i n ，酶用量为1 ( 猪皮重 量的) ，且温度应设在5 0 ；其次研究了脱脂过程的工艺条件，通过实验确 定了用n a 2 c 0 3 作为脱脂剂的基础上，再对影响因素进行了大量试验，并结 合正交实验得到适宜的反应条件：脱脂温度为4 0 。c ，反应时间是4 0m i n ， 试剂浓度为3 ；最后探讨了脱色过程的工艺条件，实验结果表明在p h 值 为7 ，温度是5 0 ，时间是l5m i n 时脱色效果最好。 在对酶解工艺条件研究过程中，为了方便快捷的测定酶解的程度，提 出了用阿贝折射仪测定溶液折射率来控制水解程度的方法。对其的可行性 从理论上进行了推导，并通过试验给予了证实。 通过系统地对从鲜猪皮中提取生物活性肽的工艺优化研究，得到酶水 解制备活性肽的一种全新工艺。该工艺过程简单，条件温和，且对活性肽 几乎没有破坏，使其营养价值保持完好。并可以得到较高的收率，是一种 提取活性肽的很有潜力的方法，应用前景十分广阔。 关键词：猪皮生物活性肽酶解脱脂脱色阿贝折射仪 b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sd e r i v e d f r o mf r e s h p i g s k i nb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s a b s t r a c t ag r e a td e a lo fn u t r i t i o nc a nb eo b t a i n e df r o mf r e s hp i g s k i n h o w e v e r ， p i g s k i ni sw a s t e da so f f a lf o rt h ep r o p e r t i e so fp e c u l i a rs m e l l ，p o o rd i g e s t r a t e ，i l lt a s t ea n dh a r dp r o c e s s i n g t h u st h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n g b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sf r o me n z y m a t i ch y d r o l y z e df r e s hp i g s k i nw a s s t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y f i r s t l y ，t h ek e ys t e p ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i sp r o c e s sw a ss t u d i e d t h e e f f e c t so fm a i nf a c t o r sw e r ed i s c u s s e da n da c h i e v e dt h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o nt h r o u g hm o n o f a c t o ra n do r t h o g o n a l i z i n gt e s t ：p h = 8 ，e n z y m a t i c h y d r o l y t i ct i m e5 0m i n ，e n z y m ed o s a g e1 oa n d5 0 。c s e c o n d l y ，t h e c o n d i t i o no fd e g r e a s e p r o c e s sw a ss t u d i e d c o n f i r m i n gn a 2 c 0 3a s d e g r e a s i n gr e a g e n tt h r o u g hl o t se x p e f i m e n t s ，o r t h o g o n a l i z i n gt e s tw a s a p p l i e dt og e tt h ee f f e c t so fm a i nf a c t o r si nt h ed e g r e a s ep r o c e s s t h e r e s u l t sw e r e ：d e g r e a s i n gt e m p e r a t u r e4 0 。c ，r e a c t i o nt i m e4 0r a i na n dt h e d e n s i t y o fr e a g e n t3 t h ec o n d i t i o no f d e c o l o u r i n gp r o c e s sw a s d i s e u s s e df i n a l l y ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tp h = 7 ，5 0 ca n d15m i nw e r et h e b e s td e c o l o u r i n gc o n d i t i o n s i nt h ep r o c e s so fs t u d y i n ge n z y m a t i ch y d r o l y t i cc o n d i t i o n s ，t h em e t h o d o fa b b e r e f r a c t i o nm e t e r d e t e r m i n i n gr e f r a c t i v ei n d e xw a sp u tf o r w a r di n i l o r d e rt o c o n t r o l l i n ge n z y m a t i ch y d r o l y t i cd e g r e ec o n v e n i e n t l y a n d q u i c k l y t h ef e a s i b i l i t yw a sd e d u c e dt h e o r e t i c a l l ya n dw a sv e r i f i e d t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t s an e wt e c h n o l o g yo fb i o l o g i c a l l ya c t i v e p e p t i d e s p r e p a r a t i o nw a s o b t m n e dd u r i n gs y s t e m a t i c a l l ys t u d y i n gt h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n g b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sf r o me n z y m a t i ch y d r o l y z e df r e s hp i g s k i n 。 t h er e s u l t sp r o v e dt h a ti th a ss i m p l et e c h n o l o g y , m i l d c o n d i t i o n ，s c a r c e l y d e s t r o y i n gp e p t i d e sa n dc o u l dk e e pn u t r i t i v ev a l u ea n dh a sh i g h e ry i e l d h e n c ei ti sak i n do f p o t e n t i a le f f e c t i v em e t h o dt oe x t r a c tp e p t i d e s ，a n d h a sb r i g h tp r o s p e c t so fi n d u s t r i a lp r a c t i c e k e y w o r d ：p i g s k i n ，b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ， d e c o l o u r i n g ，d e g r e a s e ，a b b e r e f r a c t i o nm e t e r z h a n gq i n ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rz h a n gx i a o y a n 1 1 1 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名指导教师签名 年月 日年 月 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 年月日 前言 鲜猪皮的主要成分是水，蛋白质以及脂肪，还有少量的纤维素和矿物 质。猪皮的蛋白质含量可高达2 3 ，而瘦猪肉的蛋白含量仅为1 0 左右。猪 皮中的蛋白主要是胶原蛋白。胶原蛋白含有大量的甘氨酸( 2 0 ) 、脯氨酸 ( 1 2 1 3 ) ，这些物质对补充精血、滋润皮肤、光泽头发具有一定疗效， 经常埝用可以起到改善微循环和细胞新陈代谢的作用，可见猪皮有很好的 营养价值。但是猪皮有特有的异味且消化率低，从而影响了它的食用价值， 使得约占猪体重1 l o 左右的猪发被加工厂作为猪肉加工过程中的副产品而 白白浪费，因此猪皮的资源丰富，且廉价易得。 国外对于猪皮的研究比较早，而我国仅在猪肉方面的研究比较多，在 猪皮的研究与利用方面极少报道。实际上，猪肉与猪皮的成分差别极大， 营养成分也不相同，在1 9 9 2 年9 月以前的所有文章中仅有一篇关于肉皮资 源开发利用的文章。近几年来，对于猪皮的开发利用已有相关报道，但是 绝大多数只是传统工艺的加工和改进。 肽类是氨基酸通过酞胺键( 肽键) 相互连接形成的化合物，其实质可以 看作是构成蛋白质的片段，它与蛋白质的区别在于肽类的聚合度较小，而 蛋白质较大。肽类物质，作为生命活动基本调节物质，担负着十分重要的 角色，如激素、促激素、神经调质以及许多器官合成、释放的功能调节因 子等等。多肽在食品，医药等各方面都有广泛应用，所以开发研究的前景 被大家一致看好。 本文试图通过酶解提取猪皮中的活性肽，进一步分离提纯出生物活性 肽，使猪皮的利用空间更加广阔，并且大幅度提高其附加值。 本文的创新点在于： 在国内首先系统地研究了利用酶解从鲜猪皮中提取生物活性肽的 整个工艺，对整个工艺进行了优化。 首次提出利用阿贝折射仪测定酶解溶液的折光率来分析酶解的程 度的方法。对这一方法从理论上给予了证明，且通过实验对其进行 了验证。 第一章文献综述 1 1 鲜猪皮的结构及开发现状 1 1 1 鲜猪皮的成分以及结构 鲜猪皮的主要成分是水，蛋白质以及脂肪，还有少量的纤维素和矿物 质，其中水分含量为7 0 7 5 、蛋白质为2 1 2 3 、脂肪约为1 、 灰分约0 ，5 。猪皮中的蛋白质以胶原蛋白为主，约占8 0 以上，同时 还含有少量白蛋白，球蛋白和弹性蛋白“3 。猪皮的结构是由比较薄的表皮层、 最厚，最紧实的真皮层、最松软的皮下结缔组织构成，其主要成分为真皮 层。如图卜l 所示，真皮层的重量和厚度占生皮的9 0 以上，是一种结缔组 织，并由在结构上，编织上和化学组成上彼此不相同的胶原纤维，弹性纤 维和网状纤维所构成。表皮层主要由各种形状，彼此紧贴着许多单核细胞 组成的角蛋白构成。内皮层则富含脂肪组织及肌肉组织。“。 图1 1 皮层的构造 i 表层 i i 真皮皮下组织 2 1 1 2 鲜猪皮的营养作用 根据文献记载，猪皮的蛋白质含量可高达2 3 ，而瘦猪肉的蛋白含量仅 为1 0 左右“1 。由此看来，猪皮的蛋白质含量远高于瘦猪肉。又由于除水之 外，蛋白质是其主要成分，其蛋白质中富含人体所需的1 9 种氨基酸。另外， 构成猪皮的蛋白纤维主要是胶原蛋白，即胶原蛋白是主要蛋白质，胶原蛋 白含有大量的甘氨酸( 2 0 ) 、脯氨酸( 1 2 1 3 ) ，据资料报道，每l o o g 胶原蛋白中，可供人体吸收的氨基酸约为1 4 8 9 “3 。这些营养物质对补充精 血、滋润皮肤、光泽头发、皮肤防皱具有很强的功能和一定的疗效。经常 食用，可以起到改善微循环和促进细胞新陈代谢的作用。另有报道指出将 猪皮用清水浸泡2 小时后，捞出切成大片，放入热油锅中略炒，加入肉汤、 莴笋片、玉兰片、木耳、火腿片，用中火煮1 0 分钟，再加入猪肉片同煮至 熟，加盐、味精调味后可得到药膳玉兰猪皮，其性平、味甘、咸，有活血、 止血、润泽肌肤、延缓极体衰老的功效。还有资料报道指出胶原蛋白属于 营养不完全蛋白质，但其巨大的表面积和良好的成胶性使其在排除体内的 重金属离子形成的毒素，防止一心脑血管疾病方面有一定的作用。猪皮中的 弹性蛋白虽不能溶解，但遇到胃蛋白酶及胰蛋白酶则易被消化吸收。由此 可见猪皮的营养价值十分可观，利用猪皮酶解制各的生物活性肽将有十分 重要的生理功能和营养作用。 1 1 3 鲜猪皮的开发现状 随着人类社会的不断发展，世界肉类生产也不断地发生着变化。据统 计，世界肉类总产量从1 9 9 1 年的1 7 9 2 百万吨上升到2 0 0 2 年2 4 3 6 百万 吨，其中牛肉总产量略有下降，羊肉持平，猪肉产量明显上升，且猪肉产 量一直占总产量的4 0 左右，占有相当大的优势 “ 。发达国家肉类总产 量没有大的增长，特别是牛肉的产量受口蹄疫( f m d ) 和疯牛病( b s e ) 的影响 还稍有下降。发展中国家近年来肉类产量有较大的增长，主要是禽肉和猪 肉的增长较快，牛肉和羊肉的增长并不显著c9 o 这也说明肉类生产在发展 中国家有着潜在的发展优势，特别是猪肉的生产与加工。 改革开放十几年来，我国经济增长很快，人均食肉量逐年增加。1 9 9 1 年我国肉类总产量为3 1 4 4 万吨，人均占有量2 7 k g ，到2 0 0 1 年肉类总产量 达6 3 0 0 万吨，人均占有量增加到4 9 k g 。并且据预测，2 0 0 5 年我国的肉 类总产量可达7 2 0 0 万吨，人均占有量将增加到5 4k g “。 由于人民生活水平的普遍提高，我国的养猪业发展也很快。据资料显 示，我国猪的存栏数、出栏数、猪肉产量多年来均位居世界第一位，中国 猪肉产量约占世界产量的一半之多。存栏数、出栏数、猪肉产量分别从1 9 8 0 年的3 0 5 、1 。0 9 亿头和1 1 3 4 5 万吨增长到1 9 9 6 年的4 5 7 、5 2 6 亿头和 4 0 3 7 。7 万吨，在数量上要比亚洲及一些发达国家的增长快得多。且猪肉的 产量占我国肉类总产量的6 9 4 “，是全国肉类市场的晴雨表，因此养猪 业在我国畜牧业中占有重要的地位，有“六畜之首”之称。 随着肉类产量的增加，随着人民生活水平的提高，肉类加工业必将发 生巨大的变化，分割包装肉将取代白条肉而成为肉类销售的主要形式。在 国外，猪肉皮一般剔出后另作它用。但在国内，由于别无它用，所以不被 剔出，而是与肉一起出售。但是绝大多数家庭，因猪皮有令人难以接受的 特有的异味、不良的口感、消化率低、加工不方便等原因常将其扔弃，很 少使用。肉类加工厂也由于以上原因而将猪皮作为下脚料，所以导致其利 用效率很低。目前，除少部分用于制革工业外，大部分则有待于开发和利 用，由此而造成猪皮的营养价值和功用没有得到充分的发挥。据资料显示， 对于一个年屠宰生猪l o 万头的小型肉联厂来说，由于一般猪皮约占总体重 的1 0 左右，所以每年约有6 0 0 吨的猪皮产生，如果不对猪皮进行合理 的综合利用，仅作为下脚料处理，必将对企业的经济效益造成很大的损失。 目前在国外对于猪皮已有一些利用，如德国的赫斯特公司己发明了一 种猪皮软化剂，经软化处理的猪皮质地柔软，很容易进行加工处理成多种 猪皮食品。又如德国的汉诺威袋装香肠中猪皮的添加量竟高达3 6 “。而 我国仅在猪肉的研究方面比较多，在猪皮的研究与利用方面却极少报道。 实际上，猪肉与猪皮的成分差别极大，营养成分也不相同。在1 9 9 2 年9 月 以前的所有文章中仅有一篇关于动物皮资源开发利用的文章“。近几年来， 对于猪皮的开发利用已有相关的报道，但是绝大多数只是传统工艺的加工 和改进，例如猪皮胨、水晶肚、乳化肉、猪皮条以及利用猪皮为主要原料 研制的水晶猪皮胨凉粉和猪皮膨化食品j 3 - l f i 。只有国内的赵胜年利用猪皮 酶解提取胶原蛋白“1 ；万成志利用猪皮加工替代海蜇皮，制作简单，成本 较低，且使用口感与天然海蜇皮相比毫不逊色“； 汤金浦等人将猪皮作 为生物敷料己广泛应用于大面积烧伤创面，经临床证明具有粘附性好，透 水气性适中，良好的屏障功能，较好的弹性及柔软性，能增进自然愈合过 程，安全无毒，储存方便等优点。因此，如何利用这些猪皮，使其变 粗为精，。变废为宝，创造更多的经济效益和社会效益是目前的一个重 大课题。 1 2 生物活性肽 1 2 1 生物活性肽的含义 肽类( p e p t i d e s ) 是氨基酸通过酞胺键( 肽键) 相互连接形成的化合物， 其实质可以看作是构成蛋白质的片段，它与蛋白质的区别在于肽类的聚合 度较小，而蛋白质较大。肽类物质，作为生命活动的基本调节物质，担负 着十分重要的角色，如激素、促激素、神经调质以及许多器官合成、释放 的功能调节因子等等，都是调节机体功能、维持生命活动的重要生物活性 物质“。通常所说的寡肽( o l i g o p e p t i d e s ) 指的是含有十个以下氨基酸残 基的肽类。其中仅含2 3 个残基的肽一般被称作小肽( s m a l lp e p t i d e s ) n 。生物活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是指组成蛋白质分子的氨基酸数目 少于5 0 ，分子量小于6 ，0 0 0 u ，在构象上较松散，具有某些特殊生理功能和 生物活性的那些肽类，即就是对生物机体的生命活动有裨益或具有生理作 用的肽类。这些作用包括有激素作用、免疫调节作用、抗菌作用、抗肿瘤 作用以及具有与矿物质结合的特性等等n 。 1 2 2 生物活性肽的吸收和生理作用 现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解 后r 不像以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽的形式 直接吸收。生物活性肽与游离氨基酸的吸收相比，具有以下特点：( 1 ) 两者 的吸收是完全不同的独立机制；小肽吸收具有转运快、耗能低、不易饱和 等特点，而氨基酸则吸收慢、耗能高、载体易饱和。m a t t h e w s ( 1 9 7 2 年) 发 现，离体大鼠空肠对经胰水解酶处理的4 种蛋白质( 酪蛋白、清蛋白、溶 菌酶和乳清蛋白) 的氨基酸吸收要比含相同数量单位氨基酸的混合物中的 氨基酸吸收要好；( 2 ) 小肽中氨基酸残基的吸收速度大于相应游离氨基酸的 吸收速度。r e r a t 等( 1 9 9 8 年) 在猪的试验中观察到当十二指肠灌注肽的混 合物时，除了蛋氨酸之外，出现在门静脉的氨基酸都比灌注相应的氨基酸 混合物更早，且吸收峰更高，这表明小肽混合物的吸收率高；( 3 ) 肽的吸收 可以避免氨基酸之间的吸收竞争。施用晖等( 1 9 9 6 年) 在研究不同比例的小 肽与游离氨基酸对鸡氨基酸吸收的影响时发现，当完全以小肽的形式供给 动物时，赖氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影响“。 生物活性肽是由数量较少的氨基酸通过肽键连接而成，一些活性肽在 体内代谢最终分解为氨基酸而成为体蛋白的合成原料，另一些可直接用于 合成机体蛋白质，提高机体蛋白质合成效率。除了单纯的营养作用外，更 重要的是其作为机体生理活性调节物而起作用。大量研究表明，生物活性 肽在促进动物的胃肠道发育和成熟、促进蛋白质合成与肌肉生长、增强机 体免疫力等方面均发挥显著的作用。如初乳中乳源性的生物活性肽可刺激 胃肠道上皮组织的增殖和分化，刺激酶系统的发育成熟；一些活性肽如禽 胰多肽、脾脏转移因子、胸腺肽均能提高血浆中c h ：t 。t ；水平，这表明这些 活性肽可以通过对动物神经内分泌生长轴的影响而发挥促生长作用；酪蛋 白水解物中的免疫刺激肽、脾脏转移园子、胸腺肽都具有增强机体免疫力 和抗病力的作用“5 1 ”1 “。此外，主要是来自食物蛋白质水解产物的低聚肽 在食物的感官方面起着重要的作用。例如，多种序列的氨基酸可产生四种 基本味觉( 甜、苦、酸和成) 。另外，近年来，活性肽的营养作用越来越受 到关注，对生物活性肽的功能的认识及其生产日益广泛，发现它们还可在 各种食品如奶酪和肉制品中，提供特殊的口感和风味“8 2 “。因此多肽不仅 在药物中起着重要作用，而且在食品工业也有着广泛的应用。所以有人甚 至预言“2 l 世纪将是多肽的世界”。 1 2 3 生物活性肽的来源 生物活性肽的来源主要有动物组织( 含水解) 、微生物组织、乳源蛋白、 植物组织等。 6 乳源肽 一方面乳中含有大量的生物活性肽，包括表皮生长因予( e g f ) 、转化 生长因子( t g f ) 、神经生长因子( n g f ) 、胰岛素和胰岛素样生长因子( 1 0 f 一1 和i g f 一2 ) 。这是动物长期进化的结果，因为幼小哺乳动物的许多生理功能 都还不太健全，需要从母体中获得一些具有调节作用的活性肽。由于乳中 存在蛋白酶抑制因子，所以这些活性物质能够在哺乳动物的消化道中保持 完好而不被破坏”5 。剐。 另一方面乳蛋白不仅是营养的主要来源，而且其中包含着潜在的生理 调节因子，其水解、酶解作用将具有一定的生物学活性肽类物质释放和激 活，其中既有抗菌肽类，又有更大量的生理活性肽类，包括类吗啡活性肽、 免疫调节肽、血管紧张素转化酶抑制肽、抗血栓肽、微量元素结合肽，这 些活性肽构成了乳蛋白的主要结构“。近期研究发现尽管活性肽的功能 和来源各异，但是其具有共同点，即活性肽在生物合成的最初阶段都是从 无活性的蛋白质前体，经过酶的选择性剪切而转化得来的，具有特殊的氨 基酸序列8 州。 植物来源 随着化学分离技术和结构鉴定研究方法的发展，越来越多植物来源的 多肽类化合物被分离鉴定出来。目前已经发现一百多种植物来源的活性寡 肽、环肽、环肽生物碱、糖肽等的多肽类化合物，具有较强的生理活性， 有研究表明这些肽类物质与中药治疗癌症、心血管疾病有关。 对从药用植物中提取分离得到的多肽类化合物主要进行了以下方面的 研究：( 1 ) 抗肿瘤活性；( 2 ) 神经生理活性；( 3 ) 抗脂肪分解活性：( 4 ) 抗炎 活性：( 5 ) 降压活性；( 6 ) 抗溃疡活性”“。此外，对于种子等贮藏蛋白质的 物质也进行了研究。例如，大豆、大米蛋白的合适的酶解产物可以产生具 有免疫作用的活性肽“，玉米醇溶蛋白可以抑制血管紧张素转化酶，因 此有降压的功能。 动物组织来源( 含水解) 从爬行类动物蛙属活性肽的研究己经扩展到该属的上百种，深入至蛙 的全身各部位，发现了六类活性肽，包括激动肽、缓激肽、阿片肽“。从 非洲巨蛇的毒腺提取了具有刺激收缩肌功能的多肽。”。 从哺乳动物小牛的颌下腺提取类人重组表皮生长因子的生物活性肽， 分子量约6 ，0 0 0 u 1 。 从昆虫类，如蝗虫、嶂螂等的神经组织、心血管组织可以提取到许多 的活性肽。例如从蝗虫中分离的活性肽已经多达近一百种”“。从蜂王浆的 水溶性物质中分离出活性肽，分子量约为2 ，3 0 0 u ，对革兰氏阳性菌有明显 的抑制作用“。 从多种多样的海洋生物，如贝类和海鞘血液中分别提取出了含有3 4 与 2 3 个氨基酸残基的抗菌肽 a g o 从海绵中分离得到具有凝血酶抑制作用的活 性肽。 此外，从人体的大脑皮层、血浆中也都发现了活性肽成分川。 1 2 4 生物活性肽的开发现状 旱在1 0 0 多年前，人们就注意到了肽的吸收及转运。1 9 5 3 年a g o r d 等 观察到肠道能够转运双甘肽“33 。但是对于肽的吸收机制是近二十年来才被 人们发现并被认可，直到自b r a n t l 等人1 9 7 9 年由酪素中第一次分离出吗 啡肽昼一c a s o m o r p h i n 和由可消化酶分解产生食物活性肽，人们对于肽的其 它功用以及提取才迅速发展起来，人们研制开发出了一系列的肽，如生理 活性肽方面有神经肽，激素肽和调节激素的肽，酶调节剂和抑制荆，免疫 活性肽，运输微量元素肽，易消化、易吸收的肽，抗艾滋病和抗癌多肽， 抗菌多肽等：食品感官肽方面有调昧肽，增强风味肽，苦味掩盖肽，抗氧 化肽，表面活性肽，硬度调节肽等“”。 国内对肽的研究还比较少，而且大多数是综述性的文章，对生物活性 肽的提取方面很少，酶法提取就更是少之又少。 龚丽芬等人采用化学合成法制备了牛磺酸一一一种生物活性肽”“ 王利等人研究了大豆肽豆奶酶法生产工艺，工艺过程为精选大豆一清 洗一发芽处理一磨浆一过滤一均质一热处理一冷却一酶解一调制一二次均 质一灭菌一真空脱臭一成品，得出了该工艺可行的结论“”。 谭斌等人研究了从花生中酶法提取花生肽的生产工艺，对酶制剂的筛 选，酶水解的工艺参数等进行了系统的研究”“。 1 2 5 生物活性肽的制备方法 生物活性肽生产方法的途径有三种：一是从植物、动物或微生物中提 取存在于生物体内的各类天然活性肽，即提取法；二是由游离氨基酸经人 工方法化学合成活性肽，即固相、液相合成法；三是利用消化过程中产生 活性肽或体外水解蛋白质产生活性肽，包括微生物发酵法、酶解法、化学 水解法，主要用于生产营养功能的肽制品。 提取法 主要是从富含肽的生物机体内通过不同的工艺将其提取出来，例如胸 腺肽，生产方法是将刚生下来的小牛宰杀之后，割下其胸腺，然后用震荡 分离的生物技术，将小牛胸腺中的肽震荡分离出来，制成胸腺肽针剂，这 种胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽已处于淘汰状态，因现在世界 上流行“疯牛病”，这种病毒主要吞噬动物大脑中的蛋白质，破坏其脑组 织、细胞及神经。人体一旦染上此病毒，比患上癌症还可怕，最终成为“植 物人”而很快死亡。诸如此类的肽，还有从人体血液中提炼出来的肽，其 副作用也很大，它不仅容易使人体染上甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、艾滋病 毒、性病病毒，而且有排异过敏反应，这种反应一旦出现，就很难救活。 当然随着基因工程技术的发展，通过转基因技术对微生物或植物进行基因 改造，特别是以达到特定肽在体内的高效表达，避免其毒副作用产生，然 后进行工业提取，可以极大地提高产量，降低肽的生产成本，将来也不失 是一种非常有前途的肽制备方法。 化学合成法 可根据目标肽的氨基酸序列，用化学合成的方法定向合成某种单肽。 广泛用于生产高价值的短的到中长的药理级肽，如酪啡肽和酪激肽等。属 医药原料中间体，其用途主要用于蘑药配方，以增强药效、提高人体对药 的吸收速度和吸收率。此法可按人们的意愿合成任意活性肽，但大都因成 本高、生产规模小、副反应物多及残留化合物对健康和环境可能有害的问 题而制约着其发展，目前仅仅用于科学研究领域。 化学方法 包括碱水解法和酸水解法，用酸和碱使蛋白中的肽链断裂，水解简单、 成本低，但是其缺点是不能有规则地控制生产，在生产过程中不能按规定 的水解程度进行水解，同时两种方法在生产过程中都使氨基酸受损严重， 而降低其营养价值，因此一般很少采用此方法。 微生物发酵法 此方法的关键是筛选出合适的菌种，菌种本身及其分泌物对人畜安全 无害，并能够在蛋白底物上表达良好，菌种能分泌合适的蛋白酶在体外将 蛋白切成长短合适的肽段。本方法可直接采用蛋白原料( 如豆粕或菜籽粕) 进行生产，其另一优点是产生肽的同时，微生物将原料中的抗营养因子( 如 k t i 和b b i ) 或蛋白抗原成分( 大豆球蛋白和伴大豆球蛋白) 降解，可有效地 消除这两种影响消化和健康的成分0 1 。 酶解法 采用蛋白酶在体外直接进行酶解反应生产肽制品，是常用的制肽方法。 其优点在于，首先其最适条件温度和p h 值比较温和，通过控制酶解时间和 酶与底物的比可以控制酶解度，进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解 过程易控制，因而能较好的满足活性肽生产的需要。其次，随着发酵工业 和基因工程的发展，酶的制取及提纯工艺日渐成熟，酶的产量和活性大幅 提高，使其生产成本也随之急剧的下降，从而使其生产成本低的特点更加 突出。另外，酶解蛋白质生产活性肽安全性极高，而引起人们的极大兴趣。 因而近几年报道的活性肽的制备方法基本皆为酶解法。 1 ，3 研究的目的和意义 猪皮中富含各种蛋白，尤其是胶原蛋白，具有可观的营养价值，是十 分丰富的蛋白资源。但猪皮约占其体重的1 i o 左右，又有特有的异昧、消 化率低、从而影响了它的食用，由此猪皮作为猪肉加工过程中的副产品， 资源丰富，廉价易得。因此，研究从猪皮中提取生物活性肽，具有重大经 济价值和环保意义。 o 第二章生物活性肽的提取机理与工艺研究 2 1 试验的工艺过程和工艺流程图 2 1 1 工艺过程 根据初步的摸索试验和猪皮以及生物活性肽提取利用方面的资料，对 于从鲜猪皮中提取生物活性肽，本试验采取的工艺路线如下。 将市售的鲜猪皮去污物后放入烧杯中，加适量水，加热至1 0 0 。c 后保 持2 m i n 后，再次清洗煮过的猪皮，然后将猪皮浸泡在5 0 6 0 热水中， 拔掉猪毛，用刀刮去表层油脂，将其切成约( 0 2 0 4 ) 2 的方块，然后冷 冻储藏，备用。 称取适量鲜猪皮利用加碱皂化原理加入碱液对猪皮进行脱脂，然后加 入胰酶对其水解，最后经过过滤、脱色、浓缩、干燥等步骤可得到产品， 即水解活性肽。 2 1 2 工艺流程 试验中所设计的工艺流程见图2 1 。 鲜猪皮 一厂磊习一际百i 司 t ，一l 。j l 一区亚习一巨巫卫 一匝固一臣二口 酶解成品 图2 - 1 鲜猪皮酶解工艺流程 f i 9 2 1t h et e c h n i c a lf l o w c h a r to f e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f t h ef r e s hp i g s k i n 器 2 1 3 实验方案 本试验工艺路线中，脱脂、脱色以及酶解部分都受多种因素的影响， 而这些工艺步骤对实验的结果都有很大的影响，但是不可能对几个步骤进 行同时探讨，所以本实验采取了对各个步骤分别试验优化。同时考虑到实 验中酶解的步骤比较重要，故而采取了先对酶解步骤优化，再对脱脂，脱 色进行优化。 2 2 酶解实验的优化 2 2 1 酶制剂的选择 酶是一种具有催化能力的蛋白质。酶制剂工业是知识密集型的高科技 产业，是生物工程的经济实体。据统计，全世界酶制剂市场以年平均1 1 的速度逐年增加，从1 9 9 5 年的1 2 5 亿美元增加到1 9 9 9 年的1 9 2 亿美元， 2 0 0 2 年已达到2 5 亿美元，据预测2 0 0 8 年将增加至3 0 亿美元“。酶的应 用范围很广，现在己从传统的食品和发酵工业扩展到日用化工、纺织、制 革、医药、水产加工、木材加工、造纸和农业等各个部门。 在全世界上百个有名的酶制剂企业中，丹麦的诺维信公司( n o v o z y m e s ) 牢牢把持着龙头地位，占有5 0 以上市场份额，美国杰能科国际有限公司 ( g e n e n c o r ) 次后，占2 5 左右的市场份额。在国内，江苏省的酶制剂生 产企业拥有国内大部分酶制剂的生产能力，其中有著名的国内最大的酶制 剂企业一一无锡酶制剂厂es 3 o 现今我国酶制剂工业已初具规模，但和世界 先进水平相比，无论是在产量、质量、品种还是在工艺水平以及生产设备 等各方面尚存在一定的差距。 2 0 世纪9 0 年代，由于遗传学和化学工程的迅速发展，有力地推动了酶 制荆工业的发展，带来了酶制剂工业生产的两次革命性飞跃，扩大了酶制 剂的使用价值。 酶的选择是酶解法生产活性肽的关键，合适的蛋白酶既可以保证选用 的酶符合食品安全，又可以达到生产合适片段的肽目的。胰酶是从猪、牛、 羊等哺乳动物的胰脏中的酶原，经提取、激活而获得的一种复合酶“。它 至少含有五种蛋白水解酶( 如胰蛋白酶、羧肽酶a 与b 、糜蛋白酶、弹性蛋 自酶和激肽释放酶) 、胰淀粉酶、胰鼯肪酶与核糖核酸藤等“。已有的相 关报道指出胰酶对猪皮的水解效果最好，其水解液颜色较浅，水解速度快， 虽氨基酸浓度和多敲的浓度较高”1 。另外目本学者抒并久雄指出，中性 和碱性蛋白酶几乎没有生成氨基酸的能力，这些内肽型的蛋白酶分解蛋白 质成水溶性蛋自质和极微量的氨基酸，只有氨肽酶和羧肽酶才显示出生成 氨基酸的能力。所以为了得到适宜的多肽，最好的方法就是选用复合蛋白 酶，使之兼有外切肽酶和内切肽酶两种活性。可见酶制剂选择胰酶确实 是上上之选。由于在试验过程中胰酶的用量不大，又考虑到外国的酶制剂 比国内好很多，因而使用了a m r e s c o 的胰酶，a m r e s g o 成立于1 9 7 6 年，是 微生物，生物，箍床医学，生物组织学研究领域的赢晶质生物制裁的生产 商和供应商。 2 2 2 蛋白质酶解机理和研究方法 蛋自魇酶解机理 蛋白质在水溶液中，在酶的作用下，其中的肽键断裂，形成肽链长短 不一的多肢及少量的游离氨基酸，如图2 。2 掰示”“1 ： v口v口7pv矸 一n c c n c c n c c n c c ijljjj h r 1 h r 2 h r 3 h r 4 e n z y m ei ；h 2 0 l 重! 铲 7 + p宫 ￥p n c c n c c o 4h n l c c n c c h r 3 h r 4 + h li h + p k 。n l r口r骨 h n c c n c c l h r 3 h r 4 盈2 - 2 蛋囟痿酶解示意图 o ： r + 工 hf(：)，r 一 h = = i ” n ；h + 工 一o i c 。 hi卜； r 时 z-弋r h n ；h 一 由囤2 2 可以看出，蛋白质在水解过程中，随着其断裂为各种大小不 等的多肽及少量游离氨基酸，溶液中各种多肽和氨基酸的羧基和氨基逐渐 显示出其效应，表现为水解液的p h 值随着水解的进行而下降；同时溶液中 的可溶性蛋白质和多肽的含量随水解进行逐渐增加。各种蛋白质酶解过程 中采用的检测方法也大多是基于蛋白质酶解过程的这两个特点。 描述蛋白质酶解程度的主要参数及检测方法 描述蛋白质酶解过程的参数有d h ( 水解度) 、游离氨基氮、s n t c a 指 数、阿贝折射仪法等。 ( 1 ) d h ( d e g r e eo f h y d r o l y s i s ，水解度) “2 “” a 水解度d h 的定义 蛋白质水解过程中被裂解的肽键数 ( m m o l g 蛋白质“) 与给定蛋白 质的总肽键数( m m o i g 蛋白质一。) 之比，称为水解度： d h ：旦1 0 0 向f o7 显然，水解反应中被裂解的肽键数最能反映蛋白质水解的程度，因而 比其它的蛋白质水解度定义方法( 如s n t c a 指数法) 更准确。 b 表征水解度的方法( p h s t a t 方法) ”“唧 由于蛋白质水解时总是伴随质子的释放与吸收。如果反应时p h 在氨基 和羧基的p k 值范围之外，而反应体系维持p h 恒定，则必须随时加入一定 量的酸或碱。p h 一定时，加碱物质的量与水解肽链物质的量成正比关系， 比例常数即为n h ；的解离常数c l 。记录不同时刻，为维持反应体系p h 恒定 而消耗的碱液的毫升数。消耗的碱的量即可表征蛋白质水解的程度。 ( 2 ) 游离氨基氮”7 ” 蛋白质水解液中游离氨基的量会随着水解的进行而增加，因此水解液 中游离氨基氮的含量也可以表征蛋白质水解的程度，常用的测量方法有三 硝基苯磺酸法( t n b s ) 、甲醛滴定法、茚三酮法等。 a 三硝基苯磺酸( t n b s ) 法 将水解蛋白溶解于含l s d s ( 十二烷基硫酸钠) 的热溶液中，使氨基 浓度达到0 2 5 2 5m m o l l ，将0 2 5m l 样品与2m l0 2 1 2 5m o l l 1 1 4 的磷酸缓冲液及2m l 的0 。1 三硝基苯磺酸( t n b s ) 混合并在5 0 水浴 中放置6 0m i n 。加入4m l0 1m o l l n h 。c 1 使反应中断，然后在3 4 0n m 处比色，以l - l e u 作标准。通过标准曲线将测得的l - l e u 氨基含量转化为 样品的水解当量。 b 甲醛滴定法 利用甲醛与蛋白质水解产物的一一n h ：作用形成羟甲基衍生物，从而固 定氨基，再用碱滴定羧基。根据滴定所消耗的碱液确定水解液中的氨基氮 含量。lm l0 1m o l l “n a o h 相当于1 4m 自氨基氮。 e 茚三酮法 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸作用，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反 应，最后茚三酮与反应产物一氨合茚三酮发生作用，生成紫色物质。蛋 白质、多肽和各种氨基酸都具有茚三酮反应，该反应灵敏度达1 ：15 0 0 0 0 0 ( p h5 7 ) 。 ( 3 ) s n t c a 指数法 s n t c a 指数的定义是：在特定条件下，三氯乙酸( t c a ) 水溶液中可 溶性氮的物质的量的分数。常采用的是l o 的三氯乙酸，s n t c a 指数反 映了水解产物的溶解性能，同时也表明了水解产物物质的量的分布，在一 定程度上也是蛋白质水解程度的一种表征。 s n t c a 指数= 样品中1 0 t c a 可溶性蛋白量样品中蛋白总量。 ( 4 ) 测定溶液折射率法m 。” 口敝水解度) 、游离氨基氮、s n t c a 指数这几种方法是相互关联的口”3 ， 分别从不同的方面表征了蛋白质水解的程度，因此在具体的试验过程中， 这些方法都可以得到应用。但是这些铡定方法都比较麻烦，而且所需试剂 大多都有毒且价钱昂贵，因此我们考虑采用别的简单有效地方法来检测蛋 自质水解的程度。通过查阅文献，知道在一定的温度下纯物质的折射率有 一定的值，而混合物的折射率是随组成而变化的。具体的对于本实验的酶 解水溶液，根据洛仑兹一洛伦茨公式： 加杀。豢 n 为折射率，n 为单位体积分子数，口为分子极化率 望；生n 以 ( 2 )叶1 、f z， 托2 23 对于酶解鲜猪皮溶液，则公式( 2 ) 改写为： 籍2 = 旦3 ； 叶l 、f z o ， n 2 一年一一 若设水的质量是，m 分子量7 m 1 ：胰酶的质量是m 2 分子量为膨2 ； 活性肽的质量依次是m 3 ，m 4 m n ，分子量分别为m 3 ，m 4 m 。 则公式( 3 ) 可变形为： 粤：丝( 堕+ 墼+ 塑”+ 一t u n a n ) ( 4 )_ 一= 一i 一十一+ 一十十。一t ，n ”一2 3 、m i vm 2 vi ym v 一 在公式中，由于水大量存在，故业可视为常量；胰酶的量相对来 m y 说十分少，故= m 2 a 2 可忽略不计；在实验过程中，总体积基本维持不变， m 矿 故i 笋孑，i 叁万了争万为常量，且小于1 ，因而随着m 3 ，m 4 增 埘，y 。膨ym 。矿 。“ 大时，m ，3 a 3 + + 孚璺的值反而减小；当反应进行完全或达到最后 f 。y肘y 的平衡时，罢垒十+ _ m 生a 三的值维持不变。 m ym y 令面m l 。l i = 么，瓦m 3 ，a 3+ m m n 。a 矿, , = k ，则公式( 4 ) 变为： 、m ，y。m ，ym 。矿 粤：丝( 4 + k ) ( 5 )十月+ - lnj n 。一23 、 t , 1 2 ：2 + ! 一 ( 6 ) 塑爿一1 + 塑k 33 由公式( 6 ) 可知，随着k 减小，2 2 增大，即胛增大；当k 不变时，船2 不变，即胛值会维持不变。 根据以上推导可知酶水解过程中，随着水溶性多肽的增加，其折射率 增大 如果反应进行完全或达到最后的平衡，其折射率将固定不变。因而 测得不同时间酶解液的折射率，绘出折射率与时间的线性关系图后，就可 以根据图来判断反应是否进行完全或达到最后的平衡。根据这一结果以及 利用阿贝折射仪测定折射率的方法简单，仪器廉价的特点，我们想到用阿 贝折射仪测定折射率来表征水解程度。 评定蛋白质酶解结果的主要参数及检测方法 可溶性多肽 随着水解的进行，蛋白质的长链逐渐被