（发酵工程专业论文）光滑球拟酵母中atp的生理功能与作用机制.pdf

摘要 摘要 本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母的( t o r u l o p s i sg l a b r a t a ) g 马重维 生素( 硫氨酸、生物素、吡哆醇和烟酸) 营养缺陷型菌株c c t c cm 2 0 2 0 1 9 为研究对象， 以阐明能量代谢对酵母生理过程的影响为目标，在初步了解zg l a b r a t a 中能量代谢途径 的基础上，运用代谢工程和微生物生理学的理论和方法，就a t p 代谢途径如何调控酵母 胞内微环境，并影响细胞生长与产物积累的机制展开研究。主要研究结果如下： ( 1 ) 有机整合融合p c r 、酵母高效电转化、制霉菌素富集和限制性培养基筛选等技术手 段，建立了一种针对酵母的无抗性标记并可重复使用的大片段缺失营养缺陷型菌株 构建方法，并成功构建了尿嘧啶缺陷型( a u r a 3 ) 、精氨酸缺陷型( 幻哪) 和尿嘧啶精氨 酸双缺陷型( a u r a 3 a a r 9 8 ) 等三株zg l a b r a t a 营养缺陷型菌株。在此基础上，验证了含 有2 岫片段的酵母载体在zg l a b r a t a 中的稳定性，并实现了增强型绿色荧光蛋白的 可诱导表达： ( 2 ) a t p 8 、a t p 6 和a t p 9 基因分别编码f o f l a t p 合成酶的三个重要亚基，均位于线粒体 基因组上( m t d n a ) 。以一个线粒体重新编码的a r g 8 肼基因作为筛选标记，利用同源 重组策略敲除a t p 8 、a t p 6 和a t p 9 基因。在这一过程中发现，野生型和转化的m t d n a 能同时存在于转化子中，且随着培养条件的改变，两种m t d n a 所占的比例会发生规 律性变化。作者将这一现象命名为单细胞线粒体基因组多态性( s i n g l ec e l l m i t o c h o n d r i a lg e n o m ep o l y m o r p h i s m ，s c m g p ) 。研究表明，m t d n a 不稳定性、线粒 体融合分裂过程和m t d n a 的选择性丢失是形成s c m g p 现象的主要因素。在理解 s c m g p 现象形成机制的基础上，建立了利用厌氧培养消除s c m g p 现象的策略，获 得了三株仅含有目标m t d n a 的同质体a t p 8 、a t p 6 和a t p 9 缺失菌株，并分别命名 为a t p 8 、a t p 6 和a t p 9 ； ( 3 ) a t p 6 缺失可以导致zg l a b r a t a 在基本培养基和精氨酸补充培养基中培养2 4 代后的 m t d n a 丢失率分别达到4 2 和6 3 。胞内a t p 水平、活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， r o s ) 浓度、线粒体膜间腔( m i t o c h o n d r i a li n t e r m e m b r a n es p a c e ，m i m s ) 的p h 值、 跨膜电势( 肿m ) 及乌头酸酶的表达水平与酶活性均表明，m i m s 中旷的过量积累是 导致a t p 6 缺失突变株m t d n a 不稳定的关键因素。当细胞缺失a t p 6 基因后，发挥 离子通道作用的a 亚基丢失，导致m i m s 中积累的一无法通过f o f l a t p 合成酶得 到释放，导致r o s 水平升高，干扰线粒体基质蛋白的定位，系统性的影响m t d n a 的稳定性。为了提高a t p 6 敲除突变菌株m t d n a 在不同培养条件下的稳定性，将来 源于荚膜组织胞浆菌( h i s t o p l a s m ac a p s u l a m m ) 的交替氧化酶基因彳似，和来源于乳酸 乳球菌( l a c t o b a c i l l u s 肠c t i s ) 的n a d h 氧化酶基因n o x e 表达于a t p 6 缺失突变株中， 显著提高了m t d n a 稳定性，两株菌分别命名为a o x 和n o x ； 摘要 ( 4 ) 以前面得到的一系列a t p 合成酶缺失突变株为对象，研究了胞内a t p 水平变化对细 胞生理过程的影响。a t p 8 、a t p 6 和a t p 9 三个基因的敲除显著降低了a t p 水平，强 烈的抑制了细胞的生长，4 8h 时的菌体干重分别降低了4 6 9 、4 4 2 和5 9 。8 。在 发酵初期，由于f o f l a t p 合成酶活性缺失导致的胞内a t p 水平下降，a t p 8 、a t p 6 、 a t p 9 和n o x 的胞内a t p 水平分别为出发菌株的6 5 5 、6 2 o 、4 8 4 和7 3 0 。 a t p 水平的降低显著解除了a t p 对糖酵解途径关键酶活性的抑制，加速了糖酵解速 率。但随着发酵继续进行至2 8h 后，a t p 合成酶缺失菌株的糖酵解速率显著下降。 研究表明，a t p 合成酶缺失菌株中a t p 水平的显著下降和r o s 水平的显著提高，导 致细胞抵御酸胁迫和渗透压胁迫的能力显著下降。在胞质中表达n a d h 氧化酶基因 n o x e 可以促进n a d h 代谢，降低胞内r o s 水平，改善胞内微环境，从而促进细胞 生长和丙酮酸的积累。代谢网络通量、中心代谢途径关键酶表达水平和酶活性分析 表明，f o f 】a t p 合成酶缺失对胞质中的糖酵解途径具有显著影响，而对位于线粒体 基质中的三羧酸循环影响较小，表明线粒体的亚细胞区隔可以有效保护其中进行的 物质合成和产能代谢途径； ( 5 ) 真核微生物细胞依靠一系列a t p 酶，利用水解a t p 产生的能量，进行一和其它离 子的转运，以维持各亚细胞区隔间的p h 梯度。当胞外p h 较低时，细胞需要消耗更 多的a t p 维持更高的p h 梯度。为了研究胞内a t p 水平在细胞应对胁迫过程中的作 用，通过在培养基中添加柠檬酸盐促进a t p 供给，研究低p h 条件下zg l a b r a t a 的 细胞生长和丙酮酸生产。结果表明，a t p 供给的增强显著促进了依赖于a t p 的胞内 p h 平衡过程，使培养基、胞质和液泡之间的p h 梯度得到显著提高。p h 梯度与胞内 a t p 浓度之间的量化关系表明胞内a t p 浓度的上升可以显著的促进相关的p h 平衡 过程。此外，zg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 0 1 9 的p h 平衡能力显著弱于其它常见的酵母 菌株，可能也是其可以快速积累丙酮酸的一个重要原因。 关键词：光滑球拟酵母，有机酸，线粒体，f o f l a t p 合成酶，电子传递链，能量代谢， 胞内微环境。 l i a b s t r a c t ， a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，am u l t i - v i t a m i na u x o t r o p h ( i e ，t h i a m i n e ，b i o t i n ，p y r o d o x i na n dn i c o t i n i c a c i d ) t o r u l o p s i sg l a b r a t as t r a i n c c t c cm 2 0 2 0 19w a su s e da sam o d e lt od e m o n s t r a t et h e e f f e c to ft h ee n e r g ym e t a b o l i s mo nt h ep h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si ne u k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m s b a s e do nt h ew e l lu n d e r s t a n d i n go ft h ee n e r g ym e t a b o l i s m t h em e c h a n i s m si nt h er o l eo fa t p m e t a b o l i s mi nt h ei n t r a c e l l u l a rm i c r o e n v i r o n m e n ta n dr e l a t e dp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e sw e r e i n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) ar e u s a b l em e t h o d ，w h i c hs y s t e m a t i c a l l yi n t e g r a t e dt h ef u s i o np c r , h i g h e f f i c i e n c y e l e c t r o p o r a t i o nt r a n s f o r m a t i o n ，n y s t a t i ne n r i c h m e n ta n dl i m i t e dm e d i as c r e e n i n g ，f o r c o n s t r u c t i o no fn o n - m a r k e rl a r g ef r a g m e n td e l e t i o nt o r u l o p s i sg l a b r a t aa u x o t r o p hs t r a i n s w a se s t a b l i s h e d b yu s i n gt h em e t h o d ，t h r e e7 7 g l a b r a t aa u x o t r o p hs t r a i n sw e r eo b t a i n e d ，f e ，au r a c i la u x o t r o p hs t r a i n ( a u r a 3 ) ，a na r g i n i n ea u x o t r o p hs t r a i n ( 血z 馏da n dau r a c i l a r g i n i n ed o u b l ea u x t r o p hs t r a i n ( a u r a 3 a a r 9 8 ) t h es t a b i l i t yo f2 9 mb e a r i n gv e c t o r sw a s a s s a y e di nt h ezg l a b r a t aa u r a 3s t r a i n t h er e s u l tp r o v e dt h a tt h e2 9 i nb e a r i n gv e c t o rw a s h i g h l ys t a b l ea n dc o u l de x p r e s st a r g e tg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ni nzg l a b r a t aa u r a 3 s t r a i n ( 2 ) 彳即8 ，4 z p 6a n da t p 9a r et h r e eg e n e st h a te n c o d et h r e ek e ys u b u n i t so ff o f r a t p a s e ， w h i c ha r ee s s e n t i a if o rt h er e s p i r a t i o n ，a n d1 0 c a t eo nt h em i t o c h o n d r i a lg e n o m e ( m t d n a ) t ok n o c k o u to ft h et h r e eg e n e s ，ah o m o l o g o u sk n o c k o u tb o xw i t har e c o d e da r g 8g e n e a r g 8 埘w e r et r a n s f o r m e di n t ot h etg l a b r a t aa u r a 3 a a r 9 8 s t r a i n b y b i o l i s t i c t r a n s f o r m a t i o n t h em t d n at r a n s f o r m a n t sw e r ep r i m a r i l ys c r e e n e db yt h eb a c k - m u t a t i o n o fa r g i n i n ea u x o t r o p h h o w e v e r ，i tw a sf o u n do u tt h a tb o t ht h ew i l d t y p em t d n aa n d t r a n s f o r m e dm t d n ac o e x i s t e di nt h et r a n s f o r m a n tc e l l sa n dt h er a t i oo ft h et w ok i n d so f m t d n av a r i e du n d e rd i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n sa n dg r o w t hp e r i o d s t h ep h e n o m e n o n w a sd e s i g n a t e da ss i n g l ec e l lm i t o c h o n d r i a lg e n o m ep o l y m o r p h i s m ( s c m g p l i tw a s f o u n dt h a tt h ei n s t a b i l i t yo fm t d n a m i t o c h o n d d a if u s i o n f i s s i o na n ds e l e c t i v el o s so f m t d n ap l a y e dc r u c i a lr o l e si nt h es c m g et h r e em t d n ah o m o p l a s m i cc e l l sw i t h o u t a 1 p 8 蛆p 6a n da t p 9w e r eo b t a i n e db a s e do nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h es c m 娅a n d n a m e d a t p 8 a t p 6a n da t p 9 r e s p e c t i v e l y ( 3 ) d e f i c i e n c yi na 7 p 6c o u l di n c r e a s et h el o s sr a t i oo fm t d n at o4 2 a n d6 3 o nm i n i m u l t i m e d i u ma n da r g i n es u p p l e m e n tm e d i u ma f t e r2 4g e n e r a t i o n s ，r e s p e c t i v e l y t h r o u g ht h e a s s a y o fi n t r a c e l l u l a ra t pl e v e l ，p r o d u c t i o no fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ， i n t r a c e l l u l a ra t pl e v e l ，t h ep hi nm i t o c h o n c h o n d r i a li n t e r m e m b r a n es p a c e ( m i m s la n d t h et r a n s c r i p t i o n a la n de n z y m ea c t i v i t ya s s a yo fa c o n i t a s e ，i tw a sf o u n do u tt h a tt h ew a c c u m u l a t i o ni nm i m sw a st h ed o m i n a n tf a c t o rf o rt h em t d n ai n s t a b i l i t yo ftg l a b r a t a c e l l sd e f i c i e n ti na t p 6 i nn o r m a lc e l l s t h ewa c c u m u l a t i o ni nm i m sc o u l db er e l e a s e d b yt h ef o f l 一a t p a s ea c c o m p a n i e dw i t ht h ea t ps y n t h e s i s h o w e v e r ，i nc e l l sd e f i c i e n ti n i i i a b s t r a c t 么即6 w h i c he n c o d e st h ei o nc h a n n e ls u b 山ta t h ei q + c o u l dn o tb er e l e a s e dt h r o u g ht h e f o f l 一a t p a s e t h ea c c u m u l a t i o no f ri nm i m sf u r t h e ri m p r o v e dt h e q a n dr o s ， i n t e r r u p t e dt h e t r a n s l o c a t i o no fm i t o c h o n d r i a lm a t r i xl o c a t e d p r o t e i n s a n dt h u s s y s t e m a t i c a l l yc a u s e dt h em t d n ai n s t a b i l i t yi nzg l a b r a t ac e l l sd e f i c i e n ti na t p 6 t h e e x p r e s s i o no ft w on 氏d 飞 o x i d a t i o na s s o c i a t e dg e n e s ao x lf r o mh i s t o p l a s m a c a p s u l a t u ma n dn o x ef r o ml a c t o b a c i l l u sl a c t i s c o u l ds i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h es t a b i l i t y o fm t d n ai na t p 6 t 1 1 er e s u l tf u r t h e rp r o v e dt h a tt h ec o n c l u s i o n t 1 1 et w os t r a i n sw e r e n a m e sa sa o xa n dn o x ，r e s p e c t i v e l y ( 4 ) t h ee f f e c t so fa t pm e t a b o l i s mo nt h ec e n t r a lc a r b o nm e t a b o l i s mw e r es y s t e m a t i c a l l y i n v e s t i g a t e du s i n g s t r a i n sa t p 8 a t p 6 a t p 9a n dn o x t h ed e f i c i e n c yi nt h e f o f l 一a t p a s es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h ei n t r a c e l l u l a rl e v e l i n h i b i t e dt h ec e l lg r o w t ha n d r e l e a s e dt h ei n h i b i t o r ye 髓c to fa t pd u r i n gt h ei n i t i a l2 8h h o w e v e r , t h er e l a s e d i n h i b i t o r ye f f e c to fa t pw a sm o s t l yc o m p s e n s a t e db yd e c r e a s e da b i l i t yt od e a lw i t ht h e t o l e r a n c et oa c i d i cs t r e s sa n do s m o t i cs t r e s s t h ed e f i c i e n c yo ff o f i 蹑p a s er e s u l t e di n i n c r e a s e di n t r a c e l l u l a rr o sl e v e l t h eo v e r e x p r e s s i o no fn o x ec o u l dr e c o v e rt h e i n t r a c e l l u l a rr o sl e v e lc a u s e db yt h ea t p 6d e f i c i e n c ya n di m p r o v e dt h ei n t r a c e l l u l a r m i c r o e n v i r o n m e n t t h u se n h a n c e dt h ec e l lg r o w t ha n dp y r i 】v a t ea c c u m u l a t i o n t h e m e t a b o l i cn e t w o r k sa n a l y s i s ，t r a n s c r i p t i o n a la n de n z y m ea c t i v i t i e sa n a l y s i so fc e n t r a l m e t a b o l i s m k e ye n z y m e s r e v e a l e dt h a tt h ed e t e r i o r a t i o no fi n t r a c e l l u l a r m i c r o e n v k o n m e n tc a u s e db yt h ed e f i c i e n c yi nf o f l 虹p a s ea f f e c t e dt h ec e n t r a lc a r b o n m e t a b o l i s mo nd i f f e r e n tl e v e l st h u sp r o h i b i t e dt h ef u r t h e ri n c r e a s eo fp y r u v a t ep r o d u c t i o n t h ep h e n o m e n o na l s os u g g e s t e dt h ei m p o r t a n c eo fs u b c e l l u l a rc o m p a r t m e n t a t i o ni nt h e p r o t e c t i o no fb i o m a s ss y n t h e s i sa n de n e r g ym e t a b o l i s mi nt h em i t o c h o n d f i a lm a t r i x ( 5 ) i ne u k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m s ，t h ep hi nd i f f e r e n ts u b c e l l u l a rc o m p a r t m e n t a t i o n si sk e p ti n as u i t a b l er a n g et h u st h ee n z y m e si nt h e s ec o m p a r t m e n t a t i o n sc o u l dp l a yt h e i rn o r m a l f u n c t i o n s e u k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m sr e a l i z e dt h ep hh o m e o s t a s i si nd i f f e r e n tc e l l c o m p a r t m e n t a t i o nt h r o u g has e r i e so fa t p a s e ，w h i c hc o n s u m e da d d i t i o n a la t p b e s i d e st h e n o r m a lc e l lg r o w t h t od e t e r m i n et h ee f f e c to fa r pi nt h et o l e r a n c et o1 0 w e rp h t h e i n t r a c e l l u l a rm i c r o e n v i r o n m e n tu n d e re n h a n c e da t ps u p p l yc o n d i t i o n sw a si n v e s t i g a t e d b yt h ec i t r a t ea d d i t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ee n h a n c e dt h ea t ps u p p l yc o u l d f a c i l i t a t et h ea t p - d e p e n d e n th + - t r a n s p o r t a t i o np r o c e s s e s ，t h u sk e p th i g h e rp hg r a d i e n t s a m o n ge x t r a c e l l u l a re n v i r o n m e n t ，c y t o p l a s ma n dv a c u o l e t h eq u a n t i t a t i v er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ei n t r a c e l l u l a r pc o n t e n ta n dt h ep hg r a d i e n t ss h o w e dt h a tt h ei n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a ra t pl e v e lc o u l ds i g n i f i c a n t l yp r o m o t e dt h ep hh o m e o s t a s i sp r o c e s s e s c o m p a r e dw i t ht h ep hh o m e o s t a s i sp r o c e s si ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，i tw a sf o u n do u t t h a tt h el o w e rp hh o m e o s t a s i sa b i l i t yi ntg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 019s h o u l db ea p o s i t i v ef a c t o rf o rt h ep y r u v a t ea c c u m u l a t i o n k e y w o r d s ：t o r u l o p s i sg l a b r a t a ，o r g a n i ca c i d s ，m i t o c h o n d r i a , f o f l - a t ps y n t h a s e ，e n e r g y m e t a b o l i s m ，i n t r a c e l l u l a rm i c r o e n v i r o n m e n t i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：图数日期：抛丕f 2 z 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：压1 景曼 导师签名： 日 期： 塑12 ：兰兰 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 在人类历史上，人们早就开始有意识地利用微生物生产种类繁多的生活资料。随着 微生物学和生化工程技术的发展，人们已经可以有目的的筛选并改造微生物，用以生产 更为丰富多样的生产和生活用品，如各种有机酸、抗生素、维生素、有机溶剂、蛋白质 和生物燃料。经过几个世纪的工业大生产，人类社会赖以生存的化石资源即将枯竭，直 接威胁到人类社会的可持续发展。发展生物产业，逐步替代基于化石资源的化工产业， 是全世界各国的战略目标和人类可持续发展的重要基础【l j 。大力发展工业微生物技术， 提高工业微生物技术的创新能力，是保持国家竞争力和维持国民经济持续稳定增长的重 要保证。 随着工业生物技术的不断发展，人们已经可以用更低的成本得到种类更多、质量更 好和价格更低的各种生物基制品( b i o b a s e d p r o d u c t s ) 。然而，目前绝大多数大宗生物基产 品的成本仍要高于基于化石资源的传统化工产品【2 】。因此，基于生物炼制的工业过程最 重要的瓶颈在于其经济性。在利用微生物过量合成生物基化学品的过程中，需要考虑的 首要问题是：如何优化微生物的代谢网络，以提高目标代谢产物的产量和积累速度，甚 至合成新的代谢物，实现目标产物高产量、高产率和高生产强度的统一，有效控制产品 的最终成本【3 】。在过去的几十年间，人们运用传统诱变和生化工程手段改造从自然界中 筛选得到的微生物，优化其代谢特性以发挥其最佳生产性能，在工业生物技术领域取得 了很多重大突破，极大的推动了生物技术在食品、医药和农业等相关领域的应用。但是， 经过多年的发展，传统优化手段的发挥空间已经非常有限 4 1 。随着人们对生物化学和微 生物生理过程认识的加深，以及基因操作手段的日渐成熟，更多的研究人员开始从代谢 工程的角度对微生物进行更为理性的改造。 基因工程技术的进步为菌株改良和生理学特性的认识提供了比传统诱变技术更为 有效的手段。1 9 9 1 年，b a i l e y 系统的总结了利用基因工程改造代谢网络的成果并将这一 门新的学科称为代谢工程【4 1 。代谢工程的主要手段包括：( 1 ) 强化目标代谢产物的生物 合成途径；( 2 ) 解除生物合成途径的代谢调节；( 3 ) 阻断目标代谢产物的降解途径。这 些手段在提高目标代谢产物的产量、产率和生产强度方面己被证实是非常有效的【5 】。在 代谢工程发展初期，研究人员主要针对中心代谢途径和目标产物直接相关的代谢途径进 行调控。在这一过程中，研究人员很快发现，对目标代谢产物合成途径中的某个或多个 基因进行过量表达或敲除，并不一定能实现预想的代谢工程目标【6 】。最为常见的例子是 糖酵解途径，提高糖酵解速率是所有以糖质原料为底物的工业发酵过程共同关心的问 题，但单独或者共同过量表达糖酵解途径的限速酶的基因，并不能显著提高酵解速度【7 】。 随着代谢工程和微生物生理学的深入发展，人们越来越意识到对中心代谢途径和目 标产物直接相关的代谢途径所进行的代谢工程改造，对于优化微生物的生产性能来说， 本章部分内容发表子b i o t e c h n o l o g y a d v a n c e s ，2 0 0 9 ，2 7 ( 1 ) ：9 4 一1 0 1 1 江南大学博士学位论文 是远远不够的。除了采用代谢工程重构代谢网络，还应当在对微生物代谢网络结构进行 准确分析的基础上，重视细胞表达调控网络，以及代谢网络和分泌途径所在的亚细胞区 隔内微观环境的研究。即不仅要定向改变代谢流的方向并使通量最大化，还要理性的优 化代谢流分支所在的微观环境，如亚细胞结构的完整性、细胞各区间的各种辅因子水平 ( 女n a t p 、n a d h 和各种金属离子等) 【8 】、p h 值【9 1 、渗透压【1 0 】、活性氧( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 1 l 】等。调节微生物细胞内的微观环境，使胞内的各种生化反应能在最适 的状态下向着更有利于产物快速积累的方向进行，是对中心代谢途径进行代谢工程操作 之外，改变和优化微生物功能过程中所需要考虑的最为关键的因素。 微生物细胞内各区间的区隔和各区间内的微观环境( 以下简称为胞内微环境) 涉及到 比中心碳代谢途径更为复杂的调控过程。在过去的很长一段时间里，对于从事基础理论 的研究人员和以工业生物技术为导向的应用型研究人员来说，前者更注重生理过程本 身，用最先进的手段来探索微生物内部的代谢途径、信号通路或者与某一特殊的生理现 象相关的机理，揭示微生物生理过程的细节问题；后者则更多的利用成熟的生物化学或 微生物生理学知识，应用代谢工程或过程工程的手段，使微生物具有更好的生产性能。 这种分隔导致代谢工程所涉及到的基础理论知识，往往远远落后于基础理论研究；而基 础理论研究也几乎不会考虑工业微生物过程中的实际需求。一个典型的例子就是酵母细 胞对于胞内p h 值的调控与酸胁迫耐受之间的关系。在工业生物技术领域，大部分改善微 生物对酸胁迫耐受性的工作主要集中在随机诱变和基因组重排【1 2 ，1 3 j ，而很少考虑酸胁迫 耐受机制。实际上，酸胁迫的耐受机制在微生物生理学领域获得了广泛的研究，在各种 胁迫响应机制中研究的最为透彻【1 4 】。对于真核微生物来说，主要的机制是转运矿进入培 养基和液泡，控制胞内的p h 水平处于一个适宜的范围内，而这一过程需要消耗大量的 a t p 1 4 】。因此，增力h a t p 的供应可以增强细胞维持p h 梯度的能力，来应对酸胁迫的环境 1 5 1 o 基于这种现状，对于微生物胞内微环境的研究，可以有效整合理论研究的成果和应 用研究的需要，极大促进工业生物技术的发展，为最终解决生物能源和材料的生物制造 提供技术支持。这对促进我国经济可持续发展、解决能源短缺问题和增强国际竞争力， 具有重要的战略意义。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 胞内微环境对微生物细胞生长和产物积累的重要作用 微生物以碳水化合物为原料生产发酵产品的过程中，普遍关心的问题是如何尽可能 的提高碳源利用速度，以达到提高目标产物生产效率的目的。为了提高微生物利用糖质 原料生产发酵产品的生产效率，需要加强微生物胞内指向目标代谢产物的代谢网络和分 泌途径，使底物以更高的效率转化为目标代谢产物。要实现这一目标，除了对于主干代 谢途径的改造之外，还要尽可能的考虑胞内微环境对于所在区间的代谢网络和分泌途径 的影响。本论文的主要研究目标，在于阐明a t p 供给变化对光滑球拟酵母( t o r u l o p s i s 2 第一章绪论 g l a b r a t a ) 胞内生理状态的影响，为基于a t p 的发酵过程优化和代谢工程改造提供更为完 备的理论支持。 ( 1 ) 胞内微环境的定义和内涵 广义的胞内微环境包括细胞内所有的物质组成和亚细胞结构的静态和动态信息( 图 1 1 ) 。对于真核微生物来说，胞内微环境主要包括：( 1 ) 真核细胞内部亚细胞结构的完 整性，如线粒体、液泡等的结构和功能完整性。与原核微生物不同，真核微生物细胞中 的细胞区隔可以使各种反应和产物分泌同时在不同的最适反应条件下进行 9 1 ；( 2 ) 胞内 各种辅因子的水平和存在形式，如a t p a d p 1 6 】、n a d ( p ) h n a d ( p ) 【引、乙酰c o a c o a 【1 7 】 等。辅因子由碳中心代谢途径进行再生，但与普通的代谢中间产物不同，它们被很多代 谢途径共享，并存在一定的竞争，是胞内微环境的重要组成部分；( 3 ) 胞内各区间的各 种基团和离子浓度，如胞内旷、n a + 、k + 、0 2 一和o h 等的浓度。特定的基团或离子浓 度可以表征为一些宏观特征，如p h 值( h + ) 【9 】、r o s ( 如0 2 一和o h ) u8 】及氧化还原电位 ( e - ) 【1 9 】等；( 4 ) 其它中间代谢产物或从外界吸收的化学物质。某些代谢产物除了正常的 代谢功能以外，还具有其它功能，如维持胞内的渗透压和消除r o s 【2 0 】等。在酵母中， 这一类物质通常包括甘油【2 、海藻糖和脯氨酸【2 2 】等。 图1 - 1 酵母的胞内微环境 f i g 1 - 1t h ei n t r a c e l l u l a rm i c r o - e n v i r o n m e n to f y e a s t ( 2 ) a t p 供给对胞内微环境的调控 胞内微环境受到一系列因素的影响，主要包括：( 1 ) 微生物细胞自身基因型所决定 的代谢网络和信号转导途径；( 2 ) 微生物细胞所处的胞外环境；( 3 ) 不同的细胞生长阶 段。微生物自身所固有的代谢网络，决定了细胞面对不同的外界环境时胞内微环境的响 应机制。胞内微环境的维持，直接影响微环境中的代谢网络、信号转导和物质转运，对 于细胞生长及目标产物积累都具有重要意义。细胞内部亚细胞结构的完整性是细胞生长 和特定产物积累的基础，也是维持胞内微环境的必要因素。亚细胞结构的破坏，会强烈 抑制细胞生长和目标产物积累，甚至引发细胞程序性死亡，更无法高效积累目标产物【2 3 】。 江南大学博士学位论文 因此，有目的的基因改造或改变胞外环境，可以有效调控胞内微环境，使微生物细胞的 代谢网络在更适合于目标产物的合成与积累的环境中进行【l4 1 。 在影响胞内微环境的诸多因素中，a t p 供给是最为重要的一个【2 4 】。充足的a t p 供 给是细胞生长和目标产物合成的前提条件。只有在a t p 供给充足的情况下，微生物细胞 才能合成细胞膜和膜上的转运蛋白，实现维持胞内微环境最基本的亚细胞区间的区隔， 从而维持各区间内的微环境【1 4 】。在此基础上，一系列依赖于a t p 的转运蛋白对各种离 子进行选择性转运，从而维持胞内微环境。在这一过程中，这些转运蛋白需要大量的 a t p 1 4 】。此外，a t p 还是很多依赖于a t p 的信号转导途径的重要信号和能量来源，通 过一系列信号转导途径对胞内微环境进行全局性的调控瞄】。 ( 3 ) 胞内微环境的研究手段 胞内微环境是一个动态的平衡过程，受代谢网络、底物供给、能量供给、膜脂肪酸 组成、转运蛋白等诸多因素的影响。现在普遍采用的代谢组学手段，多以经过破碎的细 胞来进行研究f 2 6 1 。在这一过程中，胞内微环境被破坏殆尽，更多的是关于细胞物质组成 的整体信息，而非胞内的真实情况，需要根据实验数据间接判断。而在真核微生物中， 胞内各区间的代谢物具有显著差异。理论上，需要将各亚细胞结构进行无损分离后，再 进行代谢组学分析，才能最为准确的反应胞内的真实情况。而在代谢组学研究中，如何 将细胞整体取样过程中的干扰最小化还一直是一个难题【2 6 j 。 在微生物生理学研究中，光学显微技术、荧光染料和荧光蛋白技术的不断成熟，为 研究胞内微环境的提供了强有力的工具。荧光染料经过多年的发展，目前已经可以对各 细胞器进行定位，并具有p h 敏感( 如b c e c f a m ，c f d a s e 等) 、r o s 敏感( 如d h c f a m 等) 、线粒体跨膜电势敏感( 如r o d a m i n e1 2 3 等) 等功能【2 7 2 8 1 。利用荧光素酶和荧光素系 统可以对胞内a t p 水平进行实时定量检测【2 9 】。荧光蛋白技术的发展，开拓了活体实时 检测胞内微环境的研究领域。o s a m us h i m o m u r a 、m a r t i nc h a l f i e 和r o g e ryt s i e n 等正 是由于发展了荧光蛋白的用途，广泛而