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论文题目：积雪草总苷转化菌株的筛选及转化产物的分离纯化与鉴定 学科专业：微生物学 学位申请人：杜鹏 指导教师姓名：茅仁刚 摘要 积雪草中的三萜皂苷具有重要的药用价值，然而由于糖苷类药物极性大，在 消化道中的吸收差、生物利用度低，利用微生物酶水解糖苷键降低极性有利于提 高苷类药物的生物利用度。本文对积雪草中的三萜皂苷的微生物转化进行了系统 研究。 通过采集不同环境的土壤样本，分离纯化得到了3 6 1 株微生物，利用七叶灵 显色技术初筛得到1 2 株产b 一葡萄糖苷酶能力较高的菌株，根据微生物液体发酵 过程中对底物积雪草总苷的转化能力从中复筛出了l 株能充分转化积雪草总苷 的微生物菌株j - 9 。通过对菌株j - 9 的形态和培养特征观察，结合分子生物学方 法进行1 8 sr d n a 和i t s 序列的测定及同源性分析，通过b l a s t 比对以及系统发 育分析，确定了其种属分类地位。菌种鉴定结果为：菌株j 一9 属于半知菌纲 ( d e u t e r o m y c e s ) 、丝孢菌目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) 、 青霉属( p e n i c i l l i u m ) 。 运用薄层层析法鉴别积雪草总苷及其转化产物，通过对不同配比展开剂的优 化比较，确定了最佳薄层层析展开剂，即氯仿：甲醇：水= 1 0 ：3 ：0 2 ；利用硅胶柱 层析法分离纯化得到了2 个高纯度转化产物a 、b 。通过测定熔点( m p ) 、比旋度 ( q 。) 以及高分辨质谱( h r m s ) 、红外光谱( i r ) 、核磁共振碳谱( 1 3 c - i 、u d r ) 、 氢谱( 1 h - n m r ) 分析，鉴定转化产物a ob 的化学结构分别为积雪草单葡萄糖昔和羟 基积雪草单葡萄糖苷。其中羟基积雪草单葡萄糖苷的结构为2 口，3 夕，6 夕，2 3 口一四羟基乌苏- 1 2 - 烯- 2 8 - 酸一2 8 一o - 夕移吡喃葡萄糖酯，未见文献报道。 建立了同时测定积雪草总苷转化产物积雪草单葡萄糖苷和羟基积雪草单葡 萄糖苷的h p l c 检测条件，色谱柱：p h e n o m e xl u n ac , 8 柱( 2 5 0 m m x4 6 m m ，5 | im ) ； 流动相：甲醇( a ) ：水( b ) = 5 5 ：4 5 ；柱温：3 0 ；检测波长：2 0 5 n m ；流速：0 8 m l m i n ； 进样量2 0p1 。其中，积雪草单葡萄糖苷和羟基积雪草单葡萄糖苷的进样量与峰 摘要上海师范大学硕士学位论文 面积呈良好线性关系，线性范围分别为2 0 5 - , - 1 0 2 6ug 和2 5 4 , - - , 1 2 6 8l ig ， i = o 9 9 9 9 和0 9 9 9 8 。平均加样回收率分别为1 0 1 1 和1 0 1 0 9 6 ( n = 6 ) ，r s d 分 别为1 3 和o 9 。本方法操作简便易行，重复性好，灵敏度高，为积雪草总苷 的转化产物的定量分析提供了快速、准确的测定方法。 关键词：积雪草，积雪草苷，菌种筛选，分离纯化，鉴定，微生物转化 论文类型：b 应用基础 垒! 壁竺 一一一 上海师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t r i t e r p e n o i ds a p o n i n sf r o mc e n t e l l aa s i a t i c ar e v e a l e di m p o r t a n tm e d i c i n a l v a l u e s h o w e v e r , t h e ya r ed i f f i c u l tt ob ea b s o r b e da n dt h e i rb i o a v a i l a b i l i t yi sl o w e ra s o t h e rp o l a rs a p o n i n s b u te n z y m a t i c h y d r o l y s a t eo fg l y c o s i d e sc a l l i m p r o v et h e i r b i o a v a i l a b i l i t y t h i sp a p e rs t u d i e dt h em i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o no ft r i t e r p e r i o i d s a p o n i n sf r o mc e n t e l l aa s i a t i c a t h e r ea l e3 61m i c r o b i a ls t r a i n ss e l e c t e df r o mt h es o i ls a m p l e si nd i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s a n d12m i c r o b i a ls t r a i n so fh i g h - y i e l di b - g l u c o s i d a s ew e r es e l e c t e db y s c r e e n i n gt e s tw i t he s c u l i n t h eb e s tm i c r o b i a ls t r a i nj - 9w a ss e l e c t e db yr e s c r e e n i n g t e s tw i t hc e n t e l l as e l e c t e dt r i t e r p e n e s ，a n di tw a si d e n t i f i e da sp e n c u mb y m o r p h o l o g y , p h y s i o l o g y ，b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y t h em e t h o d so ft l ca n dh p l cw e r ed i s c u s s e df o rg e t t i n gam o r ea c c u r a t e q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sr e s u l t f i n a l l y ，t h eb e s td e v e l o p i n gs o l v e n to f t l ci sc h l o r o f o r m - m e t h a n o l w a t e r ( 1 0 ：3 ：o 2 ) t w oa i ms a m p l e so fh i g h e rp u r i t y w e r ea l s o i s o l a t e da n dp u r i f i e d u s i n g t h em e t h o d so fs i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y t w op r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e d a s 2 a ，3 p ，2 3 a - t r i h y d r o x y - u r f i 12 一e n e - 2 8 - o i c a c i d - 2 8 一o - b - d - g l u c o p r a n o s i d e( a ) a n d 2 0 【，3 p ，6 p ，2 3 a - t e t r a h y d r o x y - u r s - 1 2 - e n e - 2 8 - o i ca c i d 2 8 - o p - d - g l u c o p r a n o s i d e ( b ) b y m e l t i n gp o i n t ，o p t i c a lr o t a t i o n , h i 曲- re s o l u t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ，i r , 1 3 c n m r , 1 h n m r t h ec o m p o u n dbh a sn o tb e e nr e p o r t e dy e ta n di ti san e w c o m p o u n d a nh p l cm e t h o df o rt h ea s s a yo ft h ec o n t e n to f t r a n s f o r m a t i o np r o d u c ta a n dbi n t h eb i o c o n v e r s i o np r o d u c t so ft h ec e n t e l l as e l e c t e dt r i t e r p e n e sw a s d e v e l o p e d p h e n o m e xl u n ac l s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m , 5 i t m ) c o l m n nw a su s e da st h es t a t i o n r yp h a s e t h em o b i l ep h a s ec o n t a i n e dm e t h a n o l - w a t e r ( 5 5 ：4 5 ) t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a s 3 0 c t h eu vd e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 0 5 n m t h ef l o wr a t ew a s0 8 m l m i n i n j e c t v o l u m e2 0m t h eh p l cm e t h o ds h o w e dag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pi nt h er a n g eo f t r a n s f o r m a t i o np r o d u c taa n dbw e r e2 0 5 1 0 2 6 t g ( r - - - 0 9 9 9 9 ) a n d2 5 4 1 2 6 8 1 x g ( r = 0 9 9 9 8 ) t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r e1 0 1 1 w i t hr s d1 3 ( i f 6 ) a n d i i i 上海师范大学硕士学位论文 1 0 1 o 埘mr s d0 9 ( n = 6 ) t h em e t h o di ss i m p l e ，r a p i d ，a c c u r a t ea n di ss u i t a b l e f o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft h et r a n s f o r m a t i o np r o d u c taa n db k e yw o r d s ：b i o c o n v e r s i o n b i o t r a n s f o r m a t i o n ，c e n t e l l aa s m t i c a ，a s i a t i c o s i d e s ， s t r a i ni s o l a t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n i v 上海师范大学硕士学位论文 论文独创性声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：衣羽勺日期：功，驴s i d 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：禾却岣导师签名：芳在，钊日期：勿加j 谚 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 第_ 章绪论 1 1 微生物转化的研究概况 生物转化( b i o c o n v e r s i o n ，b i o t r a n s f o r m a t i o n ) ，亦称生物催化 ( b i o c a t a l y s i s ) ，是指利用离体培养的植物细胞或器官、动物、微生物及其细胞 器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，本质是利用 生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。 巴斯德在1 8 6 4 年发现乙酸杆菌能将乙醇氧化为乙酸，通过微生物方法合成化 学物质的方法才逐渐为人类开始了解和掌握。5 0 年代p e t e r s o n 和m u r r a y 应用了黑 根霉( r h i z o p u sn i g r i c s n s ) 一步将_ 个羟基导入孕酮11 位上，从孕酮合成皮质酮 仅需三步，且回收率高达9 0 以上，才使得可的松问世，使本来在体内存在的微 量的各类甾体激素作为临床药物治疗疾病成为现实。这种利用微生物作用来进行 某种化学反应称为微生物转化反应( m i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o n 或m i c r o b i a l b i o c o n v e r s i o n ) 。其本质是一种物质( 底物) 经某种微生物转化生成为另一种物质 ( 产物) 的过程，由某种微生物生长代谢中产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶 作为生物催化剂而进行催化的一种或几种化学反应，简而言之，就是利用微生物 酶或微生物其本身起作用的一种生物应用技术。 微生物转化技术以微生物分离酶或微生物整体细胞做为反应催化剂，因其反 应专一性强、周期短、公害少、成本较低、条件易控、易于放大，且能完成一些 化学合成难以进行的反应等优点而受到青睐，成为生物转化技术中发展最迅速的 分支之一。其主要涉及环氧化、羟基化、氢化、脱氢、氧化还原反应、水解、水 合、脱水、胺化、酯化、酯基转移、异构化和芳构化等各类化学反应，广泛应用 于各类重要药物如氨基酸、抗生素、维生素、芳基丙酸、甾体激素和前列腺素等 的合成。而且由于微生物具有种类繁多，繁殖快等特点，所以微生物转化常被用 来对天然产物的结构进行修饰，从而获得一些结构更合理或活性更好的先导化合 物。 微生物转化中草药的研究开始于上世纪8 0 年代，经过科研工作者多年的研 究，特别是在真菌培养、次级代谢物的修饰改造、中药炮制等方面已经取得了可 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 喜的成绩。微生物具有强大的分解转化物质的能力，而且能够产生丰富多样的次 生代谢产物，通过微生物的生命活动和生长代谢过程来转化中草药，比一般的物 理或化学的手段更能大幅度地改变药性，扩大适应症，降低毒副作用，提高疗效。 同时作为一种研究天然产物在人体内代谢过程的辅助工具，微生物转化技术不但 为天然产物在体内代谢的研究提供充足的对照品和产物以供结构鉴定和活性筛 选，而且可以预测一些天然产物在动物体内的代谢过程情况。 微生物在生长过程中会产生各种各样的酶，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、 脂酶、木质素酶等。药物的某些成分在丰富而强大的微生物酶系作用下分解转化 形成新的活性成分，产生新的药效，中草药的微生物转化过程可通过下述途径来 实现n 1 。 第一，中药材经微生物的利用后，以中草药中的有效成分为前体，代谢形成新的 化合物。小桥恭一首次研究证明乜1 ，具有泻下作用的芦荟苷、番泻苷经口服后， 几乎不被消化道吸收，而是经肠道细菌有选择地分解后，产生出真正的具有泻下 活性的成分芦荟大黄素和蕃泻苷元而在消化道下部被吸收； 第二，种类丰富的次生代谢产物会在微生物生长过程中产生，某些次生代谢产物 自身就是具有良好功效的药物； 第三：中草药中的某些物质成分和微生物的次生代谢产物发生化学反应生成新的 化合物，某些新的化合物具有良好的功效； 第四，微生物的生长代谢受到中草药中的某些物质的促进或抑制作用，一些活性 成分的产生也可能会受到促进或抑制作用，微生物也可能改变自身的代谢途径以 适应中草药的特殊环境，而改变各活性成分的相互比例亦或形成新的活性成分； 另外，中药中的有毒物质在微生物的分解作用下可能被分解消除，降低了药物的 毒副作用，如棉籽饼、菜籽饼中的有毒物质经微生物发酵后可被除去。 1 1 1 萜类化合物及其皂苷的微生物转化类型 1 1 1 1 脱糖反应 七叶树皂苷一i a 可在肠内菌酶作用下酶解糖链被转化为2 10 一o - 巴豆酰基原 七叶皂苷元和原七叶树皂苷元。另外通过发酵法或酶法，黑曲霉u v 一4 8 能将甘草 皂苷转化为单葡萄糖单醛酸基甘草皂苷元( m g g a ) 口1 。 2 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 1 2 糖苷化反应 桔梗细胞悬浮体系和长春花对雷公藤内酯酮进行生物转化h 酒3 ，得到9 个产 物，分别是雷公藤甲素、雷公藤乙素、1 2b ，1 3q 一二羟基雷公藤内酯酮、1 2q ， 1 3q 一二羟基雷公藤内酯酮、1 2q ，1 3q 一表二羟基雷公藤内酯酮、1 2 ，1 3 - 雷公 藤内酯酮、5a 一羟基雷公藤内酯酮、2b 一羟基雷公藤内酯酮、1 7 一羟基雷公藤内 醋酮。除以上反应之外，还可以观察到糖苷化反应，雷公藤内酯酮被转化为1 4 一o _ b - d - 葡萄糖一表雷公藤甲素。 1 1 1 - 3 羟基化反应 短刺小克银汉霉c u n n i n g h a m e l ab l a k e s l e a n aa s3 9 7 0 对雷公藤甲素进行 微生物转化，共得到7 个转化产物，分别是lb 一羟基雷公藤甲素、5q 一羟基雷公 藤甲素、1 9q 一羟基雷公藤甲素、1 9b 一羟基雷公藤甲素、雷公藤乙素( 2b 一羟基 雷公藤甲素) 、雷醇内醋( 1 5 - 羟基雷公藤甲素) 和1 6 - 羟基雷公藤甲素畸1 。 1 1 1 4 羟基的氧化反应 从s t e m o d i am a r i t i m a 中分离的二萜类化合物s t e m a r i n8 ，在黑曲霉a t c c 9 1 4 2 中培养得到转化产物共四种，分别为9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 ，其中化合物9 ，1 0 ，1 2 的醇羟基被氧化为相应的羧酸嘲( 见图1 ) 。 l l l 8r 1 c i 毛1 0 i i p c - x - h r 1 c ：觚叫i r 州 1 0r i c o o h r a - o h , r 广i - i 帆硼 1 1r , - c h , o i i , r 2 o h 嗍r e a o h , 胛 nr , - c o o k 确蚺l 魁呻l c l i i 硼 图1 化台物s 蛔馆m8 经黑曲霉a i t o c9 1 4 2 培养得转化 产物9 ，1 0 1 1 。1 2 i 1 1 5 水解反应 第一章绪论 上海师范大学硕士学位论文 1 0 一去乙酰一7 一表紫杉醇的1 3 位侧链可被( m u c o rs p ) 和m i c r o s p h a e r o p s i s o n y c h i u r i 水解，并可使7 位羟基差向异构化，链格孢( a 1t e r n a r i aa lt e r n at e ) 则在1b 一羟基巴卡亭i 的不同位置水解口3 。 1 1 1 6 酯化反应 2 0 ( s ) 一原人参二醇一2 0 一o - b - d 一吡喃葡萄糖( m 1 ) 是口服人参皂苷的抑瘤效应 的有效成分，是人参皂苷被肠细菌转化的代谢物之一，口服或静注m l 又能在肝 内进一步被转化为脂肪酸酯，其中就包括3 一氧一油酰- m i ( o m l ) 。将o m l 与m 1 的 抑瘤作用进行比较发现，o m l 经刺激免疫应答而具有抑瘤作用嘲。 1 1 1 7 开环反应 菌c h a e t o m i u ml o n g i r o s t r e 口- t 以使3 一羰基一齐墩果烷- 1 2 烯- 2 8 一羧酸的a 一环 裂解，成为3 ，4 一开环一齐墩果烷- 1 2 - 烯- 4 - 醇- 3 ，2 8 - - - 羧酸，a _ 环开裂需要 n a d p h 1 。长春花和桔梗植物细胞悬浮体系对雷公藤甲素及雷公藤内醋酮的转化 反应均为选择性地使1 2 ，1 3 位三元氧环开环，得到相同的转化产物雷公藤内醋三 醇h 】。 1 1 1 8 异构化反应 七叶树皂苷( e s c i n s ) - i a 和一i b 、异七叶树皂苷一i a 和一i b 是中华七叶树n 0 1 9 1 、 日本七叶树溉2 和天师栗乜2 3 等种子中共有的，最主要的三萜皂苷成分，异七叶树 皂苷一i a 是七叶树皂苷- i a 的c 2 2 位乙酰基异构到c 2 8 位上。腹腔注射七叶树总 皂苷对小鼠肝癌h 2 2 和肉瘤s 一1 8 0 的生长均有较强的抑制作用1 。无论是人肠内 厌氧性优势细菌的短乳杆菌粗酶，还是人肠内细菌混合粗酶都能将七叶树皂苷 - i a 转化为异七叶树皂苷一i a 。 1 1 1 9 环氧化反应 具有细胞毒性的倍半萜烯的结构修饰主要运用环氧化反应。其中莪术 ( c u r c u m az e d o a r i a ) 细胞悬浮培养物中大根香叶酮( g e m a c r o n e ) 的环氧化反应 就是成功的实例之一。 1 1 1 1 0 双键的氧化反应 对倍半萜蛇床烯的转化可以通过6 l o m e r e l lc i n g u l a t a 菌是对其双键进行氧 化并且使萘环的一个亚甲基羟基化生成三羟基产物为1 ，1 1 ，1 3 一三羟基一b 蛇床 烯，绝对构型为( 1 s ，6 s ，9 s ，1 0 r ，i i r s ) 2 4 o 另外( 一) 别香橙烯和( + ) 香橙烯的双键 4 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 可被g o m e r e l lc i n g u l a t a 菌氧化，并且对环丙烷上的一对甲基区域选择性的氧 化一个。其代谢物被鉴定为1 0b ，1 3 ，1 4 一三羟基别香橙烯和( 一) 1 0q ，1 3 ，1 4 一三 羟基香橙烯乜引。 1 1 1 1 1 重排反应 紫杉烷骨架的六元环骈八元环a 环和b 环可被转化为五元环骈七元环，即由 6 8 6 环系变为5 7 6 环系，c - 1 和c - 1 1 直接相连的同时伴随着c - 1 5 的羟基化。 1 1 1 1 2 酰化反应 在普通的转化系统中较少见，但酰化反应对紫衫烷类化合物非常重要，特别 是c 5 ，c 7 ，c l o 等位长的疏水侧链的酰化和c 1 3 位侧链的酰化反应。 由于生物转化可使萜类化合物发生水解、双键还原、羟基化、环氧化、过氧 化等一系列的氧化反应和还原反应，这都将大大丰富天然化合物的化学结构。将 为我们寻找更好的新药开辟一条简便和行之有效的道路，能够比传统的化学方法 更好地研究天然药物。 1 2 微生物转化萜类化合物的应用 按照目的不同，萜类化合物进行生物转化可分别用于改善中药有效成分的水 溶性或稳定性，降低不良反应，提高中药产品的附加值，开发中药新药和研究药 物代谢的机制等。 1 2 1 提高中药有效成分的活性 通过修饰中药中有效成分，获得更为有效的成分以提高治疗效果。啪3 果德安 教授课题组对人参皂苷r b l 进行生物转化研究，利用4 9 种微生物菌株进行转化 试验，发现小型丝状真菌蓝色梨头霉( a b s i d i ac o e r u e a3 3 5 3 8 ) 与黑曲霉 ( a s p e r i l l u sn i g e r3 1 8 5 8 ) 具有转化能力，能将人参皂苷r g l 转化为活性更高 更强的人参皂苷r h l 。 1 2 2 改善中药化学成分的性质 天然药物中的天然活性成分作为发挥药效活性的物质往往含量较低、稳定性 5 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 较差。运用一般的传统化学转化法收率很低，甚至得不到目标产物，且使用的大 量化学试剂会产生环境污染和溶剂残留等环保问题。天然产物中与活性成分结构 类似或生源关系相近的低活性或无效成分通过生物转化技术进行结构转化，从而 获得低不良反应、更高活性的目标产物，以改善其性质、提高中药产品的附加值 和资源的利用率。 1 2 3 将无效中药成分转化为有效成分 从红豆杉属( t a x u e ) 植物树皮或针叶分离提取的一种二萜类化合物紫杉 醇，被认为是最有效的抗乳癌药物成分之一。但是红豆杉的生长很缓慢，而其中 紫杉醇含量又极低，所以其来源一直是亟待解决的问题乜7 1 。果德安教授的课题组 经过多年试验研究，获得了一株特殊的中国红豆杉( t c h i n e n s i s ) 的愈伤组织， 它的特点是丧失了合成紫杉烷和紫杉醇的能力，却具有高产紫杉醇类药物骨架的 t a x a d i e n s 的能力，这为生产活性紫杉烷类物质前体及紫杉醇提供了可能性。已 有很多文献汹趵1 报道了有关于它的结构改造的研究，并获得了多种新化合物。 1 2 4 开发中药新药 生物体中具有多种不同催化功能的酶体系，利用这些酶系对中药化学成分进 行生物转化，产生新的化合物库，然后再与药理筛选手段相结合，可从新的化合 物库中寻找到新的低毒性或高活性的天然活性先导化合物。 用微生物体系和植物细胞悬浮培养体系对雷公藤的主要成分雷公藤甲素和 雷公藤内醋酮进行结构修饰，在所得的1 7 种产物中有1 1 种为新化合物，大多数 转化产物表现出较弱的细胞毒活性，1 9 位羟基化产物除外。此例很好的说明了 在新药开发研究中，生物转化是一种重要的方法和手段，如果将其好好地利用， 我们可以创造出更多、更好的新药。 1 2 5 作为研究药物代谢机制的辅助手段 在实际应用中生物转化技术不仅是只有转化出毒性低、活性高的转化产物才 加以应用。某些生物转化还有一些其他的应用价值，如有的对新药的生物转化程 6 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 度虽然不大，但对用药配伍有较大的影响，有些甚至可达数量级，药物生物转化 研究作为创新药筛选早期阶段中的一种辅助手段加以应用，也是具有相当价值 的。 1 3 积雪草的研究进展 积雪草( c e n t e l j aa s i a t i c a ( l ) u r b ) 又称落得打、崩大碗、半边钱，为伞形 科积雪草属植物，其始载于神农本草经，列为中品。其性寒，味苦、辛，具 有清热利湿、解毒消肿之功效，主要用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿 疮毒，跌扑损伤。是民间广东地区常用中草药，利用积雪草外用及内服治病在 我国医学上用已有两千多年历史。 积雪草属( c e n t e l l a ) 植物，全世界约有2 0 种，主产于斯里兰卡、印度、马来 西亚、印度尼西亚、南非、澳大利亚，分布于南北半球热带和亚热带地区，日本 亦有分布。我国仅产积雪草1 种，广布于华东、华中、华南、中南及西南诸地区 海拔2 0 0 0i l l 以下的山下路旁、沟边、田边、草地等肥沃阴湿处。 干燥全草多皱缩成团状。叶片多破碎、皱缩，完整者展平后呈肾形或近圆形， 直径l 4 c m ，灰绿色，边缘有钝齿。叶柄长2 7 c m ，常扭曲。茎细长弯曲匍匐生 长，直径1 5 2 m m ，黄棕色，有细纵皱纹，节上长着生根茎和须状根。根呈圆柱 形，直径0 8 1 5 m m ，表面黄色至灰褐色。根茎长1 - - - 2 c m ，直径2 3 m m 。花序腋 生，伞形，短小。扁圆形双悬果，有明显隆起的细网纹及纵棱，果梗长0 8 - - 1 3 c m ， 气微，味淡口。 1 3 1 主要化学成分 1 3 1 1 三萜类成分 积雪草主要含三萜皂苷如积雪草苷( a s i a t i c o s i d e ) 、羟基积雪草苷 ( m a d e c a s s o s i d e ) 、参枯尼苷( t h a n k u n i s i d e ) 、异参枯尼苷( i s o t h a n k u n i s i d e ) 、 波热米苷( b r a s m i n o s i d e ) 等，它们均为五环三萜皂苷。近来又发现5 个三萜皂苷 d 利。在研究斯里兰卡积雪草的化学成分时，m a t s u d a 等又发现了3 种新三萜类：羟 基积雪草酸2 8 一o - 夕一伊吡喃葡糖基( 1 6 ) 一夕一伊吡喃葡糖苷( 命名为积雪草皂苷 b ) ；2 8 一o 口一卜吡喃鼠李糖基一( 1 4 ) 一夕一俨吡喃葡糖基( 1 6 ) 一鼻一伊吡喃葡糖 7 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 苷( 命名为积雪草皂苷c ) ；3b ，6b ，2 3 一三羟基齐墩果一1 2 一烯一2 8 酸2 8 0 _ 口一手 吡喃鼠李糖基一( 1 4 ) 一夕一伊吡喃葡糖基一( 1 6 ) 一俨伊吡喃葡糖苷( 命名为积雪 草皂苷d ) 3 3 o 最近张蕾磊等m 1 又发现了一新化合物积雪草二糖苷，经鉴别结 构为：2 口，3 夕，2 3 口一三羟基齐墩果- 1 2 - 烯- 2 8 - 酸一2 8 一o _ 夕一伊吡喃葡萄糖基一( 1 - - 6 ) 一夕一沪吡喃葡萄糖酯。 还有游离三萜酸，如积雪草酸( a s i a t i ca c i d ) 、羟基积雪草酸( b r a h m i c a c i d ) 、波热米酸( b r a h m i ca c i d ) 、马达积雪草酸( m a d a s t i ca c i d ) 等。 1 3 1 2 多炔烯类 据文献报到，从积雪草中已经分离出了近2 0 个此类化合物。德国的s c h u l t e 汹1 从积雪草地下部分中分离到1 4 个长链的多炔烯烃类化合物，并对其中的5 个作了 结构鉴定，其分别是：c 。h 0 2 、c i e h 2 1 0 2 、c h 2 1 0 3 、c 1 9 h ：，0 。和c 1 。h 2 7 0 4 。印度s r i v a t a v a r i t u 等人啪1 分离彳导至l jt 3 - i s o o c t a d e c a n y l - 4 - h y d r o x y - q - p y r o n e 。印度s h u k l a 等人3 钉分离得蛰jt d o t r i a c o n t 一8 一e n 一卜o i ca c i d 、1 1 一o x o h e n e i c o s a n y 卜 c y c l o h e x a n e 和3 一o - q l a r a b i n o p y r a n o s y l 一2q ，3q ，6q ，2 3 q t e t r h y d r o x y u r s 1 2 一e n e 一2 8 一o i ca c i d 刚。从积雪草中b o h l m a n 3 钔等又分到两种 新的多炔烯烃，分子式分别为：c ，h 2 4 0 。、c 。h 鹦0 。 1 3 1 3 挥发油类 积雪草含多种挥发油成分，气味芳香浓郁。应用g c - m s 分析，秦氏等汹3 从积 雪草中分离鉴定t 4 5 个长链的挥发油类成分。其中含量较高超过3 的有法呢醇 ( f a r n e s 0 1 ) 、石竹烯( c a r y o p h y l l e n e ) 、3 ，7 ，i i t r i m e t h y l 一( e ，e ) 一2 ，6 ， l o - d o d e c a t r i e n - l - o l - 3 - - - 十烷炔( 3 - e i c o s y n e ) 、榄香烯( e l e m e n e ) 、长叶烯 ( l o n g i f o l e n e ) 、胡椒烯( c o p a e n e ) 、卜h e p t g d e c a n o l 、1 ，2 ，4q ，5 ，6 ，8q o c t a h y d r o 一4 ，7 - d i m e t h y l 一1 一( 1 一m e t h y l e t h y l ) 一n a p h t h a l e n e 等。 1 3 1 4 其他成分 积雪草中富含f e 、c u 、z n 、m n 、s r 、c r 、c o 等人体必需的微量元素h u ，以及 葡萄糖、鼠李糖、槲皮素和山奈酚的黄酮苷等黄酮类成分h 幻。此外积雪草还含有 积雪草多糖( c e n t e l l o s e ) 、内消旋肌醇( m e s o - i n o s i t 0 1 ) 、四萜类成分( 主要是胡 萝卜烃类c a r o t e n o i d s ) 、叶绿素、氨基酸和香荚兰酸( v a n i l l i c a c i d ) 等。印度 s r i v a s t a v ar 4 3 在积雪草根茎的己烷提取物中分离得至l j s t i g m a s t e r o n e 、 8 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 s t i g m a s t e r o l 和s t i g m a s t e r o l b g l u c o p y r a n o s i d e 。从肯尼亚等地产的积雪草 中h o l e m a n 等人m 3 分离得到了倍半萜类成分。a h m a dt a u n g b o d h i t h a m 等人4 5 3 发现 了维生素b 。的存在。 近年来又在积雪草中发现许多其它成分，如香草酸、丁二酸、b 一谷甾醇、 胡萝卜苷、山柰酚、槲皮素、二十六醇辛酸酯、阿魏酸二十二酯，b a y o g e n i n ， t e r m i n o l i e a c i d ，3 0 一b 一2 3 一t r i h y d r o x y o l e a n 一1 2 一e n 一2 8 一o i ca c i d ，3b 一6 2 3 一t r i h y d r o x y u r s 1 2 一e n 一2 8 一o i ca c i d ，d - g u l o n i ca c i d 柏1 ，c e n t e l l i n ， a s i a t i c i n ，c e n t e l l i c i n 田1 。新近又在积雪草中首次分离得到积雪草单糖苷和q - l - 鼠李糖删。 1 3 2 积雪草有效成分药理研究进展 1 3 2 1 抗菌消炎作用 积雪草苷有较好的体内、外抗菌活性。采用小鼠膀胱上行性肾感染模型，研 究积雪草苷抗菌作用的体内疗效；采用平皿内二倍稀释法测定积雪草苷对临床分 离致病菌株及标准菌株的体外抗菌活性。张胜华等人的研究结果表明积雪草苷对 3 7 株临床分离菌及标准菌株显示抗菌活性，尤其对各种耐药细菌，包括耐5 种氨 基糖苷类抗生素、产钝化酶的粪肠球菌，耐哌拉西林的铜绿假单胞菌，产1 3 一内 酰胺酶、产超广谱b 一内酰胺酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌和醋酸钙不动杆 菌，以及耐甲氧西林的表葡菌( m r s e ) 、金葡菌( m r s a ) ，均有较强抗菌活性汹1 。 有研究结果显示积雪草苷抑带a j n o 、i l - 6 和t n f - q 等炎症因子咖，5 1 3 。积雪草苷 能抑制l p s 诱导小鼠r a w 2 6 4 7 细胞释放致炎细胞因子i l - 6 和t n 卜q ，这为积雪草 苷是否有保护小鼠避免l p s 攻击产生脓毒症的作用，以及能否用于临床脓毒症的 治疗提供了依据畴副。 1 3 2 2 促进创伤愈合和治疗增生性瘢痕 积雪草提取物对硬皮病及烧伤瘢痕等纤维化疾病有明显的疗效，能有效地促 进伤口愈合。 在研究积雪草苷对体外培养的成纤维细胞的作用时发现，成纤维细胞用药后 增殖变得不活跃。谢举临采用光镜、掺入、电镜及m t t 比色等方法检测胶原蛋白 和成纤维细胞核的合成的变化情况，这些改变使成纤维细胞合成胶原蛋白的功能 9 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 受到一定的影响。成纤维细胞用药后d n a 合成减少，生长受到呈抑制。表明成纤 维细胞的分裂增殖受到积雪草提取物抑制，并对成纤维细胞的胶原蛋白合成有明 显的抑制作用嵋羽。 为了探讨积雪草苷治疗瘢痕的作用机制，采用免疫细胞化学、蛋白印迹 ( w e s t e r nb l o t ) 及流式细胞仪分析技术结合光密度扫描分析，潘妹观察积雪草 苷对瘢痕成纤维细胞周期及磷酸化s m a d2 和s m a d7 的改变影响。结果表明，积雪 草苷使成纤维细胞增殖受阻主要通过增 j h s m a d2 转导信号s m a d7 的表达，抑制了 t g f 2 b 的病理性作用，从而发挥作用泓1 。 通过增生性瘢痕移植裸鼠的动物模型、体外瘢痕成纤维细胞的研究来探究积 雪草苷对烧伤增生性瘢痕作用的作用机制，祁少海等发现：积雪草提取物起作用 的机制是，通过阻断成纤维细胞的生长增殖，抑制其合成分泌胶原的能力嘞1 。 y o s h i y u k i 的研究表明：积雪草治疗烧伤的作用机制可能是增加角质化细胞 中m c p 一1 的表达从而促进v e g f 的生成，同时携带m c p - 1 的巨噬细胞受到积雪草苷促 进作用生成i l - 1p ，提高了烧伤处的血管的生成呻1 。 1 3 乞3 抗抑郁作用 采用小鼠强迫游泳抑郁症模型，陈瑶啼7 1 观察了积雪草总苷的抗抑作用。结果 显示积雪草总苷高、中、低3 个剂量能够显著缩短小鼠强迫游泳不动时间，改善 小鼠脑内因为强迫游泳所致的氨基酸含量的失调。结果表明积雪草总苷具有抗抑 郁活性，是通过提高机体对各种非特异性刺激的抵抗力，避免过度应激刺激所致 机体下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴和下丘脑一垂体一甲状腺轴等调节功能的紊乱而 发挥抗抑郁作用的。 此外积雪草还可以增强神经功能，在研究积雪草叶子提取物对成熟大鼠海马 c a 3 神经元的影响时，g a d a h a dm r 发现：积雪草提取物可以显著促进神经元的生 长硎。 1 3 2 4 抗肿瘤作用 观察积雪草苷对体外培养的c n e 细胞和l 9 2 9 细胞增殖的影响，以及对移植 s 1 8 0 细胞增殖和荷s 1 8 0 d 、鼠生存时间的影响，王锦菊呻3 发现积雪草苷对体外培养 的c n e 细胞和l 9 2 9 细胞的增殖有明显抑制作用，对移植s 1 8 0 细胞的增殖也受到抑 制作用，同时能提高荷s 1 8 0 d 、鼠的存活时间。黄云虹侧的研究结果显示，积雪草 l o 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 苷有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并与长春新碱显示协同作用，有作为生化调节剂 应用于肿瘤化疗的可能。 1 3 2 5 对心血管系统的作用 通过对兔心肌缺血再灌注损伤( m i r i ) 模型研究，李桂桂阳等发现羟基积雪草 苷( m c ) 对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护和预防作用。可明显减小全心及左 心心肌梗塞而积；可起到改善心电图的作用；并能明显改善心功能，降低c k 及l d h 的升高。而且，m c 降低c r p 升高程度明显；减少m d a 含量，升高s o d 酶活性；可明 显抑制( m i r i ) 引起的心肌细胞凋亡，上调b c l 一2 表达。 i n c a n d e l al t 6 2 1 研究发现，积雪草的三萜类成分具有调节静脉管壁成纤维细 胞的作用，刺激静脉壁周围胶原的重塑，能增加组织蛋白和胶原蛋白的合成，可 以用于治疗静脉功能障碍。c e s a r o n e ，m rc b 3 研究发现，积雪草的三萜类成分可以 改善微循环，改善结缔组织血管壁功能，增加毛细血管通透性，减轻踝部水肿， 可以治疗静脉高血压。 1 3 2 6 对胃黏膜的保护作用 c h e n g 等发现，积雪草的提取物能够抵抗乙醇所致的小鼠胃黏膜损害，是 通过加强黏膜的自身阻碍以减少自由基的损害，提示积雪草提取物有一定的抗胃 溃疡活性。乐锦茂等司发现复方积雪草浸膏对组胺所致的胃液总酸和游离酸、胃 液分泌、胃蛋白酶均有一定的抑制作用。给乙酸诱导的胃溃疡大鼠用不同浓度的 积雪草苷水提物和积雪草水提物经口服给药，结果发现二者的溃疡面积都可以在 溃疡诱导后的1 ，3 ，7 d 以一种剂量依赖的方式减小，并发现在此过程中，溃疡组 织中诱导型一氧化氮合酶( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e ，i n o s ) 的蛋白表 达水平和活性降低了，在溃疡组织中硝化物，硝酸盐以及稳定的终末产物一氧化 氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 也减少了，由此g u o 等得出结论，积雪草苷水提物和积雪 草水提物具有抗炎特性，并且是通过抑$ 1 j n o 合成从而促进溃疡愈合酬。 1 3 2 7 对肾的作用 在临床实践中，复方积雪草显示能显著改善慢性肾功能衰竭c r f 患者的症状， 降低尿素氮、血肌酐及2 4h 尿蛋白量呻1 。覃志成等m 研究复方积雪草时发现， 高i g a 血清刺激足细胞表达的v e g f m r n a 可以明显被复方积雪草减低；用基因表达 谱芯片检测表明：经复方积雪草刺激后，肾组织中癌基因c - m y c ，j u n