（发酵工程专业论文）根霉zm10脂肪酶酶学性质和化学修饰.pdf

左 k - 】 _ 2 2 培养基15 2 3 主要试剂1 5 2 4 主要仪器1 6 2 5 实验方法l6 2 5 1 细胞内脂肪酶的制备1 6 2 5 2 根霉脂肪酶的分离纯化一1 6 2 5 3 脂肪酶基本酶学性质的研究1 8 2 5 4 脂肪酶活性中心氨基酸的化学修饰1 9 2 5 5e d c 、d e p c 对根霉z m 1 0 脂肪酶的修饰动力学1 9 2 6 分析方法2 0 2 6 1 脂肪酶活性的测定2 0 2 6 2 蛋白质浓度的测定2 2 2 6 3s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳2 2 3 结果与分析2 5 3 1 根霉z m 1 0 脂肪酶的分离纯化2 5 3 1 1 硫酸铵饱和度对盐析效果的影响2 5 3 1 2d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换层析分离纯化条件的确定2 5 3 1 3s e p h a r d e xg 1 0 0 凝胶过滤层析分离纯化条件的确定2 6 3 1 4 根霉z m 1 0 脂肪酶相对分子质量的确定2 7 3 1 5 根霉z m 1 0 脂肪酶分离纯化结果。2 8 3 1 6 小结2 9 3 2 根霉z m 1 0 脂肪酶基本酶学性质的研究2 9 3 2 1 温度对根霉z m 1 0 脂肪酶活性的影响2 9 3 2 2 温度对根霉z m 1 0 脂肪酶稳定性的影响3 0 3 2 3p h 对根霉z m 1 0 脂肪酶活性的影响一3 1 3 2 4p h 对根霉z m 1 0 脂肪酶稳定性的影响3 l 3 2 5 金属离子及e d t a 对根霉z m 1 0 脂肪酶活性的影响3 2 3 2 6 有机溶剂对根霉z m 1 0 脂肪酶活性的影响3 3 3 2 7 小结3 3 3 3 根霉z m 1 0 脂肪酶活性中心氨基酸的化学修饰3 4 3 3 1 酸性氨基酸( 天冬氨酸谷氨酸) 残基的化学修饰3 4 3 3 2 组氨酸残基的化学修饰3 4 3 3 - 3 丝氨酸残基的化学修饰3 5 3 3 4 色氨酸残基的化学修饰3 6 3 3 5 半胱氨酸残基的化学修饰3 7 3 3 6 蛋氨酸残基的化学修饰3 8 3 3 7e d c 对根霉z m 一1 0 脂肪酶活性的修饰作用动力学3 8 3 3 8d e p c 对根霉z m 1 0 脂肪酶活性的修饰作用动力学4 0 3 3 91 、结4 1 4 讨论4 2 4 1 脂肪酶活性测定方法的选择4 2 4 2 根霉z m 1 0 脂肪酶的分离纯化4 2 4 3 根霉z m 1 0 脂肪酶的基本酶学性质4 3 4 4 根霉z m 1 0 脂肪酶活性中心的化学修饰4 4 5 结论4 5 6 参考文献 7 致谢。 8 攻读硕士学位期间发表的 山东农业大学硕士学位论文 摘要 脂肪酶在酿酒工业中的应用具有十分重要的意义，大曲中的根霉 ( r h i z o p u s ) 是白酒发酵过程中酒体香气成分形成的主要微生物之一。浓香 型白酒的风格及酒质的优劣，主要取决于酒体中己酸乙酯含量的高低以及 与其它酯类物质的比例是否协调。根霉脂肪酶在酿酒生产中得以应用，但 其酶学特性和催化机理未研究阐明，存在酶活较低、生香效果不稳定、增 香针对性不强、应用技术条件不明确、使用范围不广等实际问题，在酿酒 工业也远未得到充分应用。因此，深入研究和阐明根霉脂肪酶的酶学性质 和作用机制对其在食品工业中的应用具有较大的理论和实践意义。本论文 以明确根霉z m 1 0 脂肪酶的酶学性质和活性中心的氨基酸种类为目标， 研究了根霉z m 1 0 脂肪酶分离纯化条件、基本酶学性质、表现酶活性所 必需的氨基酸种类，主要结果和结论如下： 1 根霉z m 1 0 脂肪酶的分离纯化：根霉z m 1 0 脂肪酶经过硫酸铵盐析、 d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换层析、s e p h a r d e xg 1 0 0 凝胶过滤层析得脂 肪酶，纯化倍数1 5 3 倍，酶活回收率2 2 2 。根霉z m 1 0 脂肪酶分离纯 化条件为：最佳硫酸铵盐析饱和度7 0 ；d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换 层析最佳条件：上样量5 m l 、流速3 m l m i n 、每管收集3 m l 、洗脱体积 1 0 倍柱体积、洗脱最佳盐浓度0 4 m o l l ；s e p h a r d e xg 1 0 0 凝胶过滤层析 最佳条件：上样量3 m l 、流速：自然流速、每管收集1 8 m l 、洗脱体积： 2 倍柱体积。经s d s p a g e 凝胶电泳检测得该脂肪酶的分子量约为4 4 k d a 。 2 根霉z m 1 0 脂肪酶的基本酶学性质：对纯化后根霉z m 1 0 脂肪酶基 本酶学性质研究表明：该脂肪酶的最适反应温度3 5 ，最适p h 为8 0 。 该酶在2 0 下l h 时仍保持9 0 以上的活力，在p h7 5 、8 0 具有较高的 稳定性。n a + 、k + 、c a 2 + 、m 9 2 + 、b a 2 + 及e d t a 对其活性影响较小，z n 2 + 具有显著的抑制作用。醇类有机溶剂对该脂肪酶的活性有定的抑制作 用，其在极性较小的烷烃类有机溶剂中稳定性良好。 3 根霉z m 1 0 脂肪酶活性中心的化学修饰：采用n b s 、e d c 、d e p c 、 c h t 、p m s f 、d t n b 等6 种化学修饰剂对根霉z m 1 0 脂肪酶进行化学 修饰、底物保护实验，研究了其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关 系。实验结果表明：酸性氨基酸( 天冬氨酸谷氨酸) 残基、组氨酸残基、 根霉z m 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 丝氨酸残基、色氨酸残基为根霉z m 1 0 脂肪酶活性的必需基团。酸性氨 基酸( 天冬氨酸谷氨酸) 残基、组氨酸残基和丝氨酸残基位于根霉z m 一1 0 脂肪酶的活性中心部位，而色氨酸残基在保持脂肪酶活性中起到重要作 用，但其不位于根霉z m 一1 0 脂肪酶的活性中心部位；通过e d c 、d e p c 的修饰动力学实验表明根霉z m 1 0 脂肪酶分子活性中一i i , 至少包括一个天 冬氨酸( 或谷氨酸) 残基和一个组氨酸残基。 关键词：根霉；脂肪酶；分离纯化；酶学性质；化学修饰 2 i n d u s t r yh a v eg r e a t e rt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r , t h e c o n d i t i o n so fr h i z o p u sz m - 10 l i p a s ep u r i f i c a t i o n ，t h eb a s i ce n z y m a t i c p r o p e r t i e sa n da c t i v ea m i n oa c i dt y p ew e r es t u d y e d p r i m a r i l ys t u d yr e s u l t sa s f o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o no ft h el i p a s ef r o mr h 坛o p u ss p z m 一1 0 ：al i p a s ef r o mr h i z o p u ss pz m 一10w a su s i n ga m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ， d i a l y s i s ，d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wa n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e x g - 10 0g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h i sp u r i f i c a t i o np r o t o c o lr e s u l t e di na15 3 f o l d p u r i f i c a t i o no fl i p a s ew i t h 2 2 2 f i n a ly i e l d t h ep u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n s ：a m m o n i u m s u l p h a t es a t u r a t i o n7 0 ：t h eb e s tc o n d i t i o n so fd e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wa n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ：s a m p l ev o l u m e5 m l ，e l u t i o nf l o wr a t e3 m l l ，c o l l e c t i n g v o l u m e3 m l ，e l u t i o nv o l u m e10t i m e so fc o l u m nv o l u m e ，e l u t i n gs a l tc o n c e n t r a t i o n 0 4 m o l l ；t h eb e s tc o n d i t i o n so fs e p h a d e xg 一10 0g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ：s a m p l e v o l u m e3 m l ，e l u t i o nf l o wr a t ee a s y - f l o w - r a t e ，c o l l e c t i n gv o l u m e1 s m l ，e l u t i o nv o l u m e2 t i m e so fc o l u m nv o l u m et h em o l e c u l a rw e i g h to ft h el i p a s ei sa p p r o x i m a t e l y4 4 l ab y s d s p a g eg e le l e c t r o p h o r e s i s 2 r e s e a r c ho nt h eb a s i ce n z y m a t i cp r o p e r t i e so f t h el i p a s ef r o m r h i z o p u s s pz m - l o ：t h er e s e a r c ht ot h i sp u r i f i c a t i o np r o t o c o ls h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp ha n d t e m p e r a t u r ef o rl i p o l y t i ca c t i v i t yo ft h el i p a s ew a s8 0 a n d3 5 。c ，r e s p e c t i v e l y i tw a s 3 根霉z m 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 e x t r e m e l ys t a b l ea t2 0 。c a n dr e t a i n e d9 0 o fi t so r i g i n a la c t i v i t yf o rl h n el i p a s ew a s h i g h l ys t a b l ei nt h ep hr a n g ef r o m7 5t o8 0f o r4 h n a + ，k + ，c a 2 + ，m 9 2 + ，b a 2 十a n de d t a a f f e c t e dl i p o l y t i ca c t i v i t yo nt h es m a l ls i d e ，w h e r e a sz n z * i o n sc a u s e ds t r o n gi n h i b i t i o n t h eo r g a n i cs o l v e n to fv a r i o u sa l c o h o l si n h i b i t e dl i p o l y t i ca c t i v i t yt os o m ee x t e n t ；t h e l i p a s eh a dg o o ds t a b i l i t yi nt h eo r g a n i cs o l v e n to f a l k a n e s 3 c h e m i c a im o d i f i c a t i o no f t h el i p a s ea c t i v es i t e sf r o m r h i z o p u ss pz m 1 0 ：s i xm o d i f i e r s b s 、e d c 、d e p c 、c h - t 、p m s f 、d t n b ) w e r eu s e dt or e a c tw i t h r h i z o p u ss pz m - 1 0l i p a s e n er e s u l ti n d i c a t e dt h a ta s p a r t a t e ( g l u t a m a t e ) ，h i s t i d i n e ，s e r i n e a n d t r y p t o p h a n r e s i d u e sw e r ee s s e n t i a l g r o u p s f o rt h e c a t a l y t i ca c t i v i t y ； a s p a r t a t e ( g l u t a m a t e ) ，h i s t i d i n e a n ds e r i n er e s i d u ew e r ei nt h es u b s t r a t e b i n d i n g s i t e ，t r y p t o p h a nr e s i d u e sw a si m p o r t a n ti nm a i n t a i n i n gt h ee n z y m ea c t i v i t y , b u tn o ti nt h e s u b s t r a t eb i n d i n gs i t eo f t h ee n z y m e k e y w o r d s ：r h i z o p u s ；l i p a s e ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；b a s i ce n z y m a t i c p r o p e r t i e s ；c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n 4 山东农业人学硕士学位论文 l 引言 1 1 中国白酒与根霉脂肪酶 中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，是我国的传统蒸馏酒。中国 白酒与其他蒸馏酒相比，独具风格，具有特殊的风味。香味物质中的酯高、 酸高、醛酮高、高级醇低的特征为我国白酒的主要特点( 沈怡方，1 9 9 8 ) 。 中国白酒按照风格的不同主要划分为酱香型、清香型、浓香型、米香型和 其他香型五种香型，后又出现了风香型，董香型，豉香型，芝麻香型，特 香型等香型白酒，表l 为我国主要三大香型白酒的分析比较。 表i 三大香型白酒的比较( 李大和，2 0 0 7 ) t a b l e1t h ec o m p a r i s o no f t h r e ek i n do f c h i n e s es p i r i t s 根霉z m - 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 浓香型白酒，亦称泸香型白酒，以四川的泸州老窖和五粮液为典型代 表，属大曲酒类，其特点是窖香浓郁，清冽甘爽，绵柔醇厚，香味协调， 尾净余长。浓香型白酒在整个白酒行业中占据主导地位( 谢玉球等，2 0 0 7 ) 。 白酒酿造是集糖化、发酵、酯化为一体的生物代谢过程，酿造前期主要生 成各种酸类和醇类物质，中后期酸和醇在酶的作用下，在适当的温度条件 下进行生化反应，逐步生成各种酯类，形成白酒独特的风格( 程江红等， 2 0 0 6 ) 。酯类物质是由发酵产生的酸与醇进一步缩合而成。由于在曲酒生 产过程中，产酒快，产酯生香慢，特别是大曲中酯化菌含量较少，从根本 限制了己酸乙酯及其他酯类的生成，故造成了大曲酒发酵生香周期长，优 质酒率较低。而酒体中己酸乙酯的含量偏低历来是浓香型酒酒质低下、优 质酒少的主要原因( 潘运国等，2 0 0 6 ) 。 - 大曲是浓香型白酒生产中的糖化剂、发酵剂、产香剂。大曲质量的好 坏直接影响着白酒的产量和质量。脂肪酶的反应特性与大曲中的菌群微生 物有关，在酿酒微生物中酵母菌合成乙酸乙酯的能力较强，浓香型大曲中 的根霉、红曲霉和毛霉中的某些菌株具有合成较长直链酯的酯化活性( 刘 光烨，2 0 0 2 ) ，且相同的脂肪酶对不同的酸合成的能力也不一样，其中根 6 山东农业人学硕士学位论文 霉是浓香型大曲中的优势菌之一，具有较强的合成脂肪酶的能力，对浓香 型大曲酒的主体香气形成具有重要作用。 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，甘油三酰酯水解酶) ，是一类催化甘油酯水 解为甘油和脂肪酸的酶类，另外，其它大分子和小分子的酯、硫羟酸酯、 酰胺类化合物、多元醇酯、多元酸酯等也可作为脂肪酶所催化反应的底物。 脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，不仅能催化油脂水解，也能在 非水相中催化酯合成反应、转酯化反应、酸解反应等反应( 李春香等， 2 0 0 3 ) 。脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和、转化率高和特异性强， 不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，因而越来越多的 用于有机合成，特别是光学活性化合物及天然产物的合成( 秦韶巍等， 2 0 0 7 ) 。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及范围比动植物脂肪酶广、 底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物 脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源( 薛勇等，2 0 0 4 ) 。其中根霉属 ( r h i z o p u s ) 微生物是脂肪酶的重要生产菌。在过去的十多年里，从根霉菌 中分离到超过3 0 种脂肪酶，多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂。不 同来源的脂肪酶在选择性上有所不同，其中，根霉脂肪酶大多具有高度的 1 、3 位置专一性，因而常用于油脂加工，以提高油脂的品质。此外，在 芳香酯、生物柴油、手性化合物等有机化合物的制备中，根霉脂肪酶以其 较好的立体选择性、较高的转化率和稳定性等优点，受到了研究者及生产 企业的关注，并进行了大量的研究( 张根旺等，2 0 0 3 、舒正玉等，2 0 0 7 ) 。 脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油 酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应生物表面活性 剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂 肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成成为酶工程 领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工 业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂 的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。脂肪酶在许多领域展现 出诱人的应用前景，然而这种催化剂的许多天然性质如活性、选择性、稳 定性等在多数情况下都不能满足其催化反应的要求，这种基于拓展其应用 空间和应用范围的改进可以通过化学修饰来实现。对酶的化学修饰的目的 7 根霉z m 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 有两个：其一是通过对构成酶催化活性中心氨基酸残基的定向修饰，揭示 酶的活性中心构成和催化机理：其二是通过对活性中心构成无关的氨基酸 侧链的修饰，改善酶原有的催化功能或者创造新的功能。从根本上讲，前 者属于一种分析手段：后者则是酶工程研究的主要内容和重要手段。 1 2 产脂肪酶微生物介绍和脂肪酶的分类 在自然界中能产脂肪酶的微生物资源非常丰富，从分类上看主要是真 菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、 酵母菌、犁头霉、须霉、白地酶和核盘霉等1 2 属2 3 种( 马歌丽等，2 0 0 1 ) 。 其次是细菌，细菌主要是假单孢菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌 等。另外，放线菌中的个别种属可产生一定量的脂肪酶。青霉属有灰绿青 霉、娄地青霉、产黄青霉、擦草酸青霉、圆弧青霉和果味青霉等。红曲霉 属中已报道过1 7 种，然而有些种的界限并不明确，在实际生产中经常应 用的仅有红曲霉和烟色红曲霉。根霉属中已报道的近2 0 种，其中主要为 匍枝根霉、华根霉、米根霉和无根根霉。其次还有河内根霉、结节根霉、 甘薯根霉、小麦曲根霉和德氏根霉等。除此之外，象巴特勒犁头霉、羊毛 状腐质霉、白地酶等脂肪酶的含量也较高( 李燕等，2 0 0 6 ) 。 对脂肪酶的分类目前主要有两种分类方法：按最适酶活p h 值可分为 酸性脂肪酶和碱性脂肪酶，一般植物种子和动物胰脏所含的脂肪酶为酸性 脂肪酶，而微生物所产生的脂肪酶大多为碱性脂肪酶( r a s h i dn 等，2 0 0 1 ) ； 按脂肪酶家族可将脂肪酶分为八个家族( a r p i g n y j l 等，1 9 9 9 ) 。而脂肪酶 家族i 又细分为6 个亚科，据报道，假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 微生物产 生的低温脂肪酶是一个显著的代表，大多数假单胞菌属的脂肪酶可划分到 i 1 至i i 3 亚科。i 1 亚科的脂肪酶分子量最小( 约3 0 k d ) ，绿脓杆菌 ( p a e r u g i n o s a ) 和草墓假单胞菌( p f r a g i ) 是这一亚科的代表。i 2 亚科与i 1 亚科具有6 0 的脂肪酶氨基酸序列相似性，由3 2 0 个氨基酸残基组成，分 子量约为3 3 k d ，包括荚壳伯克霍尔德菌g l u m a e ) 和洋葱伯克氏菌 假c e p a c i a ) 的脂肪酶。这两个亚科的脂肪酶分子都有一个二硫键，而且需 要有助蛋白的帮助才能完成蛋白质的正确折叠和分泌。i 3 亚科的脂肪酶 分子量要比第一、第二亚科的分子量大的多，假单胞菌属的 p f l u o r e s c e n s ( 5 0 k d ) 和假单胞菌属的p s t r a i n m l s 3 8 ( 6 5 k d ) 及沙雷氏菌属 山东农业入学硕士学位论文 中s e r r a t i am a r c e s c e n s ，( 6 5 l ) 的脂肪酶是这一亚科的主要代表。这一亚 科的脂肪酶分子缺失了半肤氨酸残基，从而失去了形成分子内二硫键的能 力( s a m m u n o u rr h 等，2 0 0 5 ) 。 1 3 脂肪酶的分离纯化和酶学性质 对脂肪酶酶学性质的研究是在分离纯化的基础上进行的，脂肪酶的分 子量一般在2 0 6 0k d a ；从印度尼西亚温泉中分离出一株嗜热芽胞杆菌 b a c i l l u st h e r m o l e o v o r a n s1 d ，在6 5 温度的条件下具有较高的生长速率 和较高的产脂肪酶的能力，并且该菌具有较高的底物适应性能够分解多种 油脂，如橄榄油、大豆油、矿物油、甘油三酸酯及乳化剂( 吐温2 0 、4 0 ) 。 通过硫酸铵分级盐析、d e a e s e p h a c e l 离子交换层析和s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤层析后i d 1 的纯化率达至1 j 2 2 3 倍。经s d s p a g e 电泳得i d - 1 脂肪酶 的相对分子质量为3 4k d a ，该酶的最适温度为7 0 7 5 ，最适p h 为7 5 。6 0 处理l h 后仍保持5 0 以上的酶活力，c a 2 + 、z n 2 + 对该脂肪酶具有一定的 激活作用( d o n g w o ol e e 等，1 9 9 9 ) 。 虬f s p e r g i l l u sn i d u l a n sw g 3 1 2 分离 纯化出冷稳定性强的解酯酶，经凝胶色谱分离确定其分子量2 9k d a ，等 电点p i 为4 8 5 ，该酶具有水解短链和中链脂肪酸的能力，最佳酶活温度 4 0 ( i s a b e lm a y o r d o m o 等，2 0 0 0 ) 。采用离子交换层析和疏水层析法，对 c a n d i d as p 9 9 j 乃脂肪酶进行了纯化，s d s p a g e 电泳分析其分子量约 为3 8k d a ( 秦韶巍等，2 0 0 7 ) 。不同来源的根霉脂肪酶具有不同的性质， 大多数脂肪酶的最适作用温度在3 0 - - 一6 5 c 之间，最适p h 和p h 稳定范围较 宽，如少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z u sb u c t ) 脂肪酶在p h 6 0 - 8 0 范围内酶 活都比较稳定( 杨学昊等，2 0 0 4 ) ；脂肪酶作用不需要辅助因子，一般来 说，二价金属阳离子，女, c a 2 + 可提高大多数脂肪酶的活性，c 0 2 + 、n i 2 + 、 h 9 2 + 和s n 2 + 可强烈抑制多数脂肪酶的活性( g o d t f r e d s e ne ta 1 ，19 9 0 ) ；s d s ( 十二烷基磺酸钠) 、胆汁酸盐、蛋白抑制剂等能可逆地抑制脂肪酶的活 性。不同来源的根霉脂肪酶具有不同的催化合成特性，对不同短碳链芳香 酯催化效果不同，w e h t j e 等( 1 9 9 7 ) 对根霉( 尺a r r h i z u s ) 脂肪酶的研究 认为提高水分活度可提高酒精酯化反应k m 值1 0 倍以上；对c a n d i d a a n t a r c t i c a 脂肪酶研究认为其在正己烷中催化合成碳链芳香酯表现出底物 特异性，酸和醇的结构特点影响决定酶对酯的转化率，有机介质可增加酶 9 根霉z m 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 的稳定性、反应速度；针对不同来源的脂肪酶，深入研究其基本性质和动 力学特性，是促进其合理应用的基础( l a r i o s 等，2 0 0 4 ) 。 1 4 脂肪酶的结构特征 脂肪酶的结构特征决定其功能特征，研究表明，来源不同的脂肪酶， 其氨基酸组成数目从2 7 0 6 4 1 不等，其分子量为2 90 0 0 1 0 00 0 0 。迄今为止， 人们已经对多脂肪酶进行克隆和表达，并利用x 衍射等手段和定向修饰 等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂 肪酶活性中心的三元组( t r i a d ) 结构( k a w a u g u c h i 等，1 9 8 9 ) 。尽管氨基 酸序列不同，一般具有相同或相似的结构特征，活性催化中心基团往往有： s e r 、a s p g l u 和h i s3 个氨基酸残基，其中活性中心的s e r 其附近的一级 结构都存在g l y - x l s e r x 2 一g l y 保守序列( s c h r a g 等，1 9 9 1 ) 。一般而言， 不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同，而且位置不变。多数脂肪酶 都是单链蛋白，比如c a n d i d ac y l i n d r a c e al i p a s 含有5 3 4 个氨基酸残基， 其组成3 个小的和1 1 个大的p 折叠及1 0 个a 螺旋。其催化活性三元组 由s e v 2 0 9 、h i s 4 4 9 和g l u - 3 4 l 组成，s e v 2 0 9 处于超二级结构折叠螺旋 ( p 折叠( 2 0 2 2 0 8 ) 0 【螺旋( 2 1 0 - 2 2 0 ) ) 的转角处( d e r e w e n d a 等，1 9 9 4 ) 。 另一个令人感兴趣的特征是s e r - r e s i d u e 被一“0 【螺旋盖”掩蔽起来，与分 子表面被一界面所隔开，形成由暴露憎水基包围的由亲水基组成的脂肪酶 亲电区( 氧负离子洞) ，如图1 所示。这种结构有利于催化过程中底物对活 性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定。所以界面激活现象通常与 “0 【螺旋盖 的重新定向排列( 构象改变) 有关。侧链基团的化学修饰和 固定化对脂肪酶催化活性的改变与“c t 螺旋盖”的重新定向排列不无关系。 1 0 不同 的脂肪酶 扩展青霉 与多种已 辰等，2 0 功能特征。 1 5 脂肪酶的化学修饰 化学修饰在研究酶活性中心的结构、揭示酶活性的生物学功能等方面 起着重要作用，是具有操作简便、方式灵活、周期短、见效快的生物工程 技术。通过对构成酶催化活性中心氨基酸残基的定向修饰，可揭示酶的活 性中心构成和催化机理，也可改善酶原有的催化效率或者改善酶的物理化 学性质。纯化的脂肪酶不仅能用于酶性质的鉴定，经化学修饰可以进一步 揭示酶的结构与功能关系，阐明其催化作用机制；丝孢酵母脂肪酶分离纯 根霉z m - 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 化后，利用不同的化学修饰剂( n b s 、d e p c 、p m s f 、p d p 、w r k 、 n b s f ) 对酶蛋白进行修饰，通过酶催化活力的改变对位于酶活性位的氨基 酸残基进行分析，结果表明酶活性位可能含有组氨酸、丝氨酸和谷氨酸( 或 天冬氨酸) 。最后，对此酶的氨基酸成分进行了分析，结果表明，此酶分 子中天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量高，两种碱性氨基 酸精氨酸、赖氨酸及组氨酸的含量也比较高，而脯氨酸、色氨酸的含量相 对较低( 宋欣等，2 0 0 7 ) 。纯化的脂肪酶不仅能用于酶性质的鉴定，经化学 修饰可以进一步揭示酶的结构与功能关系，提高催化效率和稳定性；m 利用p n p c f p e g 修饰皱褶假丝酵母产脂肪酶。修饰后的脂肪酶在4 0 c 条件 下可以储存6 个月而不失活，酶活稳定性比天然酶有所增加( j h e m a 7 i z 等， 1 9 9 9 ) 。修饰后的脂肪酶有许多用途，如用于甘油三油酸酯的水解、油酸 的酯化作用和异丁苯丙酸的对映选择体酯化作用。用丁醛、异丁醛和丙酮 修饰脂肪酶，使反应速率提高了5 0 ，水解和酯化的活性都有所提高，而 酶的底物专一性并未受影响( k a i m a l 等，1 9 8 9 ) ；用5 磷酸毗哆醛修饰 c a n d i d ac y l i n c a c e a n 旨肪酶赖氨酸残基、用二硫苏糖醇还原其二硫键，修 饰后酶催化酯化活性有较大提高而水解活性改变不大( k a w a s ，1 9 8 9 ) ： 利用氨基酯的盐酸盐使c a n d i d a r 醒0 i - , 肪酶发生脒化反应，引人了疏水的 长链烷基，大大改善了脂肪酶在有机溶剂中的溶解度和热稳定性，催化酯 化反应的活性有很大提高，但水解活性略有下降( b a s i l 等，1 9 9 2 ) ；在 r h i z o p u sd e l e m a r 脂肪酶上引入双十二烷基葡萄糖基谷氨酸而得到的修饰脂 肪酶，除热稳定性有所提高外，对长碳链甘三酯的催化专一性增加 ( t s u z u k i 等，1 9 9 1 ) ；利用对二甲硫基苯酚酯( d s p ) 于温和条件下在酶上 引入了脂肪酸，这种脂肪酸修饰的脂肪酶在正己烷等有机溶剂中催化酯化 反应的能力优予天然酶，而且改变了天然酶对不同底物的亲和力 ( m u r a k a m i ，1 9 9 3 ) ；针对不同来源的根霉脂肪酶，采用化学修饰手段 系统深入研究根霉脂肪酶的结构特征和催化特性，研究建立提高催化效率 和稳定性等特定酶学性质的修饰技术，是脂肪酶酶工程研究和应用的有效 可行途径和主要趋势之一。 酶是一种高效生物催化剂。在常温常压和中性介质中，酶能够催化许 多化学方法难以完成的反应，且酶催化效率高、专一性强( 可减少或避免 1 2 山东农业大学硕十学位论文 副反应) ，符合将废弃物控制在最小限度、实现绿色化学的要求。尤其酶 在催化有机相中的反应取得成功后，其用途更加广泛。但目前酶在工业生 产中的应用并不十分普遍，其主要原因是酶对热、酸、碱、氧化剂、有机 溶剂和重金属离子的稳定性差，已开发的酶的种类有限，工业化的酶催化 工艺与化学工艺相比仍有许多问题亟待解决。这促使科学家们不断寻找新 的酶，或开发新的方法以改变、提高原有酶的性质，目前已开发出些成 功的方法，如定点诱变和随机诱变。这些基因工程方法由于只能用天然氨 基酸进行取代，仍有一定局限性。采用化学修饰法，在天然酶分子上接一 些化学基团，可得到多种多样的修饰酶。其后，蛋白质水平的酶分子改造 酶化学修饰改进酶的功能，再次成为研究热点。事实说明，只要选择 合适的修饰剂，利用化学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合 成出新的酶。酶的化学修饰的发展前景是非常诱人的，在理论及实用上均 具有重要意义。 1 6 本课题研究的内容、目的和意义 1 6 1 研究内容 ( 1 ) 根霉z m 1 0 脂肪酶的分离纯化条件 ( 2 ) 根霉z m 1 0 脂肪酶的基本酶学性质 ( 3 ) 根霉z m 1 0 脂肪酶活性中心的化学修饰 1 6 2 研究目的和意义 通过对根霉z m 1 0 脂肪酶的分离纯化条件的探索，建立根霉z m - 1 0 脂肪酶最佳的分离纯化条件；明确根霉z m 1 0 脂肪酶的基本酶学性质包 括最适温度及p h 、温度及p h 稳定性、金属离子影响、有机溶剂稳定性； 通过对根霉z m 1 0 脂肪酶活性中j 心的化学修饰，呀确该酶表现酶活的必 需氨基酸及活性中心氨基酸种类。本实验以根霉z m 1 0 为出发菌株，对 其产细胞内脂肪酶进行了分离纯化，对其基本的酶学性质进行了研究，并 以纯化后的酶类为原料通过对其氨基酸侧链基团的化学修饰，初步探明脂 肪酶分子中表现酶活性所必需的氨基酸的种类、酶活性中心部位氨基酸种 类和个数，揭示脂肪酶的结构与功能的关系，以期为今后根霉z m 1 0 脂 肪酶研究提供理论和方法基础。 根霉z m l o 脂肪酶酶学性质和化学修饰 1 7 技术路线 l 根霉菌株的活化 上 i 根霉的扩大培养 1 4 过硫酸铵 s d s 考马斯亮蓝r 2 5 0 p 巯基乙醇 b s a 蛋白m a r k e r c h t n b s 葡萄糖 无水乙醇 e d c h c i 夏斯 夏斯 夏斯 夏斯 上海伯奥生物科技有限公司 中国科学院上海生物化学研究所 上海晶纯试剂有限公司 上海晶纯试剂有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 天津市百世化工有限公司 上海晶纯试剂有限公司 1 5 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 根霉z m 1 0 脂肪酶酶学性质和化学修饰 2 4 主要仪器 仪器名称 蛋白分离纯化系统 u v 0 2 1 0 0 型分光光度计 冷冻离心机 p b 1 0p h 计 h h s 恒温水浴锅 h h - b 1 1 5 0 0 电热恒温培养箱 s w - c j i f 超净工作台 z d 8 5 a 气浴恒温振荡器 q l 9 0 1 涡旋器 y x q g 0 2 电热式蒸汽消毒器 n i k o ny s 2 电子显微镜 海尔冰柜 电子天平 k d m 型可调控温电热套 a l p h a i 5 真空冷冻干燥仪 层析柱 2 5 实验方法 生产厂家 瑞典g ea k t a p u r i f i e r1 0 0 尤尼柯仪器有限公司 美国b e c k m a nc o u l t e r 公司 s a r t o r i u s 公司 江苏省金坛市正基仪器有限公司 上海市跃进医疗器械一厂 苏州安泰空气技术有限公司 常州澳华仪器有限公司 其林贝尔仪器制造公司 山东新华医疗器械厂 日本尼康光学仪器有限公司 青岛海尔特种电冰柜有限公司 上海精天电子仪器有限公司 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司 德国c h r i s t 公司； 上海华美实验仪器厂。 2 5 1 细胞内脂肪酶的制备 菌种在麸皮汁蔗糖斜面培养基培养3 d ，用无菌水洗下孢子，稀释成 孢子悬浮液。l m l 孢子悬浮液接到5 0 m l 发酵培养基q b ( 2 5 0 m l 三角瓶) ， 在3 0 。c 培养箱中培养7 2 h 。取上层菌丝体，冰冻后在真空冷冻干燥机中冻 干。在冰浴中用研钵将菌丝体磨成粉状，用一定量p n8 0 的t r i s h c l 缓 冲溶液溶解，4 c 下浸提3 0 m i n 后1 2 0 0 0 r m i n 冷冻离心1 0 r a i n ，取上清液 定容即为粗酶液。 2 5 2 根霉脂肪酶的分离纯化 2 5 2 1 透析袋的选择与处理 将透析袋用蒸馏水洗净，严格检查有无漏洞。使用前经过以下处理： 1 6 山东农业人学硕七学位论文 将透析袋剪成合适长度，在l m m o l le d t a 溶液中，煮沸1 0 m i n ，再在2 n a h c 0 3 溶液中煮沸1 0 m i n ，最后在蒸馏水中煮沸1 0 m i n 即可使用。 2 5 2 2 盐析 当高浓度的盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀，这一现象称为盐 析。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的 分离纯化。几种因素如p h 、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质的盐析 点时起着重要作用。选择( n h 4 ) 2 s 0 4 是因为它具有一些优良性质，如盐析 的有效性、范围广、溶解度高、溶液散热少并且经济适用。 经测定发现酶蛋白沉淀主要发生在一定( 4 0 7 0 ) 的饱和度区间， 利用酶蛋白和杂蛋白在( n h 4 ) 2 s 0 4 中溶解度的差异可实现对脂肪酶的选择 性沉淀，并得到粗酶液。分别取一定体积的粗酶液，缓慢加入( n h 4 h s 0 4 固体至其饱和度分别为：2 0 ，3 0 8 0 ，慢搅1 h ，溶解后4 。c 静置 过夜，离心后分别收集上清液和沉淀测定酶活及蛋白浓度。 2 5 2 3 透析脱盐 将沉淀用缓冲液溶解后放进透析袋中透析，透析液用k h 2 p 0 4 n a o h 缓冲液( p h 7 0 ，2 0 m m o l l ) ，样品与透析液的体积比为1 ：2 0 。放置冰箱 透析，每隔6 h 左右换液一次，透析时间2 4 h 。 2 5 2 4d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w ( 1 6 c m x 2 0 c m ) 柱层析 离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。它对蛋白质 的分辨率高，操作简易，重复性好，成本低。按照离子交换原理，蛋白质 可从大量缓冲液中被分离，所以此方法尤其适用于蛋白质粗提物的初始纯 化。可进行离子交换的蛋白质在实验条件下必须有单一电荷，溶液中单一 电荷的蛋白质可被离子交换树脂上的小离子置换指与蛋白质末端离子的 交换，并且能够被固定在树脂上。通过提高溶液中相反离子浓度或降低蛋 白质所带电荷数等方法可将蛋白质从树脂上洗脱下来。利用此法，可根据 蛋白质电荷性质不同而将其分离开来。 取一定体积浸泡于2 0 乙醇的d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换剂， 用已配好的数倍体积上样缓冲液平衡过夜，将平衡的离子交换剂装柱。待 其沉降后用同样缓冲液以一定的流速再平衡数个柱体积，待洗脱液p h 与 上样缓冲液p h 一致后，上样。上样后先用平衡缓冲液洗脱未吸附蛋白， 根霉z