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联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 摘要 拟除虫菊酯类杀虫剂因高效、低毒、易生物降解等特性而比有机 氯、有机磷类杀虫剂使用更为广泛。目前的研究已有很多报道关于拟 除虫菊酯在急性水生生物毒性方面的对映体选择性，但对于哺乳动物 细胞的毒性作用在对映体选择性差异方面的研究还鲜有报道。 本文首先利用c h i r a l c e lo j h 手性液相色谱柱，实现了c i s b f 两个 对映异构体的正相高效液相色谱拆分，并通过6 8 9 0 n 气相色谱对 1 r - c i s b f 及l s - c i s b f 两个对映异构体进行了定量分析。 本论文主要在对映体层面上研究了联苯菊酯( b i f e n t h r i n ，b f ) 对 人羊膜细胞( f l ) 的细胞毒性、遗传毒性及其对靶标生物菜青虫p f 盯话 r a p a el 的杀虫活性。结果显示：在以f l 细胞为模型的一系列体外实 验中，m t t 法检测细胞生长活力表明当染毒浓度超过3 0 m g l 时，根 据f l 细胞存活率判断联苯菊酯对f l 细胞毒性强度依次为 1 s - c i s b f ( 5 5 ) r a c e m a t e ( 6 0 ) i r c i s b f ( 8 2 ) ( 矽 0 0 5 ) ；活性氧 ( r o s ) 水平测定实验表明染毒后f l 细胞r o s 水平明显升高，其中 1 s - c i s b f 染毒后f l 细胞内r o s 产生量与染毒浓度呈现一定的剂量效 应关系，在最高染毒浓度2 0 m g l 条件下，1 s - c i s b f 作用f l 细胞后 r o s 产生量是l r c i s b f 的1 4 7 倍之多0 1 r c s b f ( 8 2 ) ( p o 0 5 ) a c c o r d i n gt ot h ec e l lv i a b i l i t yo ff lc e l l sw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fb i f e n t h r i nw a sa b o v e3 0 m g l t h ee l e v a t i o no fr o s p r o d u c t i o nw a si n c u b a t e dw i t hb fi nf lc e l l s ，a n df lc e l l si n c u b a t e dw i t h 浙江工业大学硕士学位论文m 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 is - c i s b fe x h i b i t e da d o s e - d e p e n d e n t a c c u m u l a t i o no fi n t r a c e l l u l a r r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，a n dt h er o sp r o d u c t i o no ff lc e l l s i n c u b a t e dw i t h1s - c i s b fw a s1 4 7t i m e sm o r et h a n1r c s b fa tt h e m a x i m u me x p o s u r ec o n c e n t r m i o no f2 0m g l ( p 0 o1 ) i nt h ec o m e t a s s a y ，s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e di nd n at a i ll e n g t ho ff lc e l l s b e t w e e nt h eg r o u pe x p o s e da tc o n c e n t r a t i o no f5 0 m g la n dt h ec o n t r o l g r o u p ，a n dt h et a i ll e n g t ho fd a m a g e dd n ai n c u b a t e dw i t h1s - c i s b fw a s 3 4t i m e sm o r et h a n1r c s b f ( p 0 0 1 ) t h ec y t o s k e l e t o nm o d i f i c a t i o n w a so b s e r v e db yf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea f t e rf i t c - p h a l l o i d i n st a i n i n g a t t h ec o n c e n t r a t i o no f5 0 m g l ，t h ed a m a g eo fc y t o s k e l e t o ni nf lc e l l s i n c u b a t e dw i t h1s - c i s - b ff o r2 4 hw a sv e r yo b v i o u s ，t h ea b n o r m a la n d i n c o m p l e t ef - a c t i nw e r eo b s e r v e di nf lc e l l s b u ti nt h es a m ec o n d i t i o n ， f lc e l l si n c u b a t e dw i t h1r - - c s - b fh a da l m o s tn oe f f e c to nt h ed a m a g eo f c y t o s k e l e t o n t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t 1s - c i s b fw a s s t r o n g e r t h a n 1 尺- c 括- b fi nd a m a g i n gc y t o s k e l e t o nf o rf lc e l l s t h ec y t o f l o wa n a l y s i s i n d i c a t e dt h a ta f t e re x p o s e dw i t hb fa tt h ec o n c e n t r a t i o no f5 m g la n d 5 0 m g l ，t h ea p o p t o s i sr a t eo ff l c e l l sw a si n c r e a s e d ，a n dt h ea p o p t o s i sr a t e o ff lc e l l si n d u c e db y1s - c i s b fw a s3t i m e sm o r et h a n1 r c s b fa tt h e c o n c e n t r a t i o no f5 0 m g l w h i l et h el c s ov a l u e so fe n a n t i o m e rt ot h et a r g e t p e s to np t e r t sr a p a el s h o wt h a t 1r c i s b fw a s3 0 0t i m e sm o r ea c t i v e t h a nls - c i s b f a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n ts t u d yi nv i v oa n di nv i t r o ，t h e s er e s u l t s 浙江工业大学硕士学位论文 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 i n d i c a t e dt h a tt h ee n a n t i o s e l e c t i v ec y t o t o x i c i t ya n dp e s t i c i d a l a c t i v i t yo f b i f e n t h r i nb e t w e e nn o n t a r g e to r g a n i s ma n dt a r g e to r g a n i s mw a sr e v e r s e t h e s ei m p l i c a t i o n st o g e t h e rs u g g e s tt h a ta s s e s s m e n to ft h ee n v i r o n m e n t a l s a f e t ya n dn e wp e s t i c i d e sd e v e l o p m e n tw i t hc h i r a lc e n t e r ss h o u l dc o n s i d e r e n a n t i o s e l e c t i v i t y k e yw o r d s ：s y n t h e t i cp y r e t h r o i d s ；b if e n t h r i n ；c y t o t o x i c i t y ；p e s t i c i d a l a c t i v i t y ；e n a n t i o s e l e c t i v i t y 浙江工业大学硕士学位论文 v 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 b f - 联苯菊酯 r o s 一活性氧族产物 s p 删除虫菊酯 d h t 一双氢睾酮 符号说明 f l 一人羊膜细胞 l c 5 旷一半致死浓度 a i 卜雄激素受体 i c 5 口一半抑制浓度 l a b c 一肛提肌加球海绵体肌l d 5 旷一半数致死量 b s 卜牛血清蛋白 o v a 一卵清蛋白 l d l 一检出限 h p i ，c 一高效液相色谱 g c 一气相色谱法 l p o 一脂质过氧化物 n p d 一氮磷检测器e c 5 伊一半致畸浓度 l b c 一2 - 甲基- 3 一苯基苄基氧基羰基 m 1 t 一3 ( 4 ，5 - - - 甲基2 噻唑) 2 ， 丙酸5 二苯基溴化四唑 l b y 一2 甲基3 苯基苯甲酸f p d 一火焰光度检测器 d n b l ，3 - - - i 肖基苯 e c d 一电子俘获检测器 s f c 一超临界色谱法c h o 一卵巢细胞 c e 一毛细管电泳法 t l c - 一薄层色谱法 c e c 一电色谱法 p c 一纸色谱法 h p m c 一高效膜色谱法 c m p 一手性流动相 c d 一环糊精c s p 一手性固定相 e l s d 一蒸发激光光散射检测器d m s o - - 一- 甲基亚砜 d c f h d a _ 一二氯荧光素二乙酸酯e d t 卜乙二胺四乙酸 f p h d - - f i t c 标记的鬼笔环肽e b 溴化乙啶 o d 一光密度p s 一磷脂酰丝氨酸 浙江工业大学硕士学位论文 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 p 卜碘化丙啶 n m p 一正常熔点琼脂糖 f a c t i n _ 肌动蛋白聚合体 a n o v 卜单因素方差分析 l o o h 一氧化脂 d d t 一滴滴涕 c h 一中国仓鼠卵巢细胞 d c f h 一27 ，7 ，- 二氯氢化荧光素 p b s 一磷酸盐缓冲溶液 l m p 一低熔点琼脂糖 s 驴一标准偏差 i r a c 一国际抗性行动委员会 s c g e _ 一单细胞凝胶电泳 a t p a s e - - - - _ 三磷酸腺苷酶 f i t c 一异硫氰酸荧光素 浙江工业大学硕士学位论文 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名： 。弘私日期：涉7 年f 月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 纭氍、 纠杉彤屏 f1 日期：泖7 年广月弓，日 酩胁n r 卧仆1 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选样性研究 1 1 选题背景及意义 第一章前言 在非手性的环境里，手性污染物的对映异构体具有相同的物理和化学特性， 但是由于生命体系具有极强的手性识别能力，不同构型的立体异构体往往表现出 不同的生理、生化与毒理性质【i ，2 】。1 9 9 6 年世界农药市场上使用的农药中约有2 5 以上是具有手性中心的【3 】，并且随着结构更复杂的化合物投入使用，这个比率呈渐 增趋势1 4 1 。经过十几年的发展，目前我国市场上使用的农药中约有4 0 以上具有手 性结构，且主要为拟除虫菊酯杀虫剂、有机磷杀虫剂、三唑类杀菌剂以及芳氧丙 酸酯类【5 】。对于手性化合物，通常只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一 种没有显著的生物活性甚至无效，也或者具有更强的环境危害。由于受到认识和 技术的限制，这种差异性还没有得到人们的足够重视，大多数手性农药仍然是作 为单一化合物进行商品化，因此对手性农药在环境安全、生态毒性以及人类健康 风险方面的对映体选择性进行评价显得尤为重要。近年来关于手性农药在环境归 趋中的对映体选择性已经有一些研究，如急性水生生物毒性【4 6 】、胚胎发育【7 1 、致 癌性和内分泌干扰性【8 】。相关的研究表明手性农药在细胞毒性及一些效能上表现出 不同甚至完全相反的作用，细胞毒性的测定是对环境和生态毒性进行评价的一种 有效的方法。但是利用细胞为模型对手性农药进行对映体选择性方面的研究并不 多，目前大量的手性农药仍然被当作单一非手性的化合物来生产和使用的事实也 反应了这一方面研究的欠缺。 自7 0 年代中期以来，拟除虫菊酯( s p s ) 因其高效低毒而得到广泛使用，在 高毒有机磷农药被禁止使用后，拟除虫菊酯杀虫剂有了更广泛的使用空间，但在 使用的同时也带来了环境污染和食品安全等问题。由于拟除虫菊酯在农作物病虫 害的防治和家庭有害昆虫防治中应用尤其广泛，因而人类长期暴露的可能性非常 大【9 , 1 0 】。拟除虫菊酯的大量使用也增加了其它非靶标生物( 如鸟类、鱼类以及生存 于土壤和水体中的有机生物) 长期暴露于这类农药的风险性】。某些拟除虫菊酯 类杀虫剂残留期较长，不仅对蜜蜂、家蚕和蝶类等农业有益生物的毒性较大，对 鱼、虾、蟹、贝等水生生物毒性也较高，而且大部分拟除虫菊酯类农药属于环境 激素类物质，对哺乳类动物的正常生理活动有很大影响，所以长期接触即使是低 浙江工业大学硕士学位论文 l 联苯菊酶的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 剂量也会引起慢性疾病【1 2 , 1 3 】，有些类型的拟除虫菊酯还有致畸、致癌、致突变的 作用【1 4 16 1 。一些体外实验表明拟除虫菊酯的细胞毒性作用可导致d n a 链断裂和基 因突变【1 7 , 1 8 l 。体外实验尤其是细胞培养法对环境毒性评价是非常敏感而有效的。 联苯菊酯( b f ) 是一种目前广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂，因其广谱的杀 虫、杀螨活性而被大量应用于农业生产和家庭生活等方面f 1 9 l 。在南加利福尼亚， 科研人员在9 5 0 o - - 1 0 0 的沉积物样品中检测到联苯菊酯，在干季测定的最高浓度 达到5 4 2 9 9 k g ，在湿季测定的最高浓度达到1 2 2 r , g k g t 2 0 1 。联苯菊酯( c i s b f ) 是 一种手性农药，有两个对映异构体1 s - c i s b f 和l r c i s b f 。本课题组目前已有一些 关于联苯菊酯对水生生物【4 p 7 l ( 如网纹水蚤( c d u b i a ) 、大型蚤( d m a g n a ) 、斑 马鱼) 的急性毒性以及联苯菊酯在内分泌干扰效应上的对映体选择性研究【8 】。查阅 相关文献发现，近年来以昆虫和动物为模型对联苯菊酯的毒性研究非常之多，但 是以哺乳动物细胞为体外模型对人体进行细胞毒性和遗传毒性的研究却鲜有报 道。本课题通过在对映体层面上对联苯菊酯体外细胞毒性和体内靶标生物的急性 毒性试验研究，对现有手性污染物进行了对映体层面上的毒理学数据补充。 1 2 本文的研究内容 细胞毒性检测是利用靶标细胞的增殖和凋亡等效应来检测环境化学物毒性 的一种体外分析实验。我们选取离体培养人羊膜( f l ) 细胞模型作为研究人体内 作用的替代模型。人羊膜( f l ) 细胞系最初来自正常的羊膜【2 1 l ，近年来这种细胞 一直被用作于一些环境化学物的毒性检测实验中，如微囊藻毒素和三丁锡的毒 性1 2 2 , 2 3 】。本文通过体内和体外相结合的试验方法，研究了联苯菊酯对靶标生物鳞 翅目昆虫菜青虫( p i e r i sr a p a el ) 杀虫活性的对映体选择性以及通过联苯菊酯对 f l 细胞活力、活性氧水平、d n a 损伤、细胞骨架损伤、细胞凋亡的研究，进一步 分析了联苯菊酯的细胞毒性、遗传毒性的对映体选择性。 本文实验为从对映体水平上研究联苯菊酯进而到研究手性农药对靶标生物的 活性及对非靶标生物毒性的对映体选择性，以及为研究更加安全有效的农药提供 了一定的理论依据。由于受到分离技术的限制，在手性层面上研究拟除虫菊酯的 非靶标环境安全性几乎没有，现有的毒理学数据也大多是基于外消旋化合物存在 的，而通过非手性分析得到的农药毒理学数据与实际的生态毒理学效应并不相符。 手性农药的对映体进入生物体内的手性环境将作为不同的分子加以匹配，因此在 浙江工业大学硕士学位论文2 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 生物活性、药代动力学和毒理学等方面均存在对映体的立体选择性作用。对映体 选择性可能极大的影响手性农药在非靶标环境中的生态毒理效应。所以在研究手 性农药时，必须弄清它们对靶标生物活性及非靶标生物毒性以及在生态系统中生 物降解或生物富集过程中的对映体选择性。我们的研究结果也再次说明，从对映 体层面分析手性农药的细胞毒性对于相关生态毒性和健康风险性的评价具有重要 的现实意义和指导价值。 浙江工业大学硕士学位论文 3 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 第二章文献综述 2 1 拟除虫菊酯的毒理学研究 拟除虫菊酯( s y n t h e t i cp y r e t h r o i d s ，s p s ) 是上世纪7 0 年代人工合成的一类重要的 杀虫剂，最初是从除虫菊类植物( 除虫菊是指菊科菊属除虫菊亚属的若干种植物) 中所含的有效成份除虫菊素发展而成的。根据拟除虫菊酯化学结构的不同可分为 两型：不含a 氰基的i 型( 以氯菊酯为代表) 和含a 氰基的i i 型( 以氯氰菊酯、溴 氰菊酯和氰戊菊酯等为代表) 2 4 , 2 5 1 。迄今已商品化的拟除虫菊酯有5 0 多种，因其 具有高效、低毒、广谱、击倒快、残留少等特点，被广泛应用于农业生产和家庭 生活中。 拟除虫菊酯作为一种神经毒物，其神经毒作用的研究较多，它能影响昆虫的 神经系统，是杀虫作用的主要机理之一， 哺乳动物等多种生物的钠离子通道活性， 但它同时也能影响昆虫以外的鱼类以及 从而干扰神经系统的正常功能【2 6 1 。拟除 虫菊酯类杀虫剂作用于昆虫神经轴突部位，抑制昆虫的a t p a s e ，能延缓昆虫钠离 子通道的开关【2 7 1 。菊酯类药剂是轴突毒剂，与d t l 作用十分类似，但比d t r 作用 复杂。它同时具有驱避、击倒、毒杀作用，一般认为，驱避作用是除虫菊酯作用 与感觉器官引起的，不影响神经系统，而击倒只影响周围神经，毒杀则破坏中枢 神经系统；通常认为拟除虫菊酯杀虫剂通过对哺乳动物中枢神经和外周神经的损 坏造成神经毒性作用，而且这种神经毒性作用和s p s 杀虫剂的非靶标生物的状况相 关，包括体质、年龄及其发育阶段等方面【2 8 】。 电生理学研究表明，i i 型拟除虫菊酯影响钠通道的门控过程，使钠通道长时 间不关闭【2 9 1 ，但对电压门控氯通道的作用却相反，即减少氯通道的关闭时问【3 0 ， 这似乎对拟除虫菊酯由钠通道引发的毒性效果起了补充或放大作用。用氰戊菊酯 和胺菊酯对大鼠神经细胞所做的研究表明，这类杀虫剂对钠及钙通道的作用特点 为：低剂量时激活，高剂量时抑制，但激活作用较弱，抑制明显【3 1 1 。n a r a h a s h i 研 究小组用膜片钳技术证实拟除虫菊酯引起神经兴奋性毒性是因为延迟神经细胞钠 通道的关闭过程，也就是拟除虫菊酯占领钠通道结构部位( 位于钠通道内外两侧 之间的疏水性区域) ，延迟钠通道的失活过程，产生持久的活化，导致重复后放 3 2 - 3 6 。进一步在分子水平上的研究发现，拟除虫菊酯类杀虫剂对电压敏感的钙通 浙江工业大学硕士学位论文 4 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 道的作用和对钠通道的作用互不影响【3 7 ，3 8 1 。钠通道是拟除虫菊酯类杀虫剂的主要 作用靶标，且拟除虫菊酯主要作用于钠通道的0 【亚单位的s 6 片段上的位点【3 9 , 4 0 】。电 生理学实验研究提示，哺乳动物神经元钠通道在相当于昆虫钠通道s u p e r - k d r 的位置 上的氨基酸残基是异亮氨酸而不是蛋氨酸，当用蛋氨酸取代野生大鼠的钠通道的 异亮氨酸时可使其对溴氰菊酯的敏感性增加1 0 0 倍。这也许就解释了为什么拟除 虫菊酯类杀虫剂对哺乳动物毒性较低，而对昆虫有强烈的毒杀作用。 由吴霞编译【4 2 】有关拟除虫菊酯等杀虫剂的作用机制最新进展，我们可以对拟 除虫菊酯杀虫剂的选择毒性有进一步的认识。拟除虫菊酯类杀虫剂对昆虫的毒性 要比对哺乳动物的毒性高出许多。以前人们一般都认为由于哺乳动物体内较高的 酶解毒能力导致了选择毒性的产生。然而，更进一步的实验分析已清楚地表明， 神经钠离子通道在选择毒性方面起到十分重要的作用。根据实验分析，拟除虫菊 酯对于神经的效能随着温度依赖性、内在敏感性、修复速率、酶促作用、体型大 小这5 个系数的不同而不同。众所周知，拟除虫菊酯和d d t 两类杀虫剂在低温条件 下比在高温条件下杀虫效力更佳。由于哺乳动物和昆虫之间的体温存在差异，除 虫菊酯类杀虫剂作用于钠离子通道因温度依赖性引起的神经效能，在昆虫体内是 哺乳动物的5 倍。拟除虫菊酯类杀虫剂对钠通道的内在敏感性，在哺乳动物体内要 比昆虫体内低许多，两者相差l o 倍。与此相关的另一方面是在洗提出拟除虫菊酯 类物质之后的钠通道的修复率大小，对哺乳动物而言其修复速度大大快于在昆虫 体内的修复速度，差别系数约是5 。由于温度差异，推测起来两者的解毒速率哺乳 动物是昆虫的3 倍。哺乳动物较大的体型尺寸也将为拟除虫菊酯在到达靶标位之前 被解毒提供更多的机会，估计这一差别系数为3 。把所有的这一系列差异相乘，结 果得到两者差异系数的总和为2 2 5 0 。这个数值足以在哺乳动物和昆虫的l d 5 0 值之 间形成差别，其范围是两者相差5 0 0 - - - 4 5 0 0 倍。 神经递质物质是参与神经信号传导的重要组成成分，而s p s 影响了对多种神经 递质物质的释放。研究发现s p s 可以影响脑部不同部位神经递质的释放，在对自由 活动大鼠的研究中发现拟除虫菊酯能够改变乙酰胆碱的释放【4 引。2 0 0 5 年 m u h a m m a d 等的研究也发现，i 型菊酯丙烯菊酯和i i 型菊酯氯氟氰菊酯、溴氰菊酯 可以影响大鼠的乙酰胆碱的释放和功能【4 4 1 。这一研究小组2 0 0 6 年的研究又发现丙 烯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯还可以影响大鼠中多巴胺的变化【4 5 1 。国内学者利用 标记的谷氨酸，研究s p s 对大鼠脑突触小体谷氨酸摄取的影响，在所给剂量范围内， 浙江工业大学硕士学位论文 5 联苯菊酯的细胞毒性及蓉虫活性的对映体选择性研究 溴氰菊酯和氯菊酯可干扰脑组织高亲和性谷氨酸摄取机制的功能，其中以含( i t 氰基 的溴氰菊酯作用较强。应用脑片放射性同位素标记竣基递质释放实验，以及体外 观察拟除虫菊酯对大鼠额叶皮层兴奋性氨基酸释放过程的影响，发现4 种s p s ( 溴氰 菊酯、北京菊酯i i 号、i i i 号和氯菊酯) 对脑片静息态谷氨酸基础释放无明显作用， 溴氰菊酯可促进脑片在5 0 m m o l l 氯化钾去极化状态下谷氨酸的释放，表明s p s 可能 主要通过改变n a + 通道活性而增加突触前神经末稍兴奋性氨基酸递质谷氨酸的释 放，干扰递质突触传递过程m , 4 r l 。 2 2 联苯菊酯的用途及研究概况 随着农药的大量使用，对环境、人体的影响也日益得到人们的关注。目前高 毒、剧毒农药的限制使用，促进了高效、低毒、低残留农药大量开发、研制、生 产，其急性毒性小于高毒农药，远期危害性研究成为关注的重点。联苯菊酯是一 种较新的拟除虫菊酯类杀虫剂，无论在农业生产还是在城市环境中，联苯菊酯都 有着极为广泛的应用。 2 2 1 联苯菊酯的用途 联苯菊酯是8 0 年代初期开发的一种高效杀虫剂，国际上主要由美国f m c 公司 生产，它具有杀虫谱广，击倒作用快，持续时间长的特点，具有强大的胃毒和触 杀作用，无内吸和熏蒸活性。其主要防治对象有：禾谷类作物、棉花、果树、 葡萄、观赏植物和蔬菜上的鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、鳞翅目和直翅 目等叶面害虫，也可防治某些害螨，尤适宜虫、螨并发时使用【4 s 】。联苯菊酯为 中等毒性杀虫剂，其对害虫神经细胞产生抑制作用，导致虫体无力和麻痹，最终 虫体死亡。由于其广谱、高效、低残留和对人体毒性较小等优点，也被广泛用于 家庭白蚁、羊毛蛀虫防治等家庭有害昆虫防治中【4 9 j 。尽管联苯菊酯具有广谱的高 效生物活性，但它对非靶性物种几乎没有危害，尤其是它对哺乳动物危害极小。 这是因为它具有不溶解于水的特点，不易被水浸渍，且在动植物体内无内吸作用， 因此，它很难通过其它途径侵入人体或其它非目标性生物体内。而一旦有进入生 物体内的意外发生，由于联苯菊酯在动物体内容易通过新陈代谢作用，不发生累 积作用，从而不会通过生物浓缩富集，对环境和生态系统影响较小【矧。 2 2 2 联苯菊酯的分析测试研究 浙江工业大学硕士学位论文 6 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 联苯菊酯的分析可采用气相色谱方法。据文献报导，一般的分析可采用气相 色谱，异构体含量的分析则应采用高效液相色谱法，残留物的分析则应采用具有 e c d 为检测器的气相色谱分析方法。楼小华等则应用细管气相色谱技术，对5 9 种 农药进行了分析，并考察te c d 、n p d 、f p d 三种检测器对各自选择性农药的灵敏 性和准确性。联苯菊酯在0 2 m m 内径x 2 5 m 长，固定液o v 1 0 1 ，厚度0 2 5 9 i n ，进样 温度3 0 0 0 c ，检测器温度2 8 0 0 c ，柱温采用程序升温的条件下，可得到有效分离检 测，其最小检出l - y g o 0 0 5 n g l 5 。张平南等采用正相高效液相色谱法测定联苯菊酯 含量的方法，使用正相色谱柱和紫外检测器，以正己烷和无水乙醚体积比9 6 ：4 为 流动相，对联苯菊酯原药中的联苯菊酯含量进行测定。该方法的标准偏差为0 1 5 ， 变异系数为0 2 ，线性相关系数为0 9 9 9 6 4 ，回收率为9 9 4 0 o - - 1 0 0 2 t 5 2 1 。沈萍萍采 用癸二酸二异辛酯为内标物以毛细管气相色谱法进行分析，以s e 5 4 色谱柱氢火焰 检测器定量分析联苯菊酯的含量，其方法的标准偏差为0 3 0 ，变异系数0 5 6 ，线 性相关系数为0 9 9 9 9 ，平均回收率9 9 8 t 5 ”。 目前对联苯菊酯的残留分析主要采用气相色谱法和高效液相色谱法。这些方 法检测费用高，不适合进行批量样品的快速检测。而农药残留免疫分析技术以其 简单、快速、廉价，特别适用大批量样品检测等优点得到全面迅速地发展【5 4 】。目 前，已有很多拟除虫菊酯酶联免疫吸附分析方法的报道，如氯菊酯、氯氰菊酯、 甲氰菊酯、溴氰菊酯及氰戊菊酯。水中溶解度低和半抗原合成的难度大是建立拟 除虫菊酯酶联免疫方法的主要问题【5 5 】。李波等研究以联苯菊酯的代谢物为免疫半 抗原，对联苯菊酯进行了酶联免疫方法的研究。利用联苯菊酯的代谢物联苯醇合 成了联苯菊酯的半抗原l b c ( 2 甲基3 苯基苄基氧基羰基丙酸) 和l b y ( 2 甲基3 苯 基苯甲酸) 。通过碳二亚胺法将l b c 交联于牛血清蛋白( b s a ) 作为免疫抗原 ( l b e b s a ) ，通过活泼酯法将l b c 和l b y 分别交联于卵清蛋白( o v a ) 作为包被抗 原( l b c o v a 和l b y o v a ) ，l b c b s a 为免疫原制各了联苯菊酯的兔抗血清，间 接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达5 1 2 x 1 0 4 。通过同源异源分析，发 现异源分析的灵敏度较高，对p h 值、离子强度、甲醇含量等影响因素进行了研究， 0 3 m o l l 钠离子强度的磷酸缓冲液( p h 7 5 ) 和3 0 的甲醇确定为联苯菊酯间接竞争 酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件，该方法的i c 5 0 为2 1 6 = l - 0 3 2 m g l ，检出限 ( l d l ) 为0 0 1 6 - 士o 0 0 2 m g l 。对大部分拟除虫菊酯，如三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、 氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和拟除虫菊酯的代谢物3 苯氧基苯甲酸没有明显的 浙江工业大学硕士学位论文 7 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 交叉反应【5 6 】。 2 2 3 联苯菊酯的毒理学研究 2 2 3 1 急性毒性 据报道联苯菊酯原药对大鼠急性经1 2 毒性l d 5 0 为5 4 5 m g k g ，对兔急性经皮毒 性l d 5 0 大于2 0 0 0 m 眺寥5 0 ，57 1 。1 0 联苯菊酯乳油对大鼠急性经口毒性雌性l d 5 0 为 1 4 7 m g k g ，雄性l d 5 0 为3 1 6 m g k g ，为中等毒性。1 0 联苯菊酯乳油急性经皮毒性 雌雄l d 5 0 均大- 于2 1 5 0 m g k g ，属于中等毒性【5 引。2 5 联苯菊酯乳油对意大利蜜蜂成 年工蜂，采用摄入法毒力测定l c 5 0 为1 6 2 6 3 m g l ，属于高等毒性【5 9 】。联苯菊酯对 鸟类低毒，对鹌鹁急性经口毒性l d s o 为1 8 0 0 m g k g ，对野鸭大- 于4 4 5 0 m g k g 。对鱼 毒性很高，对虹鳟l c s o ( 9 6 j x 时) 为0 1 5 i - t g l ，水蚤l c s o ( 4 8 d x 时) 为0 1 6 p g l 。联苯 菊酯对大型涵e c 5 0 ( 2 4 d x 时) 、l c 5 0 ( 4 8 d , 时) 和l c 5 0 ( 9 6 d , 时) 分别为3 2 4 、1 2 4 0 和 1 4 0 1 a g l 硎。 2 2 3 2 神经毒性 j l h o l t o n 等则进行了几种药物关于影响神经细胞活性的可能性研究，其 中，联苯菊酯与l ，3 二硝基苯( d n b ) 对鼠的对比研究中，联苯菊酯可能在共济失调 和其它功能上产生的效果l 匕d n b 更明显【6 1 1 。m j w o l a n s k y 等在i 型拟除虫菊酯杀虫 剂联苯菊酯的使用剂量对l o n ge v a n s 大鼠的神经行为综合效应评价的实验中，将联 苯菊酯溶于玉米油对大鼠经急性经口毒性试验。采用在毒理研究中常用的两个剂 量浓度1 m l k g 和5 m l k g ，分别对大鼠进行4 h 和7 1 1 染毒后的自主活动和神经病理检 查。在任一定量条件下给予4 8 个剂量( 直到2 0 或2 6 m g k g ，分别在l m l k g 和5 m l k g 剂量下) ，联苯菊酯对大鼠急性经口毒性试验表现出的典型症状与i 型拟除虫菊酯 杀虫剂相同。随着染毒剂量增加，大鼠联苯菊酯中毒特征表现为早期躁动、爪抓 脸、身体扭动，之后出现震颤、抽搐，自主活动和抓握能力减弱，爬卧、瘫卧、 头部震颤加强、体温升高。实验表明在l m l k g l 拘剂量浓度下，联苯菊酯作用于自 主活动的效能是5 m l k g ；1 ：u 量浓度的2 倍之多。这一差异在4 h 染毒表现明显，7 h 染毒 表现稍弱【6 2 1 。 2 2 3 3 致突变性研究 姜红等【6 3 利用致突变性实验鉴定生殖细胞、体细胞的致突变性以及潜在致癌 浙江工业大学硕士学位论文8 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 性，探讨高效低毒农药联苯菊酯原药的潜在危害。实验发现联苯菊酯原药的小鼠 骨髓细胞微核实验、精子畸变实验以及a m e s 实验均为阴性结果，表明在上述实验 系统未显示致突变性，与国内报道一致【6 4 1 。但a m e s 实验出现抑菌作用，建议适当 降低a m e s 实验的实验浓度。 2 2 3 4 内分泌干扰作用 朱威等采用体内、体外相结合的方法首次发现联苯菊酯具有抗雄激素作用， 其可能的作用机制是拮抗a r 。雄激素受体报告基因试验中，联苯菊酯在未引起明 显细胞毒性的1 0 一1 0 巧m n 量下就能抑f 1 t j d h t 依赖的a r 活性，并呈剂量效应关系， 其通过作用a r 而抑制荧光素酶报告基因表达的i c s o 值为0 4 8 2 i t g m l 。h e m h b e r g e r 试验中联苯菊酯1 3 5 m g ( k g d ) 剂量组大鼠表现为雄激素依赖组织重量减轻，并出现 在一般毒性之前。其研究中血清睾酮不受影响，腹侧前列腺、精囊腺以及l a b c 都 显著性下降，符合a r 拮抗剂的表现，结合a r 报告基因试验的结果，认为联苯菊酯 的作用机制之一可能是通过拮抗a r 影响雄激素依赖组织的重量【6 5 j 。 2 3 细胞毒性 我国每年都生产和使用大量的农药，农药的生产和使用，可通过多种途径进 入大气、河流和海洋，通过食物链造成多种生物危害，从而直接或间接地造成对 人类的危害。现在对农药的深层次研究较少，对常用农药的生殖毒性、胚胎毒 性、细胞毒性和遗传毒性这些不被一般人所认识而又影响深远的毒性研究不足， 目前对农药的生殖毒性、胚胎毒性、遗传毒性和细胞毒性的研究主要是对其毒性 效应的描述，而对其毒性产生机制的研究还相当不足，而且目前对农药毒性的研 究大都在较高剂量( 不低于田间使用剂量) 水平进行，痕量农药的毒性研究未受到 重视。因此对常用农药加强农药毒性机制的深入研究，揭示其危害程度，可为农 药的使用安全性提供实践指导。 2 3 1 细胞毒性的检测方法 2 0 0 0 年1 0 月举行的急性毒性系统检测的体外方法的研讨会由替代方法有效性 的机构协调委员会( i c c v a m ) 和毒性检测替代方法的国家毒性计划机构中心 ( n i c e s t m ) 组织的，是由美国环境保护总署( e p a ) ，国立环境卫生研究院( n i e h s ) 以及国家毒理机构( n t p ) 共同发起的。这个研讨会系统地讨论了体外毒性试验。研 浙江工k 大学硕士学位论文 9 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 讨会出版tr e p o r to ft h ei n t e r n a t i o n a lw o r k s h o po n nv i t r om e t h o d sf o ra s s e s s i n g a c u t es y s t e m i ct o x i c i t y ( n i h 出版0 1 4 4 9 9 ) 和g u i d a n c ed o c u m e n to nu s i n g nv i t r o d a t at oe s t i m a t e nv i t r os t a r t i n gd o s e sf o ra c u t et o x i c i t y ( n i h 出版0 1 - 4 5 0 0 ) 。会议还 列出了一些基本的细胞毒性检测方法的程序，如：中性红吸收毒性检测法、人淋 巴细胞毒性检测法、膜通透性作为灌注细胞培养毒性检测法、h e l 3 0 毒性检测法、 k e n a c i db l u e 毒性检测法、人肝细胞原代培养的细胞毒性和遗传毒性、m t t 检测法、 细胞骨架的改变作为毒性检测的参数、酵母生长速度作为毒性检测标准、酵母质 膜h + - a t p a s e 作为毒性检测的标准、中国仓鼠卵巢细胞( c h o ) 质膜的n a + k + a t p a s e 活性、c h o 细胞增殖检测，l s l 9 2 9 细胞毒性检测、v 7 9 细胞毒性检测膜损 伤、b a l b c3 t 3 细胞毒性检测、细胞内细胞器的动态观察以及细胞超微结构的观 察、细胞计数、体外预测最大耐受剂量、h e p a 1 的酶活性等。 2 3 2 细胞毒性的相关因素 药物和毒物等与生物机体接触后，一般要经过吸收、分布、代谢和排泄的过 程。被机体吸收后进入血液，通过血液循环分布到各组织器官，在组织细胞内 发生化学结构与性质的变化，形成代谢物，药物和毒物及其代谢物或贮存在体 内或通过不同途径从体内排泄【6 6 , 6 7 1 。化学物质的吸收、分布和排泄具有类似的 机理，均是反复通过生物膜的过程，统称生物转运( b i o t r a n s p o r t i o n ) 。进入生物机 体后，在相关酶系统的催化作用下，在组织细胞中发生结构和性质的变化，并形 成其衍生物，这一过程称为外源性化合物在体内的生物转化( b i o t r a n s f o r m a t i o n ) 或 代谢转化( m e t a b o l i ct r a n s f o r m a t i o n ) 。 一般情况下，外源化学物质经生物转化过程后极性及水溶性增加而易于排出， 细胞毒性降低甚至消失，这种生物转化又称为生物解毒( b i o d e t o x i c a t i o n ) 或生物失 活( b i o i n a c t i v a t i o n ) 过程。外来化合物体内的代谢转化，是毒物的细胞毒性、细胞 毒性持久性和毒物生物半衰期的决定因素之一。但有些外源化学物质代谢产物的 细胞毒性反而增高，或水溶性降低【6 8 】。例如对硫磷，乐果等通过生物转化后形 成的对氧磷和氧乐果的细胞毒性增加，磺胺类化合物在生物转化中与乙酞基结 合，水溶性反而降低。有些不能致毒的化学物经生物转化具有致毒作用。因此， 化学物的细胞毒性不仅与其本身的理化性质有关，也与其在体内的生物转化有关。 2 3 3 细胞毒性导致的死亡机制 浙江工业大学硕士学位论文1 0 联苯菊酯的细胞毒性及杀虫活性的对映体选择性研究 外来物的致毒机制很大程度上和细胞内的凋亡途径密切相关1 6 9 7 0 】：坏死和凋 亡是细胞对与外来细胞毒性物质作用的不同的反应机制。坏死是由猛烈的急性的 外来创伤而引发的细胞死亡事件；而相反，凋亡是一种主动的机体自我保护机制， 在正常的机体内以一定频率发生的。它是通过一系列的胞外和胞内信号途径引发 启动的程序性细胞死- 1 = 7 1 】，有着明确的形态和分子水平上的特征 7 2 j 。当癌基因在 体内由于各种外因被激活时，凋亡一程序性细胞死亡的机制就被启动，细胞自发地 死亡，以抑制细胞由于癌变而自发大量增殖形成肿瘤的状况。而当机体内凋亡的 各种信号途径中的一条或几条被阻断时，细胞则不能控制地处于疯长状态，肿瘤 发生的几率就大大增加。 细胞的坏死和凋亡都能利用各种手段来测定到，在凋亡的初期中期后期都有 其特定的可识别的特征【7 3 1 。对于坏死的细胞，其质膜往往破裂，细胞内容物溢出， 从而引起一个先导的炎症反应，波及到邻近细胞。而在凋亡细胞中，细胞内膜和 外膜完好，细胞内容物被完整地封存于死亡细胞的膜内【7 4 1 。并且任何加强或抑制 正常的凋亡都会和很多疾病的产生密切相关【7 5 】；而在癌症发生中，凋亡的抑制和 肿瘤的诱导及引发直接相关。 2 3 4 细胞培养方法在毒理学研究上的应用 细胞与组织培养系统用于毒性物质的研究早己不是新的概念。细胞培养自上 世纪初开始建立以来，经过近百年的发展，细胞培养技术日益成为现代生物医学 科学研究所使用的重要手段，在毒理学研究中的应用也日趋广泛1 7 6 1 。毒理学家多 年前研究发现来自于不同物种的细胞对同一种化学物品的反应是不同的【7 7 1 。这种 发现表明物种差异在体外系统中仍旧存在。因此，体外系统能够代替整体动物进 行毒性物质效应的研究。 细胞毒理学主要