单细胞分析技术t(生化4)ppt课件.ppt

单细胞分析技术的研究进展,1,1前言2定义3研究进展,2,前言,细胞作为生命体结构和生命活动的基本单元，要了解生命体中一些生命活动规律，就必须要以细胞为研究基础在生物体内的组织具有不均匀性，对于单个细胞间更是具有较大的差异。在对细胞群体的统计分析结果中，掩盖了单细胞间的差异，造成了医学、生物学及其它学科在深一步研究中受到限制。对于单个细胞的研究，能够掌握更准确更全面的细胞信息，可以深入探讨以往群体分析中平均结果对个别信息掩盖的局限性，单细胞分析的引入对与疾病的早期预防和诊断有重要的意义。,3,单细胞分析技术定义,单细胞的分析能够准确的提供出细胞内物质及细胞内生化反应的准确信息，能够反应出细胞的功能与化学组分间的特定关系，以及某些细胞在生命体内的特殊作用。在对单细胞分析研究中，主要涉及单细胞进样、溶膜、衍生及检测技术。,4,一、单细胞分析技术的研究进展,1单细胞进样单细胞分析中如何取样是该方法研究的关键之一。单个全细胞进样可以用电迁移或流体动力学进样。由于以上方法需要对毛细管的进样端口进样腐蚀，并且需要一些精密微操纵系统，所以操作比较复杂。Walt等通过芯片技术，设计了一种单细胞定位芯片，高密度芯片上有阵列微室，可以使细胞随机分散到各个微室中，从而实现了多个细胞的快速同步检测。Schmidt等基于微阵列芯片设计的单细胞进样及定位分析检测系统，可同时测定多个细胞及单细胞的动态过程，使单细胞的分析效率得到显著提高。,5,2细胞溶膜细胞在进入毛细管通道后，一般需要对细胞进行溶膜以便进行细胞内物质的分析分离检测。通常使用表面活性剂或者用低渗溶液达到细胞膜破裂的目的。这种方法操作简单并且效率较高，细胞溶膜过程一般为几秒钟,6,在对于细胞内一些反应速度很快(秒级或更短的时间)的生化反应，例如细胞内的酶活性，若能准确分析检测这些物质，就需要实验中细胞能在亚秒(subsecond)时间内溶膜，终止其生化反应。基于电穿孔原理他们又研制了一种新型的快速电溶膜方法，利用脉冲电压超过一定值将细胞膜击破。该方法溶膜时间与激光溶膜法相当，并且不需要脉冲激光器，操作也十分简便，在应用中将十分广泛。,7,3细胞衍生单细胞内很多物质没有天然的荧光特性或电化学活性，因此要对这些物质进行检测分析就需要经过衍生化。单细胞衍生有柱前、柱后、柱上与细胞内衍生。,8,董谦等设计了一种新型的细胞内衍生方法，他们用电穿孔的方法把衍生试剂导入到血红细胞内，使衍生剂与氨基酸在细胞内完成反应。细胞在受到电穿孔作用引入衍生剂后，体积略增大，胞内分析物稀释小于二倍。将衍生后血红细胞电迁移进样，在毛细管中溶膜后柱端安培法完成单个血红细胞内的氨基酸含量的测定。,9,4单细胞检测技术检测分析是单细胞研究在毛细管电泳中的核心问题。由于细胞体积很小，胞内组分含量一般都在fmol-zmol范围内，所以在单细胞分析中应用的检测器应至少能检测到fmol级。所以目前应用比较多的有紫外可见检测，电化学检测、荧光检测、质谱检测和免疫分析法等。,10,电化学分析可以不因毛细管内径极细而造成灵敏度的损失，并且进样量极小，所以很适合单细胞分析检测。其中毛细管电泳安培法在生物分析领域已成为很有前景的新技术。荧光检测器以其选择性好、灵敏度高的特点，在生物医学分析领域得到了广泛应用。特别是激光诱导荧光检测器可完成单分子和单原子的检测，在微柱分离组分检测与DNA快速序列分析等方面有重要用途。质谱法可以对未知物在无内标物的情况下进行定性分析，该法在研究生物分子方面具有很大意义。Theodore等对细胞和亚细胞内代谢物质使用毛细管电泳耦合电喷雾质谱检测，对细胞内乙酰胆碱、组胺、多巴胺及血清素等具有信号响应的物质检测限50nM，该法能够快速简便的确定单细胞内代谢产物。,11,二、单细胞分析技术在各应用领域的研究进展,近年来,单细胞分析已经从测定胞内生化组分发展到细胞膜分析,细胞中单个囊泡甚至单分子的检测,其应用领域在不断扩展。,12,1、酶活性,加州大学欧文分校Allbritton等采用CE/LIF实现了单细胞中多种激酶活性的同时测定,为揭示活细胞中信号传导的动态性质,深入理解细胞生理调控及其行为的分子机制打开了一扇窗口。他们发展的脉冲激光及电快速溶胞系统独具特色。衣阿华州立大学Yeung研究组采用CE/LIF测定了单个淋巴细胞中乳酸脱氢同工酶的活性,可望根据正常淋巴细胞与急性白血病淋巴细胞中酶的活性差异进行癌症早期诊断。,13,2、核酸,单细胞核酸分析无论对分子生物学基础研究还是疾病早期诊断都具有非常重要的意义。Yeung等发展了一种直接从单细胞检测基因表达的毛细管柱上逆转录(RT)-PCR/CE/LIF集成