（应用化学专业论文）制备型环糊精手性固定相和苯氨基固定相的合成及应用.pdf

摘要 制备型环糊精手性固定相和苯基氨基固定相的合成及应用 专业：应用化学申请者：郭子媛导师：章伟光教授 摘要 本文简要介绍了制备色谱的原理、方法、应用和展望，重点总结了高效液相 色谱研究进展、基本优化方法和思路，以及其在天然、合成和生化药物分析方面 的具体应用。具体研究如下： ( 1 ) 全对氯苯基氨基甲酸酯化p 环糊精0 c 1 p h c d ) 手性固定相用于氧氟沙 星对映异构体制备分离的研究。合成了p c 1 p h c d 键和硅胶手性固定相，建立 了该固定相半制备色谱柱柱效的具体评价方法。对氧氟沙星左右旋光学异构体混 合物进行分析和制备分离。考察了不同流动相对氧氟沙星分离的影响，从分析色 谱线性放大到制备色谱，考察了不同进样量对制备过程的影响，以峰接触法为分 离策略进行制备分离。并对分离产物进行了旋光性、h p l c 、及质谱鉴定。 ( 2 ) p c 1 p h c d 手性固定相拆分钌苯半胱氨酸非光学异构体的研究。以 p c 1 p h c d 半制备柱对钌苯半胱氨酸具有手性特征的非光学异构体混合物进行 分析和制备分离，考察了最优的分析条件和制备条件，对分离得到的纯净异构体 以分析h p l c 、c d 、m s 、n m r 、晶体衍射、分子模拟c d 等表征，为钌苯半胱 氨酸单一异构体构型的鉴定和识别进行了一系列探讨。 ( 3 ) 反相高效液相色谱法分离提纯紫杉醇。以粒度为3 0 4 0g m 的硅胶合成 了苯基氨化硅胶，以湿法装柱装填成制备柱( 2 1r a i ni d x 2 5 0m m ) ，用四种混合 物和联苯分别评价其柱效和拆分性能，直接在制备柱上探索了对粗品紫杉醇的最 适宜分离方法，以二次循环式的峰重叠法为分离策略，制备得到高纯度高产率的 紫杉醇。色谱柱经使用多次后，对其柱效做即时评价，重复性良好。 关键词：高效液相制备色谱，反相色谱，氧氟沙星，钌苯配合物，紫杉醇 摘要 a b s r a c t a p p l i c a t i o no f ( c l p h b c d ) 一c s pa n dp h e n y l s i l i c a + g e l s s pi n p r e p a r a t i v eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a j o r ：a p p l i e d - c h e i i l i 鲫呵n a m e ：g u o z i y u a n s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n g w e i g u a n g a b s t r a c t t h i sp a p e ri sc o m m i t t e dt o h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y p r e p a r a t i o no ft h el a t e s ta p p l i c a t i o n s ，e s p e c i a l l yf o rt h ea n a l y s i so fc h i r a lc o m p o u n d s a n d p r e p a r a t i o n t h ep r i n c i p l e s ，m e t h o d s ，a p p l i c a t i o n sa n dp r o s p e c t so ft h e p r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h yw e r eb r i e f l yi n t r o d u c e d f o c u s i n go nh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ys t u d ys u m m a r i z e dt h ep r o g r e s so ft h eb a s i co p t i m i z a t i o n m e t h o d sa n di d e a s ，a sw e l la si t sn a t u r a l ，s y n t h e t i ca n db i o c h e m i c a la s p e c t so fd r u g a n a l y s i so ft h es p e c i f i ca p p l i c a t i o n t h e r ea r ef o u rc h a p t e r si nt h i st h e s i s i nc h a p t e ri ian o v e lc y c l o d e x t r i n ( c d ) d e r i v a t i v e - m o n o ( 6 a - a z i d o 6 a - d e o x y ) p e r ( p - c h l o r o p h e n y l c a r b a m o y l a t e d ) 3 - c d w a s s y n t h e s i z e da n dc h e m i c a l l y i m m o b i l i z e do n t ot h es u r f a c eo fa m i n o f u n c t i o n a l i z e ds i l i c a g e lt o a f f o r da s t r u c t u r a l l yw e l l d e f i n e dc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p ) f o rh p l c t h em i x t u r eo f o f l o x a c i ne n a n t i o m e r sw a s d i r e c t l y r e s o l v e do n a n a l y t i c a l ( c l - p h - b - c d ) c s p c o l u m nb yr e v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o r m a n )ce l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c a n d t h e i rc o n s t r u c t i o n sa r ed e t e r m i n e d t h e n , t h ea n a l y t i c a lm e t h o d sw e r es c a l e du pt o s e m i p r e p a r a t i v el o a d i n gt oo b t a i ns m a l lq u a n t i t i e so fb o t ho f l o x a c i ne n a n t i o m e r s e s p e c i a l l y , d i f f e r e n tl o a d i n ga m o u n t sw e r ei n v e s t i g a t e df o rt h e i re f f e c to nv a r i o u s p a r a m e t e r so fs e m i p r e p a r a t i v eh p l c u s i n gt h em a x i m u ml o a d i n g ，a b o u td o f l x 3 0 4 m g ，l o f l x5 6m gw e r eo b t a i n e di n6h ap u r i t yo f 9 5 w a so b t a i n e df o r e a c he n a n t i o m e r i n c h a p t e ri i i ，t h eb e s ts e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fh i g h p e r f o r m a n c ep r e p a r a t i v el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya r es e l e c t e da n di d e n t i f i e dt h r o u g h c o m p a r i n gt h ec o m p o s i n go fm o b i l ep h a s e ，f l o ws p e e da n ds oo n t w oc o m p o n e n t s i i a b s r a c t o fr u t h e n a b e n z e n e sh a v eb e e ns e p a r a t e da n dt h eb a s i cs t m c t u r eo fo n ea l k a l o i di s s h o w na f t e rh p l c ，c d ，1h n m ra n dm sa n a l y s e s i n c h a p t e ri v , p h e n y l s i l i c ag e l s w e r es y n t h e s i z e d 、析t l lt h em e t h o d so f r e a c t i o no n7 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n es i l i c ag e l t h es y n t h e s i z e dg e l sw e r eu s e d a ss t a t i o n a r yp h a s eo fr e v e r s e d - p h a s ep r e h p l ct os e p a r a t ea n dp u r i f yt a x 0 1 i n s p e c t e dp r e p a r a t i o nf a c t o r sa n ds oo nc h r o m a t o g r a p he l u e n ta l l o c a t e dp r o p o r t i o n ， s p e e do ff l o w , e x a m i n a t i o nw a v el e n g t h , s a m p l es i z e ，t h r o u g hp u t ，p r o d u c t i v i t y , y i e l d a n dc y c l et i m eh a ss t u d i e d t h ef i n a lp u r i t yo ft a x o lw a sm o r et h a n9 8 谢廿1t h e t o t a lr e c o v e r yo f9 6 as i m p l i f i e da n ds e n s i t i v em e t h o df o rt a x o ls e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o nw a s e s t a b l i s h e d k e yw o r d s ：p r e h p l c ，o f l o x a c i n ，b e n z e n er u t h e n i u mc o m p l e x e s ，t a x o l i i i 目录 目录 摘要iv a b s t r a c t 11 i 目录1v 第1 章绪论1 1 1 制备色谱的技术发展1 1 1 1 制备色谱。1 1 1 2 制备型液相色谱3 1 1 3 制备型超临界流体色谱5 1 1 4 模拟移动床色谱6 1 1 5 高速逆流色谱8 1 1 6 制备色谱需解决的问题及其前景9 1 2 制备型高效液相色谱法的研究进展10 1 2 1 制备色谱仪的基本组成10 1 2 2 p h p l c 技术的分类嘞1 11 1 2 3 线性色谱与非线性色谱的特点1 1 1 2 4p h p l c 的线性放大技术14 1 2 5p h p l c 的采集技术15 1 2 6 影响制备型h p l c 分离纯化的因素16 1 3 制备型高效液相色谱操作条件的优化方法1 7 i v 目录 1 3 1 基本概念18 1 3 2 优化目标19 1 3 3 优化方法19 1 4 制备型高效液相色谱的应用2 1 1 5 本文工作的目的、内容及意义2 3 1 。5 1 研究目的2 3 1 5 2 研究内容，2 3 1 5 3 研究意义2 4 参考文献2 5 第2 章全对氯苯基氨基甲酸酯化b 一环糊精手性固定相用 于氧氟沙星对映异构体制备分离的研究3 1 2 1 实验部分。3 2 2 1 1 仪器和试剂3 2 2 1 2 全对氯苯基氨基甲酸酯化b 一环糊精手性固定相的合 成3 3 2 1 3 色谱柱装填，j 3 5 2 1 4 色谱柱性能评价3 5 2 1 5 样品前处理3 5 2 1 6 分析色谱条件3 5 2 1 7 制备色谱条件3 6 2 1 8 固体产物的获取3 6 2 1 9 旋光度( o r ) 测定3 6 v 目录 2 1 10 质谱( m s ) 条件3 6 2 2 结果与讨论3 7 2 2 。1色谱柱的评价3 7 2 2 2 流动相的影响3 9 2 2 3 最大进样量的选择4 1 2 2 4 切割方式的确定一峰接触法4 4 2 2 5 分离产物的鉴定4 5 2 3 本章小结4 8 参考文献4 9 第3 章全对氯苯基氨基甲酸酯化b 一环糊精手性固定相拆 分钌苯半胱氨酸非光学异构体的研究5 0 3 1 实验部分5 2 3 1 1 仪器和药品5 2 3 1 2 样品前处理5 2 3 1 3 分析色谱条件5 2 3 1 4 制备色谱条件5 3 3 1 5 固体样品的获取5 3 3 1 6 圆二色谱( c d ) 5 3 3 1 7 质谱( m s ) 5 3 3 2 结果与讨论5 4 3 2 1 流动相的影响5 4 3 2 2 样品的稳定性。5 6 v i 目录 3 2 3 制备条件的优化5 8 3 2 4 切割方式的确定一峰重叠法6 0 3 2 5 分离产物的表征6 1 3 2 6 进一步验证6 8 3 。3 本章小结7 0 参考文献7 1 第4 章反相高效液相色谱法分离提纯紫杉醇7 2 4 1 实验部分7 3 4 1 1 仪器和试剂。7 3 4 1 2 苯基氢化硅胶固定相的合成7 5 4 1 3 色谱柱装填7 5 4 1 4 苯基氨化硅胶柱的评价7 5 4 1 。5 粗品紫杉醇前处理。7 6 4 1 6 分析色谱条件7 6 4 1 7 制备色谱分析条件7 6 4 1 8 固体样品的获取。7 6 4 2 结果与讨论7 7 4 2 1 粗品紫杉醇的h p l c 分析7 7 4 2 2 苯基氨化硅胶柱的评价7 7 4 2 3 制备色谱最优流动相条件的选择7 8 4 2 4 制备色谱最大上样量的确定8 0 4 2 5 切割方式的确定一峰重叠法8 0 v 目录 4 2 6 循环制备8 1 4 2 7 纯品紫杉醇的h p l c 分析8 2 4 2 8 重复次数对色谱柱柱效的影响8 2 4 3 本章小结8 4 参考文献8 5 致谢8 6 作者攻读硕士学位期间的学术成果8 8 i i 目录 i x 第一章绪论 第1 章绪论 1 1 制备色谱的技术发展 色谱是迄今人类掌握的对复杂混合物分离效率最高的一种方法。作为一种 精度高、速度快的分析工具，色谱在医药工业、生化技术和精细化学品的生产 方面已成为越来越重要的制备分离的手段。制备型色谱的目的在于分离制备一 种或多种纯组分，用于进一步的定性鉴定、化学合成或制备高纯标准物。可分 为工业用大规模制备纯物质的生产制备色谱和实验室分离几毫克至几克样品， 以便鉴定色谱图中未知峰的小型制备色谱。许多情况下，所需的高纯标样只能 用制备色谱技术来得到，如外消旋体的分离【1 】。实验室制备色谱除了用柱色谱 外还有制备薄层色谱。由于样品处理量大，制备色谱要求色谱柱具有一定的容 量和效率，以分离收集纯组分。同时也要考虑分离速度，而进样和检测器这两 部分与分析色谱大致相似。制备色谱法可以完成一般分离方法难以完成的纯物 质制备，如纯化学试剂、合成中间体、蛋白质的纯化等。随着分子化学、生物 工程以及中医药现代化的迫切要求，在相关的领域都面临着大量的分离纯化任 务，制备色谱作为一种快速高效的分离技术，已经引起世界各国的高度重视。 在我国该技术已被列入“8 6 3 ”工程生物化学技术领域的攻关项目中。 1 1 1 制备色谱 制备规模的色谱这一术语对不同的人含意不同。对生物化学家来讲，制备 色谱可能意味着分离几毫克试样，然后用适合的分析技术对结构加以说明；对 有机化学家来说制备色谱大概意味着为了随后的合成工作离析5 5 0g 中间产 品。可见制备色谱从几毫克到几十克宽范围试样的负载，甚至对几百克物质进 行_ 次分离，以满足研究和其他用途的需要。 经典柱色谱法虽可处理大量样品，但是效率低，太花费时间和消耗大量溶 剂。而现代制备色谱法则具备柱效高，分离速度快等特点，是制备纯化天然产 物和化学合成产物的极好手段。但长期以来，传统制备色谱都与柱子低效、不 稳定、重现性差等联系在一起甚至很多化学工作者都千方百计试图避免使用色 1 第一章绪论 谱作为制备手段【2 】：需要大量溶剂；回收的纯样品都呈稀释状态；对于与柱子 超载相关的现象和典型分离没有理论框架；“优化 操作条件更多地依靠感觉和 习惯而非科学事实等。由于2 0 世纪8 0 年代中期压缩柱( 径向，特别是轴向压缩) 技术的出现，以及人们意识到高品质柱可以大规模使用，这种情况才开始好转。 这是现代高效制备液相色谱的开端，也称为p h p l c t 3 1 。自从其诞生，p h p l c 取 得了长足的发展。 p h p l c 的发展成为可能是由于几方面的工作：柱技术，填料( 手性与非手 性) ，理论和模型。而且，新的概念，如：s m b ( 模拟移动床色谱) 、p r e - s f c ( $ 0 备型超临界流体色谱) 以及h s c c c ( 高速逆流色谱) 都被引入以扩展色谱作为一 种工业提纯工具的应用领域。 下面是色谱发展的简明过程： 1 9 0 3 年，茨维特在华沙自然科学学会生物学会会议上提出了应用吸附原理 分离植物色素的新方法，宣读的论文题目为”一种新型吸附现象及其在生化分析 上的应用”。三年后，他将这个方法命名为色谱法。 1 9 3 1 年，k u h n 与l e d e r e r 使用色谱法证实了蛋黄内的叶绿素系植物叶黄 素与玉米黄质的混合物，使人们认识到色谱技术在分离科学中的重要性。 1 9 3 7 年，纸电泳开始被应用。 1 9 3 8 年，i z m m l o v 和s h r a i b e r 第一次使用薄层色谱法。 1 9 3 8 年，t a y l o r 和u r a y 用离子交换分离鲤和御的同位素。 2 0 世纪4 0 年代后，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱得到了 广泛应用。 1 9 4 1 年，m a r t i n 和s y n g e 创立了分配色谱。他们采用水饱和的硅胶为固 定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酷基氨基酸。 1 9 4 4 年，m a r t i n 等发展了纸色谱。 1 9 5 2 年，m a r t i n 和j a m e s 发展了气液分配色谱。 1 9 5 6 年，v a nd e e m t e r 等发表了关于色谱效率的速率理论，并应用到气相 色谱。 1 9 5 7 年，制作了离子交换色谱氨基酸分析仪。 1 9 5 8 年，g o l a y 提出了毛细管柱气相色谱。 2 第一章绪论 1 9 5 9 年，在g o r d o nc o n f e r e n c e 上发表了第一篇凝胶过滤的报告。 1 9 6 2 年，k l e s p e r 等人提出了超临界流体色谱。 1 9 6 3 年，g i d d i n g s 的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。 1 9 6 6 年，i t o 等提出了逆流色谱。 2 0 世纪6 0 年代中期，凝胶渗透色谱出现。 2 0 世纪6 0 年代后期，亲和色谱出现。 2 0 世纪6 0 年代，美国u o p 公司开发了模拟移动床色谱。 1 9 6 9 年，现代液相色谱受到重视。 2 0 世纪8 0 年代初，高速逆流色谱出现。 2 0 世纪8 0 年代以后，毛细管柱应用于超临界流体色谱技术中。 2 0 世纪8 0 年代末，毛细管电泳得到发展。 1 9 9 2 年，模拟移动床色谱首次用于手性拆分。 1 1 2 制备型液相色谱 相对于分析型色谱，制各色谱的核心就是柱子。为提供既稳定又高效的柱 子，并用小尺寸颗粒进行填充，最常用、也是最易实现的、效果较为理想的， 是动态轴向压缩柱( d a c t m ) 技术【4 】。d a c t m 技术为使用者提供了用任一种填 料自己装填柱子、方便快速地调整柱长度的可能性。m m i l m 等【5 】讨论了硅胶基 球形粒子填料在轴向压缩柱中的填充行为及稳定性。d a v i d 等【6 】考察了制备型径 向压缩色谱的操作选择性及效率，发现在适当的压缩水平时，制备系统的效率 几乎接近分析柱，表明径压缩技术提供了可预测的h p l c 放大升级的硬件水平。 现有的制备柱内径达1m ，额定压力1 0 0p a ，或更高，生产能力达几吨年。 提高柱效最有效的方式是用相当小的颗粒以减少提纯时间、溶剂消耗、产 品稀释度及提纯成本。与传统的制备色谱填料( 粒径至少1 0 0r t m ) 相比，典型的 pr e h p l c 用的填料为1 0 - 2 0 岬，柱子也较短，一般2 0 5 0c m 。另外，保证填 料的窄的粒径分布也很重要，以避免太微小的颗粒产生柱后压以及太大的颗粒 导致低柱效。制备液相色谱最常用的固定相填料是硅胶，假如硅胶的酸性有碍 于对它的使用，那么最好改用氧化铝，有时用一种低质低价填料而非高质中高 价填料会使提纯成本更高。不过多数制备分离用硅胶作固定相是令人满意的。 3 第一章绪论 现在能得到的键合相不能指望用于大型分离工作，因为它的负载容量低而不适 合于制备工作。 t e l u e a t p r o 矗i c t 图1 1 经典的单柱制各色谱 考虑到由色谱系统能得到的四种特殊属性【7 1 ，即分辨率、速度、范围和负 载，十分明显，要得到其中的任何两种必须牺牲其它两种。因此在制备色谱中， 欲得到负载势必以速度和范围为代价，在某些例子中甚至会使分辨率减小。而 色谱在超载条件下的行为是十分复杂的。s a d r o d d i n 掣8 】对制备型液相色谱的模 型化进行了综述，认为理想模型最易于理解过载色谱柱中的谱带峰形，而平衡 扩散模型则最适于工艺本身。s a d r o d d i n 等【9 】还对制备型液相色谱的实验条件的 优化进行了考察，认为收率与产率之间是一种此消彼长的关系。a n i l a 等【1 0 】对制 备型液相色谱的不同模式( 等温洗脱，梯度洗脱，顶替色谱) 的最佳化性能进行 了比较，主要参数为负载因子和理论塔板数等，并讨论了各自的优点。c h r i s t i a n 等在统一理论模型的基础上比较了四种制备型色谱( 经典洗脱色谱，循环色谱， 模拟移动床及环隙色谱) ，认为数学模型及所建议的方法学是有通用性的。在这 一方面，模拟软件是种有力的帮助，而且即使不能精确计算出最佳提纯操作条 件，也可清楚地表现出其趋势。 图1 2 循环色谱 比起其它制备方法，液相型制备色谱是目前技术手段最成熟、应用最为广 泛的一种。它的缺点也很明显【1 1 】，需消耗大量溶剂、产品过于稀释以及往往无 4 第一章绪论 法避免有毒溶剂的使用。 尽管如此，h p l c 仍然是难以替代的分离方法。在蛋白质( 包括酶) 、核酸和 糖等与生命科学密切相关的生物大分子的分离上，h p l c 也是特别爱宠的一项 技术，多种可供选择的分离模式( 反相、正相、离子交换、体积排斥、疏水作用、 亲和色谱等) 都有应用【1 2 】。 国内制备型液相色谱方面的报道不多，王志祥等【1 3 】立足于国产材料和设备， 成功地研制了一套较为实用的制备型h p l c 分离装置，根据不同的制备量和分 离要求，该装置可以使用不同内径及不同柱长的制备柱，用于生化产品的制备 分离。制备量可达数毫克至数百毫克。 1 1 3 制备型超临界流体色谱 所谓超临界流体是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质的状态，它 兼有气体和液体的某些性质，即兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、 液之间较高的扩散系数等特征【1 4 1 。二氧化碳做为一直被广泛采用的超临界流体 是由它自身的特点决定的。它临界点性质温和( t c = 3 1 0 5 ) ，成本低，安全， 且工业易得高纯度。由于c 0 2 对极性化合物的溶解能力较低，人们在以选择二 氧化碳为主要流体的基础之上，提出了很多的强化s f c 分离的技术手段。在需 要提高密度以提高超临界流体溶解性的情况下，极性化合物改性剂( m o d i f i e r ) 可 有效地提高原流体的溶解能力【1 5 】。甲醇、乙醇、乙氰、水等是较常用的改性剂。 c a n t r e l l 掣1 6 】对各种改性剂在填充柱s f c 中的作用进行了考察，发现可以把改 性剂调整到合理的模式以加强或掩盖分子间作用。r o t h 1 7 j n 考察了改性剂在 s f c 中的热动力学性质。改性剂通过引入一种低浓度强极性的化合物可进一步 改善，这种化合物可称为添加剂( a d d i t i v e ) 。b 1 a c k w e l l 等【18 】研究了添加剂作用， 认为色谱选择性与添加剂及流动相状态有关。 超临界流体具有许多获得好的色谱分离的必要特性，更重要的是，通过改 变流动相温度或压力即可改变其密度，色谱分离的特性就会改变【1 9 1 。因此一种 单一的流动相就可以用于多种用途的分离，而无需为柱平衡浪费时间，这在 h p l c 靠改变其流动相组成是难以做到的。另外，也容易去除所收集的馏分中 的流动相，简单地降压足以将超临界流体c 0 2 气化。流动相的回收也十分简便， 5 第一章绪论 只需收集气相c 0 2 ，净化后可使其重返超临界流体状态。c 0 2 易于回收，成本 低廉，使p r e s f c 对工业极具吸引力，尤其是对比p h p l c 在生产成本中流动相 占最大比例( 甚至在回收利用情况t ) i n 。然而，p r e s f c 也有缺点 2 0 】，技术相当 昂贵( 设备必须承受上百b a r 的压力) ，操作超临界流体不象液体那样简单，以及 c 0 2 的溶解性能不允许溶解所有物质，通常加入改性剂有所帮助，但同时也部 分抵消了上面所提到的优势。所以时至今日，虽然超临界流体的独特物化性质 使得c 0 2 极具竞争性，甚至在模拟移动床【2 1 - 2 2 1 和逆流色谱【2 3 】中也有应用，但超 临界流体技术在实验室中的应用远远大过它在工业化生产中的应用。 19 9 7 年在法国s t r a s b o u r g 召开的第三届国际超临界流体会议上，会议主席 k r t u k o n i s ，b r u n n e r 和p e r r u t 在大会特邀报告中指出，丙烷是一种更为实用的 工业化超临界溶剂，且己用于一些食品加工过程中。王仁安等1 2 4 比较了丙烷与 c 0 2 这两种超临界溶剂的溶解性能和传质性能，并结合文献超临界流体萃取的 实例说明，在设计工业化超临界流体萃取装置时，丙烷是一种很有竞争力的溶 剂。赵锁奇等【2 5 乏6 1 建立了国内第一套制备型超临界流体色谱，并用于天然产物 的分离制备，实验表明这套克级制备色谱使用空白硅胶填料既可以分离弱极性 化合物，也可以分离制备强极性物质及生物碱等难洗脱的溶质。 1 1 4 模拟移动床色谱 模拟移动床色谱s m b ( s i m u l a t e dm o v i n gb e dc h r o m a t o g r a p h y ) 是提纯化合 物的另一个强大且极具吸引力的分离手段。早在2 0 世纪6 0 年代就由美国工程 公司u o p 把逆流色谱的概念引入s o r b e x 家族的s m b 工艺并使之商业化，从而 作为一种工业制备工艺取得了长足的发展【2 川。由于s m b 技术减少了为达到特 定分离所需的固定相及流动相的体积，成本的节约使色谱分离更加经济可行。 但应用于制药及精细化学品的制备分离却一直发展缓慢，主要是由于缺少工艺 模拟的模型【2 8 1 、有效数值方法和计算机。直到2 0 世纪8 0 年代在有关s m b 理 论框架的形成和模拟程序的出现加上p h p l c 在硬件方面的最新进展，才使s m b 重新焕发出勃勃生机。古典制备色谱有两大缺陷，不连续且溶质稀释。s m b 的 出现打破了这些局限。s m b 是一种模拟真实移动床【2 卅( 或逆流色谱) 的重要分离 工艺。在s m b 中，固相逆流移动由进样和溶剂入口与残液和提取物出口的周期 6 第一章绪论 性切换来模拟( 如图1 3 ) ，相当于柱子朝与切换方向( 即流动相流动的方向) 相反 的方向移动。 模拟逆流的实现避免了因固相的物理移动导致的缺点。工艺具连续性，可 以将二元样品分离为高度纯净的两个组分，并完全回收。可高效拆分分离因子 相对较小的化合物【3 0 】。s m b 与h p l c 相比主要的优势在于：溶剂消耗大量减少； 收集到的产品稀释度小；填料更加有效利用。因此s m b 提纯成本比h p l c 更 少。当然s m b 也有难以克服的问题【2 】，一是s m b 是一种二元分离器，这限制 了它的应用范围；二是设备的复杂性，可能比h p l c 更难使用和维护，一般要 用8 1 6 根性能相似的柱子，致使优化提纯条件更加复杂。 提 图1 - 3 模拟移动床色谱流程图 尽管如此，s m b 还是方兴未艾，尤其是应用于外消旋溶液的分离【3 0 1 ( 一种 典型的二元分离) ，更是s m b 技术最理想的用武之地。f d a ( 美国食品与药品管。 理局) 己宣布出于药物审批的目的将认为两种对映异构体是不同的化学品【3 1 1 。 m c c o y 3 2 1 讨论了各公司使用s m b 分离手性化合物的方法。l e h o u c q 等【3 3 】贝0 对 s m b 在手性分离方面的应用进行了探讨，并提出一基于实验数据的逆流模型， 发现模型与实际系统吻合良好。也正是由于对纯手性化合物的市场需求趋势， 驱使填料制造商去开发用于手性分离的特殊固定相，包括：分子压印，蛋白质相， 环糊精等。对于s m b 系统的设计是一个热门的研究领域口4 硎。y u n 3 8 1 和z h o n g 等1 3 9 j 则研究了流速对分离的影响。 s m b 技术在我国的发展尚处于起步阶段，主要是鞍山钢铁学院的林炳昌等 7 弋舔 第一章绪论 【4 0 1 进行这一方面的研究，发表有几篇模型方面的文章 4 1 - 4 2 】，李勃等4 3 】贝0 在高分 子树脂柱和s m b 系统上分离得到了高纯度的紫杉醇。 1 1 5 高速逆流色谱 任何大规模的制备分离都是以小规模制备和一般分析为先导，摸索条件， 优化处理，逐步放大。目前的液固色谱在从分析级放大到制备或生产规模时有 局限性【4 钔，分析分离大多用反相，但这种工艺对于制备型l c 来讲太昂贵，导 致在从实验室规模( 1 5m g ) 放大到制备规模( 5m g 十几k g + ) 时需要采用正相硅 胶的方法，除非产品单价高到可以采用反相及手性介质。而且目标产物在固定 相上有可能被吸附、变质、水解或改变构型。因而色谱的选择成为突出的瓶颈。 高速逆流色谱( h i g hs p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y - h s c c c ) 避免了这些 困难。自从1 9 6 6 年y o i s h i r ol t o 提出逆流色谱( c c c ) 的概念，c c c 就是一种制备 技术【4 5 1 。 图l 一4 高速逆流色谱原理图 由于2 0 世纪8 0 年代早期i t o 的开创性工作，开发出了比过去的c c c 装置 分离效率更高且分析时间缩短的新装置，因线圈本身处于装置整体的中心轴， 以固定齿轮为中心作进行行星式的运动( 如图1 4 ) ，所以此装置称为“伊东多层 线圈行星离心机 或高速逆流色谱”( h s c c c ) e 4 6 1 。h s c c c 是一种无载体的液 液分配色谱，在分离柱体内不加入任何固态载体或支持体，因而完全排除了载 体对分离过程的影响，在色谱过程中，样品在一对互不混溶( 或很少混溶) 的溶 剂相中分配、传递，各组分依据它在这两相中的分配系数的差异实现分离1 4 7 。 它基于运转螺旋管内两相溶剂的单向性流体动力学现象( u n i q u e 8 第一覃绪论 h y d r o d y n a m i c p h e n o m e n o n ) 使逆流色谱体系的分离效率更高，更符合于分离分析 和制备纯化工作的需要。 柱内无载体占空部位，两相又高速对流，因此h s c c c 具有很强的超载能 力，非常适合半制备级或更大量的分离纯化工作。h s c c c 也不是十全十美的， 由于其固相的逆流移动会造成两相互相侵蚀和严重的混合而导致其稳定性降 低，从而使分离效率不高【4 8 1 。技术的进步使这个问题有所改观，已可与p h p l c 相抗衡 尽管h s c c c 的色谱效率受到限制，其高负载和多用途依然使其充满竞争 力，可以处理相当宽范围内的有机和无机的工业提纯问题，更是从传统中医药 及其他天然产物中进行活性分离的理想工具 4 3 ，4 9 ，5 0 1 。已经证实c c c 在方法的 快速建立、极性屏蔽和作为一种抽提工艺的多用途性。事实上c c c 可以处理含 微粒的粗抽提物( 或直接与逆流萃取耦台川) ，这意味着它具有分离细胞、细胞 类脂质和溶剂混合油的潜力。 我国是美国之外最早开发应用此项技术的国家，在h s c c c 仪器的研制方 面处于国际领先的地位【5 2 】。以张天佑5 2 彤1 为代表的我国科学家在利用h s c c c 对天然药物有效成分的分离纯化( 如紫杉醇的分离) 方面做出了许多创新性工 作。 1 1 6 制备色谱需解决的问题及其前景 制备色谱目前在我国仍只存在于少数科研单位中，要推广到工业生产仍面 临许多亟待解决的问题。首先就是制备色谱的填料用量大且价格昂贵，造成生 产成本太高。开发新的填料，或者利用已有的空白硅胶开发新的分离方法或模 式，是色谱工作者努力的方向。其次是制备色谱的升级放大的问题，这也是制 约制备色谱进一步发展的瓶颈。h s c c c 似乎没有这两方面的忧虑，但该色谱法 的流体力学机制沿需进一步阐明。另外建立连续制备色谱还有许多开发性的工 作要做。 制备色谱的发展在近2 0 年中取得了长足的进步，色谱理论逐渐完善，新技 术不断出现，显示出广阔的应用前景。 9 第一章绪论 1 2 制备型高效液相色谱法的研究进展 因此几十年来，p h p l c 在复杂混合物的分离中得到了广泛的应用【5 5 】。本综 述旨在对制备型液相色谱研究进展作一下概要论述。 1 2 1 制备色谱仪的基本组成 圈 - - _ - - - 一 禹鼢柱国 巳一 萄苔，零j彩蘖|：jiljilj乎 图1 5 制各色谱仪的基本组成 高效制备液相色谱仪( 也称作高压制备液相色谱) 与分析型的高效液相色谱 仪一样，如图1 5 所示，在大多数情况下是搭积木式的，可以根据自己的制备 需要和经费条件进行合理的选择组件并在实验室有自己进行组装。为满足大量 制备需求，相对一般的高效液相色谱需要对制备色谱主要部件提一些专门的需 求： ( 1 ) 制备柱与分析柱比较，制备柱的内径加大，便于增加上样量，在柱头 结构上也完全不同，希望样品能在柱头截面上均匀的渗入柱床，这样也克服了 柱中心样品过浓。 ( 2 ) 泵制备色谱对泵的要求不是太高。 ( 3 ) 检测器半制备色谱可以采用分析型检测器。但是对于大规模制备色谱 检测器要进行改进，以降低其灵敏度，应为h p l c 的大流量和高浓度是分析型 1 0 第一章绪论 检测器所不能承受的，示差折光检测器和紫外检测器在制备色谱中是最常用的。 另外，由于制备色谱柱价格昂贵，使用时一定要加保护柱。 1 2 2p h p l c 技术的分类1 5 6 i 按照制备规模分，目前有三种类型： 表1 - 1p h p l c 技术的分类 ( 1 ) 半制备色谱其柱内径在5 2 0l t l n l ，长度1 5 5 0i i l i n 范围，一般用1 0 岫 或2 0 3 0 岬粒度的填料，通常在不超载的条件下操作，可以说是一种放大的分 析分离。 ( 2 ) 克级制备色谱当所需分离的样品量较大时，使用5 0i n l t l 左右内径，2 0 7 0 c m 长度的色谱柱，填料粒度4 0 6 0l x r n ，可装2 0 0 5 0 0 克固定相，在超载条件下 操作。 ( 3 ) 工业用制备色谱色谱柱尺寸更大，且使用粒度更大的填料，主要是工 业用途。 在天然药物和有机化学研究中，如果所得的纯化合物只是为了结构解析， 使用半制备色谱即可很容易获得毫克级的单组分，如果所得的纯化合物是为了 进行药理活性实验或进一步进行结构改造，则需要用到克级制备色谱，而如果 是为了进一步工业化的实验室小试，则需要更大制备色谱。 1 2 3 线性色谱与非线性色谱的特点 ( 1 ) 线性色谱是指组分在固定相和流动相中的平衡浓度