（环境工程专业论文）城市污水中新型病原细菌的生物学特征及杀灭效果研究.pdf

本学位论文作 校保留并向国家有 阅和借阅。本人授 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 年月 日 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密团。 赵息旬 指导教师签名： 年月 日 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引 用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：赵忽苟 日期：年月曰 江苏大学硕士学位论文 摘要 城市污水中病原微生物潜在生物污染风险，危害人群健康，污水 中细菌分离检测尤其是病原细菌的监测和安全评价成为人们关注的 焦点。本论文通过对镇江市城市污水中细菌的分离培养，利用分子生 物学技术和生物信息学技术，结合细菌生理生化特性，对分离到的几 种病原细菌进行种属鉴定。并评估了现有污水消毒处理技术对主要病 原细菌去除效果，既为城市水体中病原微生物污染控制提供基础数 据，也为源头控制致病性新型病菌传播奠定了基础。本论文包括以下 主要研究内容和结论： ( 1 ) 利用筛选培养基对城市污水中细菌纯化分离，通过p c r 扩 增细菌的1 6 sr d n a 基因片段，根据序列比对结果并结合菌种的生理 生化特性及形态学特征，鉴定细菌的种属。从镇江市城市污水中共分 离得到6 种菌株，鉴定结果为：j d l 6 ，气单胞菌属的嗜水气单胞菌 ( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) ；j d l 7 ，不动杆菌属的a c i n e t o b a c t e r r h i z o s p h a e r a e ；j d l 8 ，类香菌属的气味类香菌( m y r o i d e so d o r a t u s ) ； j d 2 5 ，漫游球菌属的河流漫游球菌( v a g o c o c c u s f l u v i a l i s ) ；j d 2 7 ，短 波单胞菌的缺陷短波单胞菌( b r e v u n d i m o n a sd i m i n u t a ) ；j d 3 2 ，希瓦 氏菌属的s h e w a n e l l ap u t r e f a c i e n s 。 ( 2 ) 对嗜水气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) 和气味类香菌 ( m y r o i d e so d o r a t u s ) 的生长曲线及生长影响因素( 温度、氧气、p h 值) 做进一步研究，发现新型病原细菌嗜水气单胞菌和气味类香菌均 为中温型、好氧性细菌，适宜生长在中性或稍偏碱性环境中。这两种 新型病原细菌对常见的抗生素1 3 内酰胺类抗牛素：氨苄青霉，头孢菌 素类：头孢哌酮和两类抗生素低浓度混合c c d a 表现出很强的耐药 江苏大学硕士学位论文 性。 ( 3 ) 将嗜水气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) 和气味类香菌 ( m y r o i d e so d o r a t u s ) 制成人工污水水样，研究两菌种在城市污水， 城市生活污水和河水三类代表水样中的存活规律。研究发现：嗜水气 单胞菌和气味类香菌在污水和在培养基中的生长状态和适宜生长条 件不完全一致。在城市污水，城市生活污水和河水中，嗜水气单胞菌 和气味类香菌均适于在中低温条件下生存，且都有1 3 天的迟滞期， 温度较高( 3 0 ) 的各类水质均不适合两菌种的生存。嗜水气单胞菌 能在p h 为5 8 5 之间的城市污水中存活，p h 7 时对其生长最有利。 气味类香菌能在p h 为5 1 1 5 之间的城市污水中存活，p h 5 时有利于 其生长。 ( 4 ) 针对现有的污水处理技术，以嗜水气单胞菌( a e r o m o n a s h y d r o p h i l a ) 和气味类香菌( m y r o i d e so d o r a t u s ) 为目标污染物，研究 紫外线和臭氧对其杀灭效果，并建立紫外线、臭氧杀灭效果动力学模 型。紫外线杀灭菌液中和中水中嗜水气单胞菌的最佳辐照时间分别为 1 6 m i n ( 2 3 0 8 1 9 ) ，1 0 m i n ( 3 0 1 9 1 9 ) ；而杀灭菌液中和中水中气味类香菌 的最佳辐照时间分别为1 2 r a i n ( 3 9 4 1 9 ) ，1 0 m i n ( 3 0 9 9 1 9 ) 。高浓度臭氧 水杀灭菌液中嗜水气单胞菌和菌液中气味类香菌的最佳浓度分别为 1 8 m g m l ( 3 1 1 9 1 9 ) ，1 6 6 7 m g m l ( 4 2 8 3 1 9 ) 。紫外线和臭氧水杀灭两种 新型病原菌效果曲线均符合c h i c k 一级定律。 关键字：城市污水，新型病原细菌，存活规律，杀灭效果 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mi nt h eu r b a n w a t e rb o d y , w h i c hi sa l a t e n tr i s ko fb i o l o g i c a l p o l l u t i o na n dh a r m f u lt op u b l i ch e a l t h ，h a s a r o u s e dt h e w i d e s p r e a d a t t e n t i o n e s p e c i a l l ym o n i t o r i n ga n ds a f e t y a s s e s s m e n ti nt h eu r b a nw a t e rb o d y i nt h i st h e s i s ，t h es p e c i e so ft h e p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mi s o l a t e di nt h ew a t e rb o d yw a si n v e s t i g a t e d b ya m p li c a t i n gb a c t e r i u m s 16 sr d n ag e n e ，t h em a s s i v ep a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s mp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s t h e nt h e o r i g i no ft h ed o m i n a n tm i c r o f l o r ai nt h ew a t e rb o d yw a se x p l o r e da n d t h ee f f e c th a db e e n a p p r a i s e d i n r e m o v i n g t h e p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m sb y t h e e x i s t i n gs e w a g et r e a t m e n tp r o c e s s a l l t h e r e s e a r c h p r o v i d e d t h ee s s e n t i a ld a t af o rc o n t r o lt h e p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s mp o l l u t i o ni nt h eu r b a nw a t e rb o d ya n da l s oi n d i c a t e dt h e d i r e c t i o nf o rt h es o u r c ec o n t r o lt h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m t h e r e s e a r c hm a i n l yo b t a i n e dt h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n ： ( 1 ) t h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m sw e r ei d e n t i f e db ye x t r a c t i n gt h e b a c t e r i a ld n aa n da m p l i f y i n g1 6 sr d n ag e n ef r a g m e n tu s i n gp c r c o m b i n i n gt h e m o d e r nm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n o l o g ym e t h o d sa n d t r a d i t i o n a l p h y s i o l o g yb i o c h e m i s t r ye x p e r i m e n tw ef o u n dt h a t ，t h e r e w e r em a n yk i n d so fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m si nt h ez h e n j i a n gu r b a n w a t e rb o d ya n d6s p e i c e so fb a c t e r i u mw e r ei d e n t i f i e d t h e yw e r e 1 1 1 江苏大学硕士学位论文 r e s p e c t i v e l yj d l 6 ，a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ，j d l 7 ，a c i n e t o b a c t e r r h i z o s p h a e r a e ，j d l 8 ，m y r o i d e so d o r a t u s ，j d 2 5 ，v a g o c o c c u sf l u v i a l i s ， j d 2 7 ，b r e v u n d i m o n a sd i m i n u t a ，j d 3 2 ，s h e w a n e l l ap u t r e f a c i e n s ( 2 ) t h e nt h eg r o w t hc u r v e sa n d g r o w t hf a c t o r s ( t e m p e r a t u r e ，o x y g e n a n dp h ) o fa e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u sw e r e d e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n d m y r o i d e so d o r a t u sw e r ei nab e t t e rg r o w t ha r o u n d3 0 。c ，a n dw e r em o r e s u i t a b l e g r o w i n gi ns e w a g e o fp hv a l u e so fa b o u t7 a e r o m o n a s h y d r o p h i l a a n dm y r o i d e so d o r a t u sb o t hh a d s t r o n g r e s i s t a n c et o 1 3 - 1 a c t a ma n t i b i o t i c ss u c ha sa m p i c i l l i n ，c e p h a l o s p o r i n sa n dc c d a ( 3 ) b yc a l c u l a t i n gt h es u r v i v a lr a t ew er e s e a r c h e dt h es u r v i v a l l a w so fa e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u si n m u n i c i p a l w a s t e w a t e r , u r b a ns e w a g ea n dr i v e rw a t e r , d e p a r t l y t h er e s u l t ss h o w e d t h a ti nd i f f e r e n ts e w a g e s ，a e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u s w e r em o r es u i t a b l ea tal o w e rt e m p e r a t u r ea n db o t hg r o w e ds l o w l yi n f i r s tf e wd a y sa n dh i g h e rt e m p e r a t u r ew a su n f a v o r a b l ef o rb o t h t h e a e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u ss t r a i n s r e s p e c t i v e l y s u v i v e dw e l li nt h ep hv a l u eo f5 - 8 5 5 - 1 1 5i nu r b a ns e w a g er e l a t i v e l y ( 4 ) f o ra e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u sa st h e t a r g e tp o l l u t a n t s ，t h ek i l l i n ge f f e c t so fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n do z o n e w e r es t u d i e d ，a n dt h ek i l l i n ge f f e c td y n a m i cm o d e l sw e r ee s t a b l i s h e d t o k i l l e da e r o m o n a s h y d r o p h i l ai nc u l t u r em e d i u ma n di nr e g e n e r a t ew a t e r , i v 江苏大学硕士学位论文 t h eb e s te x p o s u r et i m eo fu vw e r e1 6 m i n ( 2 3 0 8 1 9 ) a n d1 0 r a i n ( 3 0 1 9 1 9 ) ， w h i l et ok i l lm y r o i d e so d o r a t u sw e r e1 2 m i n ( 3 9 4 1 9 ) ，1 0 m i n ( 3 0 9 9 1 9 ) ， r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o n so fo z o n ei nw a t e rt ok i l l a e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n dm y r o i d e so d o r a t u sw e r e1 8 m g m l ( 3 1 1 9 1 9 ) a n d16 6 7m g m l ( 4 2 8 3 1 9 ) ，r e s p e c t i v e l y u va n do z o n ew a t e rk i l l e dt h e t w on e wp a t h o g e n sl a w sw e r eb o t ha c c o r e dt ot h ec o l l i n s s e l l e c k m o d e l k e yw o r d s ：u r b a ns e w a g e ，n e wp a t h o g e n i cb a c t e r i a ，s u r v i v a l l a w , k i l l i n ge f f e c t v 江苏大学硕士学位论文 v l 江苏大学硕士学位论文 目录 第1 章绪论1 1 1 城市污水中病原微生物污染的来源1 1 2 城市污水中主要病原微生物及其危害2 1 2 1 城市污水中常见及新型病原微生物2 1 2 2 城市污水中病原微生物对人类健康影响3 1 3 水环境病原微生物污染控制指标4 1 4 分子生物学技术鉴定新型病原细菌研究5 1 4 1 分子生物学技术在细菌鉴定中应用进展5 1 4 2 1 6 sr r n a 在细菌演化分类与鉴定上的独特性6 1 4 3 1 6 sr r n a 基因序列分析鉴定菌种原理7 1 5 常见水处理技术对病原微生物的去除9 1 6 本文研究目的及主要研究内容1 l 1 6 1 研究目的1 1 1 6 2 主要研究内容1 2 第2 章城市污水中新型病原细菌的分离鉴定1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 1 水样1 3 2 1 2 分离培养基和生化试剂1 3 2 2 实验方法1 5 2 2 1 分离纯化1 5 2 2 2 菌落及菌属形念特征观察1 5 2 2 3 基于1 6 sr d n a 基因的细菌分离与鉴定1 5 2 2 4 溶血性检查1 9 2 2 5 生理生化实验鉴定1 9 2 3 实验结果1 9 2 3 1 菌落特征和菌体形态1 9 2 3 2 基于1 6 sr d n a 基因的细菌分离与鉴定2 0 v l l 江苏大学硕士学位论文 2 3 3 溶血性检查2 5 2 3 4 基于生理生化的鉴定2 5 2 4 讨论2 6 第3 章新型病原菌生长影响因素2 8 3 1 实验材料2 8 3 1 1 实验菌种2 8 3 1 2 培养基2 8 3 2 实验方法2 9 3 2 1 影响新型病原菌生长因素的测定2 9 3 2 2 敏感性实验3 0 3 3 结果与分析3 0 3 3 1 影响细菌生长因素的测定3 0 3 3 2 敏感性实验3 2 3 4 讨论3 3 第4 章新型病原菌在污水中的存活规律实验研究3 5 4 1 实验材料3 5 4 1 1 试剂：3 5 4 1 2 实验水样3 5 4 1 3 实验菌株3 5 4 2 实验方法3 5 4 2 1 人工污染水样的制备3 5 4 2 2 观察细菌在水样中的存活状况与规律3 6 4 2 3 细菌检测方法3 7 4 3 实验结果与分析3 7 4 3 1 各水样的主要水质指标检测结果3 7 4 3 2 细菌在水样中的存活状况与规律3 7 4 4 讨论4 3 第5 章紫外线和臭氧去除新型病原菌效果研究4 5 v i i l 江苏大学硕士学位论文 5 1 实验材料 5 1 1 试剂 5 1 2 实验水样 5 1 3 实验菌株 5 1 4 实验仪器设备 5 2 实验方法 5 2 1 中水水样的制备 5 2 2 紫外线和臭氧杀灭新型病原菌效果实验 5 2 3 细菌检测方法 5 3 实验结果与分析 5 3 1 中水水样的主要水质指标检测结果 5 3 2 紫外线和臭氧杀灭新型病原菌结果 5 3 3 杀灭效果动力学研究 5 4 讨论 第6 章结论与展望 6 1 主要结论 6 2 创新点 6 3 展望 参考文献 致谢 读研期间相关科研成果 附录 i 缩略语表 1 l 主要试剂及配制 i i i 测序结果 i x 江苏大学硕士学位论文 x 江苏大学硕士学位论文 第1 章绪论 水孕育和维持着地球上的全部生命，是人类生产和生活的重要资源。近年来， 水体污染非常严重，成为制约经济社会发展的重要因素。水污染是造成水严重缺 乏的主要原因之一，水资源的缺乏和污染给人们的生活带来一系列问题。水污染 包括物理污染、化学污染和生物污染，其中生物污染尤其是病原细菌的污染，对 人类的生存安全构成重大威肋，成为人类健康、经济和社会可持续发展的重大障 碍之一。 水资源的短缺使污水回用成为必然【l j 。再生水作为一种可替代的水资源，可 广泛应用于市政景观、园林绿化、工业冷却、农业灌溉、道路清扫、洗车、消防 和建筑施工等诸多方面，由于再生水是以城市污水为水源，故若再生利用过程中 化学污染物得到较好的控制，则对人体健康的威胁主要来自病原微生物。城市污 水中微生物种类复杂，而且存在地区性差异，因此掌握城市污水中病原微生物种 类及数量，是控制由病原微生物引起且可通过污水传播疾病的发生及有效控制城 市污水造成的疾病再传播的主要途径。 1 1 城市污水中病原微生物污染的来源 据全国环境统计公报报道，2 0 0 9 年，全困废水排放总量为5 7 2 0 亿吨，比上 年增加2 7 i2 1 。城市污水中含有大量病原微生物主要是因为其接纳了医院、生活 污水，畜禽场排放物和生物制品厂污水p j 。 我国每年畜禽场排放物的数量相当大，所排污水和畜禽粪尿中含有大量的病 原微生物及寄生虫，包括大肠杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌、钩端螺旋体、结核菌、 炭疽杆菌、耶尔森氏菌、弯杆菌、肉毒梭菌、肠病毒、肝炎病毒、细小病毒和各 种寄生虫等，其中大多数为人畜共患病病原菌，它们的扩散可能对水环境造成严 重污染，直接威胁着人类公共卫生安全和畜牧业生产安全。 目前我国大部分医院污水是直接消毒后排放，只有少数医院经二级生物处理 再消毒后排放。现有污水处理工艺的出水中悬浮物浓度较高，细菌与病毒可以附 着或包裹在悬浮絮体中而不易被消毒荆杀灭| 4 1 ，极易引起水体污染和传染病的爆 发流行。流行病学调查和细菌学检验证明，国内外历次大的传染病爆发流行，几 江苏大学硕士学位论文 乎都与水源污染、饮用或接触被污染的水有关【5 】。 以江苏大学微生物实验室通过对内江主要病原菌溯源研究为例i 酬，通过分析 不同来源城市污水中主要病原菌的时空分布特征发现，内江水体中主要病原菌 a r c o b a c 纪，可能来源于城市污水中的医院污水和居民区生活污水；t r i c h o c o c c u s p a s t e u r i 可能主要来源于城市污水中的医院污水；梭菌( c l o s t r i d i u m ) 则可能主 要来源于城市污水中的菜场污水和医院污水。 1 2 城市污水中主要病原微生物及其危害 1 2 1 城市污水中常见及新型病原微生物 城市污水中对人健康造成危害的传染性病原微生物大体分为三类：细菌，寄 生菌( 寄生虫与原生动物) 和病毒。城市污水中最主要的寄生虫是内阿米巴虫 ( e n t a m o e b ah i s t o l y t i c a ) ，引起痢疾及结肠和肝的溃疡，兰氏贾第鞭毛虫和隐孢 子虫也比较常见，可引起胃肠功能紊乱，痢疾，腹泻等疾病。污水中的病毒主要 有肠道病毒、轮状病毒及肝炎病毒等。其中肠道病毒( e n t e rv i r u s e s ) 包括脊髓灰质 炎病毒( p o l i o v i r u s e s ) 、柯萨奇病毒( c o x s a c k i ev i r u s e s ) 、艾柯病毒( e c h ov i r u s e s ) 、 甲型肝炎病毒和几种近年兴起的新型肠道病毒。随着任何一种动物的粪便或尿排 泄出来的病毒，都可能使水污染，其中，以能感染人类胃肠道而又能随病人的粪 便排出的病毒为数较多，在影响人类健康方面有特别的重要性。 污水中的病原细菌是造成危害的一个主要部分，如沙门氏菌( s a l m o n e l l a 踱) ， 志贺氏菌( s h i g e l l a 够) ，霍乱弧菌( v i b r i oc h o l e r a e ) ，埃希氏大肠杆菌 ( e n t e r o p a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l i ) ，结肠弯曲杆菌( c a m p y l o b a c t e r j e j u n i ) 等。 沙门氏菌可导致伤寒、败血病、急性肠胃炎爆发，志贺氏菌可导致肠道疾病如杆 菌性痢疾。 近几年来，新发传染病( e m e r g i n gi n f e c t i o u sd i s e a e s ) 在世界各国都是一个 非常重要的公共卫生问题。新发传染病( e i d ) 是指由新种或新型病原微生物引 发的传染病1 6 j 。在我国已经发现的新发传染病有s a r s 、a i d s 、0 1 5 7 ：h 7 出血性 大肠杆菌感染、0 1 3 9 霍乱、军团病、空肠弯曲菌腹泻、莱姆病、单核细胞李斯 特菌引起的食物中毒、小肠结肠炎耶尔森菌感染、肾综合征出血热、新型肝炎、 肺炎衣原体感染、小隐孢子虫肠炎猫抓病等1 7 l 。引起新发疾病的新型病原微生物 2 江苏大学硕士学位论文 种类复杂，人类对新型病原菌的传染源、传播途径、致病机理知之甚少，但是可 以肯定的是水在这类微生物传播的过程中起着重要作用。 1 2 2 城市污水中病原微生物对人类健康影响 病原微生物数量大、来源多、分布广；病原微生物在水中存活时间长短与微 生物种类、水质、水温、p h 等环境因素有关，通常吸附于有机或无机悬浮颗粒 上，在水中存活时间长，人畜感染机率大。有些病原微生物不仅在生物体内( 包 括水生生物) ，而且在水中也能繁殖，有些病原微生物抗药性很强，一般水处理 和加氯消毒的效果不佳，如污水处理不当污染水源或污水重新利用欠妥，其中仍 存活的病原微生物将对人群健康造成极大的危害。传统混凝、沉淀、过滤、消毒 给水处理能够去除9 9 以上，但出水浊度若大于0 5 度时，仍会伴随有病毒。因 此，此类污染物实际上通过多种途径进入人体，并在体内生存，一旦条件适合， 就会引起人体疾病。与化学污染物相比，污水中病原体具有以下特征1 8 】： ( 1 ) 病原体在水中的分布是离散的，而不是均质的； ( 2 ) 病原体常成群结团，或吸附于水中的固体物质上，其水中的平均浓度 不能用以预测感染剂量； ( 3 ) 病原体的致病能力取决于其侵袭性和活力，以及人的免疫力； ( 4 ) 一旦造成感染，病原体可在人体中繁殖，从而增加治病的可能； ( 5 ) 病原体的剂量反应关系不呈累积性。 据世界卫生组织调查显示【9 】，8 0 的人类疾病与水质污染有关，在发展中国 家，每年因缺乏清洁饮用水造成的死亡人数达1 2 4 0 万。联合国最近的统计数据 表吲1 0 l 目前世界上无法获得安全饮用水的人数有1 4 亿还有1 8 亿人因水污染患 病。每天约有2 5 万人死于水污染其中每8 秒钟就有一名儿奄死于与不洁净水有 关的疾病，有五分之一的淡水鱼因水污染而濒临灭绝国内外的众多学者的研究结 果显示，水体污染对人体健康的损害，包括采用流行病学、实验室研究等方法， 观察了污染物的急性、慢性作用，发现通过接触污染水中的生物污染物可以引起 霍乱、伤寒、痢疾、肝炎等传染病发病率上升。 1 9 8 2 年6 月在美国的俄克拉科马城发生了一起由宋内氏痢疾杆菌引起的胃 肠炎暴发流行，调查结果发现与在被污染的湖罩游泳有关| l l 】；1 9 9 0 年1 2 月至1 9 9 1 年4 月印度的坎普尔发生了一次戊型肝炎大流行，共有近8 万人发病，调查发现 3 江苏大学硕士学位论文 与饮用恒河水有关；1 9 9 8 年夏季，美国怀俄明州阿尔派因地区爆发了一次大肠 杆菌感染，在1 5 7 例患者中，7 1 例( 约占4 5 ) 粪便中检出了大肠杆菌；2 0 0 4 年 4 - 9 月，尼泊尔全国近三分之一的地区因饮用水不卫生而流行肠胃炎、腹泻、痢 疾等疾病，据不完全统计，造成1 2 8 万人染病，其中1 7 7 人死【1 2 l 。以上疾病的 暴发流行或由于饮用水( 或水源水) 被生活污水污染所致，或直接接触被污染的 水而引起。 由上述大量事件表明，水环境中尤其是城市污水中的病原微生物经过各种程 度的处理，又进入不同的水道，成为河川、溪流的一部分，而这些地面水又是大 多数社区饮用水的来源。被病原微生物污染水体的对人类健康造成了严重威胁， 是人类所面临的严重公共卫生学问题之一1 1 3 l 。 1 3 水环境病原微生物污染控制指标 国外病原微生物污染控制标准中对细菌的控制相对严格1 1 4 】。目前美国大部分 州对经过二级生化处理后的污水出水的消毒指标为粪大肠菌群不超过2 0 0 个 1 0 0 m l ，极个别州的标准为粪大肠菌群不超过4 0 0 个1 0 0 m l 或1 0 0 0 个1 0 0 m l 。 加拿大的污水排放消毒指标与美国类似i l 引。欧盟国家的污水排放标准主要受浴场 水指导准则约束，现行标准为受纳水体中的总大肠菌群不超过1 0 0 ( o 个1 0 0 m l ， 且粪大肠菌群不超过2 0 0 0 个1 0 0 m l ，目前欧盟正在对这一标准进行修改，预计 新标准中的粪大肠菌群数将修订为不超过个1 0 0 0 个1 0 0 m l 。同本水污染环境质 量标准二级标准总大肠菌群数小于1 0 0 0 个m l 。 我国国家环境保护总局和国家质量监督检验检疫总局颁布的城镇污水处理 厂污染物排放标准( g b l 8 9 1 8 2 0 0 2 ) 中首次将病原微生物粪大肠菌群列为 基本控制指标1 1 6 l ，要求城市污水必须进行消毒处理。2 0 0 3 年5 月4 同，国家环 境保护总局要求城镇污水处理厂出水应结合实际采取加氯或紫外线、臭氧等消毒 灭菌处理，出水水质粪大肠菌群数小于1 0 0 0 0 个l 。城市污水再生利用城市杂 用水水质( g b 厂r 1 8 9 2 0 2 0 0 2 ) 要求总大肠菌群数小于3 个l ，城市污水再生利 用景观环境用水水质( g b l 8 9 2 1 2 0 0 2 ) 中观赏性景观环境用水( 河道、湖泊) 总大肠菌群数小于1 0 0 0 0 个l ，观赏性景观环境用水水景类小于2 0 0 0 个l ，娱 乐性景观环境用水( 河道、湖泊) 小于5 0 0 个l ，娱乐性景观环境用水水景类不 4 江苏大学硕士学位论文 得检出。 水质标准中微生物指标非常关键，这是衡量水质是否安全的重要指标。目前 我国检测污水和再生水的微生物项目和指标上只列出了细菌总数和大肠杆菌两 项，大多数选择总大肠菌群或粪大肠菌群作为生物学控制指标。但这一指标并不 能完全表征处理后污水在生物学上的安全性，因为虽然水中大肠杆菌类的含量与 病原微生物含量之间有大致定性的相关关系，但是它与水中是否存在致病病毒和 病原微生物并无直接关系。实验证明大肠杆菌很容易被灭活，抵抗力低于病毒和 某些致病菌【1 7 1 。近年来国外资料报道，大肠杆菌也许还不能作为衡量水质的准确 卫生指标，如在某些地区从大肠杆菌含量 i 1 ) t 载体通用引物p l ( m 1 3 4 7 或r v - m x l 毗m ) 细菌通用引物p 2 ( 1 6 s ( + ) - - 鸯, 1 6 s ( 一) x 1 毗m ) m g c l 2 ( 2 5 m m ) 1 0 x b u f f e r d n t p ( 1 0 m m ) t a q 酶( 5 u l l i ) d d h 2 0 2 毗l 0 靴l 0 5 岸l 1 靴l 2 靴l 0 5 l 0 靴l 1 他l 经质粒鉴定初步为阳性的克隆，采用t 载体通用引物m 1 3 - 4 7 或r v m 和细 菌1 6 s 通用引物进行菌落p c r ，进一步筛选阳性克隆，同时鉴定测序方向。p c r 反应体系( 5 0 弘1 ) 见表2 2 ，反应条件同上。扩增产物经0 7 琼脂糖凝胶电泳检 测分析。 ( 5 ) 1 6 sr d n a 片段测序和序列比对 获得阳性克隆，交由上海生工进行测序。序列先经r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o i e c t i ic h i m e r ac h e c k 和b e l l e r o p h o n 软件分析检查是否为阳性异源嵌合体，然后序 列通过n c b i ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 中b l a s t 程序，将1 6 sr d n a 片断序 列与g e n b a n k 资料库中已发表的己知菌种1 6 sr d n a 序列进行比对。序列比对是 依据序列可以对应到最长序列，且相似度最高为原则，将序列比对后的资料进行 分析整理，选取序列相似度最高与相似度较接近的物种作为同源微生物。一般认 为，1 6 sr d n a 序列同源性小于9 8 ，可以认为同属不同种，同源性小于9 3 9 5 ， 认为属于不同属。将文库中序列通过e b l ( h t t p ：w w w e b i a c u k t o o l s c l u s t a l w 2 ) 数据库进行序列的两两比对，相似性大于等于9 7 视为相同基因型细菌。 ( 6 ) 系统发育分析 由1 6 sr d n a 序列比对找出一群相似度高的微生物，利用软件m e g a 4 1 构 建城市污水中细菌的系统发育树，进化距离计算采用j u k e s c a n t o rd i s t a n c e s 物 种演化距离运算模式，树的拓扑形状采用n e i g h b o r - j o i n i n g 方法构建，并对发育 树进行评估。 1 8 江苏大学硕士学位论文 经由1 6 sr d n a 序列资料库比对，构建微生物的系统发育树，从演化分析上 的分群结果，推测演化关系相近的种群，透过系统发育树来进一步鉴定分离的微 生物所属菌种，并且探讨其可能的生理特征。 2 2 4 溶血性检查 溶血性是鉴定过程中重要的一步，1 9 1 9 年b r o w n 对溶血性进行了描述：a 溶 血：或称甲型溶血，在血平板上，菌落周围部分红细胞被破坏，呈现一个草绿色 环；b 溶血：或称乙型溶血，在血平板上，菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个 清楚透明溶血环；y 溶血：或称丙型溶血，血平板上，菌落周围无红细胞溶解， 因而无溶血环。 将标本接种于羊血平板上，3 7 培养过夜，观察结果：在接种处或菌落周围， 羊红细胞完全溶解，形成无色透明区，为b 溶血；羊红细胞部分溶解或不溶解呈 草绿色的环，为a 溶血；不溶解无溶血环为丫溶血。 2 2 5 生理生化实验鉴定 将v p 培养基、m r 培养基、吲哚培养基、明胶培养基、葡萄糖培养基、蔗 糖培养基、乳糖培养基和l 苯丙氨酸培养基分别取5 m l 装入试管进行高压灭菌， 其中l 广苯丙氨酸培养基制成斜面，葡萄糖、蔗糖、乳糖培养基试管内均放入倒 立的杜氏小管，并保证小管内无气体，另外制备含淀粉平板( 淀粉含量2 ) 。接 种大肠杆菌及各菌株于各培养基，淀粉水解参照菌株为枯草芽孢杆菌。将各含有 细菌的培养基试管放置于3 0 水浴振荡和3 0 培养箱内2 4 h ，进行各种生理生 化试验，每个实验平行3 组，并设空白对照。 2 3 实验结果 2 3 1 菌落特征和菌体形态 从c e f 0 6 4 筛选培养基分离纯化获得的5 个形态特征不同的菌株，分别命名 为j d l 6 、j d l 7 、j d l 8 、j d 2 5 、j d 2 7 。从c a t 筛选培养基分离纯化获得的菌株 为j d 3 2 。 如图所示： 1 9 江苏大学硕士学位论文 j d l 6 在血平板上茵落呈灰白，菌落四周透明，圆形，边缘齐整，中间凸起， 表面光滑湿润，似蜡烛油滴，易挑起。 j d l 7 在血平板上菌落呈白色，圆形，边缘规则，整个菌落凸起，表面光滑 湿润。 j d l 8 在血平板上菌落呈浅黄色，圆形，表面光滑湿润，整个凸起，边缘整 齐，菌落散发水果味。 j d 2 5 在血平板上菌落透明略灰，圆形，表面干燥，菌落小似针尖。 j d 2 7 在血平板上菌落为白色，圆形，表面干燥，边缘规则，菌落较小。 j d 3 2 在血平板上略显粉色，透明，圆形，湿润，中间凸起，边缘整齐。 _ 够“警! ，删7 ，事氛 ，j 膏j 、? 7 ；：一? 参。一j j 。j 篾一 图2 1 各茵株茵落特征 f i g 2 1c o l o n i a lm o r p h o l o g yo fb a c t e r i a ls t r a i n s 2 3 2 基于1 6 sr d n a 基因的细菌分离与鉴定 ( 1 ) 细菌基因组d n a 的提取 江苏大学硕士学位论文 2 l k b 图2 2 细茵基因组d n a 电泳图 f i g 2 2t o t a lg e n o m i cd n ag e ne l e c t r o p h o r e s i so fb a c t e r i u m m ：a d n a h i n d i l lm a r k e r ；1 、2 、3 ：菌株d n a 本研究中细菌基因组d n a 通过酶解和酚氯抽提方法的结合，可获得较大片 段的基因组d n a ，大小约为2 1 k b 左右。 ( 2 ) 1 6 sr d n a 的p c r 扩增 以细菌总d n a 为模板，采用细菌1 6 sr r n a 通用引物2 7 f 和1 5 4 0 r 为引物 作p c r 扩增，扩增产物长度约为1 5 0 0 b p ( 见图2 3 ) 。由p c r 结果可见所提取 的总d n a 纯度能满足实验要求。同时，为减少p c r 反应的随机性偏差，以细菌 1 6 sr r n a 通用引物对每个模扳同时作4 个平行反应，将产物混合起来后纯化。 一1 5 k b 图2 31 6 sr d n ap c r 扩增产物电泳图 f i g 2 3e l e c t r o p h o r i s i sd e t e c t i o no f16 sr d n af r a g m e n ta m p l i f i e db yp c r m ：l d n a h i n d l i im a r k e r ；1 、2 、3 ：1 6 sr d n ap c r 扩增产物；4 ：1 0 0 b pm a r k e r 2 1 江苏大学硕士学位论文 ( 3 ) 1 6 sr d n a 阳性克隆鉴定 1 i k b 图2 41 6 sr d n a 阳性克隆质料鉴定结果电涿图( 部分) f i g 2 4p l a s m i de l e c t r o