（食品科学专业论文）植酸酶生产过程主要影响因素研究.pdf

- 己t ： 河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：刁运住 指导教师签名： 杉参 劢7 c 7 年r 月l , tn 矽加年r 月易d | - 1 ；- - i l l 科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用。y l q 论义的舰定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允诩：沦文被查i 孙1 ：1 借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有天数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权一阢 本学位论文属于 尉，不保密。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：刁迎巧王 指导教! j i | j 签私： 仂勿年f 月7 9 同伽加f fj - j ja f 1 钐 厂9 一 l 一 摘要 摘要 近年来，毕赤酵母作为一个极好的外源基因表达系统被广泛应用于植酸酶的生 产。本课题通过对植酸酶发酵过程主要影响因素的研究，优化了植酸酶摇瓶和发酵 罐培养的工艺条件。此工程菌摇瓶培养阶段的最佳条件为：种龄2 0 h ，接种量5 ， 生长和诱导阶段培养基的最适p h 值分别为5 5 和6 0 ，使用山梨醇甲醇混合碳源诱 导，添加量恒定为2 4 m l 天，每隔1 2 h 小时补加，最适诱导时间为6 0 h 。发酵罐阶 段最佳工艺条件为：生长和诱导阶段培养基的最适p h 值分别为6 0 和6 5 ，发酵周 期进一步缩短为5 4 h ，最终酶活达319 8 5 u m l 。 目前植酸酶工业化生产的培养基成本较高，发酵周期又很长，在很大程度上提 高了企业的生产成本。本研究采用廉价易得的麦芽汁麦麸生长培养基和麦芽汁麦麸 高温浸提培养基培养毕赤酵母工程菌产植酸酶，同时优化了培养基的组成。向1 0 0 9 麦芽粉中添加1 5 9 麦麸作为培养基原料，在菌体生长阶段添加4 的玉米浆作为氮源 补充，优化后酶活提高了近1 倍。 本课题还对目前植酸酶酶活测定使用最多的钒一钼酸铵法和钼蓝法两种方法的 准确性和稳定性进行了研究，结果表明中华人民共和国国家标准( g b t1 8 6 3 4 2 0 0 2 ) 推荐使用的钒钼酸铵法稳定性好且操作简便，适于植酸酶酶活的快速检验。 本研究对毕赤酵母工程菌的培养基和发酵工艺进行了探索和优化，提高了植酸 酶产率，缩短了生产周期。为工业化生产中降低植酸酶生产成本、提高酶表达量及 发酵生产提供了科学依据。 关键词植酸酶；毕赤酵母；发酵；培养基；酶活测定；钒一钼酸铵法 a b s t r a c t a bs t r a c t p i c h i ap a s t o r i sa sa ne x c e l l e n th e t e r o l o g o u sg e n ee x p r e s s i o ns y s t e mh a sb e e nw i d e l y u s e di nt h ep r o d u c t i o no fp h y t a s e t h ep r o c e s s e so fr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i si nb a f f l e d f l a s ka n di nf o r m e n t o ra r ea l s oe x p l o r e dt oa s c e r t a i nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so ft h i sg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e ds t r a i ni ns h a k ef l a s ks t a g ea r e ：s e e da g e2 0h ： i n o c u l a t i o n5 ；t h ep ho fm e d i u mi n g r o w t ha n di n d u c t i o np h a s e sa r e5 5 a n d6 0 r e s p e c t i v e l y t h em i x t u r eo fs o r b i t o l m e t h a n o li su s e di ni n d u c i n gs t a g e 2 4 m lo ft h e s o l u t i o ni sa d d e d p e rd a yc o n s t a n t l y f e r m e n t a t i o np e r i o di sr e d u c e dt o6 0 h t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so ft h i sg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e ds t r a i ni nf o r m e n t o rs t a g ea r e ：t h ep ho fm e d i u m i n g r o w t ha n di n d u c t i o np h a s e sa r e6 0 a n d6 5 ，r e s p e c t i v e l y f e r m e n t a t i o n p e r i o di s r e d u c e dt o5 4ha n dt h ef i n a la c t i v i t yr e a c h e s319 8 5 u m l a tp r e s e n t ，t h ee x p e n s i v em e d i u mi ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n dt h el o n gf e r m e n t a t i o n c y c l ei n c r e a s et h ep r o d u c t i o nc o s to fe n t e r p r i s e ss i g n i f i c a n t l y t w oc h e a pm e d i a - - - - - - w o r t - w h e a tb r a ng r o w t hm e d i u ma n dw o r t w h e a tb r a ne x t r a c t i o nm e d i u mw e r eu s e dt o c u l t i v a t er e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i si nt h i ss t u d y , t h ec o m p o s i t i o no ft h em e d iaa r e o p t i m i z e d 15 9w h e a t b r a np l u slo o gm a l tp o w d e ri su s e da sb a s i cm e d i am a t e r i a l s i nt h e y e a s tg r o w t hs t a g e4 o ft h ec o ms y r u pi sa d d e d t h ef i n a le n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e d a b o u to n e f o l da f t e ro p t i m i z i n g t h em o s tc o m m o n l yu s e dd e t e r m i n a t i o n so fp h y t a s ea c t i v i t ya r ev a n a d i u m a m m o n i u mm o l y b d a t em e t h o da n dm o l y b d a t e - b l u em e t h o d t h ea c c u r a c ya n ds t a b i l i t yo f t h et w om e t h o d sw e r es t u d i e di n t h i sr e s e a r c h t h er e s u l t ss h o wt h a tv a n a d i u m a m m o n i u mm o l y b d a t em e t h o dw h i c hi sr e c o m m e n d e di nt h en a t i o n a ls t a n d a r d ( g b t 18 6 3 4 2 0 0 2 ) h a st h ea d v a n t a g e so fs i m p l ep r o c e d u r e ，r a p i dt e s t i n ga n ds a t i s f i e da c c u r a c t h ec u l t u r em e d i u ma n df e r m e n t a t i o np r o c e s s e so fr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i sh a v e b e e ns t u d i e da n do p t i m i z e di n t h i sr e s e a r c h t h ey i e l do fp h y t a s eh a si n c r e a s e da n dt h e p r o d u c t i o nc y c l eh a ss h o r t e n e d p r o v i d es c i e n t i f i cb a s ef o rs u b s t r a t ec o s td e c r e a s i n g ， i m p r o v i n gt h ee n z y m ey i e l d a n di t sf e r m e n t a t i o n a lp r o d u c t i o n k e yw o r d sp h y t a s e ；p i c h i ap a s t o r i s ；f e r m e n f a t i o n ；c u l t u r em e d i u m ；a c t i v i t ya s s a y ； v a n a d i u m a m m o n i u mm o l y b d a t em e t h o d i i 日录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第1 章绪论1 1 1 植酸与植酸酶l 1 2 植酸酶的分类与来源1 1 2 1植酸酶的分类1 1 2 2 植酸酶的来源2 1 3 植酸酶的应用意义3 1 3 1减少磷排放，保护生态环境3 1 3 2 提高蛋白质、氨基酸的利用率4 1 3 3 提高矿物元素的利用率5 1 3 4 提高能量利用率5 1 4 植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵国内外研究进展6 1 4 1外源基因在毕赤酵母中的发酵表达6 1 4 2 高密度发酵6 1 5 本课题的研究目的与方法7 第2 章植酸酶的活力测定9 2 1 试验主要试剂及仪器1 0 2 1 1 主要试剂及溶液10 2 1 2 仪器和设备1 1 2 2 试验方法12 2 2 1 钒一钼酸铵法和钼蓝法标准曲线的测定1 2 2 2 2 钒一钼酸铵法与钼蓝法稳定性的比较1 4 2 2 3 两种不同底物对钒一铜酸铵法测定结果的影响1 4 2 3 试验结果 1 4 2 3 1 钒一钼酸铵法与钼蓝法标准曲线比较1 4 2 4 两种酶活检测方法稳定性的研究1 6 目录 2 5 不同底物对钒钼酸铵法检测结果的影响17 2 6 本章小结1 8 第3 章培养基筛选1 9 3 1 试验材料2 0 3 1 1 菌种2 0 3 1 2 主要试剂2 0 3 1 3 主要仪器：2 0 3 1 4 培养基2 1 3 2 试验方法2 1 3 2 1 测定方法2 1 3 2 2 培养基筛选2 1 3 3 试验结果2 2 3 3 1 麦麸添加量2 2 3 3 2 玉米浆的添加量2 3 3 4 本章小结2 5 第4 章植酸酶发酵过程主要影响因素研究2 7 4 1 试验材料：，2 8 4 1 1 菌种2 8 4 1 2 主要试剂2 8 4 1 3 主要仪器2 8 4 2 试验方法2 9 4 2 1测定方法一2 9 4 2 2 基因工程菌摇瓶培养条件研究2 9 4 2 3 基因工程菌发酵罐培养条件研究3 0 4 3 试验结果与讨论31 4 3 1 基因工程菌摇瓶培养条件研究31 4 3 2 基因工程菌发酵罐培养条件研究3 9 4 4 本章小结点4 l 结论4 3 参考文献4 5 i i 目录 攻读硕士学位期间所发表的论文5 1 致 谢5 3 i i i 第1 章绪论 第1 章绪论 植酸酶是一种可作为饲料及食品添加剂的新型酶制剂。它能将饲料及食品中的 植酸( 盐) 转化为可供有机体利用的无机磷，降低单胃动物粪便中磷的含量，从而 减轻磷对环境的污染，植酸酶还能消除植酸对多种金属离子的螯合作用，改善蛋白 质、脂肪等营养成分的吸收和利用。植酸酶因其多方面的特性，已成为饲料、医学、 人类营养、食品工业、植物生理学和植物育种等领域关注的焦点。 1 1 植酸与植酸酶 植酸又称肌醇六磷酸，含磷较高( 2 8 2 ) ，含有6 个磷酸残基，具有极强的螫 合能力，可与钙、镁、钾、锌、铁、钠、铜、锰等矿物质结合形成不溶性盐类，降 低了矿物质在肠道中的吸收；植酸还可络合蛋白质，抑制消化酶活性。植酸的存在 使多种常量和微量元素的利用率下降，降低了蛋白质、脂类物质等营养因子的消化 吸收，因此，植酸是一种抗营养因子。 植酸( 盐) 广泛存在于植物果实以及籽粒中，一股产生在种子的成熟过程中和 休眠期，是许多植物组织中磷的主要存在形式，占植物总磷含量的6 0 - - - 9 0 。菜 籽饼粕及浓缩菜籽蛋白中植酸的含量为3 0 9 9 ，棉籽饼粕中植酸的含量在2 9 以上，玉米、水稻、高粱、小麦、大麦中植酸的含量为0 9 6 1 1 7 。 植酸磷必须水解成无机磷才能被畜禽利用，但因单胃动物肠道中缺乏分解植酸 ( 盐) 的酶，因此很难消化利用植酸磷。根据美国肯塔基大学通过1 0 年的研究证实， 猪只能利用豆粕中磷的2 5 - - - 3 5 ，玉米中磷的l o 1 2 ，典型的猪同粮中磷的 利用率仅仅为1 5 ；而鸡对豆粕和玉米中磷的利用率比猪还低。显然8 5 左右的磷 从畜禽粪便中排出，导致了土壤和水源的污染。 植酸酶是指能催化植酸( 及其盐) 水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称【2 】。将其添 加到植物性饲料中，可降解植酸磷，不仅能提高动物对植酸磷的吸收利用率，而且 还可减小植酸对微量元素的螯合作用，提高动物对植物蛋白和多种矿物元素的利用 率以及植物性饲料的营养价值，同时减少动物排泄物中磷的含量，减少对环境的污 染。 1 2 植酸酶的分类与来源 1 2 1 植酸酶的分类 植酸酶可以根据开始水解植酸的位点和最适p h 值两和，方式来进行分类。根据国 际纯化学与应用化学联合会和困际生物化学联合会定义，依据开始水解植酸的位点 河北科技火学硕十学位论文 不同，植酸酶可分为3 植酸酶( e c3 1 3 8 或肌醇六磷酸3 磷酸水解酶) 和6 植酸酶 ( 3 1 3 2 6 或肌醇六磷酸6 磷酸水解酶) ，两种植酸酶分别从第3 位碳点和第6 位碳 点水解磷酸盐，最终形成系列中间体【3 4 j 。 根据最适p h 值不同，植酸酶也可大致分为两类：组氨酸酸性植酸酶和碱性植酸 酶，前者在p h 值5 0 左右具有较高活性，后者在p h 值接近8 0 的时候活性较古【4 1 。 除了芽孢杆菌外，大部分的生物植酸酶和植物植酸酶都属于酸性植酸酶，因其在饲 料和人类食品中的适用性及较碱性植酸酶更广泛的底物特异性而被广泛关注。 1 2 2 植酸酶的来源 植酸酶在自然界中分布广泛，到目前为止，研究者己经从动物、植物和微生物 中分离出多种植酸酶基因。由于动物植酸酶含量很低，植物植酸酶在加工、贮藏等 过程中极易被破坏，且难以提纯，而微生物植酸酶作用范围广，较为稳定，易规模 化生产，因此，近几年的研究都集中于微生物植酸酶【5 】。 1 2 2 1 植物植酸酶 植酸酶广泛存在于植物中，在种子或花粉发芽时，植酸酶将植酸水解为磷酸盐 和肌醇，为种子萌发及幼苗生长提供必要的营养物质。植酸酶最早是1 9 0 7 年在植物 中发现的，因此早期的研究都集中在植物和动物器官上【6 】。植物植酸酶分为两种，大 部分的植物植酸酶是从肌醇的第6 位碳点上开始水解，因此是6 植酸酶，一般存在 于植物籽实中：另一种存在于植物的组织中，为3 植酸酶。目前已知可从多种植物 中分离出植酸酶，包括谷物、油菜籽、大豆、玉米、小麦和黑麦等。植酸酶的活性 因植物种类的不同而有很大的差别，小麦、黑麦、大麦、小麦麸中的植酸酶具有较 高的活性，但是玉米、燕麦、大豆饼中的植酸酶活性很低【7 j 。v i v e r o s 等测定了2 4 种 饲料中植酸酶的活性，结果发现在所有的谷物籽实中，黑麦籽实的植酸酶活性最高， 超过了5 0 0 0 u k g ，黑小麦中植酸酶活性为2 0 3 0 u & g ，小麦中植酸酶的活性为 1 5 0 0 u & g ，而燕麦、玉米胚和高粱籽实中的植酸酶几乎没有活性( 小于1 0 0 u & g ) 【8 】。 植酸酶的微生物基因编码可被克隆并移植到植物中，以实现植酸酶的高效表达，并 已成功的向大米、小麦、甘蔗、拟南芥、大豆、油菜、马铃薯中进行了移植【9 】。在人 类营养的应用中，植酸酶可被用于促进人们对大米和小麦中铁的吸收利用。 1 2 2 2 动物植酸酶 动物植酸酶存在于哺乳动物的小肠以及脊椎动物的红血球和血浆原生质中，但 是含量一般很少而且活性很低【_ 7 1 。相对于植物和微生物植酸酶，动物植酸酶方面的研 究很少。反刍动物由于瘤胃中的微生物可产生植酸酶，因此可降解利用植酸盐，单 胃动物因缺乏内源性植酸酶而难以利用植酸盐。 第l 章绪论 研究者对动物胃肠道中植酸酶的存在情况进行了调查研究。p a t w a r d h a n1 9 3 7 年 首先报道了植酸可以在小鼠的肠道内水解，后来的研究发现了猪、羊、牛的小肠中 也存在植酸酶【1 0 1 1 】。b i t a r 和r e i n h o l d 从小鼠、鸡、牛犊和人的小肠中的植酸酶进行 了部分纯化，研究发现小鼠肠中植酸酶的活性是人类的3 0 倍【l2 1 。普通人小肠中的植 酸酶对植酸几乎没有降解能力，对植酸的降解没有任何意义，因此从饮食中摄入的 植酸酶可能是植酸降解的一个重要因素。而且有趣的是，许多动物，包括人类在内， 当磷摄入量不足时，体内的植酸酶就会增多，活性也会提高，以满足机体对磷的需 要【1 3 】。 1 2 2 3 微生物植酸酶 真菌和细菌是植酸酶的重要来源。第一个对酵母菌植酸酶的报道是在1 9 8 4 年， 后来又发现几种菌株有降解植酸盐的能力，其中，黑曲霉、烟曲霉被广泛应用于植 酸酶的商业生产【14 1 。许多细菌中也都含有植酸酶，主要有枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、假单孢菌( p s e u d o m o n a s ) 等。 属于曲霉、根霉、青霉、毛霉的超过2 0 0 多种真菌已经被用来尝试生产植酸酶， 都可以产生有活力的胞外植酸酶【l5 1 。其中产酶最活跃的菌株是黑曲霉( 彳n i g e r ) ，而 无花果曲霉( a f i c i u m ) 产酶的效率最高。一般而言，丝状真菌所产植酸酶为胞外酶， 容易分离提纯，而细菌植酸酶往往是胞内酶( b s u b t i l i s 和肠杆菌属e n t e r o b a c t e r 除 外) 。黑曲霉n p p l 3 1 3 5 可以产生两种植酸酶，一种植酸酶的最适p h 值为5 5 和2 5 ， 另一种的最适p h 值是2 o ，最适温度为5 5 ，后来这两种植酸酶分别被命名为植酸 酶a 和植酸酶b t l 6 】。黑曲霉n p p l3 1 3 5 也可以用菜籽饼做培养基进行固体发酵生产 植酸酶。烟曲霉植酸酶在p h 6 5 ，温度3 7 ，湿度为6 4 时具有最佳活力m j 。嗜热 真菌疏绵状嗜热丝孢菌最佳活力展现在6 5 。c ，p h 值为6 0 时【l8 1 。另一种嗜热真菌嗜 热侧胞霉的最适温度为4 5 ，最适p h 值为6 o 【l 圳。 研究者对2 1 种酵母菌进行了筛选，发现部分具有植酸酶活性，也就是说它们可 以在以植酸磷的钠盐作为唯一磷源的培养基中生长，其中s c h u u z n n i o m y c e sc a s t e l l i i 所产植酸酶活性最高，对其特性进行研究发现，这种酶具有较广泛的底物特异性， 植酸磷是它最偏爱的底物，而且它的适宜温度比其他微生物来源的植酸酶高【2 。 1 3 植酸酶的应用意义 1 3 1 减少磷排放，保护生态环境 。 磷对骨骼的完整性和生长性能郜至关重要，为此营养学家试图向动物饲料早添 加适度过量的磷以保证满足动物对磷的需要。但是，由于磷的排泄与总磷有密切关 系，从环境方面考虑，动物饲料中应该含有最低限量的磷以保证可持续生产。因此， 3 河北科技人学硕士学位论文 对磷水平适当的建议标准已成为密切关注的问题。 目前环境中磷污染日益严重，且已经给水体质量造成了严重的危害，因此需要 减少动物的磷排泄及其向环境中的排放，这就促使了植酸酶在畜禽同粮中的添加。 磷浓度超标是河流、湖泊和水库水体富营养化最常见的原因。地表径流经过富含磷 的土壤，加速了水体富营养化，严重者可能导致赤潮和鱼类死亡。因此，任何减少 猪和家禽磷排泄的方法对环境和可持续生产都是有益的。 日粮中添加植酸酶可大大减少猪禽粪便的磷污染。2 0 0 u k g 一1 0 0 0 u k g 的植酸酶 可使猪粪、禽排泄物中的磷含量降低2 5 - - 一5 0 。基于现有数据，每头猪从18 k g 长 到1 0 9 k g 需要消耗3 1 8 k g 饲料，包含1 4 3 k g 的磷( n r c 推荐，平均4 5 k k g 日粮) ， 将排泄0 7 1 k g 磷；添加植酸酶后，摄入磷可降低到1 1 l k g ，排泄磷低于0 5 6 k g 。 s i m o n s 等的研究证明了微生物植酸酶在减少磷排泄方面的巨大潜力。研究者做 了对比试验，使日粮中磷和钙的含量分别为4 5 9 k g 7 5 9 k g 和6 0 9 k g - - - 9 0 9 k g ，再 加入1 5 0 0 f t u k g 酶活的植酸酶，结果显示磷的排泄量平均降低了6 1 【2 。z y l a 等 从肉鸡的小麦大豆日粮中完全除去了磷酸氢钙，从而降低了非植酸磷和钙的水平， 在4 3 天的喂养试验中，这种喂养机制减少了4 5 的磷排放。另外，外源酶显著提高 了屠体产量和饲料利用犁2 2 1 。 2 0 0 3 年p a i k 用了一个更简单的估算方法，他在肉鸡日粮中降低了非植酸磷水平， 做了两组对照喂养试验，一组添加了1 5 0 0 f t u k g 酶活的植酸酶，另外一组没有添加， 结果发现，没添加植酸酶的一组磷排放量减少了1 4 8 ，但对肉鸡体重的增加有不良 影响；添加了植酸酶的一组磷排放量减少了2 9 6 ，而且对肉鸡体重增加无影响【2 3 1 。 1 3 2 提高蛋白质、氨基酸的利用率 植酸可与一些蛋白质牢固的结合在一起，阻碍蛋白质的水解，植酸与蛋白质的 这种结合与p h 值有很大关系。当p h 值低于蛋白质的等电点时，植酸的磷酸基团与 蛋白质的阳离子基团结合，形成二元的蛋白质植酸复合物，只有在p h 值低于3 5 时才能溶解。这些复合物可影响酶的活性、蛋白质的溶解性和蛋白质的消化率。体 外研究表明，植酸与蛋白质的结合程度还受蛋白质的来源与溶解性以及饮食中钙与 镁的水平等的影响【2 4 。 植酸对蛋白质的抑制作用可能是因为蛋白质植酸的非特定性作用以及对钙离子 的螯合作用，这影响了胰岛素与c 【淀粉酶的活性，对蛋白酶活性的影响也是降低蛋 白质吸收率的原因。 植酸酶的水解作用释放出络合物中的蛋白质，使其消化利用率得到提高。在饲 料中添加微生物植酸酶后，不仅能使蛋白质而且使赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨 4 第1 章绪论 酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、组氨酸、异亮氨酸和苏氨酸的表观消化率均提高 9 ，1 2 t 2 5 1 。 许多试验已经证实植酸酶能够提高蛋白质的回肠利用率，但是一些利用纯化饲 料进行的研究中发现植酸酶对蛋白质的消化率没有影响【2 6 1 。有研究者认为是因为植 酸酶在植酸浓度低( 2 o g k g ) 的非典型畜禽日粮中几乎不起作用【拥。 1 3 3 提高矿物元素的利用率 饲料及食品中植酸酶的存在不利于其中矿物质元素的吸收利用，包括锌、钙、 镁、锰、铜等。植酸与下列离子形成络合物的稳定性依次减弱：z n 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + ： c 0 2 + 、m n 2 + 、c a 2 + 。由此可见，植酸对矿质元素利用率影响最大的是锌。植酸的存在 可以降低以植物性食物为主食的人群对z n 2 + 的吸收和动态平衡，而这可以导致侏儒 症和性腺功能低下。p h 值是影响植酸盐溶解性的重要因素，在较低p h 下的溶解性 要好于在较高p h 的溶解性。c a 2 + 、c d 2 + 、z n 2 + 和c u 2 + 的植酸盐在p h 值低于4 - - 5 才 能溶解，但是植酸镁在酸性p h 值到p h7 5 都能溶解。 g a o 等以玉米豆粕作为基础日粮，在生长猪和断奶仔猪日粮中添加不同水平的 植酸酶替代磷酸氢钙，试验结果显示钙磷的消化率明显高于对照组，植酸磷在胃中 的消化率显著上升，血清中钙和磷的含量差异不显著。结果表明，添加植酸酶提高 了钙和磷的消化率【2 8 】。在不同种饲料中添加3 0 0 u k g 5 5 0 u k g 水平的植酸酶可使植 酸磷的利用率提高，与磷代谢有关的指标如胫骨磷的含量、血清中磷的含量、灰分 中磷的含量均明显提高，并且胫骨的抗剪切力强度和应激能力也有明显改善 2 9 】。 r e v y 等在含3 2 m g k g 锌的仔猪基础日粮中分别添加2 0 m g k g 锌和1 2 0 0 u k g 植 酸酶，比较锌的利用率，发现添加植酸酶的效果较好，锌浓度和血清碱性磷酸酶及 骨中锌含量和锌沉积都优于添加锌组，同时还改善了仔猪对c a 、p 、m g 、f e 、c u 的 利用率【3 0 】。 1 3 4 提高能量利用率 植酸与脂肪酸钙镁聚合形成脂肪酸盐，也可直接或间接地与淀粉结合，同时抑 制0 【一淀粉酶的活性，从而限制了淀粉的利用率，降低了畜禽对这些能量物质的利用。 b r a d y 等报道在日粮中添加不同水平的植酸酶可提高能量物质的利用率，添加 1 0 0 0 f t u k g 水平的植酸酶时能量利用率提高了6 3 ，另外植酸酶的添加还增加了背 膘厚度1 3 1 | 。j o h n s t o n 等向不同钙磷水平的日粮中添加植酸酶，发现植酸酶的添加能 促进能量代谢【3 2 1 。 以上表明，将植酸酶添加至饲料及食品中，可在很大程度上提高磷、蛋白质、 5 河北科技大学硕士学位论文 矿物质营养元素和能量的利用率。 1 4 植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵国内外研究进展 1 4 1外源基因在毕赤酵母中的发酵表达 巴斯德毕赤酵母是- - , e e 甲醇营养型酵母，它可以在以甲醇为唯一碳源和能源的 培养基中快速生长。由于其在外源蛋白表达方面具有其他系统所不可比拟的优点， 已经迅速发展成为分子生物学领域应用最广泛的外源蛋白表达系统之一【3 3 1 。 巴斯德毕赤酵母的表达载体含特有的乙醇氧化酶( a o x l ) 基因启动子，因而能 够在以甲醇为主的培养基中快速生长，并达到很高的浓度，并能通过甲醇诱导a o x l 启动子调控外源蛋白基因的表达【3 4 1 。甲醇是醇氧化酶诱导剂，而葡萄糖、乙醇、甘 油等是抑制剂。r o n a n o s 等通过试验表明：巴斯德毕赤酵母在以甲醇为碳源的培养基 上生长，醇氧化酶蛋白占可溶性蛋白的3 5 ，而在葡萄糖，乙醇或甘油培养基上生 长则检测不到这种酶【3 引。 巴斯德毕赤酵母的表达兼具有原核表达系统和真核表达系统的优点。繁殖速 度很快，对条件要求低，所需培养基价廉，具有强烈的好氧生长偏爱性，能进行细 胞高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于大规模工业化生产【3 6 】；表达产量 高，迄今为止，已有3 0 0 多种异源蛋白成功的在该表达系统中获得了高效表达，如 破伤风毒素片段c 可达1 2 9 l ，已有报道其胞内表达量惊人，甚至达到了2 2 9 l 3 7 】： 作为真核表达系统，可对表达的目的蛋白进行翻译后的加工和修饰，如二硫键的 形成、蛋白磷酸化、信号序列加工等，从而使目的蛋白具有类似天然蛋白的活性， 此外，也可在c 甲基化中起作用，对位于细胞膜上的蛋白进行表达有着重要作用【3 8 】。 巴斯德毕赤酵母与酿酒酵母表达系统相比较，又具有分泌效率高，表达菌株稳定， 表达质粒不易丢失，糖基化程度低，蛋白抗原性低等优点【3 9 1 。 1 4 2 高密度发酵 高密度发酵工艺又称高密度发酵技术，是高效表达外源蛋白水平的一种重要策 略。该方法极大地改进了发酵工艺，发酵周期可缩短一半以上，菌体产量和产物表 达量是非高密度发酵的1 0 5 0 倍，蛋白活性提高2 - 3 斜矧，还可减少培养容器的 体积、减少设备投入，从而降低生产成本，极大地提高了产品在市场上的竞争力【4 1 1 。 迄今为止，已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量，如巴西三叶胶腈水解酶的 表达量高达2 2 9 l t 4 2 1 ，植酸酶表达量达1 2 2 9 l t 4 引，等。 不同菌种和不同菌株之间，在达到高密度的水平上差别很大，不同外源蛋白的 表达水平相差也很大，引起这种差异的重要因素有两个，一是工程菌本身的特性有差 6 第1 章绪论 异，二是发酵工艺。因此，想要在生物反应器最大限度的得到目的蛋白，就必须对 发酵过程进行研究，探索影响产物合成的因素，确定最佳发酵工艺条件。 郭美锦等对基因工程菌毕赤酵母产人重组血清蛋白的培养条件进行了研列删。 种子培养基为b m g y 加4 m l l 的p t m 盐，温度3 0 o ，摇床转速2 2 0 r p m m i n ，摇 瓶装量2 0 m l 2 5 0 m l ，培养2 4 h 后，按1 0 的接种量接入全合成培养基( 1 c l g l ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，4 甘油，0 9 3 9 lc a s 0 4 ，1 4 9 9 lm g s 0 4 7 h 2 0 ，1 8 2 9 lk 2 s 0 4 ，0 1 m o l f l 磷酸 缓冲液) 。进行摇瓶培养，待甘油耗尽，溶氧上升后，用n a o h 调节p h 值至6 0 ，并 加入o 1 m o l l 磷酸缓冲液l m l ，然后按1 2 舢补加p t m 盐和甲醇至终浓度o 5 ， 进行诱导培养，每隔2 4 h 补加一次甲醇。诱导1 2 h 后，有明显的外源蛋白表达，2 4 h 后粗蛋白含量就达到了2 5 0 m g l ，目的蛋白含量占分泌性蛋白总量的8 0 ，随后表 达量逐渐下降。 王涛等对毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件进行了5 l 发酵罐研究【4 5 】。通过单因素 试验和正交试验确定了最佳接种种龄是2 4 h ，最佳接种量是1 0 ，并得出结论：温度 和p h 值是酶产量的主要影响因子，并结合实际情况，得到5 l 罐发酵产木聚糖酶的 最佳工艺条件：温度为3 0 0 ，p h 值为5 5 ，空气流量3 l r a i n ，搅拌转速3 0 0 r r a i n ， 发酵1 3 0 h ，最后测得毕赤酵母发酵产木聚糖酶的酶活为2 7 8 0 u m l 。 易巧等对毕赤酵母基因工程菌表达人白细胞介素2 突变体的发酵条件进了了优 化 4 0 3 。以b m g y 作为初始培养基，温度3 0 ，摇床转速3 0 0 r m i n ，装样量为 1 0 0 m i j 5 0 0 m l 三角瓶，培养至o d 6 0 0 达到3 - - 6 ( 大约1 6 h - - 一1 8 h ) 后，离心弃上清液并 将菌体细胞沉淀悬浮在1 5 到1 1 0 原初始培养液体积的b m m y 培养基中，0 5 到 5 甲醇诱导。得出摇瓶发酵表达m v h i l - 2 的最佳条件为：发酵液初始p h 值为6 0 ， 诱导期间甲醇浓度为0 5 ，诱导时间7 2 h ，最终目的产物可达到菌体总蛋白的3 0 以上，为其进一步上发酵罐，大量生产重组人白细胞介素2 奠定了基础。 叶明等从土壤中分离到了3 3 株可产植酸酶的菌株，其中一株黑曲霉所产植酸酶 的活力最高【4 丌。对这株黑曲霉的原生质体进行了紫外诱变，诱变后酶活提高了 6 1 1 6 ，且所产植酸酶对热非常稳定。作者对诱变菌株的发酵条件进行了摸索，结 果表明，菌株的最佳产酶条件是：初始p h 值为5 0 ，温度为2 8 ，摇床转速为1 3 5 r r a i n ， 发酵时间为6 0 h ，酶活达到3 5 0 8 u m l 。 1 5 本课题的研究目的与方法 目前我国植酸酶主要应用在饲料领域，在饲料中添加植酸酶，能降低单胃动物 粪便中的磷排泄量，也可提高动物对蛋白质、矿物质元素、能量等的吸收和利用， 不仅降低了动物饲养对环境的污染，对动物的生长和发育也有很大的促进作用。随 7 河北科技大学硕士学位论文 着人们对肉类需求的不断增大和环保意识的增强，植酸酶的需求量也将越来越大。 本课题的主要目的是对毕赤酵母基因工程菌的培养基和发酵条件进行进一步探 索和优化( 发酵条件的优化分为摇瓶培养和发酵罐培养两个部分) ，最大程度上提高 植酸酶的酶活，降低植酸酶的生产成品，从而扩大植酸酶的应用范围。本课题还研 究了不同测定方法和不同底物对酶活测定结果的影响。 第2 章植酸酶的活力测定 第2 章植酸酶的活力测定 随着植酸酶在饲料行业越来越广泛的应用，植酸酶活性的测定方法也越来越受 到人们的关注。虽然我国2 0 0 2 年建立了测定植酸酶酶活的国家标准，但对于商品植 酸酶的活性检测，国际上至今仍没有普遍公认的检测方法。 植酸酶的活性有多种测定方法，大都是依据植酸酶酶水解植酸钠产生无机磷的 量来测定酶活。植酸酶活性的测定方法大致有以下4 种【4 引。 第一种是钒一钼酸铵法。这种方法目前使用较多，是1 9 9 1 年g i s t b r o c a d e s 和 b a s f 公司提出的植酸酶酶活测定方法。测定原理为在一定的温度和p h 值条件下， 植酸酶可水解底物植酸，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵试 剂处理可使水解反应停止，并可同水解释放出来的无机磷产生颜色反应，生成黄色 的 ( n h 4 ) 3 p 0 4 n h 4 v 0 3 * 1 6 m 0 0 3 含磷复合物，在4 1 5 n m 波长下测定吸光值，以标 准植酸酶作为对照，计算出样品中的植酸酶酶活。 第二种是f e s o a _ 钼蓝法。这种方法的原理是在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸 铵会解离出钼酸，钼酸与被释放出来的无机磷发生反应，生成磷钼酸络合物，当有 还原剂f e s 0 4 存在时，络合物会立即变成蓝色的物质( m 0 2 0 3 m 0 0 3 ) ，这种蓝色物 质在波长7 5 0 n m 处有最大吸收，在此波长测定吸光值，以空白作为对照，即可计算 出样品中植酸酶的活性。 第三种是v c 钼蓝法。这种方法的原理是在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵 解离出的钼酸与被释放出来的无机磷发生反应，生成磷钼酸络合物，当还原剂v c 存 在时，络合物会立即变成蓝色的物质，这种蓝色物质在波长6 5 0 n m - - - - 6 6 0 n m 之间有 最大吸收峰，在此波段内测定吸光值，以空白作为对照，即可计算出样品中植酸酶 的活性。 第四种是丙酮一磷钼酸铵法。这种方法的原理是在酸性条件下，过量的钼酸铵 与无机磷发生反应，可生成黄色的络合物，然后加入丙酮，将黄色络合物提取出来， 这种黄色物质在波长3 5 5 n m 处有最大吸收峰，在此波长测定吸光值，以空白作为对 照，即可计算出样品中植酸酶的活性。 汤海鸥等考察了在p h 值5 5 和6 0 的情况下，用三种不同的底物( s i g m ap 0 1 0 9 、 p 3 1 6 8 和p 8 8 1 0 ) 检测植酸酶的活性时，检测值之间的关系【4 9 1 。结果表明，采用p ol 0 9 和p 3 1 6 8 作底物测得的结果之问差异不显著，两者可以互相替换使用；采用p 3 1 6 8 和p 8 8 1 0 作底物检测的结果之间虽然差异很大，但存在着一定的线性关系。 万丹等对钒一钼酸铵法和钼蓝法的稳定性进行了研究，对钼蓝法进行了一系列 9 河北科技大学硕十学位论文 的改进，还原剂使用酒石酸氧锑钾i v c ，使测定稳定性得到提升【5 0 1 。认为乙酸缓冲 液较柠檬酸缓冲液更为适宜。p h 值和金属离子对测定结果影响较大，因此应根据不 同菌种选取合适的p h 值，并且屏蔽掉金属离子。 邹大琼等研究了表面活性剂对钒一钼酸铵法和钼蓝法的影响，结果表明如果表 面活性剂选用不当，会影响钒一钼酸铵法和钼蓝法测定的灵敏性和标准曲线的线性 相关系数【5 1 1 。杨平平等对钒一钼酸铵法和钼蓝法进行了比较，认为钒一钼酸铵法的 抗干扰能力强，反应时间和温度对钒一钼酸铵法几乎没有影响，且操作较为简便， 适合作为快速检测植酸酶酶活的方法【5 2 1 。 刘志伟等讨论了底物植酸钠溶液的p h 值对植酸酶酶活测定的影响【5 3 1 。当将底物 溶液的p h 值由6 4 8