（食品科学专业论文）黄酮类化合物体外抑制N亚硝基二乙胺生成的研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 黄酮类化合物体外抑制n 一亚硝基二乙胺生成的研究 摘要 n 0 2 - 在体内外的弱酸性条件下均可能与胺发生亚硝化反应生成 强致癌性的n 亚硝胺，从而诱发机理癌变。因此，如何清除n 0 2 - 或 抑制n 亚硝胺的生成，进而减少肿瘤的发病率己成为食品安全领域 研究的热点之一。黄酮作为一种天然的植物次级代谢产物广泛分布于 植物中，由于其具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生理活性，已被开发 成多种保健食品。随着对黄酮活性研究的不断深入，发现黄酮还具有 清除n o z 、抑制n 亚硝胺生成的功效，目前这方面的研究仍停留在 黄酮粗提物的水平上，如竹叶黄酮、甘草黄酮、苦荞黄酮等。本研究 对黄酮单体抑制n 亚硝基二乙胺( n - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e ，n d e a ) 的 合成进行了深入的探索，为有效利用黄酮类化合物作为外源性的n 亚硝胺合成抑制剂奠定基础。研究内容包括： 1 建立n 0 2 - 和n d e a 的测定方法。 2 以表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c e ) 作为参比，选择槲皮素、 木犀草素、白杨素三种不同结构的单体黄酮为研究对象，考察黄 酮结构、浓度、抗氧化力与n d e a 生成量之间的关系。选择邻苯 二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚为对象，探讨酚羟基位置 及数量对n d e a 生成的影响。 3 在模拟胃液条件下( p h3 0 ，3 7 ) ，分析黄酮的代表性物质槲皮 浙江工商大学硕士学位论文 素抑制n d e a 生成后所得的产物。利用制备型高效液相 ( p r e h p l c ) 对产物进行分离纯化；用紫外可见光分光光度计 ( u v i s ) 、高效液相质谱联用仪( h p l c m s m s ) 及核磁共振 氢谱( 1 h - n m r ) 鉴定产物结构；利用混合物的1 h - n m r 特征图 谱推测产物的含量关系，利用反相高效液相色谱二极管阵列检测 器( i 冲h p l c d a d ) 验证所推测的结果。 4 在此基础上，对菊米、银杏叶、艾草3 种植物的黄酮粗提物进行 研究，考察了n o c 清除率及n d e a 生成的抑制率随粗提物浓度、 反应时间、p h 、温度的变化。 研究结果如下： 1 槲皮素、木犀草素、白杨素均具有清除n 0 2 - 的能力，清除率随 黄酮浓度的增加而增加，大小依次为：槲皮素 木犀草素 白 杨素。三种黄酮对致癌物n d e a 的生成具有双重影响低浓度 下起促进作用，高浓度下起抑制作用。清除率及抑制率和黄酮的 抗氧化能力成正比。通过比较具有不同酚羟基结构的苯酚类化合 物对n d e a 生成的影响推测黄酮类化合物的双重作用效果与黄酮 摩尔浓度及其酚羟基位置有关：黄酮类化合物各环上的酚羟基活 性相差较大，b 环酚羟基活性最高，c 环酚羟基次之，a 环酚羟 基活性最弱。当黄酮浓度达到一定量后，n 0 2 - 完全被黄酮b 环 上的邻位酚羟基反应生成了稳定的邻苯醌型产物，从而抑制 n d e a 生成；当黄酮浓度过低时，黄酮b 环上的邻位酚羟基不足 于和n 0 2 - 完全反应，过量的n 0 2 - 进而与a 环上的间位酚羟基 浙江工商大学硕士学位论文 反应，产生了更强的亚硝化试剂，从而促进n d e a 生成。此外， 黄酮结构中酚羟基数量的多少与黄酮作用效果的强弱有关，槲皮 素、木犀草素、白杨素三者羟基数量依次减少，因此在相同浓度 下其作用强度依次减弱，确切的作用机制还有待进一步研究。 2 通过分析得出：模拟胃液条件下，槲皮素在抑制n d e a 生成的过 程中被氧化成化合物c l 【2 - ( 3 ，4 一d i h yd r x y b e n z o y l ) - 2 , 4 ，6 一t r i h y d - r o x y b e n z o f u r a n - 3 ( 2 h ) 一o n e ，该化合物又会自分解为化合物c 2 3 ，4 - d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d 】和c 3 【2 ，4 ，6 - t r i h y d r o x y p h e n y l g l y o x y l i c a c i d ，c l 、c 2 、c 3 的含量比例为1 ：0 2 ：o 5 。 3 对菊米、银杏叶、艾草黄酮粗提物的研究发现，黄酮含量高的两 种粗体物( 菊米：7 1 7m g m l ，艾草：5 2 0m g m l ) 都具有清除 n 0 2 一、抑制n d e a 生成的能力，清除率及抑制率和反应时间、 黄酮用量成正相关性，和p h 成负相关性。此外，过低或过高的 温度都不利于黄酮抑制n d e a 的生成。由于银杏粗提物中含游 离酚羟基的黄酮含量过低( o 8 5 m g r n l ) ，在三种黄酮粗提物中它 对n 0 2 - 的清除率最差，而且始终促进n d e a 的生成，。 结论： 研究结果表明，在弱酸性条件下，当黄酮类化合物的摩尔浓度达 到一定量后，黄酮具有与亚硝酸盐发生氧化还原反应竞争性地抑制胺 类与n 0 2 - 结合进而产生致癌性n 亚硝胺生成的能力，抑制效果与黄 酮的抗氧化力及浓度呈正相关性；当黄酮浓度过少时，它对n 亚硝 胺的生成具有促进作用。黄酮类化合物的这种双重作用可能和黄酮浓 浙江工商大学硕士学位论文 度及其结构中游离酚羟基的位置有关，详细的机理还有待进一步研 究。通过分析槲皮素抑制n d e a 生成后的产物得出，黄酮类化合物 在抑制n 亚硝胺生成的过程中，自身被亚硝酸氧化生成相应的氧化 型产物。 关键词：黄酮；n 亚硝胺；作用效果；槲皮素；产物 浙江工商大学硕士学位论文 s t u d yo ni n h i b i t o i 之ye f f e c t s o f f l a v o n e so n - n i t r o s o d i e t h y l a m 仆j ef o r m a t i o n i nv i t r o a b s t r a ct n i t r i t em i g h ti n t e r a c tw i t ha m i n e su n d e rt h em i l d l ya c i d i cc o n d i t i o n s i nv i t r oa n di nv i v ot og e n e r a t ec a r c i n o g e n i cn i t r o s a m i n e s t h u sh o wt o s c a v e n g en i t r i t eo ri n h i b i t et h ef o r m a t i o no fn i t r o s a m i n e s nv i v oa n d n v i t r oh a sb e e nb e c o m i n go n eo ft h eh o tr e s e a r c ht o p i c si nf o o ds a f e t yf i e l d f l a v o n e sa ss e c o n d a r ym e t a b o l i t eo fp l a n t sw h i c hw e r ew i d e l y d i s t r i b u t i n gi nt h ep l a n tk i n g d o mh a v eb e e na p p l i e di nd e v e l o p i n gh e a l t h f o o df o rm a n yb i o l o g i c a la c i t i v i t i e s ，s u c ha sa n t i o x i d a t i o n ，a n t i t u m o r , a n t i a g i n g ，e t c w i t h t h ef u r t h e rs t u d y i n go ff l a v o n ea c t i v i t i e s ，i th a s r e v e a l e dt h a tf l a v o n e sh a dt h ea b i l i t yo fs c a v e n g i n gn i t r i t ea n di n h i b i t i n g t h ef o r m a t i o no fn i t r o s a m i n e s h o w e v e r , t h es t u d yo ff l a v o n e so n i n h i b i t i n g n i t r o s a m i n ef o r m a t i o ns t i l lf o c u s e do nc r u d ef l a v o n e s e x t r a c t i o n s ，s u c ha sb a m b o o lf l a v o n e ，f g u o r i c ef l a v o n e ，b u c k w h e a t 浙江工商大学硕士学位论文 f l a v o n e i nt h ep r e s e n tp a p e r , w es y s t e m i c a l l ys t u d i e dt h ea b i l i t yo f d i f f e r e n tp u r if l a v o n e si n i n h i b i t i n gt h ef o r m a t i o no fn i t r o s a m i n e t o p r o v i d e a p r e l i m i n a r y t h e o r e t i c a lb a s i sf o rf l a v o n e sa sn i t r o s a t i o n i n h i b i t o r c o n t e n t s 1 t h em e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn 0 2 - a n dn - n i t r o s o d i e t h y l l a m i n ew e r ed e v e l o p e d 2 q u e r c e t i n ，l u t e o l i na n dc h r y s i nw e r eu s e dt oe v a l u a t et h er e l a t i o n s h i p s b e t w e e ns t r u c t u r e ，c o n c e n t r a t i o n ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n dt h ea b i l i t y o fa c t i n gi nn d e af o r m a t i o nw i t he g c ga sr e f e r e n c ec o m p o u n d t o i n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea m o u n ta n dp o s i t i o no ft h e p h e n o l i ch y d r o x y la n dt h e e f f e c ta c t i o ni nn d e af o r m a t i o n ， 1 , 2 一d i h y d r o x y b e n z e n e ，1 , 3 d i h y d r o x y b e n z e n e ，1 , 4 一d i h y d r o x y b e n z e n e a n d1 , 2 ，3 一t r i h y d r o x y b e n z e n ew e r es t u d i e d 3 t h ep r o d u c t so fq u e r c e t i nw h i c hi st h et y p i c a l r e p r e s e n t a t i v eo f f l a v o n e sa f t e ri ti n h i b i t e dn d e af o r m a t i o ni ns i m u l a t e dg a s t r i c c o n d i t i o nw e r ea n a l y z e d t h ep r o d u c t sw e r es e p a r a t e db yp r e p a r a t i v e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h ep r o d u c t s w e r e i d e n t i f i e du s i n gu v 厂、，i ss p e c t r o p h o t o m e t e r , h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r ya n dn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y t h e nt h ep r o p o r t i o n a lr e l a t i o n s h i p o fp r o d u c t sw a s c a l c u l a t e db a s i n go nt h ec h a r a c t e ro fn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e 浙江工商大学硕士学位论文 s p e c t r o s c o p y a n d t h er e s u l tw a sv a l i d a t e d b ya n a l y z i n g w i t h r e v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y d i o d ea r r a y d e t e c t o r 4 f u r t h e r m o r e ，t h et h r e ec r u d ef l a v o n e se x t r a c t i o n so fj u m i ，g i n k g o b i l o b aa n da r g yw o r m w o o dw e r es t u d i e d ，i n v e s t i g a t i n gt h ei n f l u e n c e s o fe x t r a c t i o n s c o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o nt i m e ，p ha n dt e m p e r a t u r eo n t h es c a v e n g i n gr a t ea n di n h i b i t i n gr a t e r e s u l t s 1 q u e r c e t i n ，l u t e o l i n a n d c h r y s i n c o u l d s c a v e n g e n i t r i t e t h e s c a v e n g i n gr a t ew a sp o s i t i v e l yr e l a t e dw i t hf l a v o n e sc o n c e n t r a t i o n a n da p p e a r e dt ob eq u e r c e t i n l u t e o l i n c h r y s i n i tw a sd i s c o v e r e d m a tt h e r ew e r et w o f o l di n f l u e n c e so ff l a v o n ei ne f f e c t i n gn d e a f o r m a t i o n ，c a t a l y z i n gn d e af o r m i n ga tal o wc o n c e n t r a t i o na n d i n h i b i t i n gn d e a f o r m a t i o na tah i g hc o n c e n t r a t i o n 。t h es c a v e n g i n g r a t ea n dt h ei n h i b i t i n gr a t ew e r ep o s i t i v e l yr e l a t e dw i t ht h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f f l a v o n e s b yi n v e s t i g a t i n g t h ee f f e c t so f p h e n o l i c c o m p o u n d sw i t hd i f f e r e n tp h e n o l i ch y d r o x y l si nn d e af o r m a t i o n ，i t w a sd e d u c e dt h a tt h et w o f o l di n f l u e n c e so ff l a v o n e si nn d e a f o r m a t i o nw a sd e p e n d i n go nt h ec o n c e n t r a t i o na n dt h ep h e n o l i c h y d r o x y lp o s i t i o no ff l a v o n e s t h e r ea r eg r e a t l y d i f f e r e n c e so f p h e n o l i ch y d r o x y la c t i v i t yi nf l a v o n e s ，t h eh y d r o x y l so fbr i n g t h e h y d r o x y l so fcr i n g t h eh y d r o x y l so far i n g u n d e rt h eh i g h 浙江工商大学硕士学位论文 c o n c e n t r a t i o no ff l a v o n e s ，n 0 2 一c o m p l e t e l yi n t e r a c t e dw i t ht h e h y d r o x y l sa tbr i n go ff l a v o n e st of o r ms t a b l eq u i n i n ed e r i v a t i v e s i n h i b i t i n gn d e af o r m i n g u n d e rt h el o wc o n c e n t r a t i o no ff l a v o n e s ， t h eh y d r o x y l sa tbr i n go ff l a v o n e sw a sn o ts oe n o u g ht oi n t e r a c tw i t h n 0 2 - t h a tt h el a r g ee x c e s so f n 0 2 - - w o u l di n t e r a c tw i t ht h eh y d r o x y l s a ta r i n gt og e n e r a t eam o r ep o w e r f u ln i t r o s a t i n ga g e n tc a t a l y z i n gt h e n d e af o r m a t i o n i na d d i t i o n ，t h ea m o u n to fh y d r o x y l si n f l u e n c e dt h e e x t e n to ff l a v o n e si ne f f e c t i n gn d e af o r m a t i o n t h ei n h i b i t i n gr a t e s o fq u e r c e t i n ，l u t e o l i na n dc h r y s i nw e r ed e c r e a s i n gs u c c e s s i v e l ya s w e l la st h ea m o u n to fh y d r o x y l s d e c r e a s i n g t h e d e f i n i t i v e m e c h a n i s mn e e d st ob ef u r t h e rs t u d i e d 2 t h ep r o d u c t so fq u e r c e t i nr e a c t i n gw i t hn 0 2 一a tt h es i m u l a t eg a s t r i c c o n d i t i o nw a si d e n t i f i e da s c l 【2 ( 3 ，4 一d i h y d r x y b e n z o y l ) - 2 ，4 ，6 一 t r i h y d r o x y b e n z o f u r a n 一3 ( 2 h ) 一o n e ，w h i c h c o u l d d e c o m p o s e t o g e n e r a t ec 2 3 , 4 一d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d a n dc 3 【2 , 4 ，6 - t r i h y d r o x y - p h e n y l g l y o x y l i ca c i d t h ep r o p o r t i o n a lr e l a t i o n s h i po fc 1 ，c 2a n dc 3 w a sl ：0 2 ：0 8 3 b ys t u d y i n gt h ee f f e c to ft h ec r u d ef l a v o n e se x t r a c t i o n so fj u m i ， g i n k g ob i l o b aa n da r g yw o r m w o o de f f e c t i n go nn i t r o s a t i o n ，i tw a s s h o w nt h a tt h et w oc r u d ef l a v o n e se x t r a c t i o n sc o n t a i n i n gf l a v o n e sa t t h eh i g hc o n c e n t r a t i o n ( j u m i ：7 17m g m l ，a r g yw o r m w o o d ：5 2 0 m g m l ) h a dt h ee f f e c t so fs c a v e n g i n gn i t r i t ea n di n h i b i t i n gn d e a 浙江工商大学硕士学位论文 f o r m a t i o n t h es c a v e n g i n gr a t ea n di n h i b i t i n gr a t ew e r ep o s i t i v e l y r e l a t e dw i t ht h e r e a c t i n g t i m ea n df l a v o n e s c o n c e n t r a t i o na n d n e g a t i v e l yr e l a t e dw i t ht h ep hv a l u e t h a tt h et e m p e r a t u r ew a st o o h i g ho rl o ww a su n f a v o r a b l et ot h ei n h i b i t i n ge f f e c to ff l a v o n e s t h e c r u d ef l a v o n e se x t r a c t i o n c o n t a i n i n g f l a v o n e sa tt h el o w c o n c e n t r a t i o n ( g i n k g ob i l o b a ：o 8 5m g m l ) a l w a y sc a t a l y t i cn d e a f o r m i n ga n dt h es c a v e n g i n gr a t ew a st h el o w e s t c o n c l u s i o n s i tw a ss u g g e s t e dt h a tf l a v o n e sc o u l dr e d o xr e a c tw i t hn i t r i t eu n d e r m i l d l ya c i d i cc o n d i t i o na n di n h i b i t et h ef o r m a t i o no fn i t r o s a m i n ei ft h e c o n c e n t r a t i o no ff l a v o n e sw a se n o u g h t h eb l o c k i n gr a t ew a sp o s i t i v e l y r e l a t e dw i t hi t sc o n c e n t r a t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i v i t y f l a v o n e sc o u l d a c c e l e r a t en d e af o r m i n ga tal o wc o n c e n t r a t i o n t h et w o f o l di n f l u e n c e s o ff l a v o n e si ne f f e c t i n gt h en d e af o r m a t i o nm i g h tb er e l a t e dw i t ht h e s t r u c t u r eo fp h e n o l i ch y d r o x y lo ff l a v o n e s ，w h i c hn e e dt ob ef u r t h e r s t u d i e d b ya n a l y z i n gt h ep r o d u c t so fq u e r c e t i nr e a c t i n gw i t hn i t r i t e ，i t w a sc o n c l u d e dt h a tf l a v o n e sw e r eo x i d a t e do nt h ep r o c e s so fi n h i b i t i n g t h en i t r o s a m i n ef o r m a t i o na n dp r o d u c e dr e l e v a n to x i d a t i o np r o d u c t s k e y w o r d s ：f l a v o n e s ；n i t r o s a m i n e ；e f f e c t ；q u e r c e t i n ；p r o d u c t 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名墓鏊盗 日期砷年j 月侈日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：猫导师签 日期： 浙江工商大学硕士学位论文 第1 章引言 硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于环境中，在土壤、水和动植物体内均有分布， 是自然界中含氮化合物的普遍存在形式，同时也是食品中常用的添加剂。硝酸盐 在硝酸盐还原菌的作用下可以被还原成亚硝酸盐。亚硝酸盐对人体健康具有危害 性，它不仅可以和人体血红蛋白直接结合，导致高铁血红蛋白症【1 1 ，而且还会使 胺发生亚硝化反应，生成强致癌物n 一亚硝胺【2 1 。因此，如何减少亚硝酸盐及n 亚硝胺对人类健康的危害，已成为科学界研究的重要课题。 1 1 亚硝酸盐 1 1 1 亚硝酸盐的来源 硝酸盐和亚硝酸盐的来源很多，诸如食品添加剂、含氮肥料和农药的使用， 工业废水和生活污水的排放，农作物从自然环境中摄取和生物机体氮的利用等 等。自然界中约有1 0 0 余种菌株具有硝酸还原能力1 3 i ，如大肠杆菌、白喉棒状杆 菌、白念珠菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、变形菌、放线状菌、酵母和霉菌等， 这类还原菌在自然环境及动物体内环境中都有存在。 由于氮肥的普遍使用以及氮、磷、钾比例失调，造成农产品尤其是蔬菜中硝 酸盐含量逐年增加，引起土壤、水体中硝酸盐和亚硝酸盐的富集。有资料表明， 世界各国近2 0 年来地下水中n 0 3 一的浓度增加速度约每年l 一3 m g l 1 4 1 。蔬菜 是人体摄入硝酸盐的主要来源，占总摄入量的8 0 9 0 t 5 1 。1 9 0 7 年r i c h a r d s o n 首先发现蔬菜中含有大量的硝酸盐，1 9 4 3 年w i l s o n 又进一步揭示蔬菜中的硝酸 盐可还原成亚硝酸盐【6 】。1 9 8 2 年沈明珠等报道1 7 1 ，不同种类蔬菜的新鲜可食部分 中硝酸盐含量不同，按其均值大小排列依次为：根菜类 薯类 绿叶菜类 白菜类 葱蒜类 豆类 茄果类。一些蔬菜，如豌豆、土豆和番茄通常低于 2 0 0 m g k g ( n a n 0 3 ) ，而甜菜根、莴苣和菠菜多数高于2 5 0 0 m g k g ( n a n ( h ) 。同 一蔬菜的不同部位硝酸盐和亚硝酸盐含量差异也很大，从高到底依次为：根 茎 叶柄 叶片。亚硝酸盐在新鲜蔬菜中的含量较低，但经过保存或加工后，其 亚硝酸盐的含量会大幅度增加，比如在蔬菜的腌制过程中，由于硝酸盐还原菌的 浙江工商大学硕士学位论文 作用，一般腌制2 天后，亚硝酸盐含量就会逐渐增加，4 8 天时达到最高值。 如腌制过的青菜，亚硝酸盐含量可达7 8m g k g ，而变质的腌罗卜叶可高达 2 2 9 6 0m g k 9 1 5 1 。 硝酸盐和亚硝酸盐也是允许使用的食品添加剂，在腌肉、火腿、香肠、罐头 等食品加工中通常作为发色剂或防腐剂使用。其发色机理是，硝酸盐在细菌的作 用下被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐和肌肉中的乳酸产生亚硝酸，亚硝酸由于不稳 定易分解成一氧化氮，然后一氧化氮与肌红蛋白反应生成红色的亚硝基肌红蛋 白，从而使肉制品呈现稳定的红色【8 l 。另外，亚硝酸盐还起到改善风味和防腐的 作用，能防止食品中肉毒梭菌的生长，延长货架期【9 l o 由于添加少量亚硝酸盐就 能够起到大量硝酸盐作用的效果，因此，亚硝酸盐已经逐步取代硝酸盐作为发色 剂或防腐剂使用。为了控制硝酸盐和亚硝酸盐的使用量，从而降低它们对人体健 康的危害，很多国家都制定了限量卫生标准以限制其使用范围和使用量。我国国 标规定肉制品中硝酸盐用量不得超过0 5 9 k g ，亚硝酸盐不得超过o 1 5 9 k g 。残 留量以n a n 0 2 计，肉制品不得超过0 0 5 9 k g ，肉类罐头不得超过0 0 3 9 k g 【1 0 j 。 另外，很多研究学者也在努力寻找业硝酸盐的替代品，以期避免它在食品加工中 的使用，遗憾的是，目前为止还没能找到它的更好替代品。 硝酸盐和亚硝酸盐除了通过饮用水、蔬菜、肉制品等外源性物质进入人体外， 也可以由机体内源性的合成。由于体内存在一氧化氮合酶，该酶可将精氨酸转化 成一氧化氮和瓜氨酸，一氧化氮可以形成过氧化氮，后者与水作用释放亚硝酸盐 i l l 】。另外，唾液腺可以浓缩富集硝酸盐并分泌到1 ：3 腔中，唾液中的硝酸盐水平是 血液的2 0 倍，而唾液中的硝酸盐可以被1 ：3 腔细菌还原为亚硝酸盐。尽管唾液中 硝酸盐和亚硝酸盐含量的波动水平个体差别较大，但2 4 h 内唾液腺分泌的硝酸盐 累积量占硝酸盐摄人量的2 8 左右，而唾液中产生的亚硝酸盐量可以占硝酸盐 摄人量的5 一8 0 1 。 1 1 2 检测方法 亚硝酸盐作为公认的有毒物质，一直是食品、环境、饲料等行业的重点监控 对象。1 8 7 9 年j o h a n np e t e rg r i e s s 开发出了亚硝酸盐测定的经典方法g r i e s s 试剂比色法【挖】。随着分析化学新方法和新技术的不断出现和发展，亚硝酸盐的 检测方法也更加多样化。到目前为止，已经报道的亚硝酸盐的检测方法主要可以 2 浙江工商大学硕士学位论文 分为光度法、色谱法以及电化学法等，具体包括紫外可见光分光光度法、h p l c 法、离子色谱法、毛细管电泳法、离子选择电极法等。我国国标法是采用盐酸萘 乙二胺法( g r i e s s 试剂比色法) 和示波极谱法【1 3 】。 1 1 2 1光度法 光度法中最常用的是g r i e s s 试剂比色法，原理是：样品经沉淀、脱脂等预处 理后，在弱酸性条件下，n 0 2 - 先与对氨基苯磺酸( 磺胺) 重氮化反应，产物与 n - l - 萘乙二胺( 即盐酸萘乙二胺) 偶合形成紫红色的偶氮苯染料，其在5 3 8 n m 处有最大吸波长，该方法不但灵敏度、准确度高，重现性好，而且设备简单，操 作简便，检出限达l m g k g 【1 3 l ，目前仍作为亚硝酸盐检测的标准方法。但该方法 的抗干扰能力不理想，不适合复杂样品的检测，而且所涉及的试剂n 1 萘乙二 胺本身就是强致癌性物质，会威胁操作人员的健康及污染环境【1 4 】。1 9 8 7 年 m o n t e s 等开创性的使用溴酸钾作为氧化剂，运用动力学反应的差异测定亚硝酸 盐，从根本上改变了经典的亚硝酸盐测定方法，为亚硝酸盐的无毒检测提供了思 路【1 5 i 。该方法是在酸性介质中，利用n 0 2 一对溴酸钾 1 6 - 1 8 】、氯酸钾【1 9 珊】、溶解氧 2 1 j 、双氧水1 2 1 - 2 2 1 等氧化剂氧化有机染料这一褪色反应具有强烈的催化作用，根 据有机染料褪色的速度不同测定亚硝酸盐的含量，因此，也被俗称为催化光度法。 该方法优点是检出限低，一般为2 4 x1 0 一2 1 0 。1 2 9 m l ，而且避免了有毒物质 的使用，但测定条件不易控制，干扰因素较多，重现性和稳定性相对较差。a n d r a d e 等人采用流动注射法，测定了蔬菜及肉制品中的亚硝酸盐【2 3 1 。其原理为：先用 硫酸将亚硝酸盐还原为一氧化氮，在酸性条件下，一氧化氮会和f e + 、硫氰酸盐 发生反应，生成f e s c n n o + ，该复合在4 6 0 n m 处有最大吸收，且吸光度与亚硝 酸盐的浓度成正比。与g r i e s s 试剂法相比，该方法操作简便，分析速度快，每 小时可分析3 0 4 0 个样品，但检测限较高，为1 3 m g k g ，精确度和准确度与g r i e s s 试剂法相当。此外，z a t a r 等人建立了一种采用磷钼蓝复合物的分光光度法测定 亚硝酸盐。其原理为：先用硫化钠将磷钼酸还原为蓝色的磷钼蓝复合物，该复合 物在8 1 4 n m 处有吸收，它与亚硝酸盐发生氧化后，反应液的颜色变浅，从而通 过测定8 1 4 n m 吸光度降低的程度计算亚硝酸盐的含量1 2 4 1 。该方法的优点是灵敏 度、精确度高，不易受到其它离子的干扰，但是线性范围窄，而且易受色素影响， 所得的结果往往会偏高。 浙江工商大学硕士学位论文 随着荧光技术的发展，荧光法也被应用到亚硝酸盐的测定中，而且取得较好 的效果。s t a l i k a sc d 等利用离子色谱一色氨酸荧光猝灭法测定n 0 3 - 和n 0 2 一 【2 5 1 。l i 等采用荧光探针1 ，3 ，5 ，7 四甲基8 ( 4 氨基苯) - 4 ，4 二氟4 硼3 a ， 4 a - - 氮s i n d a c e n e ( t m a b o d i p y ) 来检测肉制品和蔬菜中痕量的亚硝酸盐【2 6 】。 亚硝酸盐和t m a b o di p y 先后在酸性和碱性环境下反应，生成重氮酸盐，这 种物质是一种稳定的强荧光剂，因此，该方法具有特异性高、灵敏度高的优势， 检测范围为8 3 0 0 n m o l l ，检测限o 6 5 n m o l l 。在此基础上，h u a n g 等采用l ， 3 ，5 ，7 一四甲基一2 ，6 二乙酸基一8 一( 3 ，4 二氨基苯) 二氟化硼二氮s i n d a c e n e ( t m d c d a b o di p y ) 作为荧光探针，从而将检测限降低到0 2 1n m o l e 【2 7 1 。 光度法是当前测定亚硝酸盐的主要方法。经典的紫外可见光光度法具有结果 准确：费用低等优点，但是时间较长，所用试剂具有致癌性，在测定含色素较多 的样品时容易受到干扰，还需要不断改进。荧光法检测限低，灵敏度高，但是荧 光法测定亚硝酸盐线性范围窄，抗干扰能力差，目前还没有得到普遍应用。 1 1 2 2 色谱法 色谱法测定亚硝酸根首先通过分离将可能对亚硝酸根测定不利的离子和亚 硝酸根分开，然后以紫外一可见光分光光度仪或电导仪【2 7 】等为检测器测定其含 量。目前，应用较多的色谱法主要有高效液相法和离子色谱法。 n 0 2 - 在2 0 0 2 2 0 n m 处具有紫外吸收，样品通过色谱柱的分离后可以用紫 外检测器直接检测2 8 。引。f e r r e i r a 采用r p h p l c 配合二极管阵列检测器测定 了火腿中亚硝酸盐的含量，在最佳条件下，亚硝酸盐的检测限为0 0 1 9 m g k g ， 回收率为9 3 6 1 0 4 3 ，精密度和准确度甜3 0 1 。然而，紫外直接检测法选择 性差，对色谱的分离度要求比较高，另外，在2 1 0 2 2 0 n m 处，还易受到c 厂 的干扰。将n 0 2 - 进行柱前衍生化处理可以减少c r 的干扰。t s i k a s 等利用酸性 条件下，n 0 2 - 和- 乙酰半胱氨酸反应，生成亚硝基乙酰半胱氨酸，然后 通过测定3 3 3 n m 处产物的吸光度，从而计算n 0 2 - 的量，该方法的检测限是5 0 n m o l l t ”】。衍生化处理和h p l c 技术的结合，拓宽了亚硝酸盐测定样品的多样 性，使其能够测定一些更为复杂的样品，如生物液体，是检测技术研究的热点之 一。然而，该方法不能同时检测n 0 2 - 和n 0 3 一，需要将n 0 3 一转化成n 0 2 一后 才能测定，因此，在同时检测n 0 2 一和n 0 3 一时操作繁琐，而且灵敏度低，检测 4 浙江工商大学硕士学位论文 限高。 研究发现，h p l c 利用紫外检测器虽然能同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，但分 离效果不如离子色谱。离子色谱法是2 0 世纪7 0 年代中期发展起来的一项新的液 相色谱技术，它不仅能同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，还可以根据不同的要求，同 时测定多种阴离子组分的含量，如氟、氯、甲酸、乙酸、草酸等离子，以满足同 一样品多阴离子组分的同时定量测定。1 9 8 4 年，j a c k s o n 等采用阴离子交换柱为 固定相，氯甲磺酸盐缓冲液作洗脱液，在2 1 0 2 1 4 n m 处同时测定肉制品中的硝 酸盐和亚硝酸盐。该方法灵敏度高、选择性好、准确度高，而且基本上消除了 c l 一的干扰1 3 。朱岩等利用离子色谱法配合紫外分光光度仪测定肉制品中的 n 0 2 - 和n 0 3 一，得到了较好的效果1 3 6 1 。幸梅华等采用反向离子对色谱一安培检 测法同时测定离子和非离子化合物n o 厂、s c n - 、c 6 i - 1 6 n h 2 ，并对影响分离的因 素进行了研究，在1 5 m i n 内三组分可完全分离，检测限在n g m l 级，该方法已 经应用于工业废水和环境水质中这3 种组分的监测【3