（分析化学专业论文）丙烯酰胺的高效液相色谱检测方法研究.pdf

摘要 摘要 丙烯酰胺是一种对人体有神经毒性和生殖发育毒性的物质，国际癌症研究机构 ( i a r c ) 1 9 9 4 年也对丙烯酰胺的致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2 a 类致癌物，即人类 可能致癌物，因此食品中丙烯酰胺的污染引起了国际社会和各国政府的高度关注。经高温 处理的高淀粉食品中广泛存在较高水平的丙烯酰胺，而我们日常饮用的一些保健茶中含有 较高含量的淀粉，一般又都是经过高温处理，那么其中是否会生成丙烯酰胺，其含量多少 是值得关注的问题。本论文以决明子茶、大麦茶为研究对象，采用高效液相色谱法对其丙 烯酰胺含量进行了测定。另外，本文还探索了新型的柱前衍生一高效液相色谱法检测丙烯酰 胺的方法。全文共分为四章： 第一章：综述了丙烯酰胺的形成机理、毒性研究、检测方法以及食品中丙烯酰胺生成 量的影响因素和抑制方法。 第二章：建立了决明子茶中丙烯酰胺的高效液相色谱检测方法。先对决明子茶进行粉 碎，用纯水提取，接着在1 0 0 0 0r m i n 的速度下离心2 0m i n ，然后取1m l 上层清液通过 o a s i sh l b 柱和b o n de l u tp r s 柱，用5 甲醇水溶液洗脱，最后通过高效液相色谱仪进行 检测。并对不同产地、不同生产日期的决明子茶中丙烯酰胺含量分别进行了对比。 第三章：通过高效液相色谱法对大麦茶中丙烯酰胺含量进行了测定，并对不同产地、 不同批次的大麦茶中丙烯酰胺含量进行了测定。 第四章：探索了一种新型的柱前衍生一高效液相色谱检测丙烯酰胺含量的方法。本章包 括衍生试剂的制备过程、衍生反应条件的优化等，并通过高效液相色谱法实现了衍生试剂 与衍生产物的有效分离。 关键词丙烯酰胺决明子茶大麦茶柱前衍生高效液相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t a c r y l a m i d ei sas m a l lm o l e c u l ew h i c hh a sn e u r o l o g i c a lt o x i c i t ya n dr e p r o d u c t i v ea sw e l la s d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y t h ei a r ce s t i m a t e di t st o x i c i t yo fc a u s i n gc a n c e ri n 19 9 4a n dr a n k e d a c r y l a m i d ea sp o t e n t i a lc a r c i n o g e n i c i t y s ot h ep o l l u t i o no ff o o dc a u s e db ya c r y l a m i d eh a s a r o u s e dw o r l d w i d ea t t e n t i o na n dm a n yg o v e r n m e n t sh a v es t a r t e dt h ei n v e s t i g a t i o no fa c r y l a m i d e i nf o o d m o d e ls y s t e ms t u d i e sh a v es h o w nt h a ta c r y l a m i d ei sf o r m e dd u r i n gt h em a i l l a r dr e a c t i o n o fr e d u c i n gs u g a r sw i t ha s p a r a g i n e ，w h e ns t a r c h - r i c hf o o di sp r o c e s s e da th i g ht e m p e r a t u r e m a n y h e a l t hc a r et e a sa r er i c hi ns t a r c hc o n t e n ta n dt h e yn e e dt ob ep r o c e s s e da th i g ht e m p e r a t u r et o m a k ei tm o r ef i tt ob eu s e d w h e t h e ro rn o ta c r y l a m i d ew i l lb ep r o d u c e dd u r i n gt h eh e a t i n g p r o c e s si saq u e s t i o nt h a ta t t r a c t so u rr e s e a r c hi n t e r e s t i nt h i sw o r k ，a c r y l a m i d ec o n t e n ti nc a s s i a s e e dt e aa n db a r l e yt e aw a sd e t e c t e db yu s i n gs p e - h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d ，an e wp r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n - h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o dw a s a l s oi n v e s t i g a t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa c r y l a m i d e t h i st h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s ： c h a p t e ro n e ：t h ef o r m a t i o nm e c h a n i s m ，t o x i c i t ys t u d y , d e t e c t i o nm e t h o d s ，i n f l u e n c i n g f a c t o r sa n ds u p p r e s s i o nm e t h o do fa c r y l a m i d ew e r es u m m a r i z e d c h a p t e rt w o ：a ns p e - h p l cm e t h o dw a se s t a b l i s h e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fa e r y l a m i d ei n c a s s i as e e dt e a c a s s i as e e dt e aw a sg r o u n da n de x t r a c t e dw i t hw a t e ra n dt h e nc e n t r i f u g e da tt h e s p e e do f10 0 0 0r m i nf o r2 0m i n ，a n d1 m lo fs u p e r n a t a n tw a sp a s s e dt h r o u g ho a s i sh l b c a r t r i d g ea n db o n de l u tl r c p r sc a r t r i d g ea n de l u t e d w i t h5 m e t h a n o l w a t e rs o l u t i o n ， a c r y l a m i d ei ne l u a t ew a sd e t e r m i n e db yh p l c t h ea c r y l a m i d ec o n t e n t si nc a s s i as e e dt e ao f d i f f e r e n tp r o d u c i n ga r e aa n dd a t ew e r ec o m p a r e d c h a p t e rt h r e e ：t h ec o n t e n to fa c r y l a m i d ei nb a r l e yt e aw a sd e t e c t e db yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , a n dt h ea c r y l a m i d ec o n t e n t si nb a r l e yt e ao fd i f f e r e n tp r o d u c i n ga r e aa n d d a t ew e r ec o m p a r e d c h a p t e rf o u r ：an e wp r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n - h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c m e t h o dw a si n v e s t i g a t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa c r y l a m i d e ，w h i c hi n c l u d e dt h ep r e p a r a t i o no f d e r i v a t i v er e a g e n ta n dt h eo p t i m i z a t i o no fd e r i v a t i z a t i o nc o n d i t i o n s g o o ds e p a r a t i o nw a s a c h i e v e db e t w e e nd e r i v a t i v er e a g e n ta n dt h ed e r i v a t i v ep r o d u c tb yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d i i a b s t r a c t c h r o m a t o g r a p h y k e y w o r d sa c r y l a m i d e c a s s i as e e dt e a b a r l e yt e a p r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nh p l c i i i 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 了致谢。 作者签名：日期：五丝l 年月上日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密矗。 ( 请在以上相应方格内打“) 作者签名： 导师签名： 日期：丝仝年上月卫日 日期：4 年上月一之日 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为弼嘶砺叙最捆渺：7 ；j 珐锨) 的学位论 文，是我个人在导师( 翻现) 指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研 究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并 严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相 关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面 同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声 明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：盔垂i 盈日期：j 绁么月垒日 作者签名： k 锄双 日期：幽年 月上日 ，一p， 导师签名：盘查i 三日期：兰：l 年月j l 日 第1 苹绪论 第1 章绪论 丙烯酰胺的检测方法研究进展 1 1 引言 丙烯酰胺是一种白色透明片状晶体，分子式c h 2 c h c o n h 2 ，无臭，有毒，比重1 1 2 2 ( 2 0 4 0 ) ，熔点8 4 5 ，沸点1 2 5 ，易溶于水、乙醇、丙酮等有机溶剂。2 0 0 2 年4 月瑞典 国家食物管理局和斯德哥尔摩大学的科学家公布令消费者为之震惊的研究结果，即在日常 食用的油炸马铃薯条、焙烤的面包等产品中，含有潜在致癌性物质一丙烯酰胺【1 1 。该报告 经发表，立即引起w h o 、f a o 以及世界各国食品业的广泛关注，并被国际癌症研究机构 ( i a r c ) 列为可疑致癌物【2 ，3 1 。在我国，卫生部- 于2 0 0 5 年4 月4 日发布了丙烯酰胺的预警公告以 及食品中丙烯酰胺的危险性评估报告。因此，建立食品中丙烯酰胺的快速高效的检测方法 具有十分重大的意义。 1 2 丙烯酰胺的毒性研究 丙烯酰胺是一种中等毒性的亲神经毒物，可通过未破损的皮肤、粘膜、肺和消化道进 入人体，分布于人体液中。神经毒性作用主要为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记 忆和其他认知功能部位的退行性变【4 j 。生殖毒性作用表现为雄性大鼠精子数目和活力下降 及形态改变和生育能力下降【4 】。此外还有一些职业暴露人群出现盗汗、周围血管扩张、排 尿困难等自主神经功能紊乱的症状。欧盟对没有适当个人防护而接触丙烯酰胺的工人做过 调查，在不考虑经皮肤暴露的情况下，发现周围神经系统的发病率与环境空气中的丙烯酰 胺的浓度相关i s 。绝大多数职业人群在暴露于丙烯酰胺的环境下，神经系统症状逐渐加重。 w h o 食品安全负责人指出，凡是与食品有关的癌症中，3 0 - 4 0 都与丙烯酰胺的毒性有 关【5 1 。一袋炸薯片所含的丙烯酰胺量是安全范围的5 0 0 倍。每人每天丙烯酰胺的摄入量不得 超过0 5i x g k g 体重。由于丙烯酰胺具有潜在的毒性，因此对其测定方法和抑制条件的研究 非常必要。 河北大学理学硕十学位论文 1 3 丙烯酰胺的形成机理及影响因素 1 3 1 丙烯酰胺的形成机理 加拿大科学家首先提出天冬酰胺与还原糖在高温下反应可生成丙烯酰胺，随后m o t t r a m 与s t a d l e r 等f 6 7 ，8 】在同一期n a t u r e 杂志上分别详细阐述了通过美拉德反应( m a i ll a r dr e a c t i o n ) 形成丙烯酰胺的机制。这一机制包括天冬酰胺途径( a s p a r a g i n e sp a t hw a y ) 和n 一糖苷( n - g l y c o s i d e ) 途径阻1 1 1 。 1 3 2 影响因素 1 3 2 1 原料的影响 原料中的还原性糖和天冬酰胺的含量对产品中丙烯酰胺的含量有直接的影响。a d a m b e c a l s k i 1 2 】等选择了6 6 种土豆对它们之间的关系做了分析( 在1 8 0 煎炸) ，得出糖含量对 丙烯酰胺含量的影响十分显著，这与f a b i e nr o b e r t 得出的结果相刚1 3 】。最近e r l a n d b r a t h e n 1 4 1 研究指出，在淀粉类和谷物类食品中，天冬酰胺对产品中丙烯酰胺含量的影响要 比糖的影响显著，并且同时指出，当原料系统中天冬酰胺含量低时，产品中丙烯酰胺含量 随着天冬酰胺含量的升高而升高，但是当天冬酰胺含量升高到一定程度时，产品中丙烯酰 胺含量则随着天冬酰胺含量的升高而降低。另外，天冬酰胺和还原糖的含量受到种植和储 藏条件等因素的影响。使用含氮量较高的化肥可使马铃薯中天冬酰胺含量增加，低温储藏 则使还原糖含量增加，其高温加工制品中丙烯酰胺含量会大幅度提高【1 5 】。还原糖中的葡萄 糖和果糖兼具促进和清除丙烯酰胺的双重作用。一般说来，1 6 0 以上葡萄糖的清除作用 大于促进作用，而果糖却能加速丙烯酰胺的分解【1 6 1 。 1 3 2 2 加热温度j n r , - i 间的影响 研究表明，加热温度对丙烯酰胺的生成有重要影响。j e r o e nj k n o l 17 】等人报道当加 热温度为1 2 0 - 1 6 0 时，加热温度越高，时间越长，生成的丙烯酰胺越多；当温度为1 8 0 2 0 0 时，随着加热时间的增长丙烯酰胺的含量先增加后减少。淀粉类食物如马铃薯在较 低温度( 5 以下) 条件下贮藏时，马铃薯中的一部分淀粉会转变为还原糖，如用这种马铃薯 去作煎炸处理，食品色泽会马上变深，且生成的丙烯酰胺量会急剧增加【1 引。因此，对用于 油炸的马铃薯片等，在加工前最好在8 左右或较高温度中贮藏，以抑制还原糖的产生， 第1 苹绪论 从而减少马铃薯在油炸过程中产生较高浓度的丙烯酰胺【1 9 1 。 加热时间对丙烯酰胺的生成有着重要影响。s t a d l e r 2 0 1 等将葡萄糖与天冬酰胺、谷氨酰 胺和蛋氨酸在1 8 0 下共热5 - - 一6 0m i n ，发现葡萄糖与天冬酰胺共热5m i n 时应产生的丙烯酰 胺量最高，但随反应时间的增加而下降：而谷氨酰胺在1 0m i n 时达到最高，随着时间的延 长丙烯酰胺的含量保持不变；蛋氨酸在前3 0m i n 随加热时间延长而增加，而后达到一个稳 定水平。 1 3 2 3 p h 的影响 p h 对油炸食品中丙烯酰胺的形成有着重要的影响。f r 6 d 6 r i cm e s t d a g h 等人7 】分析了丙烯 酰胺生成量与p h 的关系，指出中性条件下最利于丙烯酰胺的生成。 1 3 2 4 油类型的影响 有研究表明，油类型对丙烯酰胺的生成有重要影响。t a e y m a n s 2 1 】指出，丙烯酰胺的含 量随着油量的增加而增加。w i l l i 锄s 【2 2 】研究指出，多次重复使用过的油( 过氧化值高) 并不 会影响产品中丙烯酰胺的含量。 1 3 2 5 水分含量的影响 水分含量对丙烯酰胺的形成有着重要的影响。含有一定水分的面粉在1 6 0 加热3 0 m i n 生成的丙烯酰胺含量是干燥面粉的l o 倍，而含有1 0 水分的马铃薯在高温烘制时生成的丙 烯酰胺含量也高于干燥样品【2 3 1 。 1 3 2 6 褐变程度 氨基酸和还原糖在煎、炸和焙烤等热加工条件下发生美拉德反应，生成了丙烯酰胺， 其生成量和热加工食品的褐变程度呈正相关【2 4 2 5 1 。 1 3 2 7 微波 微波加热对丙烯酰胺的生成有一定的影响。e r d o g d u 等j k t 2 6 1 分别将经微波加热1 0s 、2 0 s 矛1 3 0s 后的马铃薯在1 5 0 、1 7 0 和1 9 0 下进行油炸处理，结果证实丙烯酰胺的含量比 不经微波加热分别减少3 6 、4 1 和6 0 。 河北大学理学硕士学位论文 1 4 丙烯酰胺的检测方法 1 4 1 样品的处理 1 4 1 1 提取 食品体系中丙烯酰胺的提取是整个分析过程的重点，只有有效地提取出食品中的丙烯 酰胺，才能进行具体分析。由于丙烯酰胺是极性化合物，因此常用水或强极性的有机溶剂 进行提取。常用的提取溶剂有：水、甲醇、甲醇一水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷一乙醇等。 常用的丙烯酰胺的提取方式有液一液萃取、加速溶剂萃取和固相微萃取等。 1 4 1 1 1 液液萃取 水是提取丙烯酰胺时最常用的溶剂，因为丙烯酰胺在水中的溶解度最大，单独使用水 或与其它有机溶剂按照一定的比例形成的混合溶剂可以使大多数食品样品萃取完全。美国 f d a 建议使用含0 1 的蚁酸水溶液萃取样品【2 7 2 8 】，而且在萃取前加入一定量的n a c l 水溶液， 可以实现破乳的目的【2 9 1 。另外，萃取条件的选择直接影响着萃取效率的高低。我们多采用 水或有机溶剂与水的混合溶剂作为萃取试剂，采用6 0 - 8 0 的热水加大萃取效率，萃取时 间多控制在3 0m i n 左右。 1 4 1 1 2 加速溶剂萃取技术( a s e ) 加速溶剂萃取技术是一种在提高温度( 5 0 - - 一2 0 0 ) 和压力( 1 0 3 - 2 0 6m v a ) 的条件下， 利用有机溶剂萃取固体或半固体的样品前处理方法。其优点是溶剂用量少、快速、基体影 响小、选择性好、萃取效率高【3 0 1 。c a v a l l i 等人f 3 l 】以水作提取溶剂，采用加速溶剂萃取技术， 得到m s 的检测限为1 0 - 1 0 0 0p 舭。同时瑞士公共安全部门也提出了利用a s e 提取食品中 丙烯酰胺的方法【3 2 1 。 1 4 1 1 3 固相微萃取 固相微萃取( s p m e ) 是集采集、萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理技术，可用于提 取食品中的丙烯酰胺。l a g a l a n t e 等 3 3 j 建立了顶空固相微萃取的提取方法，首先将丙烯酰胺 衍生为n ，o 双三甲基硅烷基丙烯酰胺，然后将s p m e 萃取头插入顶空瓶中的顶空部分萃 取1 0r a i n ，从而实现了样品基质和涂层之间的分配平衡，大大提高了萃取效率。 第1 章绪论 1 4 2 样品的纯化 由于食品中丙烯酰胺的含量较低且杂质较多，因此对样品中的丙烯酰胺进行纯化与富 集是分析与测定的关键。丙烯酰胺的纯化方法有固相萃取法和化学纯化法两种方式，或者 将二者结合起来以达到较为理想的纯化效果。王海燕【3 4 1 采用固相萃取一高效液相色谱法测定 了食品中的丙烯酰胺，其检出限为2 7 1 9 8 p , g k g 。化学纯化法主要是研究不同体系中可能 存在的干扰物质，根据干扰物质的特性，选择合适的化学物质作为沉淀剂，以除去相应的 干扰物质，目前常用的主要是c a r r e z 试剂。 1 4 3 检测方法 目前，国内外普遍采用的食品中丙烯酰胺的分析方法主要有气相色谱法( g c ) 、高效 液相色谱法( h p l c ) 、气相色谱质谱法( g c m s ) 、液相色谱- 质谱法( l c m s ) 和液相色谱一串 联质谱法( l c m s m s ) ，特别是l c m s m s 法的准确性和灵敏性均较高，是很有发展前景 的检测方法。 1 4 3 1气相色谱法( g c 法) 气相色谱自身要求被分析物必须具有一定的热稳定性和挥发性，而丙烯酰胺则属于热 不稳定性的化合物。因此可以对其进行适当的衍生来改善其稳定性和挥发性，从而改善分 离度，提高灵敏度。丙烯酰胺的衍生化方法主要有溴化衍生法、2 巯基苯甲酸衍生法等。 当然，也有不进行衍生直接采用气相色谱法进行测定的，这些方法尽管有分析周期短的优 点，但检测限普遍偏高。 1 4 3 1 1衍生法 1 4 3 1 1 1 溴化衍生法 溴化衍生法是应用最为广泛的方法，其产物主要有2 ，3 二溴丙酰胺( 2 ，3 - d b p a ) 和2 一 溴丙酰胺( 2 b p a ) 。前者是当p h 为1 - - - 3 时，丙烯酰胺与溴在溴化剂的作用下发生加成反应， 生成2 ，3 - d b p a ，反应方程式如下： 河北大学理学硕十学位论文 h h n h 2 b r 2 h 另外，利用k b r 和k b r 0 3 之间的氧化还原反应产生新生态溴进行衍生，从而避免额外 加入单质溴【3 0 1 。 b o f o g n a 等在进样前加入三乙胺将2 ，3 - d b p a 转化为更稳定的2 - b p a 后进行测定，这 就成为测定丙烯酰胺的另一溴化衍生方式口5 1 。 h ( c 2 h s ) 3 n h h 1 4 3 1 1 22 巯基苯甲酸衍生法 j e z u s s e k 等3 q 采用了2 巯基苯甲酸衍生法测定食品中的丙烯酰胺。此反应需要搅拌并 且在暗处进行，衍生效率较高，衍生物具有很好的稳定性和较低的极性，在色谱分离中有 较高的保留特性。 s h + 1 9 9 6 年美国环境保护局发布了关于g c 测定水和其它物质中丙烯酰胺的方法【3 7 , 3 8 】，该法采 用溴化试剂将丙烯酰胺衍生为2 ，3 二溴丙酰胺，通过n a 2 s 0 4 盐析作用提高乙酸乙酯萃取2 ， 3 二溴丙酰胺的效率，再用硅酸镁为载体的柱纯化样品，得出方法线性范围0 - - 一5 鹏几，检出 限为0 0 3 2 弘g 几，回收率为8 5 2 。我国周宇等1 3 9 】人将薯片经水提取、溴化、蒸发后进行气相 色谱分析，得出方法的线性范围为0 - - 2 0 0 0p g k g ，样品加标回收率为6 9 9 。结果表明：该 方法具有稳定性好、灵敏度高等优点。最近z h uy o n 曲o n g 等人【4 0 】采用气相色谱法定了食品中 的丙烯酰胺，他们将试样用水萃取、微滤，然后加正己烷脱脂，溴化衍生，乙酸乙酯提取2 b p a ， 该法成本低，简便可靠。 第1 章绪论 1 4 3 1 2 不衍生的g c 法 目前，除了上述方法，有的研究者还开发了不经衍生的气相色谱法测定食品中的丙烯 酰胺。由于丙烯酰胺是极性化合物，不经衍生直接分析一般均选用强极性的色谱柱，如 d b w a x 或等效柱，也有人使用f f a p 涂壁毛细管柱【4 l 】。 2 0 0 2 年r e s t e k 公司报道用g c 法测定食品中丙烯酰胺【4 2 】，他们采用0 1 甲酸溶液为提取 剂，c a r b o p r e p t m 2 0 0s p e 柱分离除去杂质，程序升温( 初始温度1 0 0 保持0 5m i n ，以1 5 c r a i n 速度升温至u 2 0 0 ) ，s t a b i l w a x ( 1 5m x 0 5 3m i n x o 5 0 岬) 色谱柱分离，氢焰离子化检测 器( f i d ) 检测，得到方法线性范围为2 0 - 5 0 0 0 “g l ，检出限为1 0 烬l 。 1 4 3 2 高效液相色谱法( h p l c 法) 高效液相色谱法引入了气相色谱理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度 检测器，是十分常见的检测丙烯酰胺的方法。高效液相色谱法常用的检测器有紫外检测器、 荧光检测器、电化学检测器和二极管阵列检测器等。 2 0 0 4 年1 0 月刘红河在国内首次报道h p l c 法测定食品中丙烯酰胺【4 引，该法用水提取样品 中的丙烯酰胺，c 1 8 固相萃取小柱纯化处理，a g l i e n tx d b 反j ( f l c l 8 柱分离，二极管阵列检 测器测定，得到方法检出限为1 0 岖儋，最低检出量为1 0n g g ，回收率为8 0 0 - 1 1 5 0 。 t e r a d a t 4 4 1 用h p l c u v 法测定了多种食品中的丙烯酰胺的含量。p a l e o l o g o s 等人【4 5 1 报道用正相 h p l c 法测定食品中的丙烯酰胺，该法先将试样粉碎成大小均一的颗粒，然后用7 0 水提 取，震荡，离心和过滤，加正己烷脱脂，液相色谱法进行测定，得出方法检出限为1 0 嵋l - 1 ， 回收率为9 5 - 1 0 3 。其分析结果与其他报道很接近，也是一种有效测定丙烯酰胺的方法。 1 4 3 3 气相色谱一质谱联用( o c m s 法) 2 0 0 2 年3 月瑞典斯德哥尔摩大学最早宣布了使用溴化g c m s 法分析测定食物中的丙烯 酰胺的方法。其分析步骤为：将丙烯酰胺溴化衍生为2 ，3 二溴丙酰胺，然后通过气相色谱 分离，用质谱法检测。我国蒋俊树等人【4 6 】研究了食品中丙烯酰胺的气相色谱质谱( o c m s ) 定量测定方法，首先通过水、醇类等极性溶剂提取样品中的丙烯酰胺，然后进行溴化衍生， 气相色谱一质谱( o c m s ) 特征离子定性，标准加入法定量，方法检出限为5 - - - 1 0i x g k g ，回收 河北大学理学硕十学位论文 率在8 0 o 1 1 0 0 。李永香等人【4 7 1 用g c m s 法测定了方便面中的丙烯酰胺含量，采用柱 前溴化衍生的方法，以甲基丙烯酰胺为内标，分别采用g c e c d 、g c f i d 、g c m s 分析测 定，在0 - 5 0 0m g l 范围内线性良好，加标回收率范围为7 0 9 - - 8 7 6 。t r i s a l 汕a r g e 等【4 8 】 报道了g c m s 法测定食品中的丙烯酰胺，方法线性范围为5 - 1 0 0 0m g l ，r 为o 9 9 9 8 。s o a r e s c t 4 9 】用g c m s 法测定了咖啡中丙烯酰胺的含量，其净化步骤分为两步，第一步用乙醇和c a r r 铉试剂除去试样中的多糖和蛋白质，第二步用s p e 法除去色谱干扰物质。 1 4 3 4 液相色谱一质谱联用( l c m s ，l c m s m s ) 液相色谱一质谱联用是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统，是检测食 品中丙烯酰胺的常用方法，其检出限低，灵敏度高，在分析化学、医药卫生等方面发挥着 越来越重要的作用。r o s e n 和h e l l e n a s l 5 0 1 最先在研究烹调、加工过程中食品中丙烯酰胺时 采用l c m s 检测方法，提取液经过反复多次的纯化后，以0 1 醋酸水溶液与0 5 甲醇 为流动相，用质谱仪检测。美国f d a 2 0 0 3 年2 月公布了食品中丙烯酰胺的检测方法草案 【5 1 1 ，丙烯酰胺标准液用水溶解，经离心、s p e2 次净化后用l c m s 法测定。s o n j a 等【5 2 】 运用液相色谱电喷电离串联质谱法对早餐谷类食品和薄脆饼干中丙烯酰胺含量进行了测 定，得出检测限分别为2 0l 上g k g 和1 5p g k g 。我国刘红河【5 3 】用高效液相色谱串联质谱 ( h p l c m s m s ) 法测定了食品中的丙烯酰胺，首先在均质后的食品样品中加入正己烷脱 脂，然后用蒸馏水提取丙烯酰胺，c a r r e z 试剂净化样品，净化液过0 4 5 p r o 微孔滤膜，多 反应监测模式检测，外标法定量，线性相关系数为o 9 9 9 7 ，方法的线性范围为2 , - - - 5 0 0 鹏几， 检出限为2p g k g 。 第1 章绪论 表1 1 丙烯酰胺的各种检测方法的比较 t a b l e1 1d e t e c t i o nm e t h o d so fa c r y l a m i d e 1 5 抑制丙烯酰胺生成的方法 目前抑制食品中丙烯酰胺产生的方法主要为控制原料中的天冬酰胺和还原糖含量、调 整加工工艺和添加抑制剂等。 1 5 1控制原料中天冬酰胺和还原糖含量 天冬酰胺和还原糖含量是形成丙烯酰胺的重要底物，因此控制原料中游离天冬酰胺和 还原糖含量是控制食品中丙烯酰胺的根本途径。其主要方法为：一是通过品种选育并适当 改变培植条件降低原料中天冬酰胺和还原糖含量 5 4 , 5 5 ；二是选择合适贮存马铃薯的温度； k o n i 等【5 6 】认为马铃薯应避免低于1 0 c 下保存；三是采用天冬酰胺酶和其它酰胺酶除去原料 中的天冬酰胺。 河北大学理学硕十学位论文 1 5 2 调整加工工艺，添加抑制剂 加热温度和加热时间对丙烯酰胺的生成有重要影响，因此降低食品的热加工温度和缩 短热加工时间可以有效地降低食品中丙烯酰胺的含量。另外，样品油炸前预处理方法对丙 烯酰胺的形成也有重要影响。将样品热烫可以减少样品中还原糖和游离的天冬酰胺的含量 【1 5 1 。样品中添加焦磷酸钠、柠檬酸、l 乳酸等，可以减少食品中的丙烯酰胺【7 1 。d h i r a j 等【5 7 l 研究发现，生薯条上涂抹鹰嘴豆粉糊后可以使丙烯酰胺含量由1 4 9 0p g l ( g 降至5 8 0p g k g 。样 品被含c a 2 + 、n 矿的溶液浸泡也可以降低丙烯酰胺的含量，分别可降低9 5 与5 0 t 5 7 1 。另外 有专梨5 8 1 发现，添加少量类黄酮后可使炸薯条内的丙烯酰胺含量减少一半。z h a n gy u t 5 9 1 等 人报道样品用竹子叶和绿茶浸泡可分别使丙烯酰胺含量降低7 4 3 和7 4 4 。 1 6 总结与展望 丙烯酰胺是一种已知的神经毒性物质和人类可能致癌物，目前发现除职业接触外，人 们还可通过日常饮食( 如油炸薯条、薯片、高温烘烤的面包、茶叶等) 摄入丙烯酰胺。食 品中丙烯酰胺的检测已列为我国国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品 安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法的建立和我国食品丙烯酰胺分布调查作为一个重要 部分。 根据检测方法分类，目前广泛应用到丙烯酰胺检测的色谱方法有：气相色谱法、液相 色谱法、气相色谱质谱联用以及液相色谱质谱联用等。g c 法或g c m s 法测定精度高， 但须加衍生化，样品前处理方法复杂。l c m s m s 法所需仪器非常昂贵。因此，建立一种 操作简便、节约成本的方法就尤为重要。 第2 章高效液相色谱法检测决明子茶中丙烯酰胺的含量 第2 章高效液相色谱法检测决明子茶中丙烯酰胺的含量 2 1引言 2 0 0 2 年4 月，瑞典国家食品管理局吣) 和斯德哥尔摩大学首次发现富含淀粉的薯条、 饼干、面包等食物在经受高温油炸或烧烤时会生成丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 。丙烯酰胺是一种 有毒化合物，可导致细胞遗传物质d n a 的损伤 i 1 , 6 0 】，高剂量的暴露会影响人和动物的神经 系统与生殖系统。国际癌症机构( i a r c ) 将丙烯酰胺列为“人类可能致癌物”( g r o u p 2 a ) 。这一 发现引起了世界各国与f a o w h o 的广泛重视。食品中丙烯酰胺的检测已列为我国国家重 大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法 的建立和我国食品中丙烯酰胺调查作为一个重要部分。本实验采用h p l c 技术( 紫外检测器) 结合固相萃取等前处理方法，对我们日常饮用的决明子茶中丙烯酰胺的含量进行了测定。 2 2 仪器与试剂 2 2 1仪器 高效液相色谱仪( l c 一1 0 a t v pp l u s ，s h i m a d z u ，日本岛津公司) 配紫外检测器，7 7 2 5 i 手动进样阀( 美国) ；a t l a n t i sc 1 8 色谱柱( 2 5 0 x 4 6m mi d ，5 岬) ；色谱柱恒温箱( a t - 3 3 0 ， 天津市奥特赛恩斯仪器有限公司) ；o a s i sh l bc a r t r i d g e ( 2 0 0m g ，w a t e r sc o r p o r a t i - o n ，m i l f o r d ，m a s su s a ) ；b o n de l ml r c p r s ( 5 0 0m g ，v a r i a n ，c h i c a g o ，u s a ) ；离心 沉淀机( l g 1 0 2 4 a ，北京雷勃尔离心机有限公司) ；漩涡混合器( w h 6 0 1 ，太仓市科教器材 厂) 。 2 2 2 试剂与材料 丙烯酰胺( 9 9 9 ，s o l o n ，o h i o ，u s a ) ；甲醇( 高效液相色谱纯，天津市科密欧化学 试剂有限公司) ；决明子茶( 保定一笑堂，安国市福寿养生茶厂) ；丙烯酰胺储备液浓度为 1 0 0 0m e a l 0 5 甲醇溶液，存放于- 2 0 冰箱中，临用时用0 5 甲醇水溶液进行稀释。试剂 除注明外均为分析纯。试验用水为二次蒸馏超纯水。 河北大学理学硕士学位论文 2 3 实验部分 2 3 1 样品前处理 称取1g 已粉碎好的决明子茶样品置于5 0m l 的聚丙烯塑料管中，加水至1 0m l ，漩 涡振荡1 5m i n ，置于高速离心机中以1 0 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，将离心液过o 4 5 岬的滤 膜，取其中1m l 过h l b 固相萃取柱( 预先用3 5m l 甲醇和3 5m l 水活化) ，待滤液全部 流出小柱后，将其接在p r s 固相萃取柱( 预先用5m l 甲醇和5m l 水活化) 上，用3 5m l 5 的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，经滤膜过滤，供测试。 2 3 2 色谱检测条件 色谱柱：a t l a n t i sc 1 8 色谱柱( 2 5 0 4 。6n l f f li d ，5 岬) ；流动相：甲醇：水( 体积比 为o 5 ：9 9 5 ) ；流速：o 5m l m i n ：柱温：3 0 ；检测波长：2 1 0 a m ；进样量：2 0 此。 2 4 结果与讨论 2 4 1 检测波长的确定 本实验分别选取1 9 5n n l 、2 0 0n m 、2 0 5i l r n 、2 1 0n m 、2 2 6n m 作为检测波长进行对比， 其中当检测波长为2 1 0t i m 时，样品中丙烯酰胺的峰形最为理想，且受基质的影响最小。 故本实验以2 1 0n m 作为检测波长。见图2 1 。 第2 章高效液相色谱法检测决明子茶中丙烯酰胺的含量 图2 1 决明子茶与丙烯酰胺标样( o 2ug m l ) 的比较图 f i g 2 1t h ee h r o m a t o g r a mo fc a s s i as e e dt e aa n da c r y l a m i d es t a n d a r d ( o 2p g m l ) 流动相：甲醇：水( 体积比为0 5 ：9 9 5 ) ；流速：0 5m l m i n 柱温：3 0 ；检测波长：2 1 0n m ；进样量： 2 0 止 2 4 2 丙烯酰胺提取与净化方法的确定 丙烯酰胺易溶于水和甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等多种有机溶剂，但在水中的溶解度 最大，所以用纯水为提取剂可以有效提取出样品中的丙烯酰胺。另外高速离心可以使一些 小分子物质絮结在一起，从而沉淀下来，有利于提取液的纯化。 实验同时比较了不用固相萃取小柱处理和让提取液只过h l b 固相萃取小柱和过h l b d 、 柱后再过p r s d 、柱后再分析，结果发现过h l b d 、柱后再过p r s d 、柱提取液中杂质明显减少， 峰的分离度大大提高。见图2 2 。这就表明当决明子茶样品只经纯水提取，其a a 附近有很 多峰，无法确定出a a 的具体含量。当样品经h l b 固相萃取小柱后，a a 附近的峰明显减少， 但分离度相对较差一些，故需进行再净化。所以我们又将过h l b d 、柱后的溶液过p r s d , 柱 进行净化，结果显示分离度显著提高，可以明确确定出a a 的色谱峰，并计算出样品中a a 的含量。 河北大学理学硕十学位论文 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 三8 0 0 0 0 j 4 0 0 0 0 2 0 0 o 1 0 0 8 0 0 0 三8 0 0 0 j 4 0 0 0 2 0 0 0 o 5 0 4 0 0 0 3 0 0 0 j 2 0 0 0 1 0 0 1 0 ，、a ，、天 - - - ： 图2 2 决明子茶中丙烯酰胺净化条件的优化 f i g 2 2o p t i m i z a t i o no fp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so fa c r y l a m i d ei nc a s s i as e e dt e a 流动相：甲醇：水( 体积比为0 5 ：9 9 5 ) ；流速：0 5m l m i n ：柱温：3 0 ；检测波长：2 1 0r i m ；进样量： 2 0 皿 2 4 3 洗脱条件的优化 取1 0l 上g m l 的丙烯酰胺标准溶液l m l 过h l b 固相萃取柱( 预先用3 5m l 甲醇和3 5 m l 水活化) ，待滤液全部流出小柱后，将其接在p r s 固相萃取柱( 预先用5m l 甲醇和5m l 水活化) 上，分别用1 0 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5m l 5 甲醇水溶液进行洗脱，高效液相色谱仪 进行分析，得出洗脱液回收率分别为1 4 2 、6 2 9 、7 3 7 、8 0 、1 0 0 。见图2 3 。可见， 当洗脱液用量较少时，丙烯酰胺无法被完全洗脱出来，加大洗脱液的用量可逐步将丙烯酰 胺洗脱出来，直至洗脱完全。 第2 章高效液相色谱法检测决明子茶中丙烯酰胺的含量 图2 3 丙烯酰胺标准溶液的洗脱曲线 f i g 2 3e l u t i n gc u r v eo fa c r y l a m i d es t a n d a r ds o l u t i o n 流动相：甲醇：水( 体积比为0 5 ：9 9 5 ) ；流速：0 5m l m i n ；柱温：3 0 ：检测波长：2 1 0n m | 进样量： 2 0 止 2 4 4 标准曲线的绘制 对o 0 5 、o