（遗传学专业论文）酵母双杂交筛选与谷氨酰trna合成酶相互作用蛋白质及不同植物激素诱导下谷氨酰trna合成酶转基因拟南芥的生理性状分析.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一起工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期问在杨毅导师指导下取得的，论 文成果归四川大学所有，特此声明。 导师 硕士生 老荔 喜t 陡 2 0 0 7 年4 月 四川大学硕士学位论文 酵母双杂交筛选与谷氨酰t r n a 合成酶相互作用蛋白 质及不同植物激素诱导下谷氨酰t r n a 合成酶转基因 拟南芥的生理性状分析 专业：遗传学 研究生：姜维嘉指导教师：杨毅 摘要：酵母双杂交系统是研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种重要的方法。自 从有了这种方法，许多未知蛋白的蛋白质与蛋白质相互作用都被揭示。脱落酸 ( a b a ) 在调控植物的生长包括：成熟、萌芽、休眠以及对抗包括寒冷、干旱、 高盐度的环境压力等方面起作用。 谷氨酰t r n a 合成酶( g i u r s ) 属于a m i a o a c y l t r n a s y n t h e t a s c 家族i ，结 构上是具有多个亚基的蛋白质，功能上有催化t r n a 结合氨基酸、促进t r n a 的成熟和校正等典型氨基酰t r n a 合成酶家族的特点。另外，发现它参与a b a 的信号转导。g i u r s 被确定为a b a 信号通路的信号分子，作用有两点：第一 是与a b l l 和a b l 2 的相互作用。a b l l ，a b l 2 对a b a 诱导的气孔关闭起负调 控，g l u r s 能与a b l l 形成复合物，抑制它的活性，影响信号转导；在转录水 平上，g i u r s 的转录要依赖与a b l l 和a b l 2 ；g l u r s 能辅助进行a b l l ( 包括 1 个内含子) 和a b l 2 ( 包括2 个内含子) 的剪接。第二是能调控某些与内源 a b a 形成有重要关系的基因表达，比如n c e d 3 ，能间接影响内源a b a 的生 物合成。 脱落酸、乙烯、赤霉素作为植物五大激素的其中三种，在信号转导途径上 存在交叉影响。g i u r s 作为a b a 信号途径的一员，也极有可能参与到乙烯、 赤霉素的信号通路中。 在本实验中，我们利用酵母双杂交的方法筛选出与拟南芥谷氨酰t r n a 合 成酶( a t g i u r s ) 相互作用的蛋白质，寻找a b a 信号通路的其它信号分子； 2 四川大学硕士学位论文 通过测定a t g l u r s 转基因植物在外源乙烯和赤霉素分别作用下的生理指标，来 判定a t g i u r s 是否参与乙烯和赤霉素的信号转导。 我们构建拟南芥谷氨酰t r n a 合成酶全长( f c ) 和缺失n 端片段( c ) 的b d 载体，通过酵母双杂交顺序转化的方法，在拟南芥双链c d n a 分子中筛 选与a t g l u r s 相互作用的蛋白质，并进行阳性克隆的鉴定：将a t g i u r s 转基 因种子分别在加有不同浓度的外源乙烯和赤霉素的培养基上暗培养，测定外源 乙烯作用下幼苗的茎和根的长度，外源赤霉素作用下的种子萌发率，观察3 5 s 株系、谷氨酰t r n a 合成酶过量表达株系、谷氨酰t r n a 合成酶抑制表达株系 的差别。 我们成功构建了酵母双杂诱饵质粒p g b k t 7 - a t g i u r s ( f c ) 和p g b k t 7 a t g i u r s ( c ) ，进行a t g l u r s 为诱饵蛋白的酵母双杂交。通过对a t g i u r s 转基因拟南芥在外源乙烯和赤霉素作用下的生理性状分析，发现拟南芥谷氨酰 t r n a 合成酶过量表达株系和抑制表达株系对乙烯和赤霉素均不敏感。拟南芥 谷氨酰t r n a 合成酶过量表达株系相对于3 5 s 株系和抑制表达株系表现出较早 的萌发。 关键字：谷氨酰t r n a 合成酶，酵母双杂交，脱落酸，乙烯，赤霉素 3 四川大学硕士学位论文 m a j o r ：g e n e t i c s g r a d u a t es t u d e n t ：j i a n gw e i j i a t u t o r ：y a n gy i a b s t r a c t ：t h ey e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mh a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm e t h o dt oa n a l y z e t h ep r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nu n k n o w np r o t e i n sh a v e r e v e a l e dw i t hi t a b ap l a y sam a j o rr o l ei n r e g u l a t i n gp l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n ti n c l u d i n g s e e d m a t u r a t i o n , g e r m i n a t i o n , d o r m a n c y , a s w e l la s m e d i a t i n ga d a p t a t i o n st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e ss u c ha sc o l d ，d r o u g h ta n ds a l i n i t y a t g i u r sb e l o n g st oa m i n o a c y l - t r n as y n t h e t a s ef a m i l ylt h es t r u c t u r ew i t hm u c h s u b u n i t ，t h ef u c t i o n si n v o l v ec a t a l y s i n gt r n a l i n kt oa m i n oa c i d 、a c c e l e r a t i n gt r n a m a t u r a t i o na n da d j u s t i n g i na d d i t i o n , t h ep r o t e i ni sc o n c e r n e dw i t ha b a s i g n a l t r a n s d u c t i o n a t g i u r si sc o n f i r m e da saf a c t o ro fa b a s i g n a lp a t h w a y i t sm a j o r e f f e c t ：t h ef i r s ti st h ei n t e r a c t i o nw i t ha b l la n da b l 2 a b l la n da b l 2a r ca s n e g a t i v er e g u l a t o r si ns t o m a t ac l o s u r ei n d u c e db ya b a a t g l u r s 锄c o m b i n ew i t h a b i it oi n h i b i ti t s a c t i v i t y a n da f f e c tt h es i g n a lt r a n s d u c t i o n ；a tt h el e v e lo f t r a n s c r i p t i o n ，t h et r a n s c r i p t i o no fa t g l u r sd e p e n d so ua b l la n da b l 2 ，a t g i u r s s e e m st ob ei n v o l v e di nt h ep r o c e s s i n go fa b l la n da b l 2b yr e g u l a t i n gs p l i c i n go f t h ep r e 。m r n at om a t u r em r n a a n o t h e re f f e c ti st h a ti tc a ni n d i r e c t l y i m p a c t b i o s y n e h e s i so fe n d o g e n e s i sa b ab yr e g u l a t i n gs o m ek e ye n z y m e , f o re x a m p l e n c e d 3 4 四川大学硕士学位论文 a b a , e t h y l e n e ，g aa r ei m p o r t a n tp l a n th o r m o n e s ，t h ec r o s s - t a l kp e r h a p se x i s t si n t h e s es i g n a l i n gp a t h w a y s a so n eo fi m p o r t a n tf a c t o r si na b a s i g n a l i n g , a t g l u r s m a yp l a yn r o l ei ne t h y l e n ea n dg a s i g n a l i n g t h eo b j e c t i v ei st os c r e e ni n t e r a c t i n gp r o t e i n sw i t ha t g i u r si na r a b i d o s i sb yu s i n g y e a s t t w oh y b r i dt e c h n i q u e t h ep h y s i o l o g i c a lp a r a m e t e ri sd e t e c t e di no r d e rt o r e v e a lw h e t h e ra t g i u r sp a r t i c i p a t e si no t h e rp l a n th o r m o n es i g n a lp a t h w a yo rn o t m e t h o d si n c l u d es c r e e n i n ga r a b i d o p s i sc d n a , a n dr e t e s t i n gt h ep o s i t i v ec o p i e s ， t h e ns e q u e n c i n gt h e m c o n c l u s i o ni n d i c a t et h a tt h eb a i tp l a s m i dp g b k t 7 - a t g i u r s ( f c ) a n dp g b k t 7 - a t g l u r s ( ac ) a r cs u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e df o ri nt h ey e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m , a n dw ed e t e c tt h el e n g t ho fc u l ma n dt o o tt r e a t e dw i t he t h e p h o n w e a l s oc a c u l a mt h eg e r m i n a t i o nr a t et r e a t e dw i t hg a 3 a sar e s u l t , a t g i u r ss e n s e f i n e sa n da t g i u r sa n t i - s e n s el i n e sa r cn o ts e n s i t i v et oe t h y l e n ea n dg a 3 a t g i u r s s e n s cl i n e sg e r m i n a t ep t i o rt o3 5 s g u st r a n s f o r m a n tl i n e sa n da t g i u r sa n t i s e n s e l i n e s k e yw o r d s ： t g l u r s ：y e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m ；a b a ：e t h y i e n e ：卧 5 四川大学硕士学位论文 前言 拟南芥属十字花科拟南芥属的一个种，其具有植株小、形态特征简单、生 长期短、产生的种子数量多、自交繁殖等生物学特征，便于以其为材料进行遗 传分析。拟南芥核基因组小，其单倍体基因组只有8 0 0 0 0 k b 左右。由于基因组小， 使得其基因库的构建、筛选等过程变得简单、快速，同时还可节省大量人力、 物力。拟南芥已成为一种典型的“模式”植物，被誉为植物界的“果蝇”。 脱落酸( a b a ) 是一种一元羧酸，具有倍半萜结构，亲水亲脂。a b a 调控植 物发育的许多方面，包括种子贮存蛋白和脂类的合成，提高种子抗旱性，促进 休眠，抑制种子胚的萌发和植株再生等( f i n k e l s t e i n r re ta 1 ，2 0 0 2 ；g o s t i e t a 1 ，1 9 9 9 ) 。蛋白磷酸酶2 c ( p p 2 c ) 突变后，种子萌发和幼苗气孔运动都对a b a 不敏感。相应的基因a b i l 和a b i 2 都编码p p 2 c ，由g l y 1 8 0 和g l y 1 6 8 点突变 成a s p ( l e u n ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在a b i l 1 和a b i 2 1 中，这种保守氨基酸被改变， 从而使g i y a b a 的一些下游反应减弱，如k + i n 和k + o u t 、阴离子通道、 c a 2 q e y t 。 如果人为升高c a 2 3 c y t ，则可引起阴离子通道启动和气孔关闭，从而补充了 a b i l 1 和a b i 2 1 中的突变结果，说明p p 2 c 位于a b a 信号的早期，可能在 c a 2 + c y t 增加的上游。a b i l 1 和a b i 2 1 的回复突变体被分离获得，在体外磷酸 酶活性下降或完全消失( l e u n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，说明a b i l 1 和a b i 2 1 可能是a b a 信号的负调节者。a b i l 1 、a b i 2 1 和h 2 0 2 的关系为a b a - a b i l 1 n a d p h h 2 0 2 一a b i 2 1 ，胞内c a “浓度升高，气孔关闭( m u r a t ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 谷氨酰t r n a 合成酶属于a m i n o a c y l t r n a s y n t h e t a s e 家族i 、具有多个亚基 的蛋白质。晶体结构具有四个结构域，其中两个功能比较确定，n 端序列具有 使a a a m p 复合物形成的活性，称为a a r s 的a a - a m p 合成结构域，主要作用 是结合a t p 。c 端的部分序列称为a a r s 的a a t r n a 合成结构域，能识别特异 t r n a 的活性。氨基酰t r n a 合成酶是一种在生物体中普遍存在的酶，根据它 上面氨基酸的不同，功能也有一些差异：影响线粒体r n a 的剪接( 洛氨酰， 亮氨酰) ，基因的转录调控( 丙氨酰，苏氨酰) ，d n a 的包装( 苯丙氨酰) 等。 谷氨酰t r n a 合成酶作为氨基酰t r n a 合成酶的家族的一个成员，具有氨基酰 四川大学硕士学位论文 t r n a 合成酶的一些共性。谷氨酰t r n a 合成酶的两个普遍作用：第一个它能 催化t r n a 结合氨基酸；另一个是能促进t r n a 的成熟和校正。 谷氨酰t r n a 合成酶在a b a 信号通路中起到一定的作用。谷氨酰t r n a 酶与a b l l 和a b l 2 都有作用，且与a b l l 作用更强。谷氨酰t r n a 酶的表达水 平并不受a b a 调控，但当a b i l 和a b i 2 突变，它的表达水平就下降很大。因此， 谷氨酰t r n a 酶的表达水平与a b l l 和a b l 2 相关。而且，通过调控p r e m r n a 到m r n a 的剪接，来调控a b l l 和a b l 2 的加工。 四门l 大学硕士学位论文 第一部分谷氨酰t r n a 合成酶载体构建 及酵母双杂交 1 材料及来源 1 1 材料 本实验所使用的拟南芥为r i d 生态型，由本实验室保存。 1 2 菌株 ( 1 ) 酵母菌株a h l 0 9 ，从c l o n t e c h 公司购买。 。 基因型：m a t a , t r p l - 9 0 1 ，l e u 2 3 ，1 1 2 ，u r a 3 5 2 ，h i s 3 2 0 0 ，g a l 4 a , g a l 8 0 a , l y s 2 ： g a l l u a s g a l l t a t a h i s 3 ，g a i2 u a _ s g a i2 t a t a a d e 2 ，u r a 3 ：l m e l l u a s m e l1 t a t a - l a c z m e l l ( 2 ) e c o i lj m l 0 9 菌株由本试验室保存。 1 3 载体 1 3 1 克隆载体 ( 1 ) p g b k t 7 载体从c l o n t e c h 公司购买。 p g b k t 7 ：含有g a l 4d n a - b i n d i n gd o m a i n ，c - m y c ( 可与目的g e n e 表达融合 蛋白便于今后的检测和纯化) ，t r p l ( 酵母中营养缺陷型选择标记) ，k a n a m y c i n 抗性( e c o i l 中选择性标记) ，用于构建b d b a i t 质粒。 四川i 大学硕士学位论文 翟竺三! ：型! ! 三- 咖岫岫 r c a t c 6 6 址g a g a g t a g t c a a g g t c a a a g ac a g t t 6 a c t g t a t c gc c g g a a t r r 鼍l 百磊盥竺业巴| ，晰h g t a a t ac g a c r c a c t a t a g g g c g a g c c g c c a t ca t 6g a g g a gc a 6 从g c t g a t c t c ag a gg a gg a c 晌 j r i a i i t c a t a t gg c c a i gg a gg c c g a a t t c c c gg g g m cc g t c g ac f f r g c ag c g g c c g 队伍回丽丽伍嘶 1 百面丁拍ie c e l k i - i 百b a m h is a i i 嚣嚣 1 m 一加i t m i r g g g g c c t c t a a c g g g t c t t g a g c g 盯r 广町g c g c t t g u c a a g c t a a t r c c g g g c g a a t i r c t t a t b t 丌 | t o p t ， l 瑚 a t g a t l l l t m a l 。r a a 1 a 帕m t a a t a a 盯：g 1 噙t a c w t t 丌 a a g r g a c t c 丌硒们m t c 叫l a 。锶鬻怒：瞥；警“ 图1 - 1 ：p g b k t 7 载体图谱 ( 2 ) p g a d t 7 一r c c 载体，从c l o n t e c h 公司购买。 p o a d t 7 一r c c 含有g a i a a c t i v a t i o nd o m a i n ，h a 一血球凝集素( 可与目的g e n e 表达融合蛋白便于今后的检测和纯化) ，l e u 2 ( 酵母中营养缺陷型选择标记) ， a m p i c i l l i n k 抗性( e c o i l 中选择性标记) ，用于构建a d p r e y 质粒。 四川大学硕士学位论文 s m a r t i i l l m n l m s ”：竺! 竺竺! 竺型竺! ! ! 竺竺! 型! ! 。；踹。萤 莳a 丌c g 甜“t g a a g a t a c c c c a c c a a a c c c a a a a a 从g 础 t t s 朝删岣剐目i a t c t 丌a a ta c g a c t i $ 1 s 兰= = = = 哥册竺! ! ! ! 竺 “c t a t a 6 6g c g a g c g c c g c c a t g g a g t a c c c at a c g a cg t a c c a g a t t a cg c t 9 ( 9 q _ _ n - 。_ _ _ 。- - 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ - 。_ 。- 一 c a t a t gg c c a t g g a g g c c a g t g a a t t c c a c c c a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t g g c c a t l t g gc c c c d s t e r m i n u s ?坚! ! ! ! g g g a a a a a a c a t g t c g g cc g c c t c g g c c t c t a g a g gg t gg g c a t c g a t a c gg g a t c c 掇 ：i ；t o p a t cg a gc t cg a gc t gc a g 丽i i ：磊爵i 订酝a 从a c c c c g c a a g t t c a c 丌c m a t 讲m a k 田3 d l d j r 哦n $ c r f l l n g 柚岫 甜砬 从c t g t g c a t c g t g c a c 巳盯c t - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一 3 ds 口m m p n w 。 图1 - 2 ：p g a d t 7 一r e c 载体图谱 四川大学硕士学位论文 1 3 2 对照载体 ( 1 ) p o b g t 7 5 3 ：d n a - b d p 5 3 ，c - m y c ，t r p l ( 酵母中营养缺陷型选择标记) ， k a n a m y c i n 抗性( e c o l i 中选择性标记) ； p g a d t 7 一r e c t ：a d t - a n t i g e n , ，h a ，l e u 2 ( 酵母中营养缺陷型选择标记) ， a m p i c i l l i n k 抗性( e c o l i 中选择性标记) ； p g b k t 7 5 3 和p g a d t 7 一r e c t 的表达产物之间发生相互作用，构成一对阳性 对照质粒。 ( 2 ) p g b k t 7 1 a m ：d n a b d l a m t n c ，c m y c ，t r p l ( 酵母中营养缺陷型选择 标记) ，k a n a m y c i n 抗性( e c o l i 中选择性标记) ； p g a d t 7 一r e c t ：a d t - a n t i g e n ，h a ，l e u 2 ( 酵母中营养缺陷型选择标记) ， a m p i c i l l i n k 抗性( e c o l i 中选择性标记) ； p g b k t 7 i a m 和p g a d t 7 一r e c t 的表达产物之间不发生相互作用，构成一对 阴性对照质粒。 1 4 主要试剂 鲑鱼精d n a ，p e g 3 2 5 0 ，购自s i g m a 公司d m s o 购白a m r e s c o ) 【_ g a l ， 内切酶t a q i ，b s t t r l 购自t a k a r a 公司。t a gd n a 聚合酶购自t a k a r a 宝生物 工程( 大连) 有限公司。反转录试剂盒2 0 0 5 b i o b r k r t - p c r k i t 购自成都博 瑞克生物技术有限公司。各种限制性内切酶购自f e r m e n t a s 公司。r n a p l a n t 植物r n a 提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。p c r 产物回收试裁盒 p c r c l e a n u p k i t 购自u g e n e 公司。所有p c r 反应引物由三博远志公司合成。 序列测序由三博远志公司完成。其他化学试剂均为本实验室保存的分析纯试 剂。 1 5 培养基及试剂配方 y p d a 固体培养基( 1 l ) ：含腺嘌呤的酵母常规生长复合培养基 lp e p t o n c2 0 9 iy c 笛te x t r a c t 1 0 9 四川大学硕上学位论文 l a g a r2 9 i d h ：o 9 3 5 m l 灭菌后，待冷却到5 5 左右加： 4 0 g l u c o s e 5 0 m l 1 0 0 xa d e n i n e1 5 m l ( 2 ) s d ( s y n t h e t i cd r o p o u tm i n i m a lb a s e ) 培养基( 1 l ) ：人工合成极度缺陷型培 养基 y n b 1 7 9 ( n h 4 h s 0 45 9 a g a r2 0 9 d h 2 0 8 5 0 m l 灭菌后，待冷却到5 5 左右加 4 0 g l u c o s e 5 0 m l 1 0 x d r o p o u t 1 0 0 m l ( 3 ) 1 0 x 成分 体积( r a g l ) l - i s o l e u c i n e3 0 0 l v a l i n e5 0 0 l - a r g i n i c e h c l2 0 0 l ，l y s i n e h c i3 0 0 l 广m e t h i o n i n e 2 0 0 l - p h e n y l a l a l i n e 5 0 0 l 广1 1 1 r e o n i n e2 0 0 0 l - t y r o s i n e 3 0 0 a d e n i n e2 0 0 u r a d l2 0 0 l - h i s t i d i n e2 0 0 l - l e u c i n e1 0 0 0 四川i 大学硕士学位论文 二缺的d o ：不含t r y p t o p h a n ，l c u c i n e 的d r o p o u t t d o ：不含t r y p t o p h a n ，l c u c i n e ，h i s t i d i n e 的d r o p o u t q d o ：不含t r y p t o p h a n ，l c u c i n e ，h i s t i d i n e ，a d e n i n e 的d r o p o u t ( 4 ) l o x l i a c ( 1 0 0 m 1 ) l i a c , 2 h 2 0 1 0 2 0 9 d d h 2 0 5 0 m l 冰醋酸调 p h 7 5 d d h 2 0 定容 1 0 0 m l ( 5 ) 1 0 x t e ( 1 0 0 m 1 ) ： 啊s1 2 1g e d t a n a 2 2 h 2 0 0 3 7 9 d d h 2 0 8 0 m l 盐酸调 p h 7 5 d d h 2 0 定容 1 0 0 m l ( 6 ) 5 0 p e g ( i o o m l 、 l p e g 3 3 5 0 5 0 0 9 id d h 2 0 定容 1 0 0 m l 过滤灭菌 ( 7 ) p e g l i a c 溶液的配制( 1 m 1 ) ： 5 0 p e g 8 0 0 a 1 0 x t e 1 0 0 z l 1 0 x l i a c1 0 0 l 每次使用前新鲜配制 ( 8 ) 1 i x t e l i a c 溶液( 1 0 m 1 ) ： l o x t e 1 1 m l l o x l i a c 1 1m l 无菌d d h 2 0 7 8 m l 四川大学硕士学位论文 每次使用前新鲜配制 ( 9 ) h e r r i n g t e s t e sc a r d e rd n a ( 1 0 m g m 1 ) ： 使用前沸水中变性5 r a i n ，立即冰浴5 r a i n , 重复上述步骤一次 ( 1 0 ) z b u f f e r ( 1 l ) ： n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 2 1 5g n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 6 2 2g k c l0 7 5g m g c l 2 6 h 2 0 0 2 2 6g 无菌d d h 2 0 1l ( 1 1 ) x - g a l ： 溶解x - g a l ( 5 一b r o m o 一4 - c h l o r o - 3 i n d o l y lb - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) 于d m f ( n n 二甲基甲酰胺) 中，浓度2 0 m g r r d 2 0 避光保存 ( 1 2 ) z z b u f f e r 1 0 0 m l b 巯基乙醇 o 2 7 m l x g a l 储存液 1 6 7 m 1 用前新鲜配制 ( 1 3 ) b u f f e r i ： i s o r b i t o l0 9 m o 儿 le d t a 0 1 m o l l ( 1 4 ) b u f f e rl h l 喇。5 0 m m o l ll i e d t a2 0 m m o l li ( 1 5 ) b u f f e rl l h l 删sl o m l l l o l l l e d t al m i t i o l l ( 1 6 ) l b 培养基( 1 l ) ： 1 4 四川大学硕士学位论文 t r y p t o n e 1 0 9 y e a s te x t r a c t 5g n a c l 1 0 9 d h 2 0 至 1l 固体培养基需加入琼脂 1 5g ( 1 7 ) l b + a m p 培养基： l b 培养基+ l o o m g l a m p ( 1 8 ) s o b 液体培养基( 1 l ) ： 配制每升培养基应在9 5 0 m l 去离子水中加入： t r y p t o n e2 0 9 y e a s te x t r a c t5g n a c l 0 5g 灭菌前加入1 0 m l2 5 0 m m o l l k c l 溶液，滴加5 n n a o h 溶液( 约0 2 m 1 ) 调节p h 值至7 - 0 ，加入去离子水定容至1 l 使用前加入5m l 灭菌的 2 m o l lm g c l 2 溶液。 ( 1 9 ) t b b u f f e r ( 2 0 m 1 ) ： ( 2 0 ) s o l ( 2 1 ) s o i 1 mk a 4 0 m l 0 4 5 mm n c l 22 4 m l 0 5 0 mc a c l 20 6 m l k m e s ( p h 6 4 ) 0 5 m l d d h 2 0 1 2 5 m l 1 m t r i s c 1 ( p h8 o ) 2 5m l 0 5 me d t a ( p h 8 o ) 2 0m l 2 0 g l u c o s e ( 1 1 1 m ) 4 5m l d d h 2 0 定容至1 0 0 0m l 四川大学硕士学位论文 现用现配置，室温下使用 ( 2 2 ) s o l ( 2 3 ) r n a 提取： 4 mg u a n i d i n i u mt h i o c y a m t e 硫氢酸胍( 蛋白质强变性剂) 2 5 m ms o d i u mc i t r a t e 2 h 2 0 柠檬酸三钠 0 5 s o d i u ml a u r y ls a r c o s i u a t c 十二烷基磺酸钠 试剂盒( 1 ( i t 购自北京天为时代科技有限公司) 2 实验方法 2 1d n a b d g t s ( f c ) 和d n a - 即g t s ( c ) 载体的制备 2 1 1 引物设计 g t s ( f c ) ：拟南芥中谷氨酰t r n a 合成酶( a t g i u r s ) 的全长序列片段，全长为 2 6 k b g t s ( a c ) ：拟南芥中谷氨酰t r n a 合成酶( a t g l u r s ) 的n 端缺失序列片段； 全长为7 0 0 k b g t s1 2 9 fg a ，、t t c g c g g c c g c r r c c t g 戌r r r i ：n t g g c g t s1 2 9 rg a 椰c g c g g c c g c r r c c g g c a a g t c c 2 1 2g t s ( f c ) 片段的获得 2 1 2 1 大肠杆菌感受态细胞的制备 ( 1 ) 取0 5 m l 活化的大肠杆菌( 如d h 5 a ) 培养物于5 0 m l l b 中，1 8 c 振荡培养 1 8 2 4h ，使o d 6 0 0 约为0 4 。 ( 2 ) 培养物在冰上放置1 0 m i n ，倒入预冷的5 0 m l 离心管中，8 0 0 0r p m 离心 1 0 m i n 收集菌体。 四川大学硕士学位论文 ( 3 ) 加入1 5m l 已在冰上预冷的t b 缓冲液，混匀。冰上放置1 0r a i n ，3 0 0 0r p m 离心5 r a i n ，弃上清。 ( 4 ) 加入4 m l t b 缓冲液，轻轻混匀，加入2 8 0 川d m s o 使其终浓度为7 。 在冰上放置1 0m i n 。 ( 5 ) 将感受态细胞分装于e p 管中，每管0 1 0 5m l 。把细胞浸于液氮中至少 5m i n ，至8 0 保存。 其余大肠杆菌菌种的感受态制备过程仿上，以后不再赘述。 2 1 2 2 转化p g a d g t s ( f c ) 至大肠杆菌 将低温保存的干燥的质粒p g a d g t s ( f c ) 取少许溶解于缸l 的双蒸水 中存放于- - 2 0 ，备用。 ( 1 ) m lp g a j ) g t s ( f c ) 质粒加入2 0 0 z l d i - i s a 感受细胞中。冰浴4 0r a i n 。 ( 2 ) 4 2 水浴4 5s ( 时间过长容易导致菌死亡) 。立即冰浴5r a i n 。 ( 3 ) 在1 5 m l e p p e n d o f 管中加入7 0 0 , 1l b 液体培养基，3 7 c 摇床2 2 5 转分钟 培养1 小时。 ( 4 ) 离心后取1 0 ( 0 1 培养物涂布于l b a m p 的l b 固体培养基平板上，3 7 c 过 夜培养。 2 1 2 3 转化结果的检测 从平板上挑取白色菌落，接种到2 0 ( 0 1l b + a m p 液体培养基中摇菌培养。 用菌落p c r 法检测转化子。菌落p c r 所使用的上下游引物为g t s ( f c ) 特异 引物。 反应体系：1 蚴 t e m p l a t e ( 菌液) 劾l 2 5 m m m g c l 2 0 & d 1 0 x t a qb u f f e r 1 o “l 2 5 m md n t p1 “l 2 0 m m 上下游引物各1 0 u l d d h 2 0 5 0 “l 矿物油约2 0 u i 1 7 四川大学硕士学位论文 t a q 酶( 5 u p 1 ) 0 2 0 u l 反应参数： ( 1 ) 9 5 0 c 预变性3 m i n ( 2 ) 9 5 0 。c3 0 s 5 5 2 3 0 s 7 2 0 。c4 0s 重复3 5 个循环 ( 3 ) 7 2 延伸5n - f i n 。 2 1 2 4 扩增片断的检测 取靳l 扩增产物用1 0 的琼脂糖凝胶电泳检测 2 1 2 5 大量抽提p g a d g t s ( f c ) 质粒 苯酚氯仿异戊醇法： ( 1 ) 挑选单个菌落至5 0 m l l b 氨苄液体培养基中，并在3 t c 条件下摇活过夜 培养。 ( 2 ) 将菌液接种到1 0 0 0 m l 的l b 氨苄液体培养基，扩大培养 ( 3 ) 6 , 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，收集菌体，将离心管的管口向下放置在滤纸上， 让培养液滴干净。 ( 4 ) 用1 0m l 的溶液i 将细菌沉淀充分悬浮。 ( 5 ) 加入2 0 m 1 溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴5 m i n 。 ( 6 ) 加入1 5m l 预冷的溶液i ，轻轻颠倒混匀，冰浴5 m i n 。 ( 7 ) 1 1 ，0 0 0r p m 离心1 0 r a i n ，过滤收集上清。 ( 8 ) 加入3 0m l 异丙醇，充分混匀后于2 0 静置3 0 m i n 沉淀。 ( 9 ) 1 1 ，0 0 0r p m 离心3 0r a i n ，弃去上清液。加入5m ld d h 2 0 溶解沉淀。加入 弘lr n a s e ( 1 0m g m 1 ) 至其终浓度为1 0u l m l ，3 7 c 保温3 0 r a i n 。 ( 1 0 ) 加入等体积的苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，剧烈振荡，1 1 ，0 0 0 r m p 离 心5m i n ，轻轻取出上清液于干净离心管中。 ( 1 1 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，重复上步操作。 ( 1 2 ) 加入1 1 0 体积的3 m o l l 醋酸纳和2 倍体积乙醇，2 0 放置1 0 - 1 5m i n 1 b 四j t i 大学硕士学位论文 沉淀d n a 。 ( 1 3 ) 1 1 ，0 0 0r m p 离心5 m i n ；用7 0 乙醇洗涤沉淀2 次，自然或者3 7 干燥， 然后用t e ( p i j 8 o ) 溶解d n a ，并于2 0 c 保存。 s i l i c a 法： ( 1 ) 挑选单个茵落至5 0 m ll b 氨苄液体培养基中，并在3 7 c 条件下摇活过夜 培养。 ( 2 ) 将菌液接种到1 0 0 0 m l 的l b 氨苄液体培养基，扩大培养。 ( 3 ) 离心收集细胞沉淀物。 ( 4 ) 弃上清加入1 0 m ls o l u t i o ni ，充分振荡混匀。 ( 5 ) 加入2 0m ls o l u t i o n i i ，冰浴5 m i n 。 ( 6 ) 加入1 5m ls o l u t i o n l l i ，冰浴5 r a i n 。 ( 7 ) 4 c ，8 0 0 0 r p m 离心3 0 r a i n ，取上清。 ( 8 ) 加入6 0 m l 异丙醇，冰浴3 0 r a i n ，离心( 1 0 0 0 0 r p m ，3 0 m i n ) 。 ( 9 ) 弃上清，加入2 m l 0 1x t e 。 ( 1 0 ) 加入8 m l5m o l l l i c i 混匀。 ( 1 1 ) 1 0 0 0 0 9 ，1 0 r a i n 以除去r n a 。 ( 1 2 ) 转移上清，加入1 0 m lb i n dm i x ( 将一定量的s i l i c a 溶于1 0 m l4m o l l g u s c n + 4 t r i t o nx - 1 0 0 ) 。 1 0 0 r a gs i l i c a 对应1 0 0 m l 过夜培养物( 高拷贝) 。 2 0 r a gs i l i c a 对应1 0 0 m l 过夜培养物( 低拷贝) 。 ( 1 3 ) 培养3 r a i n ，再次混合，离心( 2 0 0 0 r p m ，