（环境工程专业论文）河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 中侥沧文 乃如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：z 易友羔7 苏时间：a 神多，年p 月j p 日 一鲐桫劾锄张等撕 签名日期：加；年0 5 月l 日签名日期：蒯年乡月 f 乒日 河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系 摘要 本文在2 0 0 5 年监测了河北某富营养化水库的理化因子，调查了“水华”期间水 、 体中叶绿素a ( c h l a ) 的变化情况。在查阅国、内外大量文献的基础上，优化了微囊 藻毒素m c ( - r r , y r , l r ) 分析方法，包括前处理过程和液相分析系统，建立了 一种可行的m c ( - r r ，y r ，l r ) 分析方法；同时，对水库进行了为期一年的3 种 m c s 变体时空分布的调查；借助s a s 8 1 统计软件，分析了水体富营养化的影响因 子及3 种m c s 与营养盐之间的关系；利用营养状态指数法进行了该水库富营养化评 价。结果表明： 1 ，从水体的理化指标分析，自1 9 9 0 年以来，水库水体富营养化逐年增加，至 2 0 0 4 年夏季，已经由中营养逐渐过渡到不同程度的富营养，2 0 0 5 年也呈现中营养到 不同程度的富营养状态。2 0 0 5 年4 月- - 6 月，水体呈中营养；7 月9 月，呈现中度 富营养；1 0 1 2 月，呈现轻度富营养。 2 、统计分析表明，2 0 0 5 年，与水库水体富营养化较密切的因子有t p 、t n 、 c o d m 。、水温( w t ) ，其次是p 0 4 p 和n i - h - n ，该水库的限制性营养元素并非唯一， 而是不同时期由n 或p 营养元素分别主导，4 月一7 月上句期间，p 是水库水体中的 限制性营养元素，7 月下旬一1 2 月，n 、p 是水库水体的限制性营养元素。 3 、从3 种m c 变体的时空分布分析，水库中m c 随季节的变化呈明显变化趋势， 同一时期，同一样点的3 种m c 含量有差别，特别是1 0 月和1 1 月，m c - r r 远高 于m c - y r 和m c - l r 。“水华”期间，水库中各样点的m c 分布不均；并且，各m c 变体在水体中出现、峰值及消失的时问也有所不同 4 、从3 种m c s 与c t d a 、a c d 关系上分析，调查期间，水库水体中c h l a 、a c d ( 藻密度) 和3 种m c s 变体总体变化趋势一致，m c s 峰滞后于c h l a 和a c d 峰； 5 、从3 种m 与营养盐关系上分析，2 0 0 5 年4 月- 7 月上旬，3 种m c s 变体与 t p 、n 0 3 n 呈现明显的正相关，而与n i - h - n ，p 0 4 - p 呈现明显的负相关；7 月下旬 一1 2 月，m c - l r 与t n 呈现正相关，与n h 4 - n ，p 0 4 p 呈现负相关；m c - y r 与t p ， n h 4 - n ，p o a - p 呈负相关，而m c - r r 与t p 呈现正相关，与t n t p 、n 0 3 n 呈现负 相关。水体中营养盐含量高低，可能会影响藻类细胞释放出来的每种毒素变体的比 率，从而造成3 种m c s 变体含量在同一时期有明显差异。 关键词：微囊藻毒素富营养化水华营养盐岭回归水体 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光 2 0 0 6 年6 月 a b s t r a c t p h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw e r ea n a l y s i e di n c e r t a i ne u t r o p h i c a t i o nr e s e r v o i r , h e b e ip r o v i n c e ，a n dc h l ac o n c e n t r a t i o nv a r i a t i o nw a s i n v e s t i g a t e di nt h er e s e r v o i rd u r i n g a l g a lb l o o m si n2 0 0 5 t h ed e t e c t i n gm e t h o do fm i c r o c y s t i n ( m c ) c o m p o u n d si n c l u d i n g p r e t r e a t m e n tp r o c e s sa n dh p l cs y s t e mf a c t o r sw a so p t i m i z e db yr e f e r r i n gd o m e s t i ca n d o v e r s e a sl i t e r a t u r e s ，a n daf e a s i b l em ca n a l y s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e d m e a n w h i l e ， y e a r r o u n ds p a t i a ld i s t r i b u t i o na n dt e m p o r a lv a r i a t i o no fm cc o m p o u n d sw e r e i n v e s t i g a t e di nt h er e s e r v o i r b e s i d e s ，t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r sa b o u te u t r o p h i c a t i o nw a t e r c o l u m na n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm c sa n dn u t r i e n tl e v e l sw e r ea n a l y z e dw i t hs a s 8 1 s t a t i s t i cs o f t w a r e t h ee u t r o p h i cl e v e lo ft h er e s e r v o i rw a sa s s e s s e db yt s i ma n dt h e r e s u l t sw e r es h o w e db e l o w ： 1 f r o m1 9 9 0 ，r e s e r v o i re u t r o p h i c a t i o nw a sa g g r a v a t e dg r a d u a l l yy e a rb yy e a r , t o s u m m e ri n2 0 0 4t h er e s e r v o i rh a db e e no nm e s o - e u t r o p h i cs t a t e i n2 0 0 5 ，t h er e s e r v o i r a l s os h o w e dd i f f e r e n t t r o p h i c l e v e l e v e r ys e a s o n , m e s o t r o p h i c i n a p r i l - j u n e ， m e d i e u t r o p h i ci nj u l y - s e p t e m b e r , a n dl i g h t e u t r o p h i ci no c t o b e r - d e c e m b e r 2 s t a t i s t i ca n a l y s i ss h o w e d ，t h er e s e r v o i re u t r o p h i cd e g r e eh a dc l o s er e l a t i o n s h i p w i t ht p , t n , c o d ma n dw t ，t h e ns e c o n d a r yp 0 4 - pa n dn h 4 - n t h el i m i t e dn u t r i e n t f a c t o r so ft h er e s e r v o i re u t r o p h i c a t i o nw a sn o ts i n g l e ，a n dt h ee u t r o p h i cl e v e lw a s d o m i n a t e db yna n dp r e s p e c t i v e l yi nd i f f e r e n tp e r o i d s i na p r i lt ot h ef i r s tt e nd a y so f j u l y , pw a st h el i m i t a t i o nn u t r i e n t w h i l eb o t hn a n dpw e r el i m i t a t i o nn u t r i e n t sd u r i n gt h e l a s tt e nd a y so f j u l yt od e c e m b e r , 2 0 0 5 3 t h et e m p o r a l s p a t i a ld i s t r i b u t i o no fm c sd e m o n s t r a t e dt h a tm c sc o n c e n t r a t i o n si n t h er e s e r v o i rc h a n g e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h et i m ec h a n g i n gi n2 0 0 5 t h r e ek i n d so fm c c o n c e n t r a t i o n si nt h er e s e r v o i rw e r eo b v i o u s l yd i f f e r e n ta ts a n l ep e r i o da n dl o c a t i o n , a n d m c - r rc o n c e n t r a t i o nw a sm u c hh i g h e rt h a nm c - y ra n dm c - l r ，e s p e c i a l l yi no c t o b e r a n dn o v e m b e r d u r i n ga l g a lb l o o m s ，m c sc o n c e n t r a t i o n sw e r en o tw e l l - p r o p o r t i o n e da t e v e r yl o c a t i o ni nt h er e s e r v o i r , a n dt h et i m ef o ra p p e a r a n c e s ，p e a k sa n dd i s a p p e a r a n c e so f e a c hm ci nt h er e s e r v o i rw e r ed i f f e r e n t 4 c h l ac o n c e n t r a t i o na n da c di nw a t e rc o l u m nh a dt h es i m i l a rc h a n g i n gt r e n dw i t h m c s ，w h i l et h et i m ef o rm cp e a kv a l u eo c c u r r e n c el a g g e db e h i n dt h a tf o rc h l aa n d a c d 5 、f r o mt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm c sc o n c e n t r a t i o n sa n dn u t r i e n t sl e v e li nw a t e r , i t c o u l db ef o u n dt h a tt h e s et h r e ek i n d so fm c s c o r r e l a t e dp o s i t i v e l yw i t ht pa n dn 0 3 n ， a n dn e g a t i v e l yw i t hn i - 1 4 - n jp 0 4 - pf r o ma p r i lt ot h ef t r s tt e nd a y so fj u l y , 2 0 0 5 t h e n f r o mt h el a s tt e nd a y so fj u l yt o d e c e m b e r , m c l rc o r r e l a t e dp o s i t i v e l yw i t ht n ， 2 河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之问的关系 n e g a t i v e l yw i t hn h 4 - n , p 0 4 - p ，w h e r e a sm c y rc o r r e l a t e dn e g a t i v e l yw i t ht p , n h 4 - n ， p 0 4 p ，a n dm c r rc o r r e l a t e dp o s i t i v e l yw i t ht p , n e g a t i v e l yw i t ht n 厂r en 0 3 一n t h e n u t r i t i o nl e v e li nw a t e rp r o b a b l yc o u l da f f e c td i f f e r e n tk i n do fm c sr a t i o ss e c r e t e db y a l g a lc e i l s ，w h i c hf u r t h e r l yc a u s et h r e ek i n d so fm c sc o n c e n t r a t i o n si nt h er e s e r v o i ri s d i f f e r e n ta tt h es a m et i m e k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i n ( m c ) ；e u t r o p h i c a t i o n ；a l g a lb l o o m s ；n u t r i t i o n ；r i d g er e g r e s s i o n ； w a t e rc o l u m n 3 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光2 0 0 6 年6 月 4 河北某水库徽囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系 1 引言 1 1 国内外研究进展 1 1 1 微囊藻毒素的产生 微囊藻毒素( m c ) 是蓝藻毒素中的一类。蓝藻毒素是细胞内毒素，在细胞内合 成，细胞破裂后释放出来，并表现出毒性。这些毒素大多是抗生素、免疫抑制物以 及一些对动植物有毒物质( d i t t m a n nc ta 1 ，1 9 9 7 ；s u g a n u m aa n dm a r a h i e l ，1 9 9 5 ) 。根 据人类被影响的生理系统，器官，组织和细胞，蓝藻毒素可分为肝毒素，神经毒素， 细胞毒素和刺激肠胃的毒素( c o d de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。目前，研究较多是微囊藻毒素，它 属于肝毒素，由微囊藻，鱼腥藻，念珠藻和颤藻等产生。微囊藻毒素产生的机理基 本有很多假设，一般认为有两种因素起重要作用，一是遗传差异即微囊藻的有毒株 和无毒株的遗传结构不同( d i t t m a n ne ta 1 ，1 9 9 6 ；b o m e r , 1 9 9 8 ；陈月琴等，1 9 9 9 ； m e i l 3 n e r , 1 9 9 6 ) ；另一种是环境因子影响促使其改变其毒性( w a t a n a b e ，1 9 9 6 ；u t k i l e n a n d g j f l m e ，1 9 9 8 ；o r ra n dj o n e s ，1 9 9 8 ；l u k a ea n d a e g e r t e r , 1 9 9 8 ) 。 ( 1 ) 环境因子对微囊藻毒素产生的影响 ( 卜1 ) 光照 光照是蓝藻进行光合作用的必要条件，光照的时间和强度会影响藻类的生长率， 代谢率，从而引起藻毒素的产生和释放。研究表明，当光强在1 5 4 5 j i ，m 2 s ) 以下时， m a e r u g i n o s am - 2 2 8 株随着光照强度从1 5 5 1 鲋( m 2 s ) 增加到6 2j ( m 2 s ) ，毒性会增加 4 倍( w a t a n a b ea n do i s h i ，1 9 8 5 ) 。而v a nd e r w e s t h u i z e n 和e l o f f ( 1 9 8 5 ) 使用4 3 3 - 4 2 2 3 j ( m 2 s ) 光照，发现对细胞毒性的影响甚微，而在最低光强和最高光强时，毒性最低。 u t k i l e na n dg j f i m e ( 1 9 9 2 ) 认为，光是毒素产生的一个重要制约因子，温度在高光强 下对毒素的产生几乎没有影响，只有低光强下温度才影响毒素的产生光强由4 1 2 j ( m 2 s ) 增加到8 2 4 j ( m 2 s ) 时，m a e r u g i n o s ac y a 2 2 8 1 株的细胞内毒素与蛋白质质量 比增加了2 5 倍，表明在此光强范围内，毒素的合成速度大于总的蛋白质合成速度， 光强继续增加，毒素产率不再上升。对从滇池分离出m v i r i d i s 进行培养，发现在1 5 时，光强对毒素的产生没有显著影响；而在2 5 时，具有很好的负相关性，当光 强为3 0 9j ( m 2 s ) ，干细胞得到最高的毒素产率( 3 1 3 # g ( g 干细胞) ) ，当光强为2 0 6 j ( m 2 s ) 时，则毒素产率为1 9 7 “吕隽干细胞，表明毒素的生成也受光强和温度的控制 ( s o n g e t a l ，1 9 9 8 ) 。m c 在藻体中的毒素含量因环境条件和藻类的不同生长阶段而 变，相对来说，低光强和低温可以使藻细胞中的m c s 含量增加( r a p a l aa n ds i v o n c n ， 5 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光2 0 0 6 年6 月 1 9 9 8 ) 。因此，在一定的光强范围之内，毒素随着光强的增加而增加，超过一定的光 强范围，毒素的产生和光强就没有太大的关系。 ( 卜2 ) 温度 一般认为，温度升高会加速藻类细胞的代谢过程。g o r h a m ( 1 9 6 4 ) 发现 m a e r u g i n o s 口n r c - 1 株的培养液在2 5 比3 2 5 时的毒素浓度高1 0 倍( g o t h a m ， 1 9 6 4 ) ；何振荣等( 1 9 9 0 ) 在研究m a e r u g i n o s a 脱j 静i 株时，发现在2 5 时毒性最低， 此时的细胞增长比较快，说明m a e r u g i n o s a 在合适的生长温度下，产毒很低。 h a r t b e e s p o o r t 水库( w i c k sa n dt h i e l ，1 9 9 0 ) 中，m a e r u g i n o s a 产生的最大毒素浓度 出现在夏季，表面水温为2 7 c ，冬季最低温度1 3 时，仅监测到最低浓度的毒素 w a r a n a b ea n do i s h i ( 1 9 8 5 ) 在研究s u w a 湖的微囊藻水华时，观察到7 、8 月份水体 中毒性最高。 世界上不同地区所发现的m c 主要类型也不相同，一般在欧洲温度较低的地方， m c - l r 是主要的类型，但在亚洲温度较高的地区，m c - r r 是主要的类型。r a p a l a 和s i v o n e n ( 1 9 9 8 ) 研究了固氮水华鱼腥藻产毒的条件，发现在2 5 以下时主要产 生m c - l r ，在温度高于2 5 时主要产生m c r r 。至今，关于温度与蓝藻毒素产生 的影响机理不能确定。不同温度时，产生的毒素种类和浓度不同，相同温度下，不 同藻种之间产生毒素的浓度也不同，关于这方面的研究还要做大量的工作。 ( 卜3 ) 营养元素 营养元素对藻毒素的产生也有一定的影响。例如氮，磷及一些微量元素是蓝藻 生长必需营养，对蓝藻的生长代谢起到一定的作用。若营养元素在微囊藻毒素生长 所需的条件范围内，藻的生长与毒素生成量会随营养元素含量的升高而增加。有些 微量元素对藻的生长及毒素生成也有一定影响。 o h 等( 2 0 0 0 ) 的研究表明，m c 产生速率与铜绿微囊藻特定成长率之间有较好 的正相关关系，并观察到磷浓度的降低可以促进m c 的产生s i v o n e n ( 1 9 9 0 ) 研究 了颤藻产毒的条件，发现氮浓度升高会刺激m c 的产生。另外，在o 1 m g l 到0 4 m g l 的范围内，随磷浓度增加产生m c 的量也增加，但更高磷浓度促进m c 产生的效应 却不明显。l e e 等( 2 0 0 0 ) 发现氮磷比为1 6 ：1 时，铜绿微囊藻u t e x 2 3 8 8 产生m c 的量最大，藻细胞中c h l a 含量与m c 含量之间有较好的正相关关系。将m a e r u g i n o s a n r c - 1 在b g - h 培养基中培养，将培养基中的硝酸盐减半，或磷酸盐加倍，毒性增 加了近一倍，将营养液中铁盐减半，钠盐加倍，或将镁盐增加2 倍，毒性都增j i ( w i c k s a n d t h i e l ，1 9 9 0 ) 。连民等( 2 0 0 1 ) 研究了不同浓度的氮，磷，铁，锌对h g z 培养基 中的m a e r u g i n o s an i e s - 9 0 产毒株的生长及产毒的影响。结果表明，氮，磷，铁， 锌可改变产毒株的产毒特性，高浓度的氮( 1 6 2 4 5 1 i n g l ) 有利于有毒株和无毒株 的生长，也对有毒株的产毒有促进作用。磷，锌对产毒株的产毒情况不敏感，但是， 产毒株的毒素却随铁离子浓度升高而缓慢上升。l u k a ea n da e g e r t e r ( 1 9 9 3 ) 在研究 6 河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系 微量元素的影响时，舢，c d ，c r ，c u ，m n ，n i 和s n 对毒素的产生无影响，而f c ，z n 影 响极明显，在b g - 1 1 培养基中，降低f c 和z n 的浓度都会明显促进毒素的产生。 ( 卜4 ) 其它环境影响因子 微囊藻毒素产生和含量与其它环境因子，如水体p h 值和腐殖质等环境因子也 有关系( j o n e sa n do r r , 1 9 9 4 ；o h k u b oc ta 1 ，1 9 9 8 ) 。有人研究鱼腥藻产毒条件时，发 现培养基的p h 低于7 或者高于9 2 时有助于m c 的产生( r a p a l aa n d s i v o n e n ，1 9 9 8 ) 。 毒素产生也可能受其能量状态即腺苷酸能荷控制。影响腺苷酸能荷的因素，能量和 毒素合成的相互关系可表示为：每合成i m o l 毒素需消耗n m o la t p ( b i c k e le ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。也有人认为( o r ra n dj o n e s ，1 9 9 8 ) ，微囊藻细胞的分裂速度与微囊藻毒素的 产生具有普遍的线性关系，并认为环境因素是通过影响微囊藻细胞的分裂速度来控 制微囊藻毒素的产生。然而，从铜绿微囊藻染色体中分离出了产生m c 的d n a 片 段m c y ，凡是能够产生m c 的藻种都含有m c y 基因，但不产生m c 的藻种有的也含 有m c y 基因( d u y e ta 1 ，2 0 0 0 ；林毅雄等，2 0 0 1 ) ，这说明外界理化因子的改变可以调 节和控制m c y 基因的表达( 陈刚等。1 9 9 6 ) 。南非h a r t b e e s p o o r t 水库中溶解氧含量， 与铜绿微囊藻毒素含量呈正相关，而水体表面c h l a 含量则与细胞内毒素含量呈负相 关( f r c y s h o v , 1 9 8 3 ) 。尽管许多的科学家在研究环境因素对藻毒素产生的影响方面 做了大量的工作，然而，却仍然不知道环境因素是如何影响毒素的产生。所以，关 于这方面的研究还有待于进一步研究和证实。 ( 2 ) 遗传因素对微囊藻毒素产生的影响 一些学者认为，微囊藻有毒株和无毒株毒性是由遗传决定的。对微囊藻的遗传 结构进行研究的结果表明，微囊藻毒素的合成是由毒素肽合成酶多基因控制的，并 由肽合成酶复合体合成( 非核糖体合成的多肽) 。肽合成酶及其编码基因在多种微生 物( 如某些藻类、细菌和真菌) 中存在，并控制多种生物活性小肽的合成。 m e i b n e r 等研究了有毒和无毒m c 之间的关系。他们检测了m c 的4 7 个菌株的 1 6 s 到2 3 s 核糖体d n a 内转录间隔序列，对m a e r o g i n o s a p c c 7 8 0 6 的d n a 序列顺 序分析研究发现，这种产毒的微囊藻含有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中 至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有这些基因( m e i b n e rk e t a 1 ， 1 9 9 6 ) 。 随着人们对细胞内复杂生化反应及其基因控制等知识的积累，众多学者也在蓝 藻产m c 方面进行了大量研究，总体来说在蓝藻为什么会产生m c 方面还有待于进 一步研究，而微囊藻毒素的合成将是今后的研究热点之一。 7 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光2 0 0 6 年5 月 1 1 2 微囊藻毒素的结构 目前，在国、内外研究中，发现蓝藻毒素中的微囊藻毒素种类是最多的。能够 购买到的m c 标准品主要有m c - l r 、m c - r r 和m c y r - - 种类型，因此对于m c - l r ， m c r r 和m c - y r 三种微囊藻毒素的研究比较多。下面就介绍微囊藻毒素的结构以及 其它蓝藻毒素的种类及其特点( 表1 1 ) ( c a r m i c h a e l ，1 9 9 7 ；c o d d ，2 0 0 0 ；f a l c o n e r , 1 9 9 8 ； h u n p a g ee ta 1 ，2 0 0 0 ；s h e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 表1 - 1 藻毒素的种类和结构特点 ：! 垒垒! ! ! ：! 璺旦! ! ! 竺! 坐! 塾! 竺! 丝! 竺竺! ! ! ! 坐! 坚! 呈 藻毒素类型代表种类 结构特点致毒方式产生藻种 m c 是环状七肽化合物，分子量大约为1 0 0 0 ，基本结构是：环- d - 丙氨酸l ，x 赤- 甲基异天冬氨酸山乙a d d a d 异谷氨酸n 甲基脱氢丙氨酸主要包括：1 ，d 谷 氨酸；d 丙氨酸；d - 赤b 甲基天冬氨酸；n - 甲基脱氢丙氨酸；一个特殊的含2 0 个c 原子的氨基酸；( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) - 3 氨基9 甲氧基2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基4 e ，6 e - 二烯酸。由于7 个位置上的氨基酸结构的变化，导致蓝藻毒素有不同的种类。然而， 通常导致毒素结构不同的主要是一些基团的甲基化和2 个l 氨基酸的不同( 分别用 x 、z 标明) ，氨基酸缩写用来表示不同微囊藻毒素，例如在这些位置上为亮氨酸和 8 河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系 精氮酸的毒素简称为m c - l r 。目前，已经发现的蓝藻毒素有7 0 种以上( h i t z f e l de ta 1 ， 2 0 0 0 ；s i v o n e na n dj o n e s ，1 9 9 9 ；m c e l h i n e ya n dl a w t o r t , 2 0 0 4 ) ，它们的基本结构被列在 图1 - 1 ( m c e l h i n e ya a d l a w t o n ，2 0 0 4 ) 。现在，研究最多的，也是毒性比较大的m c 有 3 种，即m c - l r ，m c - r r ，m c - y r ( 其中kry 分别代表亮氨酸，精氨酸和酪氨 酸) ，而且，发现a d d a ( 5 ) 和g l u ( 6 ) 两个氨基酸是藻毒素的毒性所必需l 拘( s i v o n e n , 1 9 9 6 ； a na n dc a r m i c h a e l1 9 9 4 ) 。微囊藻毒素只存在于微囊藻，鱼腥藻，念珠藻和颤藻等蓝 藻中。有报道称，在软管藻中也发现有微囊藻毒素( s i v o n e n , 1 9 9 6 ) 。 图1 - 1 微囊藻毒素的一般结构 f i g 1 - 1g e n e r a ls t r u c t u r eo fm i c r o c y s t l nw h e r exa n dzr e p r e s e n tv a r i a b l ea n m l n o r e s p e c t i v e l y 1 1 3 微囊藻毒素的性质及其降解 由于环状结构和共轭双键的存在，m c 性质较稳定，易溶于水、甲醇等，可在 水温介于1 5 3 0 ，p h 介于6 - 9 的富营养化水体中常年存在，具有热稳定性，加 热煮沸( 水浴1 0 0 ，3 0 m 蛐不致丧失毒性，能耐3 0 0 的高温，自来水的混凝沉淀， 过滤加氧等不能破坏其结构，不易为真核生物和细菌肽酶分解，可在水生生物中富 集。 一般普通的蛋白水解对m c 不起作用( p o u r i ae ta 1 ，1 9 9 8 ) ，其在阳光下很稳定， 但是当有色素存在时，阳光照射容易使毒素降解和异构化。在5 m g m l 的蓝藻色素 存在时，m c l r 的光解半衰期为5 a c r s u j ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ，色素存在下的光解作用是 m c 天然条件下消毒的途径之一。在一定强度日光照射下，m c - l r 降解与色素浓度 呈明显正相关，在仅有日光照射而不存在色素时，毒素分解很微弱，而在荧光照射 下则根本不发生分解( 弧u j ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。m c 的降解速率也随着紫外的强度增加而增 加，l o m g l m c - l r 在2 5 5 0 w e r a 2 强度的u v 照射下，1 0 m i n 即完全降解( _ r s u j ie ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 在自然条件下，m c 可生物降解，主要是水体中的细菌s p h i n g o m o n a s s p 降解 m c ( b o u r n e e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。在好氧条件下，草履虫对m c 的降解起重要作用( 吕锡武等， 9 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光2 0 0 6 年5 月 1 9 9 9 ) 。m c 和节球藻毒素也可能通过抑制蛋白磷酸酶，从而使细胞内的中间丝和微 丝因过量磷酸化而解聚( c a r m i c h a e l ，1 9 9 4 ) 。水中有机物也能促进藻毒素的降解，有 机物含量高，降解将加快。溶解氧则一方面抑制蓝藻的生长，一方面可促进耗氧微 生物的生长而有利于藻毒素的降解。c o u s i n s 等( 1 9 9 6 ) 发现，天然水体中的m g - l r 可在一星期内大部分降解，而在去离子水中则可稳定保持2 7 d 以上，灭菌天然水则 是1 2 d 。这些微生物对微囊藻毒素的降解作用随水体、气候条件和藻毒素初始浓度 的不同而有所变化( 1 _ a me ta 1 ，1 9 9 5 ) 。有报道表明，m c 能够在干燥的藻渣中存在6 个月，重新润湿后，它们就释放到了周围水体中( n a g a ie ta 1 ，1 9 9 6 ) ，水华达最大水 平和自溶时，大部分的水溶性毒素释放于环境中，此时存在于固形物( 包括藻和其它 微生物) 中的藻毒素量与存在于水中的藻毒素量呈反向变化关系( 徐立红等，1 9 9 7 ) 。 神经毒素不稳定，自然条件下能迅速降解为无毒产物( b o u r n ee ta l ，1 9 9 6 ) 。光和 碱性环境能导致鱼腥藻毒素a 迅速降解，高光强下，鱼腥藻毒素a 的降解呈一级动 力学，半衰期为1 2 h ；石房蛤毒素和新石房蛤毒素在p h 2 - 4 的热酸中仍很稳定，但随 d h 升高逐渐变得不稳定。 1 1 4 微囊藻毒素的危害 关于藻毒素引起的鸟类、鱼类、家畜家禽及宠物中毒、死亡的事件发生的很多。 其中以微囊藻水华的危害最严重，通过直接接触或饮用含有微囊藻毒素的水可以使 动物中毒( c a r m i c h a e l ，1 9 9 6 ) 中毒症状主要有昏迷，肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻， 甚至在数小时以至数天内死亡，主要原因是微囊藻毒素造成肝内出血，甚至肝坏死 微囊藻毒素能导致鱼的蛋白磷酸酶活性下降和谷光肝肽的内源性消耗，可使鱼 和两栖类动物从卵裂到胚胎发育的时间发生改变，甚至可以对胚胎产生致畸作用( 徐 立红等，1 9 9 8 ) 。在1 9 9 6 年，饮用蓝藻污染的池塘水后，1 7 5 头牛有2 4 头中毒死亡( 施 玮和朱惠刚。2 0 0 0 ) 。南非等地也出现牛、羊等动物饮用爆发水华的池塘水、河水而 引起肝脏病变并导致死亡的事件微囊藻毒素对小鼠免疫功能有明显的抑制作用， 经腹腔或静脉注射m c - l r 染毒大鼠和小鼠，在不同品系、年龄和生理状态等条件 下，其l d s o ( 半致死剂量) = 1 0 9 m g k g ，经呼吸道染毒大鼠时，其l d s o - - 4 3 p g k g ，肝 脏中的蛋白磷酸酯合成酶1 ( p p l ) 、蛋白磷酯酸合成酶2 a ( p p 2 a ) 受抑带r j ( m i u r a e t a 1 ，1 9 9 1 ；y u a ne ta 1 。1 9 9 9 ) 。f a w e l l 等( 1 9 9 9 ) 在研究了m c - l r 对小鼠的急性毒性实验 后，也指出口腔染毒比腹腔注射染毒的毒性要低3 0 1 0 0 倍。l i u 等( 2 0 0 2 ) 发现， 泥鳅卵发育阶段对m c - l r 最敏感，主要表现为心脏发育异常，小头和身体弯曲， 并发现心脏和肝是m c u t 的主要攻击目标如果给贻贝( m y t i l u se d u l i s ) 投喂含 m c 的蓝藻可导致其死亡( w i l l i a m se ta 1 1 9 9 7 ) 。 m c 对植物芥菜的生长及其蛋白磷酸酶活性也有抑制作用( k u r k i h e l a s m oa n d 1 0 河北某水库微囊藻毒素时空分布及其与营养因子之间的关系 m e r i l u o t o ，1 9 9 8 ) 。在芥菜种子的发育过程中，培养基中5 0 z g m l 的m c - l r 即可造 成其发育畸形，i c 5 “半数抑制浓度) 为0 即g m l ：对磷酸蛋白酶的抑制也有很好的相 关性。m c e l h i n e y 等( 2 0 0 1 ) 发现m c - l r 对茄属植物的生长和豆类植物根的发育也产 生不良影响。 m c 对人类直接造成危害的途径也很多，直接途径有：饮用水、娱乐水、血液 渗透；间接途径如食物等。在湖泊、河流、水库中进行游泳等娱乐活动，会引起皮 肤、眼睛过敏，发烧，疲劳以及急性肠胃炎。经常暴露于含有毒素的水体，会引发 人患皮肤癌、肝炎及肝癌。饮用含有m c 水的人群肝癌发病率明显高于饮用深井水 者( y ue ta l ，1 9 8 9 ) ，我国江苏海门、泰兴地区是原发性肝癌高发区，用流行病学方法 研究慢性暴露于藻毒素与人群肝病的关系，发现引用沟塘水的人肝癌发病率是饮用 深井人群的8 倍，而在沟塘水中也检出了微囊藻毒素( y ua n dc h e n , 1 9 9 4 ) 。1 9 9 6 年， 在巴西发生了一起严重的医疗事故中，证实了微囊藻毒素急性中毒的危害，其中6 0 人死l 三( p o u r i ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。英国士兵在r u d y a n d 湖训练接触有毒蓝藻后，出现面部 皮炎，口部疱疹和哮喘等症状( t u r n e r , 1 9 9 0 ) 。人类还可能通过植物及其海产品摄入 藻毒素，如采用含蓝藻水华及其毒素的水灌溉农作物，毒素可以进入农作物体内， 进而危害人类健康；还有服用含有蓝藻细胞的食品增强剂，也是暴露于蓝藻毒素的 途径之一因此，收获蓝藻的区域，应选择在经过短期和长期生物测试后证实不存 在已知毒素的水体中。目前，国际上已经认识到，建立食品增强剂原料中蓝藻毒素 检测系统的必要性 m c 毒理作用的主要靶器官为肝脏随着有关m c 毒性的研究进展，也有许多 器官毒性、遗传毒性和致癌毒性的相关报道。有研究表明m c 对脾脏、肾脏有一定 的毒性，有些亚型的m c 对有神经毒性或免疫抑制和刺激作用等( f a w e l le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 1 5 微囊藻毒素的分离检测方法 ( 1 ) 微囊藻毒素的提取 当前，有大量分析方法可以用来进行m c 的检测，这些方法不但能够定量测定 样品中的藻毒素，而且还能分析出不同藻毒素的分子结构。然而，对样品藻毒素的 提取会影响任何一种藻毒素分析方法的效率。目前，科学家们用得比较多的一些提 取m c 的溶剂包括：5 醋酸，甲醇，酸化的甲醇或者正丁醇甲醇水( 5 ：2 0 ：7 5 ) ( i - i a r a d a , 1 9 9 6 ) 。由于5 0 8 0 的甲醇水溶液的极性范围较广0 。a w t o na n de d w a r d s ，2 0 0 1 ) ，在进 行不同微囊藻毒素的提取时，逐渐被大量的学者应用。有些样品提取出来的m c 浓 度比较低，在进行藻毒素分析前，必须进一步浓缩和纯化。很多分析方法在检钡4 水 中痕量微囊藻毒素方面，灵敏度不高，所用溶剂可能会提取出更多的其它复杂混合 物，会干扰分析，特别是环境中水样和生物样品的检测更是如此因此，用c 1 8 或 1 1 中国武汉华中农业大学硕士研究生毕业论文杨旭光2 0 0 6 年5 月 者免疫亲和固相萃取柱进行预处理，浓缩样品。 ( 2 ) 微囊藻毒素的分析 目前，分析检测经预处理的样品中的m c 含量及类型，通常有生物分析，化学 分析以及生物化学分析3 种方法。 ( 2 一1 ) 生物分析 生物分析一般采用小鼠或植物来评价m c s 的毒性，用纯化的m c 或蓝藻水华中 粗提藻毒素进行测试，此外，还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评 价研究此种方法应用甚广，可以检测到未发现的毒素，但缺乏特异性，比较耗时， 灵敏度较低，且不能定量。h e s s e 等( 2 0 0 1 ) 利用藻毒素诱导鲑鱼和大鼠的原代肝细胞 死亡能力为参数检测m c - l r ，节球藻毒素，与腹泻性贝毒素复合物相关物质( 大田 软海绵酸，d i n o p h y s i s t o x i n 1 ，p c c t c n o t o x i n 1 ) 及c a l y c u l i na 。 ( 2 - 2 ) 化学分析法 化学分析方法主要是采用色谱分析方法，常用的有薄层色谱( t i c ) 、气相色谱 ( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 和液相色谱，质谱( l d m s ) ( h a r a d a ，1 9 8 s ) 。气相 色谱只能测定m c 总量，薄层色谱易于操作，不需特殊设备，耗时少，可达纳克级 的检测水平。高效液相色谱是应用最广泛的一种检测方法，它可以准确地定性、定 量检测微囊藻毒索，也可以用于微囊藻毒索的分离、纯化，紫外检测器是是i 珏i _ c 应用最普遍的检测器，m c 的最大吸收波长是2 3 8 n m ( h a r a d a , 1 9 9 1 ) ，也有报道为2 3 9 n m ，2 4 0 r i m 。h p l c 法通常可达纳克级的检测水平，改进的方法甚至可达匹克级。 h p l c 与质谱及核磁共振联用可确定m c 分子式和结构。h p l c 检测技术往往需要 标准毒素，而耳前发现的7 0 多种m c 中，多数缺乏标准毒素，只有m c - l r ，m c - y r , m c - l r 这3 种常见毒素的标准品，这就制约了h p l c 的进一步应用。l c m s 技术 很好解决了这一问题，即使没有标准毒素，只要知道这种毒素的分子量，就可对其 进行定性，而且l c m s 技术也可对毒素进行精确的定量分析( p o o nc ta 1 ，1 9 9 3 ) 。快 速原