（化学工艺专业论文）利用开孔明胶固定化啤酒酵母生产atp的研究.pdf

广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化啤酒酵母生产a r p 的研究 利用开孔明胶固定化啤酒酵母生产a t p 的研究 摘要 利用固定化酵母催化一磷酸腺苷( a m p ) 磷酸化生成三磷酸腺苷( a t p ) 是 最有工业前景的a t p 生产方法之一。该法的中心内容包括：稳定的细胞质 量、适宜的固定化形式、适宜的反应操作条件等。本文对酵母的培养条件、 开孔明胶固定化细胞的制备条件以及a t p 生产的反应条件进行了较深入的 探讨和试验研究。此外还建立了a t p 分离与提纯的实验方法，并通过实验 考察了发酵液的a t p 回收率、成品a t p 的纯度以及a t p 的实际产率。 首先选用了一株转化率较好但稳定性差的酵母菌株，对扩培培养基中 的蔗糖蜜、蛋白胨、呷4 ) 2 s 0 4 、k h 2 p 0 4 四种因素不同浓度水平进行正交实 验，研究其对培养酵母菌浓及a t p 转化活性的影响，确定了用于a t p 生产 的酵母细胞培养工艺的较佳配方，其结果为：m ( 蔗糖蜜产1 2 ，历( 蛋白胨户 o 7 0 ，m ( k h 2 p 0 4 户o 1 5 ，m ( ( n h 4 h s 0 4 ) = o 2 5 。实验还确定了该啤酒 酵母适宜的扩大培养时间是1 4 - 2 0 d x 时。 研究了开孔明胶固定化啤酒酵母细胞的制备条件，结果表明1 5 的明胶 和2 的海藻酸钠形成的复配胶包埋1 0 的啤酒酵母细胞制备成的固定化颗 粒经2 戊二醛交联l t j s 时具有较高的磷酸化活性。 利用该固定化颗粒研究了酵母酶系生产a t p 的反应机理，考察了多种 因素对a t p 转化情况的影响，结果表明用开孔明胶包埋啤酒酵母制成的固 定化细胞，在含有1 5 9 l a m p ，葡萄糖1 5 0 m m o l l ，硫酸镁1 6 m m o l l ，p n 7 0 的磷酸缓冲液2 5 0 m m o l l 中3 5 振荡反应2 小时，a t p 转化率可高达9 5 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶周定化啤酒酵母生产a 1 p 的研究 以上。底物溶液灭菌和添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + ) 后，该固定化酵 母细胞可反复使用1 0 次，a t p 的转化率稳定维持在9 0 以上。 通过a t p 分离与提纯的实验，得出发酵液的a t p 平均回收率为7 2 3 ， 平均成品纯度为9 2 3 ，平均产品实物产率为1 0 2 3 。 关键词：5 。三磷酸腺苷固定化啤酒酵母细胞开孔明胶 ， 。 i i 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶固定化啤酒酵母生产a t p 的研究 a t pp r o d u c t i o nb y b e e ry e a s tc e l l si m m o b i l i z e d i no p e np o r eg e l a t i nm a t r i x a b s t r a c t u s i n gi m m o b i l i z e dy e a s tc e l l st oy i e l da d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( a t p ) f r o m a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e ( a m p ) i so n eo ft h em o s ti n t e r e s t i n gt e c h n i q u e si n a t pi n d u s t r y t h ek e yt e c h n i q u e si nt h ea t pp r o d u c t i o na r et h es t e a d yo ft h e c e l l q u a l i t y , t h ea p p r o p r i a t e m e t h o do fi m m o b i l i z a t i o na n do p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s i nt h ed i s s e r t a t i o n , t h ec u l t i v a t i o no fy e a s t ，t h ep r e p a r a t i o no f i m m o b i l i z e dc e l l si no p e np o r eg e l a t i nb a t r i xa n dt h eo p e r a t i o n a lc o n d i t i o n so f a t pf e r m e n t a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d b e s i d e s ，t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n t e c h n i q u eo fa t pp r o d u c t i o nw a sb u i l t ，t h ea t pr e c o v e r y ，t h ep u r i t yo fa t p p r o d u c ta n dv i r t u a lp r o d u c t i v i t yw e r ea l s od i s c u s s e dw i t ht h ee x p e r i m e n t f i r s to fa l l ，as t r a i no fb e e ry e a s tw h i c hh a sh i g hc o n v e r s i o nr a t eb u tl o w s t a b i l i t yw a ss e l e c t e d a c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g n ，t h ee f f e c t s o ff o u rf a c t o r s ( c o n t e n t so fc a n es u g a rh o n e y ，p e p t o n e ，( n h 4 ) 2 s 0 4a n dk h 2 p 0 4 ) a tt h r e el e v e l s0 1 1t h ec e l l sc o n c e n t r a t i o na n dt h ea t pc o n v e r s i o na c t i v i t yw e r e i n v e s t i g a t e da n dt h e nt h eo p t i m a lr a t i oo fc o m p o n e n t si nt h ee x p a n d i n gc u l t u r e m e d i u mw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t s a r e ：r e ( c a n es u g a rh o n e y ) = 1 2 ， m ( v e p t o n e ) = o 7 0 ，m ( ( n h & s 0 4 ) = 0 2 5 a n dm ( k h 2 p 0 4 ) = 0 1 5 t h e n ，i t w a sf o u n dt h a tt h ea p p r o p r i a t ee x p a n d i n gc u l t u r et i m ew a s1 耷乏oh o u r s s e c o n d l y ，i tw a ss e l e c t e dt os t u d yt h ep r e p a r a t i o no f i m m o b i l i z e dc e l l si n 1 1 i 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶固定化啤酒酵母生产a t p 的研究 o p e np o r eg e l a t i n m a t r i x t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ei m m o b i l i z e dp a r t i c l e s c o n t a i n i n g 15 g e l a t i n ，2 n a a l g i n a t eg e la n d10 b e e ry e a s tc e l l sh a v e h i g h e ra c t i v i t y o fp h o s p h o r y l a t i o na f t e rc r o s s - l i n k e di nl h b y 2 g l u t a r a l d e h y d e t h i r d l y ，t h em e c h a n i s mo fs y n t h e s i z i n ga t p a n ds o m ef a c t o r sw h i c hm a y a f f e c tt h ea t pc o n v e r s i o na c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gt h ei m m o b i l i z e d y e a s tc e l l s o nt h eb a s i so ft h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h ei m m o b i l i z e db e e ry e a s t c e l l sw e r eu s e dt ob i o s y n t h e s i z ea t pf r o mab u f f e r ( p h 7 0 ) s u b s t r a t es o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 5 0 m m o l lg l u c o s e ，1 5 e d la m p ，1 6 m m o l lm g s 0 4 。7 h 2 0a n d 2 5 0 m m o i lp o t a s s i u mp h o s p h a t e t h ec o n v e r s i o nr a t eo fa t pc a nr e a c h9 5 a t3 5 w i t h i n2h w h e ns u b s t r a t e so fr e a c t i o nw e r es t e r i l i z e da n d n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( n a d + ) w a sa d d e d ，t h ec o n v e r s i o nr a t eo f a t pc a nb em a i n t a i n e do v e r9 0 f o r10t i m e so f r e a c t i o n s f i n a l l y ，t h er e s u l t so f t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ne x p e r i m e n ts h o wt h a t t h ea v e r a g ea t pr e c o v e r yi s7 2 3 t h ea v e r a g ep u r i t yo fa t pp r o d u c ti s9 2 3 a n dt h ea v e r a g ev i r t u a lp r o d u c t i v i t yi s1 0 2 3 k e yw o r d s ：5 乙a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( 御m ) ；i m m o b i l i z e db e e ry e a s t c e l l s ；o p e np o r eg e l a t i nm a t r i x 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶嗣定化啤酒酵母生产a t p 的研究 a d o a m p a d p a ：r p a 2 6 0 p i p p i e m p n a d + 忍 f 6 - p a t c c 6 8 7 2 彳 p 足 r 符号说明 n o m e n c l a t u r e v i 腺苷 一磷酸腺苷 二磷酸腺苷 三磷酸腺苷 溶液在2 6 0 n m 的吸光度 正磷酸 焦磷酸 葡萄糖酵解途径 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 a t p 转化率， 6 磷酸果糖 产氨短杆菌 峰面积值 a t p 纯度， a t p 回收率， 产品实物产率， 广两大学硕七学位论文 利用开孔明胶固定化啤酒酵母生产a t p 的研究 1 1a t p 的理化性质及其应用 第一章前言 帕一；厶至承x h i甘 i 夕。i i “ 图1 - 1 腺苷三磷酸 f i g i - 1a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 似t p ) a t p 易溶于水。不溶于醇、醚和其它有机溶剂，其分子末端的两个连接磷酸基团的酸 酐键都是高能磷酸键，两键容易断裂，水解可各释放出3 0 5 4 k j m o l 5 2 3 k j t o o l 的自由能【2 】， 因而a t p 在水溶液中很不稳定，易水解生成二磷酸腺苷( a d p ) 和正磷酸( p i ) 或一磷酸腺苷 ( a m p ) 和焦磷酸( p p i ) ，但a t p 的固体粉末较稳定，在低温和干燥环境能保存较长时间。 a t p 是生物体内能量的主要来源，当其水解为a d p 时放出的大量自由能，可促进体内 许多反应的进行，是细胞内特殊的自由能载体。它在细胞内广泛地存在，无论是细胞核、 细胞溶胶以及线粒体等，参与了生物体的运动、营养和代谢物质的转运、生理信号的传递 以及各种生物合成活动 3 1 ，因此具有极其重要的生物学意义 广西丈学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化啤j 再酵母生产a t p 的研究 2 0 世纪5 0 年代，a t p 作为生物药物应用于临床，并显示了越来越重要的作用。由于其与 生物体内的组织、牛长、修补、再，圭、能源供应等密切相关，可加强机体代谢，改善各种 器官的功能状态，提高细胞的活动能力，从而增强机体的抗病能力，因此临床上主要用于 治疗心脏疾病肌肉萎缩性疾患脑溢血后遗症肝炎和听力障碍等，也常用于组合能量合剂抢 救垂危病人【4 】。由于a t p 存在于所有活的生物体细胞中并参与了大多数生化反应，有关报道 嘲显示在某一生长速率下，单一培养物的 七a t p 浓度( s a t p ) 是相对恒定的，可以通过测定 s a t p 来考察培养物或某种微生物的成活能力，这项研究可广泛应用于环保行业和微生物的 检测等领域。此外，a t p 还是一种重要的生化试剂，应用于科研、生产等方面；在食品行 业，a t p 还可用作熬合剂巾j 。 1 2a t p 的工业合成研究进展 上世纪二十年代末人们从动物的肌肉组织中首次发现了a t p ，在阐明糖代谢和呼吸链 机制的同时r 明，也确立了a t p 的合成机制。在工业生产上，最早采用的是从兔子肌肉中提 取a t p 的方法【9 l ；五十年代末出现了以a m p 为原料的化学合成法f l o j ；六十年代f j l j 出现了微 生物发酵法，此后该法的发展非常迅速，相关报道很多，成为了a t p 生产的主要方法且 直沿用至今；七十年代末八十年代初又先后出现了光合磷酸化和氧化磷酸化途径生产a t p 的方法，前者是光照条件下，利用利用从光合细菌中分离的载色体，或从植物组织中分离 的叶绿体以及具有光自养能量的藻类细膨1 2 】，使底物a d p 或a m p 和无机磷( p i ) 反应生成a t p 的方法；而后者是利用真核细胞的线粒体，在呼吸作用提供的能量下，使底物a d p 或a m p 和无机磷反应生成a t p 的方法。此外，利用乙酸激酶来再生a t p ，或与腺苷、腺苷酸激酶偶 联，将a d o 、a m p 磷酸化生成a r p 的酶法也相继有报道【l3 “】，后三种方法由于成本高，技术 不成熟等原因，目前仅是研究阶段，还未用在工业上得到广泛的应用。 微生物发酵法采用微生物细胞作为酶源进行酶催化反应，由于细胞具有维持其生命活 动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此能够迅 速有效地完成多步酶催化反应。该法转化得率高，反应条件温和，反应时间短，因此成为 了目前最主要的工业生产方法。主要的工艺包括游离细胞反应法和固定细胞反应法，如今 随着生物技术的发展，基因工程菌也开始引入a t p 的生产中。以下将对微生物发酵法的发 展情况作概括报道。 关于利用微生物的发酵能力生产a t p ，首先由l u t w a k - m a n n d 掣”1 作了研究，结果发现 进行酒精发酵的酵母能将添加于培养基中的a m p 或腺苷磷酸化为a t p 。而微生物法真正用 于a t p 合成研究是从上世纪六十年代开始的。1 9 6 7 年，厉仓等【1 6 1 利用面包酵母细胞酶系作 为酶源，由5 - a m p 转化到a t p ，反应液中a t p 浓度达到1 0 m m o l l 以上，这种能完成多步 酶催化反应的方法应用于a t p 生产引起了人们的重视，随后得到发展。1 9 7 2 年田中【1 1 n 等对 2 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化啤酒酵母生产a 1 p 的研究 该方法加以改良，确立了简易的菌体制备法和添加较高浓度底物的条件。就是说，把酵母 菌体用阳离了表面活性剂“阳离子型s ”处理，再在反应液中添加氯化锰，进行氧化磷酸化 的结果，就能自8 3 9 l 的腺苷分离得到1 5 7 9 的a t p 钠盐。许多研究者还进行了寻找除面包 酵母、清酒酵母之外的新酶源的试验。河合等【is j 检索了1 7 属5 9 株酵母菌的a m p 磷酸化活性， 结果发现，以德巴利酵母为a t p 生产菌，在最适条件下能将8 0 - 1 0 0 的a m p ( 1 0 m g l ) 磷酸 化为a t p 。渡边等【19 】在探索利用石油微生物进行a m p 磷酸化的研究时发现，能同化烃的某 种假丝酵母( c a n d i d a s p ) ，可高效地由a m p 生成a t p ，并阐明了酵母菌体生产条件对5 - a m p 磷酸化的影响。除了用菌体直接投入发酵液中发酵外，田中等唧j 还研究了培养法，即伴随 微生物的生长发育，在培养液中直接积累a t p 的方法。把产氨短杆菌a t c c 6 8 7 2 接入培养基 中，于3 0 c 振荡培养4 天，在培养的第三天 j 1 1 ) k 2 9 l 的腺嘌呤。培养后，于上清液中分别生 成1 5 7 9 l 的a t p ，1 5 9 9 l 的a d p 和2 1 6 9 l 的a m p 。由于已知用同一菌株，添加腺嘌呤进行 培养可积累a m p ，因此可以认为这种磷酸化的机制是自腺嘌呤生成的a m p ，进一步被磷酸 化生成a t p 、a d p 。 国内利用微生物法生产a t p 的研究有一定进展，1 9 7 8 年首都啤酒厂袁惠民等1 2 l 】利用啤 酒酵母菌体，按照一定配比加入磷酸盐，氯化镁，葡萄糖后，直接发酵制得酶液。再将腺 苷酸用n a o h 溶解，加水稀释后与酶液混合，反应3 小时，转化率达8 4 。该工艺的优点在 于酶液稳定性良好，4 c 保存2 1 天不丧失活力；而且转化液稳定，常温放置3 天也无不良影 响；转化液菌体少，不会引起重新发酵，对后续提取工艺非常有利。1 9 7 8 年，胡兆庆等【2 2 】 报导了面包酵母合成a t p 的研究，认为提高面包酵母和白地霉的细胞通透性，可以克服细 胞壁和受氢体对细胞a t p 转化反应的限制。研究结果表明面包酵母的a t p 生产产率达到8 0 以上，白地霉a t p 得率约6 0 。林清启1 ：2 3 1 报导了转型面包酵母合成a t p 的研究，把好气培 养的面包酵母进行厌气转型，促使培养细胞的膜通透性有较大的改变，从而提高细胞酶系 的催化效果，经好气增殖培养和厌气转型培养的面包酵母，可得到在反应速度和转化率方 面都优于啤酒酵母的酶催化a t p 生产活性，这从a t p 生产细胞酶源开发和工业化生产保障 来说，转型面包酵母的培养和a t p 合成研究是非常有意义的。 随着现代酶工程技术的发展，酶固定化技术和生物反应器的应用逐渐成熟，它具有以 下一系列的优点：( 1 ) 保持细胞内酶系的自然状态，从而加强了酶的稳定性；( 2 ) 固定化细胞 可多次重复使用，也可实现连续化生产；( 3 ) 固定化细胞与产物容易分离，简化了分离工序， 并可获得高品质的产品；( 4 ) 生产成本低，经济效益高，因此在各领域获得了广泛的研究和 应用。上世纪8 0 年代前后，固定化生产技术开始被引入a t p 的生产研究中，并成为了最有 工业前景的a t p 生产方法之一。关于固定化技术的发展及应用于a t p 生产的情况将在下一节 做详细论述。 8 0 年代初开始，基因工程技术被引入a t p 的生产研究中。研究者利用基因克隆或细胞 广两大学硕十学位论文利用开孔明胶周定化砷洒酵母生产a t p 的研究 融合技术来改进微牛物菌体的糖酵解酶活性和腺苷酸磷酸化酶活力，提高其a t p 牛产能力。 f u k u d a 等【2 4 酿滔酹母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的已糖激酶萆凼和葡倚激酶皋因克隆到 质粒( y e p l 3 ) l - 得到杂交质粒p y h i 和p y g i ，然后转入酵母细胞中，结果显示带有杂交质粒 p y h l 和p y g i 的酵母细胞( d k d 5 d h ) ，其葡萄糖的磷酸化活性比没带质粒的酵母细胞提高 3 倍，能够将1 3 0 m m o l f l 的腺苷全部转化成a t p ，a t p 转化反应中葡萄糖的消耗和f d p ( 1 ，6 一二磷酸果糖) 的积累速度得到明显提高。 k i m u r a f z s ! 应用重组d n a 技术来构建生产a t p 和谷胱甘肽的基因工程菌。通过克隆糖代 谢的一些限速酶基因，即葡糖基酶( g l k ) ，磷酸果糖激酶( p 和丙糖磷酸异构酶( t p i ) 等基因， 然后将带有葡糖激酶基因的杂交质粒( p g k l 0 0 ) 导入大肠杆菌细胞内，经筛选和培养，得到 质粒p g k l 0 0 的大肠杆菌菌株。a t p 转化反应结果显示，该菌体的a t p 生产活性是普通大肠 杆菌细胞的2 5 倍，a m p 的转化率达到7 0 ，而对照菌的转化率只有1 0 。 我国关于利用基因工程菌生产a t p 的报道比较少，2 0 0 0 年中山大学徐柏年断喀采用基 因工程技术，将催化a t p 合成的酶一a d k 的基因克隆进表达载体y e p n l 8 l p 2 获得重组质粒 y e p n - a d k ，转化酿酒酵母g r f t s 后，a d k 基因获得表达。用重组菌株g r f l 8 ( y e p n - a d k ) 发酵合成a t p 其产率比对照菌株g r f l 8 提高7 5 。 这些结果显示，基因工程的重组d n a 技术在改进微生物的糖代谢活性和提高a t p 生产 活力的应用研究上能够有效地发挥作用。 1 3 固定化细胞技术在a t p 生产中的应用进展 1 3 1 固定化细胞技术简介 固定化细胞技术是2 0 世纪6 0 年代在固定化酶基础上发展起来的，指的是利用物理或 化学的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性，可反复使用的一种高新 技术【州。同游离细胞相比较，固定化细胞生物合成工艺具有可连续化操作，可重复使用， 利于产品的分离纯化等优点，因此近几十年来该技术得到了迅速的发展，其应用涉及到食 品及发酵工业、医药工业、化学分析、环境保护、能源开发等各个领域 2 8 , 2 9 1 。 固定化细胞的制备方法很多，固定化细胞的制备方法可分为如下几类： ( 1 ) 吸附法：该法又可分为物理吸附法和离子吸附法。将细胞直接吸附在载体上的方法 称为物理吸附法。而化学吸附法是将细胞与含有离子交换基团的水不溶性载体结合，使其 牢固得吸附于载体上。 ( 2 ) 包埋法：包埋法是将细胞包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止细胞 泄出，但是底物能渗入格子内与细胞相接触。此法包括聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋 法、卡拉胶包埋法和微囊法等。 4 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化啤酒酵母生产a t p 的研究 ( 3 1 共价键结合法：共价键结合法是将细胞与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。 重氮化法、烷摹化和芳摹化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇一二硫化物互换反应麽和四 组分缩合反应法等都属于此类方法。 ( 4 ) 交联法：交联法是利用有双功能团或多功能团的试剂与细胞分子之间进行分子交联 的固定化方法。交联剂有多种，最常用的是戊二醛，其它交联剂有异氰酸衍生物、双氮联 苯、n n 聚甲烯双碘丙酮酰胺和n , h i 乙烯双马来酰亚胺等 2 6 】。 各种固定化方法的优缺点比较可见表1 1 所示。 表1 - 1 各种固定化方法比较 t a b l e1 - 1t h ec o m p a r i s i o nw i t l la l lk i n d so f i m m o b i l i z e dt e c h n i q u e s 从表i 1 可以看出各种固定化方法都有其特点和不足，在实际研究中应根据研究对象情 况通过实验摸索和选择适合的固定化载体和方法。 1 3 2 固定化细胞技术在a t p 生产中的应用 八十年代初a d o y 等即锵酵母包埋在乙基纤维素的微胶囊中，开始a m p 生成a t p 的 转化率为7 0 0 , 6 ，十天内维持在5 0 以上；a s a d a m 等【3 1 1 利用半透膜的多室反应装置，停留1 8 小时，可使8 0 a m p 或腺苷转化为a r p ；m u r a t a k 掣”铡用聚丙烯酰胺凝胶共价偶联酵母转 化核苷生成a t p ，其与谷胱苷甘肽，n a d p 生产酶相偶联，转化率为6 0 。 国内研究多采用包埋或联合方法，如邱蔚然、王育维等采用胶原蛋白戊二醛交联包埋 法，其转化率在6 0 - 7 0 t ”】。此后邱蔚然等又采用明胶戊二醛交联包埋法，反应十批次，转化 率9 0 以l - m j 。九十年代，金新根等应用藻酸内凝胶戊二醛交联包埋法固定酵母也达到了 很好的效果。且持续反应十天左右，固定化酵母细胞的活力和强度均未下降口m 。近年唐学 友等采用k 卡拉胶魔芋多糖复配胶固定化酵母由核苷生a t p ，底物灭菌和添加n a d + 后， 该固定化酵母细胞可反复使用1 2 次，a t p 的转化率维持在9 5 以上p 6 j 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化啤酒酵母生产a t p 的研究 1 4a t p 的分离方法研究进展 从发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程统称为下游加工过程 ( d o w n s t r e a mp r o c e s s i n g ) 。由于a t p 稳定性差，在水溶液中易分解，且发酵液起始浓度较低， 而最后产品要求达到的纯度又较高，加上杂质又较多，因此分离提纯比较困难。一直以来 a t p 的分离技术都是a t p 生产中的瓶颈问题，其是实现a t p i 业化的关键。随着现代分离技 术的发展，a t p 的分离技术也逐渐发生了变化。 1 4 1 重金属沉淀法 早期的a t p 分离工艺是采用汞盐沉淀法【3 。”，待a t p 发酵液预处理后与硝酸高汞溶液作用 生成乳白色汞盐沉淀，沉淀物悬浮于蒸馏水中，再以硫化氢分解汞盐，并除去黑色硫化汞 沉淀，所得a t p 清夜经阳离子交换树脂进一步脱除汞离子沉淀结晶，制得a t p 成品。该法产 生大量的含汞废水、废渣和硫化氢等污染物，这些污染物若不加处理，就会造成严重的污 染。而且由于反应中间产物a d p 无法单独回收，a t p 含量也常常不能达到要求，已经很少 采用。也有用钡盐沉淀的，即将富含a m p 、a d p 和a t p 的发酵液先经离子交换树脂柱分出 三种核苷酸后，在含a t p 的洗脱液中加入2 5 的醋酸钡，使a t p 沉淀生成a t p 钡盐，产物经 真空干燥后得成品。 i a 2 离子交换法 1 4 2 1 一次阴离子交换柱分禹法 袁惠民【2 1 1 采用了一种比较简便的分离a t p i 艺；将发酵液冷却到i o c 以下后，硅藻土过 滤发酵液，滤液加蒸馏水后直接上阴离子交换树脂柱( 树脂为聚苯乙烯- - 7 , 烯苯季胺型， 1 0 0 - 5 0 目，装柱时处理为氯型，柱型号7 0 c m 1 0 0 9 i n 2 ) 。上柱完毕后，依次用水、 o o l m o l l h c l 、0 0 4 m o l l n a c l 和0 7 m o 帆n a c l 冲洗柱。分段洗脱得到富含a m p 、a d p 和a t p 的流出液，产品用活性炭，硅藻土除热源，酒精沉淀，无水乙醇无水乙醚脱水，五氧化二 磷真空干燥得a t p 成品。该工艺在生产上已经长期使用，a t p 收率稳定在6 5 以上。但该工 艺存在一个产品纯度的问题，由于发酵过程中除产生a t p 外，底物中的大量葡萄糖也被磷 酸化生成葡萄糖磷酸酯，同时在发酵液中还有无机磷酸盐存在，直接上阴离子交换树脂柱， 这些物质也被吸附在柱上，所得产品杂质较多，颜色黄，质量也受到影响。 1 4 2 2 活性炭柱与阴离子交换柱联合分离法 t a n a k a 3 8 1 采用如下工艺对a t p 发酵液进行分离：先将发酵液调p h 至4 5 ，加热使蛋白 质变性沉淀，离心，调节上清液p h 至2 0 后上活性炭柱( 炭柱用8 丙酮的乙醇溶液处理过) 。 先用蒸馏水洗涤柱子，再换用含l 氨水、5 0 乙醇的水溶液洗脱柱子，收集洗脱液，真空 6 广两大学硕十学位论文利用开孔明胶同定化啤酒酵母生产a r p 的研究 浓缩除去氨水后上d o w e x 1 2 ( c l 型) 柱( 2 0 0 - - 4 0 0 目，1 3 5 c m o 7 4 c m 2 ) ，先用0 1 m o l l h c l 洗脱出a m p 和a d p ，再换用o 2 m o l l 的h c i 洗脱a t p ，将含a t p 的、尻脱液收集，调节 d h 至7 0 ，加入0 2 5 醋酸钡溶液，得a t p 钡盐沉淀，将此沉淀物真空干燥，可得白色a t p 钡盐。 1 , 4 2 3 阴、阳离子交换树脂柱联合分离法 首都啤酒厂和中国科学院核酸协作组【3 9 l 采用阴阳离子交换柱联合使用的方法进行a t p 的分离。他们先将发酵液用三氯乙酸沉淀蛋白质，离心取上清液进行后续分离。在上清液 中加乙醇，得沉淀即a t p 粗品。将该粗品悬浮于蒸馏水中，加适量硅藻土，用布氏漏斗过 滤。滤液先上阳离子交换树脂柱，收集上柱流出液，用n a o h 调p h 6 5 7 0 后上阴离子交 换树脂柱，将阳离子交换树脂柱流出液稀释一倍，调至p h 3 0 作置换液，故置换液中的a t p 将阴柱内a d p 置换下来，依次用o 0 0 1 m o l l h c i ，p h 3 0 含0 0 3 m o l l n a c i 的溶液和 l m o l l n a c i ，p h 3 8 洗脱阴柱。将a t p 流出液加硅藻土除热源，滤去硅藻土后调# - 1 3 8 ， 加乙醇沉淀a t p ，换用无水乙醇，无水乙醚洗涤沉淀，五氧化二磷真空干燥后得成品。该 工艺a t p 收率高，产品纯，并能得到一定量的a d p 。 近年来，程金芬等【柏】参考国外报导的提取a t p 方法，加以简化改良，制定出一条适合 工业生产的a t p 提取新工艺。程金芬的做法是：将发酵液离心，得上清液，将上清液通过 7 1 4 # 强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，然后依次用水、含0 3 n a c l 的0 0 1 m o l l h c i 、含 0 3 n a c l 的0 0 5 m o l l h c i 洗脱，分别得到腺苷、a m p 、a d p 、a t p 。合并a t p 的解吸液， 调节p h 为4 ，先通过三根7 0 1 # 阴离子交换串联柱，当通过一半体积a t p 解吸液时，串联上同 样大小的第四根柱，取下第一根柱，在继续通过剩下的一半体积时，串联上第五根柱，取 下第二根柱，以此类推，直到全部a t p 液通过完毕。取下的柱1 、柱2 、柱子3 、柱子4 ，用 n a o h 液分别洗脱。得a t p 浓缩液，将此浓缩液用7 3 2 # 1 t e i 离子交换树脂柱0 - i + 型) 调p h 为中性， 再用h c i 调至p h 3 ，再通过1 2 2 # 交换柱，流出液调p h 3 ，保温2 0 2 5 ，加2 倍体积相同温度 的乙醇，能得到针状结晶。去除母液、丙酮脱水、五氧化二磷干燥得a t p 。所得a t p 含量 8 5 ，色泽洁白，提取收率5 0 6 0 ，纯度8 5 以上。 1 4 2 4 弱碱性阴离子交换树脂柱分离法 除了采用强碱性阴离子交换树脂，弱碱性树脂也可用于分离a t p ，如采用弱碱性阴离 子交换树脂v i o n i t a t - 1 x - 4 吸附a t p ，再用0 i m o l l h c i + o 2 m o l l n a c ! 溶液洗脱，洗脱液进 一步处理后，经乙醇沉淀，得到a 1 1 p 钠盐。 以上几种分离工艺，除重金属盐使用较少外，其余几种都还广泛使用于a t p 的生产工 艺中，尤以阴、阳离子交换柱联合使用见多但从我们了解的数据来看，这些工艺的收率 都不太高，而采用活性炭柱工艺时，要消耗大量乙醇，而且a 1 1 p 在酸，碱条件下极易水解， 要求提取温度控制在1 0 ，这些都是在选取提取工艺时会遇到的难题。如何提高a t p 提取 7 广西大学硕士学位论文 利用开孔明胶同定化崎酒酵母生产a t p 的研究 的收牢，减少提取过程中不必要的损失，也是对a t p 牛产研究者提出的挑战。 1 5 本课题的研究意义及总体目标 我国a t p 工业化生产起步比较晚，且技术落后。在七十年代末八十年代初曾有过小批 量生产，但由于成本高于进口产品价格，且产品质量达不到卫生部标准，只好停产。如今 完全依靠进口，每年进口原料药5 0 吨。我国a t p 生产工业缺乏国际市场竞争能力的原因 主要是反应原料成本高，发酵转化率低，提取工艺不合理等。因此，研究并突破技术难关， 实现a t p 的国产化，低成本化，可减少或避免国家每年花大量外汇进口a t p ，从而扩大a t p 的应用，提高人民的医疗水平。 开发高水平的a t p 生产工艺，经济效益显著。本课题研究的总体目标是以一磷酸腺苷 ( a m p ) 为原料，开展利用啤酒酵母酶促合成a t p 的研究，并进行a t p 提取和纯化等技术实 验，摸索最佳工艺条件及控制要点，为该产品产业化技术提供可借鉴的前提条件。希望通 过此研究为我区糖业开展综合利用开辟一条新路，并为今后我区开展核苷酸类薪药研究奠 定基础。 1 6 本课题组往年的研究成果小结及本论文的研究内容 本实验室最初采用酒精酵母酶系研究了a t p 的合成，考察了其培养条件和发酵工艺， 其后又采用广西南宁万力啤酒厂提供的啤酒酵母泥进行了a t p 合成实验的研究，确定了合 成反应的最佳工艺条件并研究了细胞通透性对a t p 生产活性的影响i 4 1 。此后，实验室又对 a t p 的分离与提纯进行了探讨研究，初步得出了a t p 分离纯化的工艺条件，通过对多种吸 附剂和离子交换树脂的筛选，获得了一种对a t p 具有优良交换解析性能的大孔强碱性阴离 子交换树脂d 2 0 1 ，并在此基础上建立了离子交换树脂柱色谱法来测定a t p 的含量，此法 不仅可作为a t p 的分析方法，也可用于a d p 和a m p 的分离检测。同时，又通过对a t p 模拟液在丙酮一水，乙醇一水体系中的溶析性能研究，初步获得了a t p 的结晶工艺条件1 4 2 1 。 本实验室对于固定化酵母合成a t p 的研究是从前年三月开始的，由于很难再获得啤酒 厂提供的啤酒酵母泥，因此采用的是自行分离筛选的菌种，菌源来于中科院微生物研究所 的2 6 0 4 啤酒酵母，但并未进行培养基、培养条件的优化研究，菌种稳定性和转化活性还待 进一步提高。在固定化研究方面，先后采用了海藻酸钠、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶作为包 埋载体，通过比较实验发现明胶的包埋性能较好，从明胶的浓度、酵母用量、溶剂选择、 交联剂浓度，交联时间等方面的研究确定了明胶包埋啤酒酵母的较优条件【4 3 】，但采用明胶 作载体合成a t p 的方法已多次被报道，缺乏新颖性，且固定化制备过程中不易切割，酵母 损失量大，难以实现大规模的机械化生产。针对以上问题，本实验的研究内容如下： 8 广西大学硕七学位论文 利用开孔明胶同定化呻洒酵母生产a t p 的研究 1 1 通过改良培养条件，获得稳定性好活性高的a t p 牛产菌种； 2 1 找到一种较新型的固定化酵母包埋载体； 3 1 摸索该载体包埋酵母的较佳条件及发酵反应的优化条件： 4 ) 通过连续实验考察固定化酵母的稳定性及转化活性； 5 1 设计一套完整的分离提纯方案，考察生产工艺的最终成品得率和成品纯度。 参考文献 【l 】【日】氨基酸核苷集谈会核苷发酵【m 】北京：轻工业出版社，1 9 8 7 ：4 1 2 - 4 2 3 【2 】王镜岩，朱圣庚，徐长法生物化学( 第三版) 【m 】北京：高等教育出版社，2 0 0 2 ：3 7 3 8 【3 】马大龙生物技术药物【m 】北京：科学出版社，2 0 0 1 ：1 0 6 - 1 1 2 【4 】李津，俞惊霆，董德祥生物制药设备和分离纯化技术 m i 北京：化学工业出版社， 2 0 0 3 ：4 1 2 【5 】g i k a sp l i v i b g s t o na g u s eo fs p e c i f i ca t pc o n c e n t r a t i o na n ds p e c i f i co x y g e nu p t a k er a t e t od e t e r m i n ep a r a m e t e r so fas t r u c t u r e dm o d e lo fb i o m a s sg r o w t h j e n z y m em i c r o b i o b e t e c l m o l ，1 9 9 8 ，2 2 ( 3 ) ：5 0 1 【6 】陆传宗一种由次黄嘌呤核苷酸制备三磷酸腺苷的方法【p 】中国发明专利：9 5 1 0 6 2 9 8 0 ， 1 9 9 7 0 1 o l f 7 1f u k u o k ak ，s u d af i s h i k a w am ac o n v e n i e n tm e t h o df o rt h es y n t h e s i so fa t pa n da p 4 a 【j 】n u c l e n s i d e s & n u c l e o t i d e s ，1 9 9 5 ，1 4 ( 7 ) ：6 9 3 - 6 9 4 【8 】w h i t e s i d e sgm l a m o r t ea ，a d d a l s t e i n s s o no ，e ta 1 c o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no f a d e n y l a t e k i n a s ea n da c e t a t ek i n a s ei nap o l y a c r y l a m i d eg e l ：e n z y m e sf o ra t pr e g e n e r a t i o n 【j 】， m e t h o d si ne n z y m o l o g y , 1 9 7 9 ，4 4 ( 5 ) ：8 8 7 - 8 9 7 9 】f u j i ot f u r u y aa p r o d u “i o no f a t p f r o ma d e n i n eb yb r e v i b a e t e d u ma m m o n i a g e n e s 【j j j f e r m e n tt e c h n o l ，1 9 8 3 ，6 1 ( 3 ) ：2 6 1 - 2 6 7 【1 0 t a n iy ，m i t a n i 、y a m a d ah u t i l i z a t i o no f c r c o m p o u n d s ：p h o s p h o r y l a t i o no f a d e n y l a t eb y o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n 【j 】a g r i cb i o lc h e m ，1 9 8 2 ，4 6 ( 4 ) ：1 0 9 7 - 1 0 9 9 【1 1 】t a n iy m i t a n iyy a m a d ah p r e p a