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天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法 分离检测研究 专业：分析化学 姓名：杨桂珍 指导老师：谢天尧副教授 摘要 毛细管电泳( c e ) 是2 0 世纪8 0 年代兴起的一种新的分离分析技术，发展非 常迅速。与其它方法相比，c e 具有高效、快速、低耗、费用低和对环境友好等 优点。分析工作者在检测方法和检测器方面努力创新，研究了许多类型的检测器。 其中电化学检测是一种灵敏度高、选择性好的检测方法，在毛细管电泳分离研究 中得到了广泛作用。 天然和人工合成甜味剂对食品工业的发展均起到了积极的作用，它们的普遍 使用对人体的健康起着直接或间接的影响，而且食品的营养和安全等方面在世界 范围内得到越来越多的关注，也日益关注食品添加剂的使用和食用的安全性。糖 类化合物一直是分析化学界公认的难分离的一类物质，尽管毛细管电泳是一种新 型的分离分析手段，但在糖类的分析上的确也存在着一些难点，因此开展毛细管 电泳电导检测在天然和人工合成甜味剂分离检测中的应用研究有重要的学术研 究和应用意义。 本论文是广东省自然科学基金资助项目( 0 3 1 5 8 9 ) 的一部分。本论文主要内 容和方法如下： 1 研究了用高效毛细管电泳电导检测三种最常见的天然甜味剂( 蔗糖、葡 萄糖和果糖) 的新方法，以未涂层熔融石英毛细管( 5 0 c r n x 2 5 p mi d ) 为分离柱， 1 6 m m o l l 硼砂+ 2 2 m m o f l t r i s ( 三羟甲基氨基甲烷) + o 2 m m o l l e d t a ( 乙二胺 四乙酸) ( p h = 9 1 ) 为电泳介质，采用了正高压分离( + 1 3 0 k v ) ，电动进样( + 1 3 0 k v 1 0 s ) ，柱端接触式电导检测，使这三种最常见的天然甜味剂无需经衍生化处理， 并在1 0 m i n 实现了分离检测，标准曲线的相关系数均为0 9 9 8 6 以上。阐述了缓 冲体系、分离电压、进样时间等因素对分离检测的影响；初步探讨了分离检测的 原理。仅需简单样品前处理，就可应用于水果和饮料中蔗糖、葡萄糖和果糖的检 测，取得了满意的结果。 2 建立了磺胺类人工合成甜味剂( 糖精钠、安赛蜜、甜蜜素) 的高效毛细 管电泳电导法分离检测方法，以未涂层熔融石英毛细管( 4 5 c m x 5 0 1 x r ni d ) 为分 离柱，1 5 m m o u l t r i s ( 三羟甲基氨基甲烷) + 1 0 m m o l l h 3 8 0 3 ( 硼酸) + 0 2 m m o l l e d t a ( 乙二胺四乙酸) 为电泳运行液，0 2 四乙烯五胺为电渗流抑制剂，采用 负高压分离( 1 5 o k v ) ，电动进样( 1 0 0 k v 1 0 s ) ，柱端接触式电导检测，在该 条件下其线性检测范围分别为o 8 ，1 1 ，1 5 - 1 2 0 1 m a o l l ，检测限为o 3 ，0 4 ，0 6 p m o l l 。对影响灵敏度和分离度的电泳运行液的组成、浓度以及进样电压等进行 了详细讨论。仅需简单样品前处理，就可应用于市售饮料中甜蜜素、糖精钠、安 赛蜜的分离检测，获得满意结果。 关键词：毛细管电泳，电导检测，天然甜味剂，磺胺类人工合成甜味剂 u s e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n o fn a t u r a la n da r t i f i c i a l s w e e t e n e r sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t h c o n d u c t i v i t yd e t e c t i o n m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：y a n gg u i z h e n s u p e r i o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rx i et i a o y a o a bs t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i sr e c o g n i z e da sap o w e r f u la n a l y t i c a lt e c h n i q u e a n dg o t t e nd e v e l o p m e n tw i t har a p i ds p e e d ，b e c a u s eo fi t sh i g l le f f i c i e n c y , l o ws a m p l e a n dr e a g e n tc o n s u m p t i o n , l o w e rc o s t so f1 1 8 0a n dl e s se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n s r e s e a r c h e r sh a v es t u d i e do nd e t e c t o ro fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dh a v es e v e r a l k i n d so fd e t e c t o r s e l e c t r o c h e m i s t r yd e t e c t o ra sah i g hs e n s i t i v e ，s e l e c t i v ed e t e c t i o n m e t h o dh a sb e e nu s e di ns e p a r a t i o n n a t u r a la n da r t i f i c i a ls w e e t e n e r sh a v eu s e dt ot h ed e v e l o p m e n to ff o o di n d u s t r y a c t i v e l y , a n di th a si n f l u e n c e do nh u m a nb e i n g sh e a l t hd i r e c t l yo ri n d i r e c t l yt h a tt h e y h a v ec o m m o n l yb e e nu s e di nl i f e t h ea t t e n t i o no fn u t r i t i o na n ds e c u r i t yi nf o o dh a s e n h a n c e di n c r e a s i n g l yi nt h ew o r l d ，a n dt h eu s i n go ff o o da d d i n gd e r i v a t i v e sa n df o o d s e c u r i t yh a v er e c e i v e dm o r ea t t e n t i o nd u r i n g r e c e n ty e a r s t h es e p a r a t i o no f c a r b o h y d r a t e s i sa l w a y sr e c o g n i z e da sad i f f i c u l tt e c h n i q u ei nt h ea n a l y t i c a lc h e m i s t r y f i e l d c eh a sg o t t e nd e v e l o p m e n tw i t har a p i ds p e e d ，b u ts o m et o u g hp r o b l e mo f c a r b o h y d r a t ea n a l y s i sr e a l l ye x i s t s s oi ti sp r a c t i c a la n dc o n d u c t i v et oh a v e as t u d yo n c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ht h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o na p p l i e d i nn a t u r a la n d a r t i 6 c i a ls w e e t e n e r s m t h i s p a p e r w a s s u p p o r t e db y t h en a t i o n a lf o u n d a t i o no f g u a n g z h o u p r o v i n c e ( 0 3 1 5 8 9 ) t h em a j o rc o n t e n to f t h i st h e s i sc o n s i s t si sd e s c r i b e d 弱f o l l o w s ： 1 an e wr a p i dm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h r e ef a m i l i a rn a t u r a ls w e e t e n e r s ( g l u c o s e ，f r u c t o s e ，s u c r o s e ) i nf o o d sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hc o n d u c t i v i t y d e t e c t i o nw a si n v e s t i g a t e ，w i t ha nu n c o a t e df u s e d - s i l i c ac a p i l l a r y ( 5 0 c m x 5 0 i t mi d ) u n d e rt h eo p t i m u ms e p a r a t ec o n d i t i o n s ：16 m m o l lb o r a x + 2 2 m m o l l ir i s + 0 2 m m o l le d t a ( p h = 9 1 ) ，s e p a r a t i o n v o l t a g e 13 0 k v t h r e ef a m i l i a rn a t u r a l s w e e t e n e r sw e r es e p a r a t e ds u c c e s s f u l l yw i t h i n10m i nw i t h o u td e r i v a t i o n t h ee f f e c t s o ft h ec o n c e n t r a t i o no fb u f f e r , t h es e p a r a t i o nv o l t a g ea n d i n j e c t i n gt i m ew e r ed i s c u s s e d i nd e t a i l w ea l s od i s c u s s e dt h em e c h a n i s mo fs e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n t h e p r o p o s e dm e t h o dw h i c hw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn a t u r a ls w e e t e n e r s ( g l u c o s e ，f i u c t o s e ，s u c r o s e ) i nd r i n k sa n df r u i to n l yn e e ds i m p l yp r e t r e a t m e n t ，a n d w a sd e m o n s t r a t e ds i m p l e ，r a p i d ，a n da c c u r a t e 2 am e t h o do fs u l f a n i l a m i d ea r t i f i c i a ls w e e t e n e r s ( s a c c h a r i ns o d i u m ，a c e s u l f a m e p o t a s s i u m ；s o d i u mc y c l a m a t e ) b yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i mc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o n w a sd e v e l o p e d ，w i t ha nu n c o a t e df u s e d s i l i c ac a p i l l a r y ( 4 5 c r n x 5 0 i _ t mi d ) u n d e rt h e o p t i m u ms e p a r a t ec o n d i t i o n s ：15 m m o l lt r i s + 10 m m o l lh 3 8 0 3 + 0 2 m m o l le d t a + 0 2 t e p a ( p h = 8 9 ) ，s e p a r a t i o nv o l t a g e - 15 0 k v t h ec a l i b r a t i o nc b r v eo ft h e s u l f a n i l m n i d ea r t i f i c i a ls w e e t e n e r ss h o w e dg o o dl i n e a r i t yi nt h er a n g er e s p e c t i v e l yf r o m 0 8 ，1 1 ，1 5 t o12 0 1 m a o l l , w i t hl e d = 0 3 ，0 4 ，0 6 p m o l l t h ee f f e c t so ft h e c o n c e n t r a t i o no fb u f f e ra n di n j e c t i n gv o l t a g ew e r ed i s c u s s e di nd e t a i l t h ep r o p o s e d m e t h o dw h i c hw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs u l f a n i l a m i d ea r t i f i c i a ls w e e t e n g t s ( s a c c h a r i ns o d i u m ，a c e s u l f a m ep o t a s s i u m ；s o d i u mc y c l a m a t e ) i nd r i n k so n l yn e e ds i m p l y p r e - t r e a t m e n t , a n dw a sd e m o n s t r a t e ds i m p l e , r a p i d ，a n da c c u r a t e k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，c o n d u c t i v i t yd e t e c t i o n ，n a t u r a ls w c c t e n e r , s u l f a n i l a m i d ea r t i f i c i a ls w e e t e n e r w 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论作者签名：删 日期：d 们转石月7 e t 。 。 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 中山大学硕上论文天然和人工合成甜昧剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下完成的成果， 该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识产权法保护。在学期间与 毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经 导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布 学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 靴馓群：舻日期：a 垆乡月 中山大学硕士论文 天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 第一章前言 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) ，是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起 来的一种新型分离分析技术。它是一类以高压直流电场为驱动力，以样品的多种 特性( 电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等) 为根据的液相微 分离分析技术【1 1 。c e 是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展。与高 效液相色谱相比，c e 分离速度快，样品用量少，且具备环境污染少等优点，已 被广泛应用在分析化学、环境化学和食品化学等领域【2 】。目前c e 的研究十分活 跃，在基础理论、仪器更新和实际应用等方面取得了许多可喜的成果。在甜味剂 的分离分析方面，相对与其它分离技术而言，c e 具有可灵活选择的操作模式、 试剂及样品用量少且对环境污染小、分析速度快、应用范围广等许多优点，因此 显示出特有的分离能力与极大的应用前景。 1 1 毛细管电泳简介 1 1 1 毛细管电泳的发展进程 毛细管电泳历史久远，它是在传统电泳的基础上发展起来的。而对高效毛细 管电泳最有启发性的工作是1 9 6 7 年瑞典科学家n j e r t e n t 3 1 首次提出利用窄孔径管 ( 3 m mi d ) 在高电场下进行自由溶液电泳，用u v 检测，虽然能高精度测定淌 度，但操作麻烦。此后，毛细管电泳向着使用细径毛细管的方向发展。1 9 8 1 年， j o r g e n s o n 等【4 】使用7 5 p x ni d 的熔融石英毛细管做毛细管区带电泳( c z e ) ，在 3 0 k v 电压下用荧光检测了丹酰化氨基酸，创立了现代毛细管电泳，成为毛细管 电泳发展史上的一个里程碑。1 9 8 4 年，t e r a b e 【5 】开辟了毛细管电泳另一个重要分 支一胶束毛细管电动力学色谱( m e c c ) ，扩展了毛细管电泳的应用范围。随后， 毛细管等电聚焦( c i e f ) 【6 】和毛细管凝胶电泳( c g e ) 【7 】模式出现。在1 9 8 8 年 c e 的商品化仪器开始逐步推出，第一届国际毛细管电泳会议于1 9 8 9 年在美国的 波士顿召开，标志了一门新的分支学科的产生【l 】。 近年来，毛细管电泳的理论和技术取得了很大进展，其中建立新的分离模式 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳( c a e ) ，亲和毛细管电泳技 术( a c e ) ，芯片毛细管电泳( c c e ) ，非水毛细管电泳技术( n a c e ) 。毛细管 电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域的应用也有较多应 用。随着毛细管电泳技术的不断发展和完善，c e 将在临床研究和基础研究领域 发挥更重要的作用，使人们看到这一新技术的重大价值和广阔的应用前景。 1 1 2 毛细管电泳基本原理 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分 之间的淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳 最基本的仪器结构如图1 1 所示。在电解质溶液中，带电粒子在电场的作用下， 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称作电泳。同时，由于毛细管内 壁与缓冲溶液接触的界面形成双电层，导致毛细管内的溶液在外加电场的作用下 整体朝一个方向运动，即在高压电场的作用下，形成指向负极的电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，e o f ) ，见图1 2 。由于电渗流的速度比电泳速度快5 7 倍，因此 毛细管电泳利用电渗流可将正、负离子和中性分子起朝一个方向移动，而正、 负离子迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。由于样品各组分间迁移速度的不 同而实现分离，这就是c z e 分离的原理。而各组分按其迁移速度的大小顺序， 图1 - 1 毛细管电泳基本装置示意图 2 电极 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 + 正极 昌冒黔猡昌留；留黔猡昌穹昌 嘏伊n 书 韶i 宅+u + o 手_ 沪 禽震总暴怠翳禽雕i 晶铽禽昆鬟 图1 2 由毛细管壁引起的电渗 依次到达检测器分别检测，得到按时间分布的电泳谱图。分别以组分的迁移时间 ( t m ) 和峰高( h ) 或峰面积( a ) 作为定性和定量分析的依据。 电渗流的方向决定于毛细管内壁表面电荷的性质。在多数水溶液里石英和玻 璃毛细管表面因硅羟基( s i o h ) 解离产生负的定域电荷s i o ，其结果使产生指 向负极的电渗。所以，一般情况下石英毛细管内壁表面带负电荷，电渗流方向从 阳极流向阴极。反之如果将毛细管壁表面改性，例如在壁表面涂渍或者键合一层 阳离子表面活性剂，或者在内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使毛细管 壁带正电荷，壁表面吸引溶液中的阴离子使溶液表面带负电荷，在外电场作用下， 整个液体向阳极流动。 电渗流的控制是c e 研究中的关键，它可以控制组分的迁移速度和方向，直 接影响到c e 的分离效率和重现性【8 1 。影响电渗大小的因素很多，例如电场强度、 毛细管内径和管壁性质、缓冲溶液组成及其p h 值、温度等。稳定电渗是提高分 离重现性的关键，改变电渗的大小则可以调节分离度，提高选择性，从而使组分 达到最佳的分离。 由于毛细管内壁表面扩散层的过剩阳离子均匀分布，液体流动速度除在管壁 附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等，所以在外电场力驱动 下产生的电渗流为平头塞状( 图1 3 a ) ，它使整个流体像塞子一样以均匀的速 度向前运动，几乎不引起样品的区带展宽，这和靠泵驱动流动相的h p l c 的流型 ( 图1 3 c ) 完全不同。能够克服h p l c 中泵推动产生的抛物线流形导致的溶质 区带扩散作用，这也是毛细管电泳能获得高分离效率的重要原因。 3 中山大学硕士论文 天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 +霪 夏 图1 3c e 中的电渗流形和h p l c 中的泵推流形及相应的溶质区带 a ：电渗的塞状流形b ：c e 中的检测区带分布 c ：泵推动抛物线流形d ：h p l c 中的检测区带分布 和色谱相同，毛细管电泳中的分离度也用r s 表示，它是指表观淌度相近的 两组分分开的程度。按照色谱理论，组分l ，2 的分离度等于两峰中心之间的距 离与两峰峰底宽度的平均值之比，即： 尺：丝：丝( 卜1 ) 5 w4 0 式中：此表示两峰中心之间的距离：形为两峰峰底宽度的平均值；盯为两 峰标准偏差的平均值。 通常，在毛细管电泳谱图上读出两相邻峰的迁移时间和它们的峰宽( w ) ， 按下式计算& 。 足= 2 0 m 2 叫“- f 吸) ( 1 - 2 )足=( 暇吸7( 1 ( + - 为峰底的平均峰宽( 以时间为单位计算) 。 1 1 3 毛细管电泳分离模式 到目前为止，毛细管电泳已经发展成为多种分离模式的技术，除自由区带电 泳和毛细管胶束电动色谱法外，尚有毛细管凝胶电泳、等电聚焦、非水毛细管电 泳、毛细管离子交换电动色谱、毛细管电色谱和毛细管等速电泳等，常见的毛细 管电泳的分离模式有六种。现将它们的特点和应用范围列于表1 1 。毛细管电泳 的多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会，这对复杂样品的分离分析 是非常重要的【。 4 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 表1 - 1 毛细管电泳的分离模式 类 名称缩写特点应用范围 型 又称自由电泳，溶质在背景电 毛细管区带电泳 解质溶液中以不同的速度迁移 ( c a p i l l a r yz o n c c 冱 而形成溶质带的电泳模式。管用于分离离子 中只允许充入缓冲液，由于电化合物 e l e c t r o p h o r e s i s ) 渗流，正负离子得到分离，而 中性溶质不能被分开【4 j 。 m e c c 是在缓冲液中加入离子 胶束电动毛细管色谱 型表面活性剂如十二烷基硫酸除能分离离子 ( m i c e l l a re l e c 竹o l d n e t i cm e c c钠，形成胶束，被分离物质在 化合物外，还能 水和胶束相( 准固定相) 之间发分离不带电荷 c a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ) 生分配并随电渗流在毛细管内 的中性化合物。 迁移，达到分剐9 。 采用两种不同的缓冲液，一是 先导电解质，置于整个毛细管 用于分离离子 中，其淌度高于样品各组分； 型物质，目前应 毛细管等速电泳 c i t p 二是后继电解质，置于一端电 用不多，常用作 ( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ) 泳槽，其淌度低于样品各组分， 柱前浓缩方法 被测组分夹在中间，整个体系 空 以富集样晶【1 0 1 。 以同一个速度移动，使溶质按 其电泳淌度不同得以分离。 c i e f 模式是将普通等电聚焦电 泳转移到毛细管中进行，通过 管管壁涂层使电渗流减到最小， 毛细管等电聚焦以防止蛋白质吸附及破坏稳定主要用于蛋白质1 ( c a p i l l a r yi s o e l c c t f i c c i e f的聚焦区带。在高压作用下， 分离和在异构酶 f o c u s i n g )毛细管内建立p h 梯度，蛋白质 鉴定、 在毛细管中向各自的等电点聚 焦，形成明显区带，再通过检 测器分别加以确认。 非水毛细管电泳 以有机溶剂完全代替水作为电 ( n o n a q u c o u s n a c e泳介质【l l 】，扩大了分析对象的 用于强疏水性 范围，为c e - - m s 方法提供了样品的分离。 c a p i l l a r ye l e c t r o p h r e s i s ) 更多的优势。 在毛细管中装入单体，引发聚 用于d 1 妣、 合形成凝胶，c g e 分凝胶和无 r n a 片段分离 填 毛细管凝胶电泳胶筛分两类凝胶具有多孔性， 和顺序、p c r 产 ( c a p i l l a r yg e l c g e起分子筛作用，溶质按照分子 物分析及蛋白 充 大小进行分离。是c e 中柱效最 e l e c t r o p h o r e s i s ) 质等大分子的 管 高的一种模式( 1 0 7 理论塔板 检测。 数) s 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 以样品与载体之间的相互作用 毛细管电色谱为主要分离机制的电泳过程， 带电和中性物 ( c a p i l l a r y c e c 依据分配系数的不同得以分 质均可分析。 e l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y ) 离，综合了了c e 和h p l c 的优 势。 d n a 测序、多 多 阵列毛细管电泳 利用一根以上的毛细管进行平肽和蛋白质、寡 ( c a p i l l a r ya r r a y c a e 行c e 操作。核苷酸、单细胞 管 e l e c t r o p h r o s i s ) 等的分离检测。 利用微细加工技术，将h p c e 可采用类似空 移植到锄2 级大小的芯片上， 管和填充管类 芯片式毛细管电泳在芯片上加工出沟道和其他功 型的分离模式， 芯 ( c h i p - b a s e dc a p i l l a r y c c e能单元，实现样品的进样、分 实现小无机离 e l e c t r o p h o r e s i e ) 离和检测等过程。多功能、快 片子至生物高聚 速、高效、试样用量少的微型 物的快速分离。 实验装置。 常用电喷雾接口，需用挥发性 联毛细管电泳质谱 c e ，m s 应用生化领域 缓冲液 用 c e y 采用停顿式扫描样品峰的测定 技 毛细管电泳核磁共振 应用生化领域 n m r 方法 术 毛细管电泳激光诱导荧 c b l i f 具有细胞，单分子分析性能 应用生化领域 光 1 1 4 毛细管电泳进样方法 1 1 4 1 电动力进样 电动力进样是依据电泳与电渗流原理而被普遍应用于c e 进样的一种方式， 该方法是将样品溶于电导较小的缓冲液，当进样时，在离子强度低的稀缓冲液中 的组分，就处于电场强度较高的状态，运动比在管内大部分高电导的缓冲液中要 快许多。于是，样品中的阳离子( 如果进样端为正极时) 就会迅速迁移至样品液 与缓冲液的边界上，随后速度开始下降，阳离子便堆积在这一界面上形成一个被 浓缩了的区带，中性离子仍分布于整个样品液，而阴离子则浓缩在样品液的尾部 与后续缓冲液的界面附近。电动力进样进样方式的最大一个不足之处，就是进样 时存在组分“歧视效应”，即淌度大的组分迁移快，进样多，淌度小的组分则 迁移慢，进样少。电动力进样的动力来源于电泳介质本身，因此可用于高粘度样 品的分析，从而扩展了分析样品类型的范围，且所需要的进样装置较简单，因为 采用电压控制，操作灵敏度也增加了。在分析一些含量极小的组分时，为了提高 6 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 分析的灵敏度通常采用了场放大进样技术，这是电动力进样的扩展【1 2 】。 1 1 4 2 压差进样 压差进样技术通常有三种形式：重力虹吸进样法、毛细管进样端加压进样法 和毛细管尾端抽真空进样法。压差进样要求毛细管中的填充介质具有流动性，比 如溶液等。进样量大小的控制是通过改变毛细管进出两管口之间的位差或压差， 以及作用时间来实现的。但压力的大小受温度和机械精度的影响，很难准确控制， 这会造成进样的精确度与重现性不高。相对来说，虹吸进样法利用的是重力因素， 可用机械装置使毛细管的进样端与检测端口之间的位差得以准确控制，故其进样 量的重现性要比用压差的方法高一些。计算机控制的固定有毛细管进样端的升降 器，可使得操作更简便和准确【1 3 】。压力进样会引起拖尾峰而带来误差，也会在 另一方面增加分析误差【1 4 】。 目前，压差进样手段仍是各种毛细管电泳仪中最常具备的。但这种技术也存 在局限性，尤其对粘度大的样品液或凝胶等填充柱不甚适合。 1 1 4 3 扩散进样 扩散进样方式通过调整样品池高度，使其液面与毛细管出口端的液面严格水 平，利用进样端管口处样品溶质与毛细管中电解质缓冲液存在浓度梯度的原理使 样品组分直接扩散进入管内【1 5 】。因为该进样方法不采用电压，所以在一定程度 上，克服了因淌度不同产生的组分岐视。并且该方法具有较好的定量特性，较强 的抗样品基质干扰和一定的抗区带电场畸变的能力，但该种扩散方法使得工作效 率大大减慢了，应用上受到限制。 近年来也出现新的进样方式，如微注射器进样、微渗析进样、电分流进样、 进样阀进样等，虽然具有独特优点，但未能得到广泛采用。 1 1 5 毛细管电泳检测方法 由于c e 中使用内径很细的毛细管，对检测器的灵敏度要求很高，所以检测 是c e 中的关键问题之一。c e 发展初期，j o r g c n s o n 曾指出，c e 技术的广泛应 用与深入发展所面临的主要挑战是高灵敏度与多模式检测器的发展，也就是说， 7 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 c e 仪器的功能与应用范围，在很大程度上依赖于c e 检测器性能与水平的提高。 如何既对溶质作灵敏的检测，又不使其微小的区带展宽，这是c e 检测器的两个 最基本的要求。检测问题牵涉到一系列的理论内容，比如检测原理、响应特性、 直接检测、间接检测等等。几乎所有的液相色谱检测手段都在毛细管电泳中做了 尝试，因此种类繁多，按用途，有通用型和选择型，前者如示差折光，连续测定 流出物的折光系数，由于这是几乎任何有机物溶液都存在的物理量，因此对缓冲 液系统有广泛的适用性，但是它们的响应是基于溶质和缓冲液之间在这一参量上 的差别，因此灵敏度较低。后者如紫外、荧光、电化学检测器等，这些都是浓度 型检测，它们对被测物质的响应有特征性，而对缓冲液系统则很少有响应，因此 灵敏度较高。 在众多的c e 检测器中，u v - v i s 吸收检测器已趋成熟，所有商品c e 仪器都 配有，是最普遍使用的一种检测器。激光诱导荧光检测器、质谱检测器接口也已 推向市场。 1 1 5 1 紫外可见吸收检测检测( u 弘v i s ) u v - v i s 吸收检测法是c e 分离的一种常规检测法。按检测方式可分为固定波 长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。由于u v - v i s 吸收检 测器通用性较好，结构简单，加上商品吸收检测器己达到较高性能，因此，u v - v i s 吸收检测器是目前应用最广泛的一种c e 检测器。 u v - v i s 吸收在柱检测方法简单，多数有机和生物分子( 特别是多肽、蛋白 质等) 在2 1 0 n m 左右有很强的吸收，因此，这种检测器已接近通用性检测器。 但是，毛细管的短光程严重限制了它的灵敏度，一般检测限不低于l o 一，远远满 足不了越来越多的对低浓度和极微量样品分析的要求。因此，为了进一步降低吸 收检测限，提出了不少有关扩展吸收光程和提高吸收检测的新方法、新技术【1 6 1 。 将毛细管的检测部分，折成“z ”型或加热吹成泡状等，都是增加灵敏度的有效 措施【1 刀。 1 1 5 2 荧光检测 荧光检测器是c e 中用到的第二大类已商品化的检测器，和紫外检测器相比， 8 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 检测限可降低3 - - 4 个数量级，这是一类高灵敏和高选择性的检测器。荧光检测 器可分为普通荧光检测器、激光诱导荧光检测器【1 8 】( l i f ) 。激光诱导荧光检测 是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法。多数情况下，l i f 的检测限为1o 1 0 1 0 2 m o l l ，比常规u v 吸收法低5 6 个数量级。高灵敏度检测对c e 有着重要意 义，这意味着可以使用更小孔径毛细管，外加更高电场强度，获得更高的分离效 率。同时，也意味着可以处理更小量样品，使高效、快速的分离技术成为极低浓 度及极微量样品( 单分子和单细胞) 分离检测的有力工具。 r a m a t h i s 1 9 1 等用微管道深为5 0 p m 的电泳芯片，采用四路荧光检测，2 0 m i n 内完成了6 0 0 碱基对的测序，准确率达9 9 4 。不足之处在于，l i f 检测器价格 较贵，且对没有荧光的溶质，需将其衍生化，有柱前衍生和柱后衍生两种方式， 也可采用间接测定能量转移检测而无需衍生化。 1 1 5 3 质谱检测器( m s ) 1 9 8 7 年o l i v a r e s 2 0 1 首次报道了c e 与m s 的联用技术，由于它可以弥补c e 定性鉴定的不足之处，因此发展非常迅速。质谱本身就是一种重要的分析手段， 质谱检测的原理与其他检测方法不同，它是根据分子的荷质比的不同达到分离的 目的。它不仅可以区分不同分子质量的分析物，还可以区分不同质量分裂模式的 分析物，具有很强的定性功能，在一次分析中可以获得很多的结构信息，分离手 段毛细管电泳和能提供组分结构信息的质谱联用，实现了分离与检测的“强强联 合 【2 1 1 ，是分析工作者追求的目标。由于毛细管电泳流动相体积小，因此，较 之高效液相色谱更易实现与质谱的连接。用于c e m s 的仅有快原子轰击和常压 离子化( a p i ，其中又可分为电喷雾e s i 和离子喷雾i s p ) 两种。接口设计有同 轴接口和液体连接接口，最常用的是如下两类：同轴连续流快原予轰击接口； 电喷雾电离接口。c e m s 特别适用于复杂生物样品的分离鉴定，在肽链序列 及蛋白结构、分子量测定等方面有卓越的表现，许多方面的研究正在开展，可以 预见这是最有发展前途的技术之一。 近年来，m o i n i 等【2 2 2 3 】对毛细管电泳和质谱的接口进行了研究，对分离和检 测多肽和蛋白质的混合物取得了满意的结果。 9 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 1 1 5 4 电化学检测器ce c d ) 电化学检测( e c d ) 是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的，与 光学检测相比，它有其独特的优点，质量检测限低、选择性好而且设备简单、价 格低廉。电化学检测器和激光诱导荧光检测器同为毛细管电泳中灵敏度最高的检 测器。根据检测原理的不同，电化学检测可分为电位法、电导法和安培法。安培 法测量化合物在电极表面受到氧化或还原时，失去或得到电子，产生与分析物浓 度成正比的电极电流。电导法和电位法是测量两电极间由于离子化合物的迁移引 起的电导率或电位变化。此外电化学检测都采用电极作为传感器，直接将溶液中 待测组分的化学信号转变为电信号，符合仪器微型化和集成化毛细管芯片电泳的 要求，因此作为微型全分析系统的集成化检测，电化学检测极具潜力f 2 4 】。 ( 1 ) 安培检测( a d ) 在众多电化学检测法中，安培法【2 5 】因其灵敏度高、检测体积小、仪器设备 简单而得到广泛应用。作为毛细管电泳检测器，安培法的基本过程如下：当毛细 管电泳分离的电活性物质流经电极表面时，在一定外加电压作用下，电活性物质 被还原或氧化，在溶液和电极间产生电荷转移，形成法拉第电流，该电流经放大 记录得到随时间变化的电泳图【2 6 ，2 7 1 。 为了克服毛细管内的电流对检测部分电流的影响，w a l l i n g f o r d t 2 8 】等首次提出 了离柱安培检测，即用一接头将分离与检测毛细管连接，使c e 分离电压和电流 与e c 检测系统相隔离，减小对e c 检测信号的干扰，因此，接头是该检测方式 的关键。根据目前文献报道，接头材料一般使用多孔玻璃和石墨、n a t i o n ，t e f l o n ， 钯管、醋酸纤维素膜以及毛细管蚀刻接头等。离柱安培检测可降低检测噪音，因 此可使用5 0 或7 5 p r n 等较大内径的分离毛细管，但离柱安培检测存在接头和超 微电极制作困难、区带增宽效应等问题。 柱端安培检测是将检测电极置于毛细管出e l 位置进行检测，是由h u a n g t 2 9 1 等首次提出的。一般认为使用内径小于2 5 p r o 的毛细管时，分离电压对检测噪音 无明显影响。柱端安培检测过程中需保持毛细管与电极准直，将毛细管末端用 h f 腐蚀，使出口直径扩大以及管壁减薄后，可方便准直，提高库仑效率，降低 1 0 中山大学硕士论文天然和人工合成甜味剂的毛细管电泳电导法分离检测研究 检测限。 谢天尧等d o 报道了一种新型检测技术方波安培检测法，在恒定电压上叠加 一个小振幅方波交流电压，测量方波后期通过电解池的交流电流而进行定量分 析，应用于检测多巴胺和去甲肾上腺素，二者取得了良好的分离，检出限分别为 1 ox1 0 刁和2 0x1 0 。v m o l l 。现已用此技术分离检测手性药物对映体【3 1 。3 1 苯二醇 的三种位置异构体卅。 ( 2 ) 电位检测法( p d ) 电位检测是利用离子选择性电极( i s e ) 对待测物质的选择性响应而定量的 一种方法。电位检测仪器简单，测量的线性范围宽，而且由于i s e 的内阻很高， 不易受高压电场的干扰，尤其现今离子选择性电极分析方法已获得了长足的发 展，利用离子选择性电极可以同时检测无机和有机离子【3 5 。7 】。但该方法的缺点是 i s e 的种类有限，因而可测定的物质仅限于几种简单的阴、阳离子，选择性较差。 电位检测还存在的问题是敏感电极使用寿命短，电极的抗污染能力比较差，离真 正实用还有较远的距离。 ( 3 ) 电导检测( c d ) 电导检测是根据两指示电极间在恒定的小电流通过时溶液电导变化进行检 测f 3 8 1 。原则上讲，凡离子状态的物质都可以用电导检测器检测，所以电导检测 器是一种通用型的检测器。它操作成本低，线性范围宽，死体积小。根据毛细管 电泳电导检测中的电极连接方式，