（果树学专业论文）农杆菌介导苹果转化AtGAI基因的研究.pdf

中文摘要 摘要：果树转基因中存在的问题除了转基因沉默和外源基因不能在果树生命周期中稳定表达外， 一个重要的限制因子是转化效率低，植株再生困难为了优化苹果离体再生体系与遗传转化体系， 提高果树基因转化效率，以宫藤富士苹果为试材，对其离体再生体系和农杆菌介导的遗传转 化体系进行了研究试验结果表明：以宫藤富士苹果茎段为外植体，分别在初代培养基( m s + 1 0 m s i 6 - b a + 1 0 0 m g l 抗坏血酸) ，继代培养基( m s + 1 0 m g l 6 - b a + 0 0 1 m g l n a a ) 、 生根诱导培养基( 1 2 m s + 1 0 m g l i b a ) 、生根培养基( 1 尼m s ) 进行初代培养、继代培养、生 根诱导培养和生根培养基可以获得富藤富士苹果再生植株；以宫藤富士苹果组培茁叶片 为外植体，在m s + 5 0m g l 6 - b a + 1 0m g l n a a 培养基上可以得到最高的再生效率，为7 3 3 ， 且叶片近轴面接触培养基对叶片再生的效果好于远轴面接触培养基。采用根癌农杆菌介导法将拟 南芥赤霉素信号传导负调节因子, , l g a 基因转入富藤富士苹果组织，经过抗生素筛选获得抗 性愈伤，分化获得再生植株，通过i c r 、p c r - s o u t h e r n 检测，证明a t g a 基因转入宫藤富士 苹果细胞中，得到转基因植株共计1 3 株，平均转化率为3 7 关键词；苹果，再生，农杆菌介导，叶盘法，遗传转化，a t g a 基因 a b s t r a c t a b s t r a c t ：d u r i n g 鼬t r e eg e n e t i ci n n s o r m a t i o n , b e s i d et r a n s g e n es i l e n c i n ga n di n s t s b l ee x p r e s s i o no f 自r a n s g e n ei nw h o l el i f ec i r c l eo f 鼬n e c t w oo ft h er a t e - t i m i t i n gs t e p sa i el o wr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y a n dl o wg e n ei r a l l 觚e re f f i c i e n c y ho r d e rt oo p t i m i z et h er e g e n e r a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m so f a p p l e ，t h e r e g e n e r a t i o ns y s t e m a n d a g r o b a c t e r i 咖d 皈妇时m e d i a t e d u a n a f o r m a t l o n o f a p p l e 缸l d o m e n c ab o r k h c y1 ：n j i w e i es t u d i e d t h el 戗m l t si n d i c a t e dt h a tw h e ns h o o ts e g m e n t sw e l l ：u s e da s e x p l a n t ss e e d l i n g s c o u l d b e i n d u c e d s t a g e b y s t a g e o n i n t r o d u c t i n n l n c d i u m ( m s + x 0 m g l 6 - b a + 1 0 0 m g l v i t a m i nqp r o l i f e r o u sr e 蹦n m ( m s + i 0m g l 6 - b a + 0 0 1m g l k m x r o o ti n d u c t i o nm e d i u m ( 1 2 m s + i 0 m g l n 3 a ) a n dr o o t i n g m e d i u m ( 1 2 m s ) w h e n l e a v e s o f 或a f i l i z e ds e e d l i n g s _ 眦u s e d 勰e x p l a n t ss e e d l i n g sc o u l db er e g e n e r a t e do rm s m c d b l ms u p p l e m e n t e dw i t h5 0m g l6 - b aa n d1 0 m g 几n a a a lt h eh g h c s tf r e q m - n c yo f7 3 3 m o r e o v e r , t h er e g e n e r a t i o nf e q u e n c yw a sh i g h e rw h e n t h el e a v e sw e r ep l a c e dw i t ha d a x i a ls i d ec o n t a c t i n gi d c d i n mt h a nw i t ht h ea b a x a ls i d ec o n t a c t i n g m e d i u m a r c , a 窖c t h e n e g a t i v e r e g u l a t o r i n a r a b l d o p s i s t h a l l a n a g i b b e r e l l i n , i g n a t i n g p a t h w a y w a s l r a n s f o r m e dt o f u j i a p p l e 初爿f 馈k d 盯f 啪t u m e f a c e n s t r a n s g e n i cs e e d l i n g s 懈t e s t e dt h r o u g h p c ra n dp c r - s o u t h e r n 1 3u a n s g e n i cs e e d l i n g sw c i eo b t a i n e da n dt h ea v e r a g et r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y w a s3 7 k e yw o r d s ：a p p l e , r e g o n e r a a o n , a g r o b a 棚纽m e f a c e n sm e d i a t e d , l e a fd i t r a n s f o r m a t i o n , a t g a 缩略词 m s ：m u m s h i n ga n ds k o n gm s 基本培养基 2 , 4 - d ：2 , 4 - d i c h l o r o p h o x y a c e t i ca c i d2 , 4 - ：氯苯氧乙酸 6 - b a ：6 - b e n z y l a d e n i n e 6 _ 苄基腺嘌呤 t d z ：噻重氮苯基脲 a m p ga i n p i c i l l j n 氨苄青霉素 b l a s t ：( t h e ) b 疵l o c a l a l i g n m e n t s e a r c h t o o l 基本序列比对工具 b p ：b a s ep a i r 碱基对 b s a ：b o v i n e s e r u m a l b u m i n 牛血清白蛋白 r i f tr i f a m p i n 利福平 c e i lc e f o t a x i m e 头孢霉素 c r a b ：c c 蛳m y l 姐皿o n h mb r o m i d e 十六烷基三乙基溴化钠 d d h 2 0 ：d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d e p c ：d i e t h y p y m c a d n a t e 焦碳酸二乙脂 d n a ：d c o x y n b o n u c l e i c a c i d 脱氧核糖核酸 e i y r a ：e t h y l e n e d i n i l r i l o t e t r a c e f i c a c i d 乙二氨四乙酸钠盐 阳y r ：h y g r o m y c i np h 嘴p h a 岫n s 矗n 潮霉素磷酸转移酶 h y g ：h y g r o m y c l n 潮霉素 i p t g - i s o p r o p y l t h i o - 8 - o - g a l a c t o p y r a n m i d e 乙丙基硫代半乳糖苷 k a n * * k a n a m y c i n 硫酸卡那霉素 k b ：k i l ob a s ep a i r 千碱基 k t ：k i n e f i n 激动素 n a a ：a - n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d 萘乙酸 n o s ：n o p a l i n es y n t h a s e 胭脂碱合成酶 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r n a ：r i b o n u c l e i c a c i d 核糖核酸 r p m ：r o u n d sp e rm i n u t e 转每分钟 u ：u n i t 活性单位 x - g a h5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 口- d - g a l a c t o p y r a n o s i d 5 溴4 氯- 3 - 吲哚半乳塘苷 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名： 毒产绢 时间：办甸年乡月三日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生躲崭俑 导师签名： 唾泛纽 时间：力邝7 年乡月三日 时间：扩哆年月反日 第一章文献综述 1 1 果树转基因研究进展 1 1 1 果树组织培养与再生体系建立的研究进展 1 1 1 1 果树组织培养研究进展 组织培养，广义上又称为离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生 质体等，通过无菌操作。在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术；狭义上指用植物各部分组织，如形成层，薄壁组织、叶肉组织，胚乳等进行 培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织经过再分化形 成再生植物植物组织培养与细胞培养开始于1 9 世纪后半叶。1 9 0 1 年m o t g a b 首先提出。细胞 全能性”的概念，随后德国植物生理学家h a b e r l a n d t 在“细胞学说”的基础上进行了离体细胞培 养实验，并于1 9 0 2 年发表了关于。植物离体细胞培养实验”的报告，证实了细胞全能性理论的 正确上世纪3 0 年代中至5 0 年代末，组织培养领域有两个重要突破，即发现b 族维生素对植物 生长的重要意义和发现生长素是一种天然的生长调节物质从上世纪年代起，随着植物学各 个领域如细胞学、遗传学、生理学、生物化学、植物病理学、发育生物学的研究深入，植物组织 培养有了飞速的发展植物组织培养技术已经与离体快繁技术、植物脱毒技术，植物器官和细胞 生物反应器、常规育种、基因工程育种、种质资源保存等紧密结合取得了可观的经济效益和社会 效益 果树组织培养根据植物细胞的全能性及果树的生物学特性，在离体条件下研究果树器官发生 及器官分化的规律，并对果树无性系快繁、花药培养、胚培养( 胚抢救) 、原生质体培养、细胞 融合( 体细胞杂交) 、果树脱毒技术及体细胞遗传学的原理和方法进行系统研究。以满足果树现 代生物技术的发展和生产上对良种繁育的需要 果树无性系快繁技术可分为以下几个阶段：初代培养，继代增殖培养，伸长及生根培养、驯 化移栽培养初代培养外植体的选择很重要，从目前组织培养已获成功的植物看。果树的生理状 态、发育阶段、取材部位、取材时间以及取材大小都直接影响到初代培养的成败不同的外植体 对培养基的要求不同，m s 、1 3 5 等基本培养基在果树初代培养中有较好的效果在所用生长调节 剂上，细胞分裂素以b a ，k t ，z r 、t d z 较为常用，生长素多用i a a 、n a a 和2 , 4 - d ，b a 和 生长素配合使用使外植体脱分化或腋芽萌动进行增殖在果树继代增殖培养基中b a 对芽的增殖 最有效，工作浓度一般在0 1m g l 到1m 班之间，细胞分裂素浓度过高，芽多但细弱，芽的质 量差甚至还会抑制芽的发生。生长素一般使用i a a 或n a a ，工作浓度在0 0 1m 玑到0 0 5m g l 之间，浓度过高对芽的增殖有抑制作用，并容易形成愈伤组织( 王艳等，2 0 0 2 ) 多数果树离体 培养都存在生根困难的问题，通常的生根方法有一步法生根和两步法生根，一步法生根指新梢直 接转入无激素的生根培养基中，两步法生根指在含有生长素的培养基中培养一段时间后再转入无 激素的生根培养基中，还可以将新梢基部浸在一定浓度的i b a 溶液中一段时间然后转入无激素的 生根培养基中，一般后两种方法更利于生根( 杨宁等，2 0 0 5 ) 花粉和花药培养主要用来获得单倍体植株木本果树由于多年生且杂合程度高，很难在短期 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 内获得纯系，因此，通过果树花粉和花药培养诱导单倍体，染色体组加倍后即可得到纯系，便于 研究遗传规律，提高选育效率同时还可以制造缺体和其它非整倍体，扩大遗传种质目前国内外 已先后在苹果、梨等果树上有成功的报道，中国农科院果树所杨振英等( 2 0 0 5 ) 从富士苹果 花药培养选育出高品质新品种华富。其果实近圆形，平均单果重2 3 6 5g ，风味酸甜适度，有 淡香，品质上等或极上等。 胚培养是果树组织培养中开展最早、应用最广泛的一项技术胚抢救技术解决了远缘杂交中 胚败育的问题，并为核果类早熟果树品种的选育提供了有效途径，因而成为果树育种改良的重要 手段之一b l a c k ( 1 9 9 8 ) 最早将胚胎培养技术应用于育种研究，随后国内外研究人员相继在杏、 桃、樱桃、葡萄、苹果、柿等树种上开展了研究并获得成功 原生质体指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分，它具备以下特点。每个细胞的原生质体都含 有该个体的全部遗传信息，在一定培养条件下具有再生成与亲本相似个体的全能性；原生质体能 克服细胞不亲和障碍，可以进行远缘体细胞杂交；原生质体还可以直接摄取外源d 0 t a 、细胞器、 病毒、质粒等，是进行遗传转化的理想受体；原生质体培养还可以用于分离、纯化突变体和种质 的超低温保存目前已经在柑桔、草莓、猕猴桃、苹果、杏、葡萄等果树上开展了原生质体培养 的研究，何道一等( 2 0 0 4 ) 以富士苹果单倍体试管苗幼叶和幼叶诱导的愈伤组织为材料制备原生 质体，采用液体浅层静置培养、琼脂糖固体培养及海藻酸钠球包培养获得原生质体愈伤组织，每 克愈伤组织可制备原生质体4 3 1 0 6 个，原生质体来源的愈伤组织分化频率达8 8 1 l i 2 果树离体再生体系的建立 果树离体再生体系的研究是细胞突变和遗传转化研究的基础，为果树品种改良提供了有效途 径。国外自2 0 世纪8 0 年代中期就开始果树高频再生体系的研究我国从1 9 7 0 年代起，就开始 了果树快繁体系和高频再生体系的研究虽然在果树苗木的组培工厂化生产方面，我国与欧美等 发达国家尚有差距，但在果树组培种类、果树组培快繁体系的建立等方面，一直处于国际先进水 平目前我国己在苹果( 何道一等，2 0 0 4 ；刘莹等2 0 0 6 | 王贵章等2 0 0 6 ) 、柑橘( 邓秀新等，2 0 0 0 ； 张键等，2 0 0 6 ；陆玉英等，2 0 0 6 ) 、梨( 孙清荣等。2 0 0 4 ；刘翠琼等，2 0 0 5 ) 、草莓( 秦永华等， 2 0 0 5 ；周厚成等，2 0 0 7 ) 桃( 阎国华等，2 0 0 2 ；李曜东等，2 0 0 3 ；韩明玉等，2 0 0 6 ) ，樱桃( i j u , e ta 1 ，2 0 0 2 ；王关林等，2 0 0 3 ；师校欣等，2 0 0 6 ) 、杏( 王鸿等。2 0 0 5 ) 、葡萄( 杨晓明等，2 0 0 6 ； 贺柱等，2 0 0 7 ) 、猕猴桃( 付志惠等，2 0 0 l 4 ；田娜等，2 0 0 7 ) 、番木瓜( 曾继吾等，2 0 0 3 ) 等果树上 先后建立了高频再生体系，部分果树如苹果、梨、草莓等再生效率可达以上影响果树离体 器官再生的因素很多，主要有培养基成分、外植体特性( 类型、处理方式) 、生长调节剂、基因型 等，其中任何一个方面的变化都会对再生过程产生重要影响，并最终影响外植体的再生效果 1 培养基的影响 基本培养基中的多种成分均影响再生效果w e l a n d e r 等( 1 9 9 2 ) 研究表明，苹果离体叶片培 养时m s 好于b ，tb 5 又好于改良n 6 酸枣、樱桃叶片培养适宜的培养基为w p m ( 孙清荣等，2 0 0 0 ， 2 0 0 1 ) 葡萄叶片培养多采用n n 6 9 基本培养基( 李云等2 0 0 2 ) f a s o l o 等( 1 9 8 9 ) 研究表明，培 养基中不同形态的氮源对再生的效果不同；不同类型的糖也对叶片再生有影响，以甘露醇最好， 2 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 其次为蔗糖，葡萄糖、果糖蔗塘在组织培养中较为常用，高的糖浓度( 约为7 ) 虽易于诱导 愈伤组织，但所诱导的愈伤组织致密坚硬，在继代培养时容易褐化w e l a n d e r 和f a s o l o 等( 1 9 9 2 ) 对不同种类的凝固剂试验结果表明，g e l r i t 好于琼脂，但琼脂成本低易于得到 2 外植体的影响 由于植物细胞具有全能性，可选用的外植体种类多样，包括叶片、茎尖，茎段、愈伤组织、 单倍体原生质体、体细胞胚、子叶、下胚轴等外植体的成熟度或培养时间也与再生能力密切相 关k o u i d e r 等( 1 9 8 5 ) 对苹果的研究表明，花后4 周不带种皮和胚乳的胚，只产生愈伤组织，6 1 5 周的胚可以产生多个不定芽，且生芽数随着时间延长而增多，到1 0 1 5 周每胚生芽数最高而且， 近成熟的新鲜胚再生不定芽较快。组培苗幼嫩的叶片再生效果较老叶好，其中以最上部3 4 片展 开的叶片效果最好( w e l a n d e r 乩na l 。1 9 9 2 ) ，以茎段为外植体时，组培苗最上部的2 个节问最 好此外，外植体处理和放置方式也会对再生结果产生影响 3 生长调节剂的影响 生长调节剂在植物发育过程中具有的重要作用，是植物发育和离体再生研究的重点不同生 长调节剂组合可以调节细胞分裂，芽增殖、愈伤组织形成等再生培养基中必须同时具有细胞分 裂素类物质和细胞生长素类物质细胞分裂素以6 - b a 、z t 、k t 、1 d z 较为常用，生长素多用i a a 、 n a a 和2 , 4 - d 孙爱君等( 2 0 0 0 ) 认为b a 与n a a 的比值是影响外植体的离体再生主要因素之一 高浓度的b a 及高b a - - 与n a a 比值有助于外植体分化不定芽，较高浓度n a a 则使外植体产生愈伤组 织，有利于建立更快、更有效的外植体再生体系自1 9 8 0 年以后，一种新型细胞分裂素类物质一 ，苯基脲衍生物1 d z 被广泛应用于植物组织培养在草莓t u d l a _ t 的研究表明，在诱导叶片再生不定 芽的试验中t d z 的效果明显优于b a ( 张志宏等，1 9 9 8 ) 但以m 1 4 为试材诱导叶片再生不定芽时 发现，1 d z 诱导的不定芽多呈丛状，不易分离，。玻璃化”较严重，且芽成苗较困难( 于冬梅等， 1 9 9 8 ) 而马哈利樱桃离体叶片再生诱导时1 d z 不如6 - b a ：有 效( 黄文江等，2 0 0 2 ) 4 基因型的影响 基因型是影响果树外植体再生的内在因素不同基因型的差异主要是核物质的不同，而相同 基因型的不同外植体之间，主要是细胞质的差异王关林等( 2 0 0 5 ) 认为同一类植物，尽管基因 型有属，种或变种的差异，但其对基本培养基的偏好及其主要成分具有同性基因型对茎尖培 养调控作用的差异不明显基因型对叶片的再生能力影响较大不同的基因型对最佳植物生长调 节剂组合有差异宁淑香等( 2 0 0 1 ) 比较了6 种樱桃砧木再生能力，发现不同的砧木品种培养基 具有共用性。但6 种砧木的再生能力存在差异，原因可能为6 种植物都属于蔷薇科李亚科李属的不 同种植物，虽然在同一培养基上都分化较好，但种间还存在着一定的差异，这主要由于同一属不 同种植物之间，基因型也存在着一定的差异所致 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 5 其他因素的影响 影响果树离体再生的其他因素还包括培养基的p h 值，培养基的其他化学添加物，如秋水仙 素、活性碳等，外植体的接种前处理，如消毒时间、消毒方式、黄化处理、外植体的放置方式以 及培养条件，如光照时间、光照强度、光照类型、是否需要暗培养、暗培养时间以及培养温度、 培养湿度等 1 1 2 果研遗传转化的研究进展 由于果树实生苗童期长、遗传背景相对狭窄、杂合程度高等原因，果树常规育种周期一般 较长( 约1 0 - 1 5 年) ，且很难预测子代的性状分离规律以筛选出目标性状，从而降低了育种效率， 不能满足生产发展的需要随着转基因技术迅速发展，果树品种改良也被注入了新的活力国外 果树转基因研究的开展较其它农作物晚，1 9 8 8 年第一株转基因核桃在美国诞生( m c g g a n a h a n , e ta l 1 9 黯) ，随后在苹果，柑橘、梨、草莓、欧洲李，桃、杏，葡萄，蔓越桔、猕猴桃、番木瓜、芒 果和香蕉等果树上也相继成功地实现了遗传转化，获得了转基因植株果树转基因技术的成功为 利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种莫定了实践基础。 1 1 工1 果树遗传转化的方法 植物遗传转化的方法很多，包括农杆菌法、基因枪法，电击法、聚乙二醇( p e g ) 法、显微 注射法、超声波法、脂质体法、碳化硅纤维介导法，微束激光穿刺法、病毒载体法和花粉管通道 法等目前在果树上应用的转化方法有农杆菌介导法，基因枪法，聚乙二醇( p e g ) 法、花粉管 通道法、电击法和微束激光穿刺法等，其中农杆菌介导法、基因枪法最为常用 ， 1 农杆菌介导法 农杆菌是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌它能在自然条件下趋化性地感染大多数 双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根根癌农杆菌( a g r o b a c t e d u mm m e f a d e m ) 和发根农杆菌( 胛曲4 c 细妇mr h z o g e n s ) 中细胞中分别含有t i ( t u m e r n d u c e ) 质粒和砒 ( r o o t n d u c e ) 质粒，其上有一段t - d n a ，在毒性( v r ) 区编码蛋白的参与下，农杆菌通过侵染 植物伤口进入细胞后，可将t - d n a 插入到植物基因组中因此，农杆菌是一种天然的植物遗传 转化体系研究人员将目的基因插入到经过改造的t - d n a 区，借助农杆菌的感染实现外源基因 向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术。再生出转基因植株农杆菌介导法起 初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物( 尤其是水稻) 中也得到 了广泛应用 目前，果树转基因最常用的方法是农杆菌介导的转化法最常用的含有t i 质粒的根癌农杆 菌菌株为l b a4 4 0 4 、e h a1 0 1 和e h a1 0 5 ，也常用3 2 8 ：t n 5 、a1 3 6 c 5 8 1 2 7 0 7 ；而常用的含有 撕质粒的发根农杆菌菌株有1 8 5 5 n c p p b 和a t c c l 5 8 3 4 通常使用的除菌筛选抗生素有羧苄青霉 素、头胞霉素、塞胞霉素等对转化细胞的选择，常用的抗生素有卡那霉素，胺苄青霉素、潮霉 素等仁果类果树以茎段或叶片为外植体，通过根癌农杆菌介导获得了转基因苹果、转基因梨等 4 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 ( q i l ，na l ，2 0 0 5 ；h o l e f o r s , na l , 1 9 9 8 ；刘庆忠等，2 0 0 1 ；达克东等，2 0 0 1 ) 核果类果树以胚 或下胚轴为外植体，通过农杆菌介导法，获得了桃、欧洲李和杏的转基因植株，建立起这3 个树 种的转化系统外，还把番木瓜环斑病毒( p r v ) 的外壳蛋白( c p ) 基因导入欧洲李，把洋李痘病 毒和c p 的基因导入杏( 马海军等，2 0 0 6 ) 一般说来，农杆菌v i r 基因诱导必须注意以下几点：( 1 ) 诱导培养基p h 介于5 0 6 0 之问 ( 2 ) 农杆菌培养温度应在2 8 c 3 0 c ( 3 ) 避免在培养基中含有酵母提取物“) 培养基中需含有较高 浓度的糖 2 基因枪法 基因枪法是由美国康乃尔大学生物化学系j o h n cs a n t o r d 等于1 9 8 3 年发明的该法又称为 高速粒子喷射技术( h i g h - v e l o c i t yp a r t i c l em i c r o p r o j e c 6 0 n ) 、粒子轰击( p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ) 或 基因枪轰击技术( g c g u nb o m b a r d i n g ) 这种方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因 基因枪根据动力系统可分为压缩气体、高压放电、火药引爆驱动三类原理是将d n a 吸附在金 属颗粒( 金粒或钨粒) 表面，通过动力系统将带有基因的金属颗粒以一定的速度射进植物细胞， 由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的它 具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点对于农杆菌不易感染 的植物，采用该方法可打破载体法的局限 基因枪法也常用于果树的遗传转化，目前已经在桃( y 岛na l ，1 9 9 4 ) 、葡萄( h e b e r t ，da l ， 1 9 9 3 ) ，香蕉( 王鸿鹤等，2 0 0 0 ) ，番木瓜( h l c 虬烈a 1 1 9 9 0 ) 、蔓越橘( s e r r e s , da l ，1 9 9 2 ) 、 荔枝( 桑庆亮等，2 0 0 1 ) 等果树上利用基因枪法获得了转基因植株例如，y e 等( 1 9 9 4 ) 用基因 枪轰击桃未成熟胚、胚轴、茎尖、叶片和长期胚性愈伤组织转【匕g u s n p o 口i 茨合基因，所有类型 的外植体均获得了船基因的瞬时表达，并在长期胚性愈伤组织中得到固定表达但是，基因枪 的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击 后培养有直接关系 1 1 二2 2 提高农杆菌介导的遗传转化效率的主要方法 i 选择适宜的外植体作为转化受体 在农杆菌介导的遗传转化研究中，同种植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农 杆菌的侵染具有不同的敏感性概括来讲，幼叶、幼胚、茎尖顶端分生组织，小孢子、愈伤组织、 悬浮细胞培养物等分生组织及细胞分裂活跃的组织对农杆菌的侵染最为敏感，适宜作为转化受 体，且一般认为，幼嫩的外植体比老的外植体好韩美丽等( 1 9 9 8 ) 建立枳壳上胚轴遗传转化系 统的研究中认为枳壳种子萌发2 0 天的上胚轴转化再生频率最高，可达1 5 5 ，随着苗龄的增加， 转化率下降，在3 0 和4 0 天时转化率分别为1 1 0 和5 9 但p a n g 等( 1 9 8 8 ) 在番木瓜上的研究表 明，老叶比幼叶更易受农杆菌侵染 5 2 筛选适宜的抗生素浓度 在植物基因转化中能够准确、有效地分离转化与非转化细胞，杀死非转化细胞且不干扰转化 细胞的正常生长，也不影响植株的再生，是转化成功的重要环节之一，也是提高转化效率的关键 步骤植物遗传转化中常用的筛选标记基因有：新霉素磷酸转移酶( n 聊) ，潮霉素磷酸转移酶 ( m 喊m h ) ，p 盯乙酰基转移酶( p a t ) 及二氢叶酸还原酶( d h f r ) 等基因在果树遗传转 化中使用较为普遍的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因a p t 口和潮霉素磷酸转移酶基f g h p t ， 前者编码蛋白可以抑制新霉素族的氨基糖苷类菌素( 抗生素) 的活性，如卡那霉素，新霉素等， 后者编码的蛋白能够抑制潮霉素的活性 3 选择适宜的培养条件 适宜的培养条件有利于农杆菌的侵染和转化细胞的生长不同的培养条件包括培养基的成 分，p h 值、激素种类及其比例、外植体在接种前是否需要进行预培养，共培养的方法以及是否 需要延迟筛选等外界环境因素还包括温度、湿度等 1 1 3 利用基因工程改良果树性状的研究进展 1 1 3 1 果树自身重要功能基因的克隆 国外自上世纪年代起就已经开始从果树上分离具有完整编码区的c d n a 序列，我国果树 基因克隆开展较晚，近年来，我国加强了对果树基因资源的研究及开发利用，从果树种质中克隆 了一批抗病、抗逆、与发育相关的基因，并应用于果树的基因转化工作如已在马哈利樱桃( 张 开春等，2 0 ) 、中国李( 李广平，2 0 0 6 ) ，梅( 李广平等，2 0 0 6 ；王家福等。2 0 0 7 ) 上克隆了 与抗真菌病相关的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因i g i p 与铁代谢相关的苹果铁结合相关基因 f c 】 t i 血( 叶霞等，2 0 0 6 ) 和苹果铁高效相关二价铁转运蛋白基因( 戚金亮，2 0 0 3 ) 与钙信号传 导有关的猕猴桃钙调蛋白基因( 任小林等，1 9 9 7 ) ，葡萄果实a c p k l 、c d p k 蛋白激酶基因和苹 果果实中的钙依赖蛋白激酶基因m d c p k i ( y 吐，e ta t , 2 0 0 6 ) 等与果实成熟相关的基因包括草莓 果实膜蛋白基因a n n f a f ( 王关林等。2 0 0 1 ) 、樱桃a c c 氧化酶基因( 壬俊英等，2 0 0 2 ) ，香蕉 g e t 基因( i j l 。e ta l , 2 0 0 4 ) 、荔枝乙烯受体, c e r s l 基因( 韩继成等，2 0 0 3 ) 等与花发育相关 的苹果m a p 2 基因( 周盛梅等，2 0 0 5 ) 苹果m d z f i 基因( c a o , e ta l , 2 0 0 4 ) ，草莓s a p 2 基因 ( 宿红艳等，2 0 ) 、桃m a d s - b o x 基因( 吴凡等，2 0 0 4 ) ，柿m a d s - b o x 基因( 丁燕等，2 0 0 r 7 ) 及无核荔枝m a d s - b o x 基因( 郑学勤等，2 0 0 5 ) 这些基因的克隆为进一步大规模分离果树基因、 进行基因功能的研究以及果树品质的改良、产量及抗逆性的提高莫定了坚实基础 6 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 3 2 国内外果树目标性状改良研究的比较 表格1 - 1 国内外果树遗传转化研究比较 t a b l e l - 1 0 加叩缸幽n o f f a 吐懈笋北t i c 协m 砥眦m 幽t 缸a i i n | 棚曲i o a d 转化目的 田内 重井 参：文 转入基因受体物种转入基因受体物种 一 执瘸菜豆几丁质酶基因、苹果、樱桃等抗真菌蛋白基因m o 血，植物凝集蠢基葡蕾，柑桔、撬、草莓、援 l 豇豆胰蛋白一抑崩园，几丁质酶基因、洋车瘟病毒( 即v ) 横杳，酞洲季，事，蔓越 嗣基因，抗菌肚基因的c p 基因番木瓜环蠹病毒p r v 的井充桔，苹果i t l 2 6 矮化砧等 辱蛋白c p 基因、t 髂v 外壳蛋白基因、c r v 外壳蛋白基因，c 俨基因，机菌肚基因 苹果抗火疫痛基因抗菌肚删基因， 乐菌肚基因等 抗虫 n 基因 抗珠性抗冻蛋白 阡 耐盐性甜菜碱脱氢目i 基因， 艰价酎盐基因 - l i f d 恤山 苹果集、甜橙， 取基因豇豆获蛋白曩抑制捆( c ，巧) 基因 草葺 柑描，蕾誓越 桔，洋桑、胡桃、 簟蕞，山檀、量 钩子、番木瓜， 花橄果、板栗簪 吝侧基因，s o d 基园草薯，破樱楗 草暮群豢撬 抗缺铁性番茄羲羹体基因 麓海囊 哪玎2 藏墙性状改 良 调节果实成 麓 改善果实鲜 或加工品 质 药物治疗性 转基因水果 d 棚或，啦苹果寮，轵，血埘基因a p l 基因，壹耳酮合成酶基甜橙、枳、草莓，番木瓜， 基因橇，甜樱撬、譬因番术瓜 o c 合成醇基因撬、棱撬 纛槐等 多囊半乳蕾醛酸醇橇，囊 基因、蛾氧化醇 基因 2 s m 承解酶基因、 o c 舍酶基因 o c树莓，葬猴槐，幌等 7 氧化酪基因 苹果蕾素基因、控制敝的反史基因、山苹果，蕾蕾、抽子 梨醇磷酸脱氢尊基因，囊胡萝h 蠢生物 合成基因 抗乙塑肝炎的卸， 0 墓因 番蕉 9 注参昔文慧l l 怠慧婷1 9 9 8 达克东等抛l 王关# 等，2 9 刘庆虐等。2 1 0 1 ；商哪吐_ a t , 1 9 9 $ i 吲_ 2 氐蜘棚l e t a t , 1 9 9 3 ；n i o 嗨矗山2 缸弛矗a 1 ，1 9 9 4 参考文献2 l 马拜军善2 1 1 0 6 | q - 嗵矗- k 1 9 9 7 , m 峨_ l l 1 9 9 8 参考文献，i 冯 最齐簪2 0 晒：o 曲蜘峨_ i t , 2 8 0 2 参考文献4 l 刘风华萼1 9 9 7 ；舞军蜂辞2 1 1 0 2 参考文献q u , _ a l l ，2 0 0 5 参考文献瑚i e 却嶂 c t 吐，1 9 9 s f 札一l ，2 0 0 1 ：日吨矗乙1 9 9 8 ；n p ed l 1 9 9 8 参考文献7 l 李瞳东等2 8 0 3 ；胡钟享簪2 8 1 1 6 ；m 叫_ i l 1 9 9 4 参考如魄s m m e t 山2 0 0 i ；1 砘e l 山2 0 0 6 tc 毗h 止2 f 1 0 2 参考文献9 l 蜀m 一_ - l 2 d 吁 7 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 l 抗病、抗虫、改良栽培性状以及调节果实成熟等方向是国内外研究的热点 从表1 - 1 来看，抗病育种是国内外转果树基因研究最主要方向之一国际上克隆了1 0 多种抗 病基因，如抗真菌蛋白基因o s m o t l n 、植物凝集素基因、苹果抗火疫病基因等，遗传转化的受体 物种也涉及1 0 种以上的果树树种( f m s l a d , c ta l ，1 9 9 5 ；s c o r z a , e ta i ，2 0 0 6 ；n o r e n , c ta 1 ，1 9 9 3 ； n o r e l l i , da 1 ，2 0 0 6 ；m 峨e ta 1 ，1 9 9 4 ) ；而我国克隆的抗病基因和培育的抗病果树树种相对较少 抗虫育种方面，厨基因是国内外抗虫育种中广泛采用的基因，我国利用皿基因转化获得了苹果、 柑橘、橙等1 0 余种转基因新材料，而国外的研究主要集中在草莓等果树上( 马海军等，2 0 0 6 | g i a h a m ，e ta l , 1 9 9 7 ；d a n d e k a r , e ta l ，1 9 9 8 ) ；且国外更注重抗虫新基因的开发，如豇豆胰蛋白酶 抑制剂( c p f n ) 基因等利用转基因技术改良果树栽培性状以及调节果实成熟期也是国内外共同 关注的研究领域，克隆的相关功能基因较多，培育的转基因果树也较多( h o l e f o r s , da l ，1 9 9 8 ；p c n a , c ta l ，2 0 0 1 ；m u c h , e ta l ，1 9 9 8 ；n e u p a n e , c la 1 ，1 9 9 8 ，李耀东等，2 0 0 3 | 胡钟东等，2 0 0 6 ；m c t h e a s , e ta l 。1 9 9 4 ) ，只是研究的果树树种各有侧重，这主要与各国果树资源和生产中主栽树种有关系 2 发达国家日益重视开发果实品质改善和药物治疗性的转基因水果新品种 发达国家果树育种目标从提高产量逐渐向追求质量改善转变，转基因果树育种则为改善果实 鲜食或加工品质提供了新的途径如转入提高糖含量和类胡萝 索含量的基因，从而培育出相关 转基因苹果( t e o 。c ta l , 2 0 0 6 ) 、柚子( c o s t a , e ta l , 2 2 ) 等新品种通过食用转基因水果就能预 防或治疗某种人类疾病，从而使转基因果树成为植物生物反应器的一个重要研究方向，也成为了 发达国家重视的方向，如能生产抗乙型肝炎疫苗的转基因香蕉已培育成功( k u m a r , e ta l 。2 0 0 5 ) 3 提高抗逆性是我国果树转基因育种研究的重要方向 面对不断恶化的生态环境，为从根本上解决低温、干旱和盐碱等非生物胁迫对果树生长发育 的不良影响，培育抗逆性强的果树品种是我国转基因果树育种研究的一个重要方向如通过转入 抗冻蛋白a f p 培育出具有一定抗冻性的转基因杏( 冯殿齐等，2 0 0 5 ) ，转入甜菜碱脱氢酶基因、 双价耐盐基因等培育出具有抗盐性的转基因草莓( 刘风华等，1 9 9 r 7 ) 、猕猴桃( 樊军锋等，2 0 0 2 ) 等果树，转入番茄铁载体基因的八棱海棠能够提高抗缺铁胁迫性( q u ，c ia l ，2 0 0 5 ) 总体来看，我国果树转基因研究已经进入国际先进行列，在抗病、抗虫、抗逆性等转基因研 究领域已经取得了重要进展，但是在果实品质等研究领域则相对缺乏对于我国未来转基因果树 研究影响最大的是我国克隆的具有自主知识产权的功能基因较少，往往是一个基因在十几个物种 中开展遗传转化；此外遗传转化效率较低，也在一定程度上制约了我国转基因果树研究取得更大 进展。因此，当前的研究重点应放在利用我国丰富的果树种质资源克隆果树自身重要功能基因， 提高基因转化效率以及开发转基因新技术上。 8 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 2 1 苹果转基因研究进展 2 1 1 苹果高频再生体系的建立 苹果高频再生体系建立的研究中，多以叶片为外植体。但也有苹果茎段，茎尖以及原生质体 再生的报道王贵章等( 2 0 0 6 ) 报道了苹果主栽品种长富2 黄化茎段再生不定芽的研究，该小组 比较了m s 、1 2 m s 及n 基本培养基与6 - b a 、n a a 不同处理组合对长富2 黄化且无腋芽的节间 茎段再生效率的影响，筛选得到最适培养基为m s + 6 - b a 5 0 m g l + n a a o a m g l + c h 2 0 0 m g l + 蔗糖3 0g l + 琼脂7g l ，再生频率可达8 3 师校欣等( 2 0 0 4 ) 研究了黑暗培养对新红星苹 果茎尖分化和不定根诱导的影响，发现一周的黑暗培养效果最好何道一等( 2 0 0 4 ) 报道了苹果 单倍体原生质体培养再生植株的研究，该小组以富士单倍体试管苗幼叶及幼叶诱导的愈伤组织为 材料制各原生质体，并在分化培养基上诱导原生质体来源的愈伤组织再生不定芽，其分化频率达 到8 8 秦玲等( 2 0 0 2 ) 认为t d z 浓度在1 0 - 2 0m g l 时2 0 0 1 富士离体叶片分化不定芽的频 率可达1 0 0 于丽艳等( 2 0 0 5 ) 报道乔纳金苹果试管苗叶片在m s + b a 4 0 m g l 1 0 m g l + i a a 0 2m g l 的分化培养基上不定芽的再生效率可达1 0 0 0 4 综上，影响苹果离体再生的因素很多，包括基因型、培养基、叶片发育阶段及生理年龄、暗 培养等。尽管在过去的几十年中，苹果叶片培养再生技术已取得了相当大的进展, i f 多品种都已建 立稳定的再生系统，但也存在不少亟待解决的问题。苹果叶片高频率多芽再生体系的建立需进一 步研究，许多苹果的不同基因型品种再生效率还很低，有待科研人员进一步探索 2 1 2 苹果遗传转化研究进展 自1 9 8 9 年英国e a s tm a i l i n g 园艺研究所的j a m e s 等首先报道苹果遗传转化取得成功以来，导入 苹果的外源基因菜豆几丁质酶基因( 赵慧等，1 9 9 8 ) 、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( 达克东等，2 0 0 1