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浙江工业大学硕士研究生学位论文 m t b e 对三种单细胞淡水藻的毒性研究 摘要 甲基叔丁基醚( m t b e ) 作为一种汽油添加剂，因其能提高辛烷值、 减少尾气污染物而被广泛使用。然而，m t b e 的泄漏及其稳定性、迁移 性和毒性，已对水环境和人类造成危害。国内外有关m t b e 对藻类的毒 理学研究并不多见，因此研究m t b e 对藻类的毒性效应具有重要意义。 本文以椭圆小球藻、螺旋鱼腥藻和水华束丝藻作为试验藻种，对 反映藻类生物量的指标( 干重、叶绿素a 含量和藻液在6 8 0r i m 处的吸光度) 进行对比，结果表明吸光度是反映藻类生物量的一个良好指标。 以吸光度为测试指标，研究了m t b e 对藻类的急性和慢性毒性影 响。急性毒性以9 6 h - e c 5 0 值为评价指标，结果表明，m t b e 对椭圆小球 藻与水华束丝藻的急性毒性较接近，但小于对螺旋鱼腥藻的毒性。慢 性毒性则以1 0 1 5 天为实验周期，测定m t b e 对藻类生长的影响。发现 较低浓度m t b e ( 、 4 8 0 4 7 青鳓o r y z i a * l a f i p e s 最低观察到作用浓度l o e c ( $ d ) 2 6 0 0 4 8 青鳊o r y z l a sl a t i p e s ( 小于1 天的胚胎) 最低观察到作用浓度l o e c ( 1c 1 ) 1 9 3 2 4 8 虹鳟o n e h o r h y n e h u sm y k i s s 半数致死浓度l c 5 0 ( 9 6h ) 8 8 7 4 9 虹鳟o n c h o r h y n c h u sm y k i s s 半数致死浓度l c 5 0 ( 9 6i l ) 1 2 3 7 4 4 无脊椎动物i n v e r t e b r a t e s ： 轮虫b 阳c 咖们勖馏 半数致死浓度l c 5 0 ( 2 4h ) 9 6 0 4 7 桡足类n i t o c r a s p i n i p e s 半数致死浓度l c s o ( 9 6 h ) 1 0 0 0 1 5 1 大型蚤d a p h n i am 口g m 半数致死浓度l c 5 娜h ) 6 8 l “ 大型蚤d a p h n i a 昭m 半数致死浓度l c 5 0 ( 9 6h ) 5 4 2 4 9 大型蚤d a p h n l a 昭m 1 1 4 效应浓度e c 2 5 ( 9 6h ) 5 7 4 9 】 淡水糠虾驴括肼e r c e d z s 半数致死浓度l c 5 0 ( 9 6h ) 2 3 6 1 4 7 海水糠虾的g 娩p 拈b a h i a 半数致死浓度l c s o ( 9 6h ) 1 3 6 4 4 1 1 5 藻类在生态毒理学中的应用 藻类在水生和土壤生态系统中起着举足轻重的作用。作为水生生态系统的初级 生产者，藻类能通过光合作用为无脊椎动物，鱼类、水鸟等生物提供0 2 、食物， s 第一章绪论 其种类多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能。藻类又是土壤生 物区系的重要组成类群，在土壤中的含量一般为1 0 3 - 1 0 5 个克土壤。藻类在土壤生 态系统中的生态作用与土壤肥力的关系非常密切。蓝藻的固氮作用是土壤肥力的 主要生物来源，固氮能力可达1 5 - 4 9k g , ，h a t 5 7 1 。 藻类与周围环境形成统一的整体并且相互影响，因其个体微小( 一般小于2 0 0 um ) ，比表面积较大，因此藻类对环境变化十分敏感。藻类个体小、繁殖快，对毒 物敏感，在较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平上的影响评价。 而且在一水生态系统中，藻类的种类组成依赖于不同种的敏感性，若一藻种对某 种毒物比较敏感，当这一水体被此毒物污染时，较敏感的藻种首先受到影响，进 而消失。这样，利用水体中藻类的组成，可以预测水体受污染的程度。而且这些 被测试的藻类如果在生态系统的测试中被包含进去，可以提高测试系统预测最敏 感生态系统反应的能力【5 8 】。因此许多国家在化学品风险测试中选用藻类进行生物 测试，并建立了多个藻类生物测试标准方法1 5 9 , 6 0 l 。 现在，利用藻类进行生态毒理学研究得到高度重视，并被广泛的应用于对污 染物生态风险评价。在藻类毒性测定中，常用方法有o e c d ，i s o 和u s e p a 标准测 试方法，在我国还有我国国家环保局制定的标准方法。 藻类的急性毒性测试有多种不同的方法：静态测试法、改进静态测试法、连 续流动或间断流动测试法和原地测试法。各种测试法各有优缺点，根据不同的测 试日的选择不同的测试试。比较不同化学品对生物的毒性一般使用静态测试法， 其中藻类的培养又有瓶法、开口试管法和微盘法。在瓶法培养过程中，藻类的生 长密度迅速使藻类对碳的需求超过c 0 2 从气相进入液相的速度，从而使培养基p h 值升高，这种情况在藻类培养的三天内即可出现。为了保持藻类毒性测试过程中 的p h 值恒定，允许的p h 值变化不得超过1 5 。也有用开口试管测试法来避免p h 对测 试结果的影响。 在中国国家环保局规定的藻类毒性测试中，推荐使用的藻类为：普通小球藻( c v u l g a r i s ) 、蛋白核小球藻( cp y r e n o i d o s a ) 、斜生栅藻 o b l i q u u s ) 、羊角月牙藻 c a p r i c o r n u t u m ) 和四尾栅藻强q u a d r i c a u d a ) 。其中羊角月牙藻被认为对毒物较为敏 感，而普通小球藻和蛋白核小球操对毒物的抗性较强。在藻类生态毒理学研究中， 除了采用以上藻类以外其它藻类有被使用。本实验选择绿藻门小球藻属的椭圆小 球藻( ce l l i p s o i d e a ) 、蓝藻门鱼腥藻属的螺旋鱼腥藻s p i r o i d e s ) 和束丝藻属的水华 9 第一章绪论 束丝藻翻f l o s - a q u a e ) 作为测试生物，不仅因为这几种藻是“水华”发生期的优势 藻种，都适用于以生长繁殖或生理生化为指标的生物测试，而且国内外对这三种 淡水单细胞藻的毒性研究鲜有报道。 有毒化合物在生产、销售、运输、使用、储存和废弃等各个环节都会造成对 环境的污染，这已成为全球性环境问题之一。过去大量的报道只见于对非靶生物 如鸟类、无脊椎动物、鱼类、哺乳动物的影响及其毒理学研究。近十余年来，随 着对有毒物质的生态效应的研究由单一物种向生态系统整体效应的更大关注，有 毒化合物对生态系统的初级生产者一藻类的毒性及其生态毒理学研究引起了国内 外学者的广泛重视。有毒化学品对藻类的毒性数据，在其使用及废水排放与治理 中均有重要的参考价值，因此开展有毒化学品对藻类毒性的研究，不仅对于深入 了解有毒化学品对单种藻类和藻类群落的毒性效应以及对农药的生态风险评价而 言是重要的，而且对于认识有毒化学品对生态系统结构和功能的整体效应，揭示 有毒化学品在生态系统中的迁移和转化规律，以维护生态系统的健康进而维护人 类健康也有重大理论意义和现实意义。 1 2 研究目的和内容 1 2 1 研究目的 通过模拟自然水体中藻类的生长情况，研究m t b e 对藻类的影响，包括急性 和慢性毒性的研究，为m t b e 在淡水环境的污染控制和治理提供基础数据和理论 借鉴。同时，可为m t b e 对环境的影响以及在环境中的安全使用提供决策依据， 使之在生产、流通与使用过程对生态环境和人类健康的危害降低到允许或可接受 的水平。 由于实际环境中，生物体往往是同时或先后受到两种或两种以上有毒有害物 质的共同作用，因此，研究多种有毒化合物对受试生物的联合毒性很有实际意义， 目前开展的研究也很多。雌二醇作为一种活性较强的环境雌激素，其对生物的危 害，以水生生物居多，但在目前，m t b e 与雌二醇对藻类联合毒性效应，国内外尚 未见报道。因此，开展这方面的研究具有重要意义。 利用生长模型描述藻类在实验室模拟环境下的生长过程，研究了不同浓度 m t b e 对藻类生长的影响。目前，尚未见到有关m t b e 存在条件下藻类生长模型报 1 0 第一章绪论 道，本文提出的生长模型可以预测不同m t b e 浓度条件下淡水藻类的生长情况，这 对于研究污染物对浮游植物生长的影响有重要的实际意义。 本实验可为水体生态风险评价和水环境保护提供更为科学的依据，为复合污 染物排放标准的制定提供参考。 1 2 2 研究内容 ( 1 ) 藻种各生物量测试指标的相关性 对藻液干重、叶绿素a 含量等反应藻类生长量的指标进行了测量，并与藻液 在6 8 0n l n 处的吸光度进行对比，建立干重、叶绿素a 含量与吸光度的线性关系， 以验证吸光度指标的准确性。 ( 2 ) m t b e 对藻类的单一毒性 以藻液吸光度作为测试指标，测试m t b e 对藻类的急性毒性，以9 6 h e c 5 0 值 为指标，并据此计算m t b e 对藻类的最低有显著影响有效浓度l o e c 、最高无显 著影响有效浓度n o e c 以及最大可接受毒性浓度m 朋陀值。同时，研究了m t b e 对藻类的慢性毒性( 实验周期为1 0 - q 5 天) 。 ( 3 ) m t b e 与雌二醇对藻类的联合毒性 在单一毒性的基础上，测定m t b e 与雌二醇二元混合物在不同配比( 毒性单位 比为1 ：l ，1 ：4 ，4 ：1 ，2 ：3 和3 ：2 ) 下的联合毒性效应。采用毒性单位法盯u ) 、相加指数 法0 蛳和混合毒性指数法( m t i ) 评价了混合体系对椭圆小球藻和螺旋鱼腥藻的联合 毒性效应。 ( 4 ) 试验藻种生长模型的研究 利用l o g i s t i c 生长模型描述椭圆小球藻、螺旋鱼腥藻和水华束丝藻在不同 m t b e 浓度下的生长过程。 1 2 3 课题的创新之处 目前国内还未有m t b e 对藻类的毒性数据，这一研究领域尚属空白。国外虽 有不少m t b e 对藻类的毒性数据，但鲜有关于其慢性毒性以及联合毒性方面的研 究。尽管国内对m t b e 污染水体的问题，尚未引起足够的重视，但人们终将面临 环境水体受到m t b e 污染的现实。本研究可以填补这一空白，为m t b e 对淡水环 境的污染控制和治理提供理论基础。 此外，国内外关于本实验所选藻种的毒性研究亦寥寥无几 第一章绪论 1 3 课题来源 本课题得到国家自然科学基金项目m t b e 微生物降解的机理与活性增强 ( 2 0 4 7 6 0 9 9 ) 和浙江省自然科学基金甲基叔丁基醚微生物降解过程的研究 ( y 5 0 4 2 7 2 ) 的资助。 第二章实验材料 2 1 实验藻种 第二章实验材料 本研究以椭圆小球藻( c h l o r e l l ae l l i p s o i d e a ) 、螺旋鱼腥藻( a n a b a e n as p i r o i d e s ) 和水华束丝藻p _ i z 鲫伽忉伽捍月盼唧獬力三种单细胞藻作为测试生物，均购于中国 科学院水生生物研究所。其中，螺旋鱼腥藻和水华束丝藻的种群密度总和在“水 华”发生期占据绝对优势。 2 2 化学试剂 ( 1 ) 毒性实验的标准样品 雌二醇用丙酮溶解，配制成2g l 的储备液置于4 冰箱中备用。m t b e 在 实验前直接用蒸馏水配置成所需浓度备用。 表2 - 1 药品列表 1 阻b l e2 一lt h el i s to f e h e m i c a i s ( 2 ) 化学试剂 表2 - 2 试剂列表 t a b l e2 - 2t h el i s to fr e a g e n t s 第二章实验材料 成分 浓度( g l ) e d t a f e 配方 2 4 主要仪器及设备 表2 - 4 主要仪器和设备列表 t a b l e2 - 4t h em a i na p p a r a t u sa n de q u i p m e n t s 1 4 第二章实验材料 第三章实验准备 3 1 藻类的培养 第三章实验准备 3 1 1 藻类的接种培养 固体斜面上的原种必须经过接种和驯化培养后才可以用于试验。即将原种移接 到盛有新鲜无菌的s e 培养液的锥形瓶中，锥形瓶置于摇床( 转速1 2 0r r a i n ) 荡培养， 白色荧光灯均匀持续光照，光强为3 ，0 0 0l u x ，温度2 2 2 ，p h 为7 0 0 2 ，c 0 2 通气培养或自然空气培养。待大量繁殖后( 9 6h 移种一次) ，离心弃去上清液，将所 得藻再次接入新鲜培养液中培养。如此反复接种3 - 5 次后，如镜检细胞生长正常 而纯净，方可用作测试材料。离心收集藻类，用n a h c 0 3 ( 1 5m g l ) 溶液悬浮洗涤3 次后，接入适量培养液中制成待试藻种。 3 1 2 藻类的同步化培养 用作生物测试的藻必须是处于对数期并且是同步化生长的细胞，因此在正式测 试之前，首先要进行藻类的同步化培养。同步化培养是指用适当的方法，使一个 藻群中各个体都从同一阶段开始生长，并在同一步调下生长发育，通过生活史中 各阶段，再恢复到最初开始生长的阶段。要使藻细胞达到同步化生长，可以通过 变换光暗周期、温度和营养条件等方法来实现。国外从1 9 5 3 年起，田宫等首先获 得小球藻的同步培养成功【6 ”。目前最常用的方法是改变光暗周期，又称l - d 处理， 即当藻液达到对数生长期时，采用暗处理；细胞在暗中一段时间后，数目开始下 降，马上用新鲜培养基稀释到最适浓度，然后再进行光照并镜检。在细胞数目尚 未发生任何增长时再用暗处理。在暗中子细胞释放结束后，进一步稀释到适当数 目，此时可能会有新的周期开始。经过这样3 - 5 个循环，培养物可达同步。达到 同步化生长的藻类，即可用于毒性实验。 3 2 生测指标的确定 藻类对有毒化学品的反应表现为生理、生化、形态、亚显微结构和细胞遗传 等各个方面1 6 2 , 6 3 1 ，有许多指标可以采用，如藻液的吸光度、叶绿素a 含量、藻类生 1 6 第三章实验准备 物量( 干重或湿重) 、细胞密度、细胞生长速度和c 0 2 的吸收等 6 4 6 5 j 。为了快速、 准确利用藻评价m t b e 对环境的污染状况，生测指标的选择至关重要，而生长繁殖 是生物最基本和显而易见的生命现象，因此选用有关藻类生长繁殖的参数作为生 测指标具有较大的生态学意义和应用价值。干重是反映生物量最准确的指标；叶 绿素a 也是一个常用的反映生物量的指标，但叶绿素a 含量测定法操作相当烦琐， 耗费时间长，每提取测定一次大约需要一天时间，且该方法破坏样品，不适于连 续测定。干重法测定则需要特殊的过滤装备，因此价格昂贵，且费时较长。有人 研究表明绿藻藻液吸光度可反映绿藻的生物量，并且绿藻藻细胞数目与藻液吸光 度之间有很好的相关关系【6 6 , 6 7 6 8 】。 用分光光度法测藻类生物量，操作简单、耗时短，测定一份样品只需1m i l l ， 且测定结果重现性好，误差小；测定时还不破坏样品，特别适于连续测定，是一 种非常简便，有效的测定方法，可以替代其它测定方法。同时还由于藻液吸光度 是藻细胞数目、大小分布和光学特性的复杂函数，因此，为了快速而又准确地测 定藻类的生物量，本实验直接用吸光度表示藻细胞的生物量，并以此为依据计算 测试有毒化学品对藻类的e c s o 值，评价其对藻类的影响。但在吸光度的测量中， 有资料显示，个人所用的波长存在差异，有的选用4 6 0m 1 6 6 1 ，有的选用6 5 0 n m 6 7 , 6 8 , 叫，有的选用6 8 0 衄【7 0 7 1 1 ，还有的选用7 3 0 咖m l ，我们对三种藻的9 6 小 时培养物在4 0 0r i m - 8 0 0n m 波长范围内进行扫描，发现这三种藻的藻液在6 8 0n m 附近有最大光吸收，因此认为6 8 0n m 是比较合理的。为进一步确定吸光度指标的 准确性，同时对干重、叶绿素f l , 含量等指标进行了测量，并与藻液的吸光度进行 相关性分析，以确定它们与藻液吸光度之间的相关性。 取生长处于对数期的藻液，四层纱布过滤以除去悬浮物，接种到新鲜灭过菌 的s e 培养液中，混匀，使起始藻液吸光度o d 6 8 0 为0 0 1 ，然后分装到5 0 m l 三角 瓶，每瓶加液1 5i n l ，实验条件与藻类培养条件相同，培养4 天。然后取藻液，将 其稀释成7 个不同的梯度，每个梯度三个平行，分别进行干重和叶绿素的测定， 利用e x c e l 软件分别计算o d 6 8 0 与干重、叶绿素含量之间的线形回归方程。 3 2 1 干重的测定 干重测定采用常规法【7 3 1 。用4 7m m 干燥并已称重的玻璃纤维滤膜( w h a t m a a g f c ) 过滤已知体积的藻液，在1 0 5 下干燥2 4h 。在干燥器中冷却并称重。干燥 前后滤膜的重量差即为藻类的干重，即藻液干重( d w 户藻和滤膜总重量一滤膜重 1 7 第三章实验准备 量。 3 2 2 叶绿素a 含量的测定 按常规叶绿素测定法测定7 4 】，即取一定体积的试验藻液，置于离心管中，并 加入0 2m l 碳酸镁悬浮液( 1 ) ，上离心机离心( 3 ，5 0 0r m i n ) 1 0r a i n 后，弃去上清 液，将离心管底部的藻用少量9 0 丙酮洗入研磨器仔细研磨数分钟，将研磨后的 匀浆物移入具塞刻度离心管中，再用少量9 0 丙酮冲洗研杵和研钵，并入离心管 中，使最终提取液总体积小于1 0i i l l 。将离心管放入离心机内，在转速3 , 5 0 0r m i n 下离心1 0r a i n ，将上清液移入刻度离心管，用少量9 0 丙酮再冲洗沉淀物并离心。 这样操作再重复一次，每次离心所得上清液并入上述离心管内。最后将提取液定 容到1 0l n l ，将提取液倒入1c n l 光程的比色皿中，在分光光度计上测定波长为7 5 0 1 1 1 1 1 ，6 6 3n l n ，6 4 5n m ，6 3 0 衄处的吸光度，以9 0 的丙酮液作空白对照。按下 列公式计算叶绿素a 含量( m g l ) ： 叶绿素a ( m g l ) = 1 1 6 4 ( o d 6 6 3 一o d 7 5 0 ) 一2 1 6 ( o d 6 4 5 一o d 7 5 0 ) + 0 1 0 ( o d 6 3 0 一 o d 7 5 0 ) x 1 0 v v = 藻液体积( l ) ，o d = 吸光度，1 0 = 定容体积( i i l l ) 3 2 3 吸光度( o d 6 8 0 ) 测定 用比色法测定，直接用分光光度计测试藻液在6 8 0a m 处的吸光度。 3 3 生测指标的相关性 本实验按常规测定方法，对三种藻藻液干重和叶绿素a 含量与藻液在6 8 0n m 处 的吸光度的相关关系进行测定，分别以干重和叶绿素a 含量为纵坐标，以吸光度为 横坐标，经过e x c e l 软件中的线形回归得到干重与叶绿素a 含量与吸光度之间的回 归方程。 1 8 第三章实验准备 1 椭圆小球藻 ( 1 ) 椭圆小球藻藻液干重与吸光度的相关性 5 0 0 总4 s3 0 0 颦2 0 0 蒸瑚 o o0 20 40 60 8l1 2 吸光度( o z ) 6 8 0 ) 图3 - 1椭圆小球藻藻液干重与吸光度的关系 3 - 1r e l a t i o n s h i pb e t w nd r i e dw e i g h ta n d a b s o r b a n e eo f c h l o r e i l ae l l 翻s o i d e a ( 2 ) 椭圆小球藻藻液叶绿素a 含量与吸光度的相关性 o 0 2 0 40 60 8l1 2 吸光度( o d 6 8 0 ) 图3 - 2椭圆小球藻叶绿素a 含量与吸光度的关系 f i g 3 - 2r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h lac o n c e n t r a t i o na n d a b s o r b a n c eo f c h l o r e l l ae l l i p s o i d e a 图3 - 1 和3 - 2 显示，对于椭圆小球，藻液干重和藻液在6 8 0n n l 处的吸光度之 间的直线回归方程为d w ( m g l ) = 4 4 4 8 9 a + 1 5 9 8 4 ，相关系数r 2 = 0 9 9 1 7 ，说明椭 圆小球藻干重和吸光度之间有很好的正相关关系。叶绿素a 含量和吸光度之间的 直线回归方程为c h la ( 嵋几) = 3 4 3 4 3 a + 8 5 1 9 7 ，相关系数r 2 = o 9 9 7 8 ，说明椭圆小 1 9 o 弱如筋加：。m， 一喘n)捌姐懒袋蕾 第三章实验准备 球藻叶绿素a 含量与吸光度之间也具有很好的正相关关系。 2 螺旋鱼腥藻 ( 1 ) 螺旋鱼腥藻藻液干重与吸光度的相关性 6 0 0 o5 0 0 掣 誊4 0 0 犁3 0 0 疑2 0 0 麟1 0 0 0 0 0 20 40 60 811 2 吸光度( o d 6 8 0 ) 图3 - 3螺旋鱼腥藻藻液干重与吸光度的关系 啦3 - 3r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd r i e dw e i g h ta n d a b s o r b a n c eo f a n a b a e n as p i r o i d e s ( 2 ) 螺旋鱼腥藻藻液叶绿素f t 含量与吸光度的相关性 00 20 40 60 8l 吸光度( o d 6 8 0 ) 图3 - 4螺旋鱼腥藻叶绿素a 含量与藻液吸光度的关系 珞3 - 4r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h lac o n c e n t r a t i o n a n da b s o r b a n e eo f a n a b a e n as p i r o i d e s 图3 3 和3 4 显示，对于螺旋鱼腥藻，干重和叶绿素a 含量与吸光度之间的直 线回归方程分别为：d w ( m g l ) = 5 3 5 8 3 a + 1 6 0 3 4 ，c h la ( 扯g l ) = 3 0 0 8 8 a + 7 2 7 7 5 ， 相关系数r 2 分别为：o 9 9 2 7 和o 9 9 2 9 ，说明螺旋鱼腥藻干重和叶绿素a 含量与吸 o o 0 o o o o 咖 姗 湖 咖 姗 o 3 2 2 l l 、甍n)咖如懈酯古 第三章实验准备 光度之间具有很好的正相关关系。 3 水华束丝藻 ( 1 ) 水华束丝藻藻液干重与吸光度的相关性 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0o 20 40 ，6 0 8l1 2 吸光度( o i ) 6 s o ) 图3 - 5 水华柬丝藻藻液千重与吸光度的关系 酶3 - 5r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd r i e dw e i g h t a n da l o r b a n c eo f a p h a n i z o m e n o n f l o s - a q u a e ( 2 ) 水华束丝藻藻液叶绿素a 含量与吸光度的相关性 00 20 40 60 8 11 2 吸光度( o d 6 8 0 ) 图3 - 6水华束丝藻叶绿素a 含量与藻液吸光度的关系 f i g 3 - 6r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h lac o n c e n t r a t i o n a n da b s o r b a n c eo f a p h a n i z o m e n o n f l o s - m l u a e 图3 5 和3 6 显示，对于水华束丝藻，干重和叶绿素a 含量与吸光度之间的直线 回归方程分别为：d w ( m g l ) = 5 1 2 3 3 a + 2 8 4 9 3 ，e h la ( p , g l ) = 2 4 1 5 1 a - 3 3 1 1 2 ；相关 系数r 2 分别为0 9 9 4 7 和0 9 9 2 ，也说明水华束丝藻干重和叶绿素a 含量与吸光度之间 2 l 0 砌 笱 加 m 5 1暑3螂如馓骚古 第三章实验准备 具有很好的正相关关系。 从上述分析可看出，反映三种藻生物量的干重、叶绿素a 含量和藻液在6 8 0n m 处的吸光度( o d 6 8 0 ) 之_ n 有很好的正相关关系。k a s a i 等人【7 l 】也报道了藻类细胞数 目与藻液在6 8 0n m 处的吸光度( o d 6 8 0 ) 之间有高度的相关性，相关系数在0 9 9 以上。 干重和叶绿素a 含量是估算生物量的良好指标，从三种藻藻液干重、叶绿素a 含量与 藻液在6 8 0n m 处的相关关系可看出，对于所测试的三种藻，藻液干重、叶绿素a 含 量和藻液在6 8 0r m 处的吸光度三个指标之间具有很好的正相关关系，同时还由于 藻液吸光度是藻细胞数日、大小分布和光学特性的复杂函数，所以藻液吸光度也 是反映藻类生物量的良好指标。 因此，为了快速而又准确地测定藻类的生物量，本实验直接用吸光度表示藻 细胞的生物量，并以此为依据计算测试m t b e 对藻类的e c 5 0 值，评价m t b e 对藻 类的影响。 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 4 1 引言 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 国外关于m t b e 对藻类的毒理学做了一定量的研究，但大部分只是短时间的 急性试验，对藻类的慢性试验的研究尚未见报道。r o u s c h 等人研究了关于m t b e 对羊角月牙藻，舟形藻和聚球藻生长的影响【4 3 】。发现3 0 天后舟形藻和聚球藻的 生长在m t b e 浓度为2 , 4 0 0m g l 时受到明显的抑制。羊角月牙藻的生长在m t b e 浓度为6 0 0m g l 时受到刺激；在1 , 2 0 0m g l 和2 , 4 0 0m g ，l 时，基本不受影响；但 在4 ，8 0 0 和9 , 6 0 0m g l 时，则受到明显的抑制。可见，舟形藻和聚球藻对m t b e 比羊角月牙藻敏感。同时，上述研究表明较高浓度的m t b e 能抑制藻类生长，而 较低浓度的m t b e 则可作为藻类生长的营养源促进藻类生长。 然而，以上结论与b e n k i l m e y 的有明显的差异。b e n k i n n e y 发现m t b e 对羊 角月牙藻的9 6 h - e c 5 0 为1 8 4m g l 。虽然许多研究证实即使在类似的环境条件下， 不同藻种对有毒物质的敏感性也是有差异的 7 5 , 7 6 。但两项研究之间的巨大差异尚 未能简单地解释，需要进一步的试验。 鉴于目前为止国内外关于m t b e 对藻类的毒理学研究大部分只是短时间的急 性试验，并局限于几个种类，尚未见对藻类的慢性试验的研究，此外，较低浓度 的m t b e 可促进藻类生长，而藻类的异常增殖严重破坏了湖泊的生态环境，有些 藻类如微囊藻( m i c r o c y s t i s ) 、鱼腥藻( a n a b a e n a ) 等还会分泌出大量藻毒素，严重污 染环境、危害人畜的健康。因此，为了更好地评价m t b e 的生态风险，本文研究 了不同浓度下m t b e 对三种单细胞淡水藻的急慢性毒性。 4 2 实验方法 4 2 1 急性毒性实验 在正式进行测试前，首先要进行预备试验，以确定m t b e 对藻类的e c s o 的大 体范围，为正式实验提供依据。正式试验时，根据o e c d 规定的藻类生长抑制测 试方法，取生长处于对数期的藻液，四层纱布过滤以除去悬浮物，接种到新鲜灭 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 过菌的s e 培养液中，混匀，使起始藻液吸光度o d 6 8 0 为o 0 1 ，然后分装到5 0 m l 三角瓶，每瓶加液3 0l n l ，处理加入一定浓度梯度的m t b e ，一般设8 个浓度梯度 ( 使抑制率在5 0 上下均有分布) ，各设3 个平行，对照不加，然后用四层纱布封 口，实验条件与藻类培养条件相同。9 6 小时后直接测藻液在6 8 0n m 处的吸光度 ( o d 6 8 0 ) ( 比色杯直径1 伽) 。 本研究选用抑制藻类5 0 生长的m t b e 的有效浓度9 6 h - e c 5 0 ，最低有显著影响 有效浓度l o e c 、最高无显著影响有效浓度n o e c 以及最大可接受毒性浓度m a t c 值作为评价指标。这三个值是m t b e 不对藻类产生影响的浓度界限。l o e c 值是 m t b e 对藻类产生影响的下限，m a t c 值是藻类对m t b e 能忍耐的最大剂量，n o e c 值是m t b e 不对藻类产生毒性的浓度上限。 根据0 1 ) 6 8 0 计算抑制百分率，抑制率根据( 对照o d 6 8 0 - - 处理o d 6 8 0 ) 对照 o d 6 8 0 公式计算【7 _ 7 】，根据毒物浓度的自然对数和生物效应的百分率单位成直线关 系这一原理，利用m t b e 浓度的自然对数与抑制百分率之间的相关性方程计算 e c 5 0 值。 一般确定l o e c 和n o e c 值的方法有两种【7 3 l ：( 1 ) 各浓度组结果与对照组结果进 行统计比较，与对照组有显著差异的最低浓度为l o e c 值，与对照组无显著差异的 最高浓度为n o e c 值；( 2 ) 利用m t b f 旅度的自然对数与抑制百分率之间的相关性 方程计算e c 2 0 和e c l o 值，计算得出的e c 2 0 可作为l o e c 值，e c i o 可作为n o e c 值。 本试验采用第二种方法求算l o e c 和n o e c 值。最大可接受毒性浓度m a t c 等于最 低有显著影响浓度l o e c 和最高无显著影晌浓度n o e c 的几何平均值，即 m a t c = ( l o e c * n o e c ) m 而计算得出。 本实验选用第二种方法。 4 2 2 - i 曼性毒性实验 取生长处于对数期的藻液，接种到新鲜灭过菌的s e 培养液中，混匀，使起始 藻液吸光度o d 6 8 0 为0 0 1 ，然后分装到5 01 1 1 l 三角瓶，每瓶加液3 0m l 。m m e 由高 ( 2 0 ，0 0 0m g a ) 到低( 2m g l ) 稀释为1 3 个浓度，处理加入不同浓度的m r b e ，各设3 个平行，对照不加。然后用四层纱布封口，实验条件与藻类培养条件相同。实验 周期是1 0 1 5d ( 周期长短根据对照的生长情况) 。每2 4h 后测定藻液在6 8 0n i l l 时的吸 光度( 比色杯直径lc m ) ，平行样之间的相对偏差小于l o 。计算抑制率( 抑制率= 【对 照吸光度样品吸光度】，对照吸光度1 0 0 叼。根据不同浓度m t b e 对藻类生长的抑制 第四章m t b e 对蕞类的单一毒性 率随时间的推移作图。 4 3 结果与讨论 4 3 1m t b e 对藻的急性毒性 ， 表4 _ 1 表明，m t b e 对椭圆小球藻、螺旋鱼腥藻和水华束丝藻的半数效应浓度 9 6 h - e c 5 0 分别为7 , 7 5 6 、2 , 9 6 7 和8 , 9 0 7m l ，对其生长产生影响的下限l o e c 值 分别为l ，1 7 0 、1 3 2 和2 3 8 8m e l ，m t b e 不对其生长产生影响的上限n o e c 值分 别为6 2 3 、4 7 和1 , 5 4 0m e l ，而椭圆小球藻、螺旋鱼腥藻和水华束丝藻对m t b e 能忍耐的最大剂量m a t c 值分别为8 5 4 、7 9 和1 , 9 1 8m e l ，这与r o u s c h 4 3 1 等人对 羊角月牙藻，舟形藻和聚球藻生长影响的研究结果较一致。 表4 - 1m t b e 对不同藻种生长的影响 t a b l e4 - 1t h eg r o w t he f f e c to f m t b et od i f f e r e n ta l g a e 注：y 代表藻类生长抑制率( ) ；c 代表m t b e 浓度，单位为m g l 。 e c 5 0l o e cn o e c 图4 - 1m n 啦对三种藻的e c 、l o e c 、n o e c 和m a t c 值比较 矾昏4 - 1c o m p a r i s o ne c l o e c , n o e c a n dm a t cv a l u e sa m o n gm t b et od i f f e r e n ta l g a e 2 5 o o 0 o o o o 0 o o o o o o o o o o o 0 o o o o 0 0 o 0 9 8 7 6 5 4 3 2 l j 碗日 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 从图4 - 1 中显见，m t b e 对椭圆小球藻与水华束丝藻的急性毒性较接近，而对 螺旋鱼腥藻的9 6 h - e c 5 0 值则与前者相差了近3 倍。由此推断，三种藻对m t b e 的耐 受性大小顺序为：水华束丝藻 椭圆小球藻 螺旋鱼腥藻，并且，螺旋鱼腥藻对m t b e 比椭圆小球藻和水华束丝藻更敏感。 4 3 2m t b e 对藻的慢性毒性 ( 1 ) 椭圆小球藻 g 糌 磊 熏 棠 一 糌 啦 霉 时间( d a y ) 圈4 - 2 ( a ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 脚4 - 2 ( a ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 。八。众、 ； 时间( d a y ) 圈4 - 2 ( b ) 2 0 0 - 1 0 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i g 4 - 2 ( b ) 2 0 0 - 1 0 0 0m g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 加卯如柏如加m o m 加 加。 加珈 霉：舶 蜘 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 拿 、- ， 褥 啦 辗 ；一要 时间( d a y ) 图4 - 2 ( e ) 2 0 - 1 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i g 4 - 2 ( c ) 2 0 - 1 0 0m g lm r b eg r o w t hi n h i b i t i o n 一； 时间( d a y ) 图4 - 2 ( d ) 2 - 1 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i 蛋4 - 2 ( d ) 2 - 1 0m g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 图4 啊2 ( a ) 表明：高浓度m t b e 对椭圆小球藻的生长有明显的抑制作用，抑制 率随浓度的增加而增加。其中2 0 0 0m g l 和5 0 0 0m g l 组在第3 天使椭圆小球藻达 到最大抑制率，分别为2 7 和4 7 ；而1 0 0 0 0 m g l 和2 0 0 0 0 m g l 组则在第5 天 达到最大抑制率6 8 和6 9 。8 天后，高浓度m t b e 产生的抑制作用明显降低， 2 0 0 0m g l 和5 0 0 0m g l 组甚至还对椭圆小球藻的生长产生了轻微的刺激作用。 由图禾2 可见，2 0 0m g l 、5 0 0m g l 和1 0 0 0m g l 组对椭圆小球藻的生长影 响不太大。其中2 0 0m g l 组在第3 天使椭圆小球藻的生长有较大的刺激作用。7 如 0 卯 如 o j o 五 ，)哥磊嚣 o o o o o o o o 2 乏4 石堪m 协 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 天后，它们的作用就逐渐减弱。 图4 - 2 ( e ) 和图4 - 2 ( d ) 显示了低浓度m t b e 对椭圆小球藻生长的促进作用，且不 同浓度对其生长产生的影响有差异的。5 0 m g l 、2 0 m e l 、1 0 m g l 、5 m g l 和2 m g l 组均在第3 天使椭圆小球藻的生长受到最大的刺激，促进生长分别达2 1 2 、2 0 5 、1 0 8 、6 5 和6 3 ，1 0 0 m g l 组在第5 天促进生长达1 0 9 。7 天后，促进 作用就逐渐减弱。 实验结果表明，当m t b e 浓度1 0 0 0m g l 时，刺激藻的生长，其中5 0m g l 组在第3 天使椭圆小球藻的生长受到最大的刺激，促进生长达2 1 2 ；当m t b e 浓度 2 0 0 0m g l 时，抑制藻的生长，其中2 0 0 0 0m g l 组在第5 天到达最大抑制 率6 9 。 ( 2 ) 螺旋鱼腥藻 9 0 ，2 0 0 0 0 m g ， pl 8 0 7 0 蕃6 s 。0 器4 0 嚣3 0 2 0 l o 0 1 2 3 4567891 0 时间( d a y ) 图们( | ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 v i e , 4 - 3 ( a ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g r lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 5 0 4 0 s3 0 锝 耄2 0 l o o l23 4 56 789l o 时间c d a y ) 图4 - 3 ( o ) 2 0 0 - 1 0 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i g 4 - 3 ( b ) 2 0 0 - 1 0 0 0m g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 123456789l o 时间( d a y ) 图4 3 ( c ) 2 0 - 1 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 r i g 4 - 3 ( c ) 2 0 - 1 0 0m g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 加 o )哥磊霖 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 ：一彳= 一夕衙二 时间( d a y ) 图4 - 3 ( d ) 2 - 1 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i g 4 - 3 ( d ) 2 - l om g lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 图4 - 3 ( a ) 表明：高浓度m t b e 对螺旋鱼腥藻的生长有明显的抑制作用，抑制 率随浓度的增加而增加。其中1 0 0 0 0m g l 和2 0 0 0 0m g l 组分别在第4 天和第5 天使螺旋鱼腥藻达到最大抑制率，分别为6 l 和8 l ；而2 0 0 0m g l 和5 0 0 0m g l 组则在第4 天达到最大抑制率4 6 和5 3 。随着时间的推移这种抑制作用缓慢减 弱，在第1 0 天1 0 0 0 0 m g l 和2 0 0 0 0 m g l 组对螺旋鱼腥藻的抑制率仍有3 1 和3 7 。 由图4 3 ( b ) 和图4 3 ( c ) 可见，随着处理组m t b e 浓度的下降，其对螺旋鱼腥 藻生长的抑制作用也不断减弱。其中2 0m g l 和5 0m g l 组对螺旋鱼腥藻的生长影 响不大，在整个实验周期内抑制率保持2 0 以内。各个浓度组在第4 天达到最大 抑制率，之后这种作用就逐渐减弱，直至实验末期螺旋鱼腥藻的生物量基本与空 白组相当。 图4 - 3 ( d ) 显示了低浓度m t b e 对螺旋鱼腥藻生长的有轻微的刺激作用。2m g l 组在第3 天促进螺旋鱼腥藻的生长达1 9 。随后，这种刺激作用就逐渐减弱。 实验结果表明，m t b e 对螺旋鱼腥藻的生长在实验浓度范围内表现为抑制作 用，并随浓度的增加而增加。其中2 0 0 0 0m g l 组在第5 天使螺旋鱼腥藻的生长受 到最大的抑制，抑制率为8 1 ；当m t b e 浓度5 0m g l 时，对螺旋鱼腥藻的生 长影响不大。 加 m o 邶 珈 号： 长v 哥器辕 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 ( 3 ) 水华束丝藻 g 锝 磊 嚣； 。f 12345 6 7 89l o 哥哥秀帝 时间( d a y ) 图4 - 4 ( a ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g lm t b e 对生长的抑制 f i g 4 - 4 ( a ) 2 0 0 0 - 2 0 0 0 0m g ，lm t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 3 0 2 0 1 0 0 荨1 0 磊一2 0 嚣3 0 - 4 0 5 0 6 0 爪一 ，、 ll il ；1 时间( d a y ) 图4 - 4 ( b ) 2 0 0 - 1 0 0 0r a g i , , i w r b e 对生长的抑制 4 - 4 ( b ) 2 0 0 - 1 0 0 0m g i , m t b eg r o w t hi n h i b i t i o n 3 l 加如加m o m 加 第四章m t b e 对藻类的单一毒性 g 褂 磊 霉 g 褥 亲 嚣 时间( d a y ) 圈“