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有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 摘要 从自然环境、人畜食品、健康动物胃肠道内容物等样品中选育有益乳酸芽孢 杆菌，并对其进行培养条件的优化，为乳酸芽孢杆菌类微生态制剂的研发奠定基 础。 用添加溴甲酚紫指示剂的g y p 平板从6 7 样品中分离出4 1 株产酸芽孢杆 菌，通过高效液相色谱检测、抑菌试验和芽孢形成数试验，从中筛选出s c 株、 s l l 株、t r 株等三株性能优良的产乳酸芽孢杆菌。通过b i o l o g 微生物自动鉴 定系统、1 6 s r r n a 碱基序列分析，对三株菌进行种属关系的分析鉴定。鉴定结 果是：s c 株株为乳酸芽孢杆菌s c ( 暂命名) ，t r 株为乳酸芽孢杆菌t r ( 暂 命名) ，s l l 株为蜡状芽孢杆菌。 选用乳酸芽孢杆菌s c 作为出发菌株，以紫外线、亚硝基胍作诱变物，以不 同的浓度和作用时间对s c 株进行复合诱变；诱变培养后，挑选出2 0 0 株诱变株， 比较它们的产酸、抑菌活性和芽孢形成率等三方面的性能，最终筛选得到一株芽 孢形成率符合要求，产酸能力和抑菌活性均有提高的正向突变株，即乳酸芽孢杆 菌s c 2 7 株。用s c 2 7 株培养物对5 组昆明系s p f 小鼠进行急性毒性试验，将 培养物按1 0 、5 、2 5 、1 2 5 、0 6 2 s g k g 五种剂量分别给小鼠灌胃染毒，并记录 每天情况。整个试验过程中无小鼠死亡，小鼠亦无病理解剖学变化。 稳定性试验的结果表明，s c 2 7 株具有较好的热稳定性，在湿热处理中，当 温度达到1 0 0 、作用时间在2 0 m i n 以上时，活菌数才下降一个数量级。在干热 处理中，在8 0 、4 0 m i n 和1 0 0 、6 0 m i n 的时候显示该活菌数为零，而其它 不同温度和不同处理时间均不能使该活菌数下降一个数量级；同时，s c 2 7 株对 p h 值2 2 7 0 具有很好的耐受性，说明具有较强的耐酸性；但该菌株对多数抗 生素较为敏感。 通过乳酸芽孢杆菌s c 2 7 的体外抑菌试验，表明该菌的培养物对金黄色葡萄 球菌、大肠埃希氏杆菌等五种革兰氏阳性、阴性指示菌有明显的抑制作用；另外， 试验结果显示s c 2 7 株培养物的抑菌物质具有较好的热稳定性，受木瓜蛋白酶、 蛋白酶k 、胰蛋白酶的影响较小。 在培养条件的探索上，以p h 值、芽孢产生总数、芽孢形成率作参考指标并 考虑培养基成本的问题，比较筛选出适宜该菌生长的碳源、氮源，在此基础上进 一步考虑添加对乳酸和芽孢形成有利的金属离子，利用正交试验设计，对s c 2 7 株进行培养条件的优化。最终得出培养基的优化组合是：黄豆汁0 5 、甘蔗汁 1 3 、k 2 h p 0 40 0 5 0 、m g s 0 40 0 5 0 、m n s 0 40 0 2 0 ；其培养条件的优化组合 是：发酵温度为3 7 ；接种量为1 0 ；装液量为4 0 m l 2 5 0 m l ；先摇床1 2 0 r m i n 培养2 4 h ，再转入静置培养9 6 h 。 本研究选育出了一株能发酵产生乳酸、芽孢形成率较高、对热和酸稳定、有 较强抑菌活性的有益乳酸芽孢杆菌，t l p - $ l 酸芽孢杆菌s c 2 7 ，并优化出了适合其 生长的培养基和培养条件。 关键词：乳酸芽孢杆菌，选育，培养条件，代谢产物，抑菌活性，稳定性 n b r e e d i n go fb e n e f i c i a ls t r a i na n do p t i m i z a t i o no fc u l t u r e c o n d i t i o nf o rb a c i l l u sl a c t a t e a b s t r a c t a i mt oe s t a b l i s hb a s e o fd e v e l o p m e n to fp r o b i o t i c sa b o u tb a c i l l u sl a c t a t e ， b e n e f i c i a ll a c t i ca c i db a c i l l u sw e r es e l e c t e df r o ms a m p l eo f w i l de n v i r o n m e n t ，f o o do f p e o p l e ，f e e do fl i v e s t o c ka n dg a s t r o i n t e s t i n a lc o n t e n t so fh e a l t h ya n i m a l c u l t u r e c o n d i t i o no ft h eb a c i l l u sw a sa l s oo p t i m i z e d i nt h i sp a p e r , 41s t r a i n so fa c i db a c i l l u sh a sb e e ni s o l a t e df r o m6 7s a m p l e sb y g y pp l a t ew i t hb r o m e r e s o lp u r p l ei n d i c a t o r s c ，s l l ，a n dt rs t r a i n sw i t hg o o d p e r f o r m a n c eh a sb e e ns e l e c t e db yh i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，v i t r o i n h i b i t i o nt e s ta n dq u a n t i t yt e s to ff o r m e dg e r m g e n u sr e l a t i o n s h i po ft h e3s t r a i nw a si d e n t i f i e d b yb i o l o gm i c r o b i a la u t o m a t i ci d e n t i f i c a t i o ns y s t e ma n d16s r r n as e q u e n c ea n a l y s i s s c ，t rs t r a i n sa g el a c t i ca c i db a c i l l u s ，s l ls t r a i ni sb a c i l l u sc e r e u s u s el a c t i ca c i db a c i l l u ss ca sp r i m i t i v es t r a i n ，u l t r a v i o l e ta n dn t ga si n d u c t i o no f m u t a t i o n 2 0 0s t r a i n si n d u c e dm u t a t i o nw e r es e l e c t e d b yc o m p a r i s o no ft h ea c i d p r o d u c t i o n ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n db a c i l l u sf o r m a t i o nr a t e ，o n es t r a i n ，t h es c 2 7 ， o fm u t a n tp o s i t i v ew a sg a i n e d ，i t ss p o r ef o r m a t i o nr a t e ，a c i dp r o d u c t i o nc a p a c i t ya n d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sf i tw i t hr e q u i r e m e n t aa c u t et o x i c i t yt e s tw a sd e s i g n e d 5 g r o u p s k mm i c ew a sa d m i n i s t r a t e dc u l t u r ea td o s eo f10 ，5 ，2 5 ，1 2 5 ，o 6 2 5e c k g t h er e s u l ts h o w e dm a tn om i c ed i e d ，n op a t h o l o g yc h a n g eo c c u r r e d s oi ti ss a f e 弱ak i n do f f e e da d d i t i v e s t a b i l i t yt e s tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es t r a i ns c 2 7h a dn i c et h e r m a ls t a b i l i t yi n h m t ，w h e nt h et e m p e r a t u r er e a c h e d1 0 0 t i m ew a sm o r et h a n2 0m i n ，t h en u m b e r o fv i a b l ec e l l sd e c r e a s e do n l ya no r d e ro fm a g n i t u d e i nt h ed r yh e a tt r e a t m e n t ，a t c o n d i t i o no f8 0 ，4 0m i na n d10 0 ，6 0m i n ，t h a tt h ev i a b l ei sz e r o ，a to t h e r t e m p e r a t u r e sa n do t h e rp r o c e s s i n gt i m e ，t h e r ew a sn on u m b e rv i a b l et h a td e c r e a s e da n o r d e ro fm a g n i t u d e t h ep hv a l u eo ft o l e r a n c et e s ts h o w e dt h a tt h ea c i d - f a s tb a c t e r i a h a sag o o dp e r f o r m a n c ei ne n d u r a n c eo fa c i de n v i r o n m e n t ，b u tt h ea n t i b i o t i c s e n s i t i v i t yt e s t ss h o w e dt h a tt h eb a c t e r i ai ss e n s i t i v et oa n t i b i o t i c s i nv i t r ob a c t e r i o s t a s i se x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ec u l t u r eo ft h eb a c t e r i ah a s s h o w e do b v i o u sb a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t ya g a i n s t5s t r a i n so fg r a mn e g a t i v ea n dg r a m i i i p o s i t i v e ，s u c ha ss t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，e s c h e r i c h i ac o l i i na d d i t i o n ，t h et e s tr e s u l t s s h o wt h a tt h ec u l t u r eo fs t r a i ns c 2 7a n t i b a c t e r i a lm a t e r i a lh a sg o o dt h e r m a ls t a b i l i t y , t h ei m p a c to f p a p a i n ，p r o t d n a s c k 觚dt r y p s u li sf e w e x p l o r a t i o na b o u tt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s p hv a l u e ，t h et o t a ln u m b e ro f s p o r e sp r o d u c e da n ds p o r ef o r m a t i o nr a t ew e r eu s e da si n f e r e n c er e f e r e n c ei n d e x ，a n d t h ec o s to ft h em e d i u mi so nc o n s i d e r a t i o n ，c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sf i tf o r b a c t e r i ag r o w t hw e r es e l e c t e d o nt h i sb a s i s ，f u r t h e ra d df a v o r a b l em e t a li o n sf o r f o r m a t i o no fl a c t i ca c i dw a si n c l u d e d ，b yo r t h o g o n a ld e s i g n ，f i n a l l yc o m et ot h e o p t i m i z e dc o m b i n a t i o no fm e d i u mi s ：s o y b e a n sj u i c eo 5 ，s u g a rc a n ej u i c e13 ， k 2 h p 0 40 0 5 ，m g s 0 40 0 5 ，m n s 0 40 0 2 0 o o ；i t sc u l t u r ec o n d i t i o n si nt h e o p t i m i z e dc o m b i n a t i o ni s ：c u l t u r ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ei s3 7 。c ；i n o c u l u mw a s 1o ；m e d i u mv o l u m e4 0m u 2 5 0m l ；s h a k e r12 0r m i nf o r2 4l l ，t r a n s f e r r e di n t o s t a t i cf e r m e n t a t i o nf o r9 6 h al a c t i ca c i db a c i l l u s ：s c 2 7 ，w i t hp r o d u c t i o no fl a c t i ca c i d ，h i g hr a t eo ff o r m s p o r e s ，g o o dt h e r m a ls t a b i l i t y , n i c ea c i dt o l e r a n c ea n dm e t a b o l i t e sa n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ys t r o n g ，w a ss e l e c t e d g r o w t ho fm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n so fi tw e r e o p t i m i z e d k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c i l l u s ，b r e e d i n g , c u l t u r ec o n d i t i o n ，m e t a b o l i t e ，a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y , s t a b i l i t y i v 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 满恼 2 09 3 年6 具聪b 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：甍始 导师签名：铱荔孱 2 0 纱多年 2 0 形年 6 只7 6b 具；b 广东海洋大学硕士学位论文 1 研究的目的意义 第一章引言帚一早 与l 石 长期以来，饲用抗生素的使用，给畜牧业的发展带来了巨大的促进作用【l 】， 但是在盲目追求眼前利益的情况下，泛滥、违规使用抗生素又造成了一系列严重 的问题，如药物残留导致的肉蛋奶品质下降、国际贸易壁垒等，更为严重的是引 起致病菌株产生耐药性、药物残留通过食物链传递给人，而这些给人类和畜禽的 健康均带来了极大的危害【2 , 3 1 。因此，饲用抗生素的使用泛滥又严重的阻碍了畜 牧业的发展。 益生素是近年来国内迅速崛起的一类微生态制剂，它是指可以直接饲喂动物 并通过调节动物肠道微生态平衡而达到预防疾病、促进生长和提高饲料利用率的 活性微生物或其培养物【4 ，5 】。因其无毒副作用、无残留污染、不产生抗性、成本 较低、使用方便等优点而广泛用于医疗、保健、食品、畜牧水产和饲料等行业【6 1 。 乳酸菌作为一种常用的益生菌，其对动物机体的营养、保健、促进生长等方面的 作用已得到普遍的认同，但其抗胃酸、抗热和抗干燥的能力较差，同时这些乳酸 菌制品普遍存在着保存性差，随保存时间延长而活菌数量下降明显等缺点，因此 添加剂中的乳酸菌能以活菌形式进入肠道的数量为数不多，所以其作为益生菌的 效能也大大下降，因此研究寻找更优良的菌种已是目前的研究重点【7 ，8 】。 一般益生菌抗胃酸、抗热和抗干燥的能力较差，因而能经历饲料制粒过程和 胃内酸性环境而到达动物肠道的活菌数量并不多，而是以死菌及其培养物的状态 到达动物肠道，并不能全面的起到益生菌的作用 9 , 1 0 】。乳酸芽孢杆菌是一类即能 产生乳酸又能形成芽孢的革兰氏阳性杆菌，其能发酵利用培养基中的糖类物质而 产生乳酸，其除具有普通乳酸菌的种种有益特性外，还因其能形成芽孢，具有较 强的耐热、耐酸以及耐高渗透压的能力，所以在经历饲料加工过程和动物胃内酸 性环境后，芽孢仍能安全到达动物肠道，芽孢在缓慢发育为营养菌体后开始快速 生长并在肠道内定植，从而抑制了致病菌或条件性致病菌的生长繁殖，使肠道菌 群正常化。乳酸芽孢杆菌比一般益生菌更具有效作用，更具有实际应用的价值和 前景j 。目前，乳酸芽孢杆菌现已成为益生素研究和应用的热点，也是我国农业 部2 0 0 4 年批准使用的菌种之一【1 2 1 。 本研究的目的是以健康动物肠道内容物、人畜食品、酸败食物等作为分离源， 选育出有益的乳酸芽孢杆菌优良菌株，并对其生物学特性和发酵条件进行研究， 为绿色、环保的乳酸芽孢杆菌益生素的开发和应用奠定基础，在社会、生态和经 有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 济效益方面具有重要意义。 2 益生菌研究概况与发展方向 2 1 益生菌国内外研究概况 “益生菌”这个词最早被l i l l y 和s t i l l w e l l 用来描述微生物产生的促生长物质， 它在国内有较多的译名，如益生菌、益生素、促生素、原生素、利生素、微生态 制剂等【1 3 。1 5 】。p a r k e r ( 1 9 7 4 ) 用“益生菌”来表示使肠道微生物保持平衡的微生物或 物质【1 6 , 1 7 1 ；1 9 8 9 年，f u l l e r 把“益生菌”定义为能够促进肠内微生物平衡，对宿主 产生有益作用的活的微生物制剂 1 8 , 1 9 】；1 9 9 4 年，在德国海德堡召开的国际微生 态学术讨论会上，对微生态制剂( 益生菌) 下的定义为：益生菌是含活菌和( 或) 死 菌，包括其组分和产物，旨在改善粘膜表面处微生物或酶的平衡，或者刺激特异 性或非特异性免疫机制的活菌制剂【2 吨2 1 。 益生菌的使用历史较为悠久，早在公元前2 0 0 年，印度、埃及和古希腊就用 有益于人体的乳酸菌制作发酵食品【1 2 】。1 8 5 7 年，巴斯德( p a s t e u r ) 描述了乳酸 茵；1 8 9 9 年，蒂歇尔( t i s s i e r ) 报道双歧杆菌；1 9 0 0 年，毛洛( m o r o ) 鉴定了 嗜酸乳杆菌；1 9 0 5 年，梅奇尼科夫出版了长寿一书，论述了酸奶能使人长 寿【2 3 。2 6 1 。 2 0 世纪5 0 年代，德国人鲁希( r u s c h ) 以及我国临床医务工作者用健康人 体内的混合菌群治疗肠道疾病获得了成功，这是利用人体内正常生理菌群治疗疾 病的开始【2 7 2 8 】；在6 0 年代日本学者光冈对肠道菌群做了全面的分析，实验动物 学家把单一菌和多种菌引进无菌动物和悉生动物体内，对他们的生理功能以及菌 与菌、菌与宿主之间关系做了一系列的研究【2 9 1 。这些都为微生态学的建立和益生 菌的开发提供了理论根据；1 9 7 4 年，p a r k e r 开始把益生菌用于饲料添加剂，随后， 益生菌制品在市场上日益增多【3 0 ，3 1 】；到8 0 年代，我国微生态学家康白、刘秉阳、 陈延熙、梅汝鸿、何明清等率先在我国研制出了人用益生菌制品、植物益生菌制 品和动物益生菌制品【1 2 1 。 益生菌真正建立在现在科学基础上的研究只有二十几年的历史，但是由于它 前景广阔，所以发展异常迅猛【3 2 1 。从国内外发展演变来看，日常用的饲用微生物 种类主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、光合细菌等几大类，美国食品 与药物管理局( f d a ) 1 9 8 9 年规定允许饲喂的微生物种类有4 0 余种，其中有近 3 0 种是乳酸菌【3 3 1 ，我国1 9 9 4 年农业部批准使用的微生物种类有：蜡样芽孢杆菌、 2 广东海洋大学硕士学位论文 枯草芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸链球菌等【3 4 1 。 饲用益生菌制剂的效果已被公认，然而饲用益生菌制剂在饲料加工、运输中 易失活，导致在肠道生长速度缓慢，难以与其他微生物在竞争中处于优势地位； 并且在进入消化道后，大多难以经受盐酸、胆汁酸等低p h 值的作用，难有足够 的菌数到达肠道并发挥作用。这是目前限制饲用微生态制剂大量生产和应用的主 要原因。因此，在添加益生菌制剂时应注意使用具有耐酸、耐高温高压的菌种， 这样才能在动物生产中达到理想的效果【搏3 6 】。 2 2 益生茵的研究发展方向 在寻求抗生素替代品的过程中，益生素的开发、应用遇到了一系列的问题， 而这些问题也是乳酸芽孢制剂所面临的。同时，这些问题亦道明了其未来的发展 方向f 3 7 】。 2 2 1 益生素使用的时效性 动物的不同生理状况和病理状况对益生菌发挥的生理作用有一定的影响。一 般来说，刚出生的动物体内的菌群比较少，此时摄取的益生菌可优先定植于肠道 黏膜，形成良好的生物屏障体系，在应激期内引入益生菌也对形成优势菌群有利： 患消化道疾病的动物摄取益生菌疗效也较明显，所以掌握时间并持续地给予益生 菌才会起到应有的作用3 8 , 3 9 】。 2 2 2 益生菌菌株的筛选及改造 动物体内正常菌群的分布具有宿主特异性、部位特异性和菌株特异性，同一 菌株在不同的动物肠道内粘附的效果不同，在肠道中不同肠段中分布的数量也有 很大的区别【4 0 1 。益生菌菌株若不能很好地粘附，就只能作为一种过路菌群，其所 起的作用就没有一种长效机制【4 1 1 。因此，筛选能稳定粘附在肠道内生存并繁殖， 促进动物生产性能和免疫机能提高的菌种，或对现有利用效果较好的益生菌进行 基因改造使其很好地在各种动物体内都能发挥长效作用，这些均是未来微生态添 加剂发展的方向【4 2 1 。 2 2 3 防止有耐药性质粒的菌种作为益生菌 有些细菌携带可传递的耐药性质粒( r 因子) ，这种质粒可以自由移动，它 不是生物学上属、种所决定的，它是个别菌特有的质粒，在机体内可传递给其他 3 有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 菌。如果使用抗生素则造成抗生素选择压力，促使含耐药性质粒的菌大量繁殖， 并有可能传递给其他致病菌，其后果不堪设想【4 2 1 。 2 2 4 益生菌与其他相关物质的优势互补作用 益生菌并非万能的，它有一定的局限性，如果把它和另一些具有生理作用的 物质( 如中草药、疫苗等) 科学配伍，有可能起到协同作用或优势互补的作用【4 3 1 。 2 2 5 有针对性地开发新的益生菌 不同动物所处的生态环境、消化道系统、饲料类型、体内优势菌群不同。比 如食肉动物、食草动物、杂食动物、水生动物都有自己的优势菌群。有针对性地 筛选各自的益生菌将会产生各自特异的生理功制4 4 ，4 5 1 。 2 2 6 进一步阐明益生菌制剂的有效物质和作用机理 目前对益生菌制剂的作用机理基本是从微生态学的宏观方面阐述理解，随着 微生物技术的发展，开发出的益生菌制剂中，很多都证明了有很好的作用效果【4 引， 其中起作用的除了一些菌体、细胞代谢产物和变性培养基外，还有一些“未知生 长因子”。这些因子是什么以及通过何种方式起作用，还无从得知。因此从细胞 水平和分子水平来进一步深入研究益生菌制剂中的有效物质和作用机理，是微生 态饲料添加剂未来发展中所要解决的问题 4 7 , 4 8 】。 另外，目前使用的益生菌制剂多数是外籍菌，这些菌种能否在体内增殖，在 何处增殖，增殖速度如何，作用方式如何等问题均是益生菌制剂在动物体内发挥 作用的基础，但开展这方面的研究比较困难，研究报道甚少；同时，不同添加剂 量在体内的增殖规律是否有所不同，更未见研究报道；以不同的作用效果如生产 性能、免疫功能、肠道菌群变化为考察指标时，饲用益生菌制剂的最适添加量是 否不同，仍有待进一步研究【4 1 1 。 3 乳酸芽孢杆菌的研究进展 乳酸芽孢杆菌能发酵利用培养基中的糖类物质而产生乳酸，其除具有普通乳 酸菌对机体营养、保健、提高免疫力、促进生长等种种有益特性外，还能形成芽 孢，因此对热、干燥、辐射、酸、碱和有机溶剂等杀菌因子具有极强的抵抗力【5 2 1 ， 所以在经历饲料加工过程和动物胃内酸性环境后，芽孢仍能安全到达动物肠道并 4 广东海洋大学硕士学位论文 顺利发育为营养菌体而起到益生菌的全面作用【5 3 l 。从研究历史上来看， d e m e t e r ( 1 9 3 1 ) 、p e t e r s o n ( 1 9 4 0 ) 、g o r d o r ( 1 9 4 9 ) 、g i o n ( 1 9 8 4 ) 等对乳酸芽孢杆菌曾 做过报道 5 4 , 5 5 1 。日本学者中山大树( 1 9 4 9 ) 也从绿豆芽中分离出若干株同型乳酸 发酵的芽孢杆菌并鉴定为凝结芽孢杆菌。早在上世纪6 0 年代，日本已将该菌开 发为食品、药品和饲料添加剂，并已实现了商品化【5 6 , 5 7 】。在我国，天津轻工业学 院微生物研究室于1 9 9 3 年率先开展了乳酸芽孢杆菌制剂的开发研制，并且分离 得到了一株同型乳酸发酵的芽孢杆菌 1 0 , 1 1 】。2 0 0 5 年，天津市畜牧兽医研究所报 道，该菌可以明显降低肉仔鸡、仔猪的死亡淘汰率、饲料增重比，对平均增重、 日增重均有明显促进作用【3 4 】；2 0 0 7 年，吴建忠等报道，乳酸芽孢杆菌对a a 鸡、 黄羽肉鸡、哺乳仔猪等具有良好的促生长、提高免疫力的作用 5 2 , 5 3 1 。但是，从总 的来说我国对乳酸芽孢杆菌的基础研究、应用研究报道相对较少，与发达国家相 比仍然有较大的差距【4 2 】。 3 1乳酸芽孢杆菌的作用机理 3 1 1 促进有益菌生长，调节动物消化道的微生态平衡 研究表明，益生素以活菌状态进入动物肠道要比以死菌( 细胞组成部分和代 谢产物) 状态进入肠道内的功效好得多【5 8 , 5 9 。主要原因是死菌不能在肠道内消耗 游离氧，更不能定植，不能促进肠道内厌氧菌的生长以达到菌群平衡，而只能从 死菌的细胞和代谢产物的营养成分中供给机体部分养分【删。所以决定益生素类菌 株的临床效果的好坏，不单取决于菌种特性，还取决于益生素本身活菌数含量的 高与低，而决定活菌数高低和有效期的长短的主要因素是益生素产品中活菌产生 芽孢数量的多少【6 1 1 。芽孢形成率高，活菌就多且有效期保存时间也随之延长。乳 酸芽孢杆菌中芽孢的形成使得该菌具备了耐酸、耐碱、耐高温和耐储存的优良性 胄邕【2 6 】。凭以上优点，乳酸芽孢杆菌所形成的芽孢能顺利到达动物肠道，并进一步 发育为营养菌体。同时，乳酸芽孢杆菌在发酵生产过程中多为兼性厌氧繁育【6 2 】， 菌体进入动物肠道内需要消耗大量的游离氧，并在肠道内定植，降低氧化还原电 势，有利于乳酸菌、双歧杆菌等厌氧性土著菌的生长繁殖，从而有利于肠道内微 生物的菌群平衡，提高机体免疫力和抗病能力，减少肠道疾病的发生，促进动物 生长【6 3 1 。目前国内市场的某些益生素产品效果欠稳定、效果不明显，就是因为所 使用有益菌株不能形成芽孢或芽孢率不高，使产品质量的稳定性和有效性得不到 保证【删。 3 1 2 促进动物机体的消化作用 5 有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 动物摄取的营养物质进入机体后被吸收利用。需要经过一系列的理化作用。 乳酸芽孢杆菌通过以下两种方式影响动物机体的消化作用：一是乳酸芽孢杆菌产 生的乳酸能降低肠道p h 值，酸性环境能促进肠道分泌多种消化酶，从而提高对 营养物质的消化与吸收利用 6 5 , 6 6 ；二是通过乳酸芽孢杆菌在动物消化道内生长、 繁殖和定植，直接产生如维生素、氨基酸、短链脂肪酸等多种营养物质，能补充 动物内源酶的不足、增a n d , 肠蠕动的速度，改善肠道消化功能，促进对饲料中各 种营养成分的消化与吸收【6 7 , 6 8 】。 3 1 3 改善动物机体免疫功能，提高抗病能力 天津医科大学对乳酸芽孢杆菌的应用试验表明，该菌除具有上述功能以外， 同时还具有降低动物血脂、防止动脉粥样硬化；降低血糖水平，使糖耐受量减低 现象好转；提高动物腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增强吞噬细胞功能；增强动物 n k 细胞活性；使动物免疫器官发育增快，t 、b 淋巴细胞的数量增多，动物的 体液和细胞免疫水平提高；增大动物肝脏和法氏囊系数等作用。同时，它对动物 的结肠炎也有很好的疗效【3 4 1 。 3 2 乳酸芽孢杆菌的作用效果 乳酸芽孢杆菌能发酵糖类物质产生乳酸，分泌消化酶和细菌素等，且其自身 能形成芽孢，其生物学功能也主要通过这三方面来体现，其具体作用如下。 3 2 1 抑制有害菌，提高免疫力 乳酸芽孢杆菌具有极强的肠道粘附能力f 明，能借助对肠道细胞受体的粘附形 成一层保护性生物膜，避免肠道细胞受菌体毒素的侵害，同时还可产生大量的有 益代谢物，促进动物肠道微生态种群平衡及营养物质的消化吸收和利用p 4 。 在预防疾病或促进免疫系统功能方面主要归功于其所引起的“定殖障碍” 4 3 1 ， 其能通过营养和吸附位点的竞争、产生细菌素或其他抗菌肽等抑制其他种类细菌 的定殖，这些定殖障碍构成了一种强烈的粘膜屏障作用，从而阻止致病菌的吸附 和入侵，进一步抑制肠道内致病菌、腐败菌的繁殖，防止发生肠道感染，消除下 痢和腹泻症状【6 9 】。除了定殖障碍，其还能强化上皮组织的屏障功能，从而防止致 病菌在上皮组织内的转位，降低细菌感染【7 0 】。 除此之外，乳酸芽孢杆菌产生的乳酸可降低肠道p h 值，能有效抑制有害细 菌的生长和繁殖【7 1 】，如：可抑制大肠杆菌及有害梭菌类的生长；而乳酸又是肠道 微生物活性的重要调控物质，它在小肠内可进一步代谢生产乙酸，肠道内的环境 6 广东海洋大学硕士学位论文 被酸化，对酸敏感的病原进一步被抑制，当肠道环境p h 值下降时，以分子形式 存在的强有机酸( 甲酸、乙酸) 的浓度上升，通过细胞膜扩散入细胞内并表现出 更高的抑菌能力【7 2 1 ，同时肠道酸性环境一方面可以激活内源酶活性，从而有利于 营养物质的消化吸收【7 3 , 7 4 1 。 3 2 2 营养生理作用 乳酸芽孢杆菌是酶制剂的重要来源，如蛋白酶、淀粉酶等重要酶类都是这个 属的细菌产生的，在动物生产中使用乳酸芽孢杆菌制剂能很好的补充动物内源酶 的不足，并促进营养物质的消化吸收【7 5 1 。另外，乳酸芽孢杆菌制剂可通过改善动 物胃肠道功能来提高蛋白质、钙等营养物质的消化吸收，如经该菌发酵后食物中 营养成分的质量、生物可利用性、消化性都会提高，同时其能产生多种消化酶( 蛋 白酶、淀粉酶) 、乳酸及核黄素、硫胺素等b 族维生素供机体吸收和利用【7 6 1 。 3 2 3 耐高温高压作用 乳酸芽孢杆菌在生长繁殖的对数生长期后能形成芽孢，芽孢对理化因素有强 大的抵抗力，故该菌具有一定的耐热、耐酸、耐干燥的特点，对饲料加工过程的 温度、压力等不良因素抗性较强】，同时抵抗胃酸和胆汁中脱氧胆酸的能力较强， 能耐受消化道中的不良环境条件 r 7 1 。因此，乳酸芽孢杆菌所形成的芽孢能顺利到 达动物肠道并发育为营养菌体，通过生物夺氧作用，抑制有害菌，在维持肠道正 常生态平衡方面起了积极的促进作用【1 7 8 1 。 3 2 4 降低血液中胆固醇含量 乳酸芽孢杆菌降低胆固醇血症的作用可能来源于三个让面1 7 9 , 8 0 ：一是对3 羟基一3 甲基戊二酰c o a 还原酶的抑制作用，该酶是体内胆固醇生物合成的限速 酶，进而降低血液中胆固醇的量；二是通过胆盐水解酶的作用，将小肠内的胆盐 水解，水解后的胆盐能与食物中胆固醇发生共同沉淀作用，从而促进食源的胆固 醇向粪便中转移；三是茵体对胆固醇的同化作用。其中可能有一种至多种机理同 时起作用【8 l 】。 3 2 5 抗肿瘤作用 某些乳酸芽孢杆菌制剂可以激发体内的抗肿瘤作用【8 2 , 8 3 】，其作用主要在于： 抗畸变作用，能直接与这些致突变化合物结合，降低致突活性；减少体内可 7 有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 导致致癌物、畸变剂和致瘤剂产生的酶活力，如降低叠氮还原酶、硝酸盐还原酶 等原致癌物酶的活力。 3 3 乳酸芽孢杆菌在畜牧生产上的应用 1 9 9 8 年，c a v z z o n i 等发现乳酸芽孢杆菌可提高肉仔鸡的生长速度及饲料转 化效率，并比较了维吉尼亚霉素与乳酸芽孢杆菌对肉仔鸡的作用效果，日增重两 者之问无差异，但两者均显著高于空白对照组，因此研究者认为，乳酸芽孢杆菌 同维吉尼亚霉素一样均具有促进生长和预防疾病的作用【8 4 , 8 5 ；2 0 0 5 年，天津市 畜牧兽医研究所对乳酸芽孢杆菌制剂的应用试验表明，在肉用仔鸡饲料中添加该 菌预混剂1 0 0 - - 3 0 0 m g k g 可提高平均体重，平均日增重提高5 5 左右，死亡淘 汰率降低1 5 2 ，饲料增重比下降了7 ；在生长仔猪饲料中添加同样量的该菌 预混剂，平均体重增长4 9 ，平均日增重提高了l o 1 7 ，饲料增重比降低了 6 6 3 5 】。2 0 0 7 年，吴建忠等报道，在1 - 4 9 日龄a a 鸡日粮中分别添加2 0 0 m g k g 乳酸芽孢杆菌制剂和5 0 m g k g 土霉素，结果表明：乳酸芽孢杆菌制剂组和土霉素 组的全期平均日增重比对照组提高1 5 2 9 和9 1 0 ( p o 0 5 ) ：乳酸芽孢菌制剂组和土霉素组的全期料 肉比分别比对照组降低9 0 9 和7 3 6 ( p o 0 5 ) 。 吴建忠同期报道，乳酸芽孢杆菌制剂对2 1 - 4 2 日龄黄羽肉鸡生产性能和免 疫器官发育有促进作用。结果表明：与对照组相比，各试验组均能显著提高肉鸡 平均日增重( p o 0 5 ) 和饲 料转化率( p o 0 5 ) ，试验组肉鸡的胸腺指数和法氏囊指数均有上升的趋势。其 另外的研究表明：乳酸芽孢杆菌粉剂对哺乳仔猪黄白痢有预防功效，连续灌服3 天乳酸芽孢杆菌制剂对乳猪黄白痢的预防效率可达到9 9 5 嘣5 2 挪j 。 3 4 影响乳酸芽孢杆菌使用效果的主要因素 3 4 1 饲用菌种 菌种是影响乳酸芽孢杆菌作用效果的主要因素之一【8 6 】。不同菌种，其生理生 化特性、分泌代谢有一定的差异，这将导致在生长过程中代谢产物不同，引起作 用效果亦不同：甚至同种菌的不同菌株其生理特性也存在一定差异，导致作用也 不一定相同；再者，即使是同菌株，但在不同工艺条件下所制备的产品，其活菌 数量以及芽孢形成率也有一定的差别，以致其使用效果也有一定的差别【8 7 ，8 7 1 。 8 广东海洋大学硕士学位论文 3 4 2 动物个体状况 动物的种类、年龄、健康状况等也是影响乳酸芽孢杆菌作用效果的一个重要 因素【7 3 】。研究发现，当动物处于生长早期体内酶系不健全时、应激条件下以及处 于疾病尤其是胃肠道疾病时，添加乳酸芽孢杆菌饲喂动物更能起到良好的作用效 果【7 5 1 。 3 4 3 饲料成分 饲料的营养水平对乳酸芽孢杆菌的使用效果有一定的影响，该菌在高营养水 平的饲料中的使用效果不如在低营养水平饲料中的使用效果明显f 8 8 1 。现时研制的 乳酸芽孢杆菌制剂绝大多数都对抗菌物质敏感，若饲料中含有一定量的饲用抗生 素或防霉剂，必然会在一定量上杀死乳酸芽孢杆菌，从而影响其使用效果；同时， 若饲料含水量过高，必然也会缩短乳酸芽孢杆菌制剂的可储存时间，同样会降低 其效果 8 9 - 9 1 。 3 4 4 环境和其他影响因素 在环境卫生差的条件下使用要优于条件好下使用瞰】；在使用剂量上，有的仅 添加几万个乳酸芽孢杆菌，而有的添加到上千万甚至更高，这样也会产生千差万 别的使用效果；同时，不同的添加饲喂方式也会使作用效果不一样，一般而言， 拌料饲喂的效果好于饮水的效果9 3 , 9 4 1 。 4 本研究的内容及要解决的问题 本研究拟从自然环境中分离出产酸芽孢杆菌，从这些出发菌株中再通过高效 液相色谱仪检测、抑菌试验和芽孢形成率试验来筛选出具有乳酸产量较大、抑菌 活性较好、芽孢形成率较优的菌株，然后通过形态染色和培养特性观察、b i o l o g 微生物自动鉴定系统及1 6 s r r n a 碱基序列分析等方法来鉴定细菌的种属。获得 产乳酸芽孢杆菌后，以该菌为出发菌株做联合诱变试验，筛选出产酸能力强的正 向突变株，并检测其生物安全性、抵抗性、抑菌特性等性能，最终以适合该菌生 长的培养基为起点，对其进一步作培养基、培养条件的优化。 4 1乳酸芽孢杆菌的分离鉴定 9 有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化 用添加溴甲酚紫的g y p 平板从采集到的样品中分离产酸菌株，通过显微镜、 高效液相色谱仪来进一步筛选出既产芽孢又产乳酸的菌株，最终以b i o l o g 微生 物自动鉴定系统来分析细菌对碳源( 或氮源) 利用的差异，并结合该菌的1 6 s r r n a 碱基序列分析来共同确定所得菌株的种属。 4 2 乳酸芽孢杆菌的诱变筛选 以分离得到的菌株为出发菌株，通过不同作用时间、不同剂量组合的紫外线 和亚硝基胍来对该菌进行复合诱变，并以产酸性能、抑菌特性、芽孢形成率为依 据进行筛选，以期获得较为理想的正向突变株。 4 3乳酸芽孢杆菌的毒性和稳定性试验 用昆明系s p f 小鼠做该菌株的急性毒性试验，检测该菌培养物的安全性及 毒副作用。通过自制菌粉，检测其对热、p h 值以及抗生素的敏感性，确定该菌 的稳定性。 4 4 乳酸芽孢杆菌体外抑菌试验 用牛津杯双层平板定量扩散法进行乳酸芽孢杆菌s c 株培养物对5 种指示菌 的抑菌试验，并检测经高温、酶等因素处理后代谢产物的抑菌性能。 4 5 培养基的选择及培养条件的优化 通过对比筛选，确定适合菌株生长的碳源、氮源、矿物盐类，并以p n 值、 菌数、芽孢形成率为依据，通过正交试验设计来筛选出适宜的培养基组分、配方 比例和培养条件。 1 0 广东海洋大学硕士学位论文 第二章产酸芽孢杆菌的分离 乳酸芽孢杆菌广泛分布于自然界中，根据已有报道，奶粉、酸败罐头食品、 动物饲料、动物胃肠道、植物根毛、根际土壤等都能分离到该类细菌。鉴于此， 本试验主要从自然环境、人畜食品和饲料及动物肠道内容物中采集样品，进行产 酸芽孢杆菌的分离。将所得的菌株低温保存，以供下一步的筛选鉴定。 1 材料与方法 1 1 样品采集与处理 从红树根际土壤、菜园土壤、甘蔗根毛等自然环境，从酸败啤酒、市售酸豆 角、酸菜、腐乳、酒曲、酸乳、酱油、动物饲料等人畜食品和饲料，从牛、羊、 鸡、海螺等动物肠道内容物等三方面共采集样品6 7 份作为分离源。按常规采样 方法取样，记录采样时间、地点、环境条件等以备考查。对于收集到的样品若不 能立即进行分离，须密封包装好放置4 c 冰箱保存，保存时间不超过一周。 1 2 分离培养基 1 2 1 营养肉汤 蛋白胨o 5 ，牛肉膏0 3 ，酵母提取物o 1 ，p h6 8 - 7 0 ，1 1 5 。c 高压蒸 汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 2 改良营养琼脂 蛋白胨o 5 ，牛肉膏o