实验三_单向琼脂扩散实验.ppt

临床免疫学实验指导检验医学院免疫学教研室吴荣实验二、单向琼脂扩散试验,【实验原理】将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在比例适宜时形成白色沉淀环.沉淀环直径与抗原含量成正比。用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等，具有高灵敏性，高特异性特点。,【实验目的与要求】掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、结果分析及临床应用,【试剂与器材】1.羊抗人IgG血清（兔抗人血清，购买）2.标准参考血清(标准IgG质控物，购买)3.待检人血清（IgG抗原）4.pH7.40.01MPBS缓冲液（或NS）5.琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）6.载玻片、打孔器、37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等,用于制作标准曲线,【操作注意事项】1.制备抗体琼脂板琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性2.加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致3.加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察4.加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头5.检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作6.孵育时间应控制在37，24-48小时，时间太短或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。,【标准曲线的制备】由实验教师,1.购买标准已知浓度的人血清（IgG抗原）购买标准羊抗人（兔抗人）抗人IgG-抗体（抗血清）2.制备1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记）取琼脂粉1.0g，加NS，100ml.混匀加热溶解成透明液体，放56，加入标准抗血清1.01.5ml，混匀，制板3.制板，打孔，孔径3mm，孔距1.2-1.5cm，打5个孔。4.加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L110，120，140，180，1:160.稀释100mg,50mg,25mg,12.5mg，6.25mg.浓度5.保温反应：将凝胶板放湿盒内，37反应24h,观察结果.6.用坐标纸制作标准曲线:以沉淀环直径（mm）为纵坐标;以标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线.,标准曲线与样品测定结果（实物实拍）,测定样本：病人血清（标本1.25mm，标本2.20mm）,标准曲线制备：标准抗原稀释4钟浓度，预温24h，沉淀环直径数据30mm25mm20mm15mm,以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。,沉淀环直径（毫米）,4,2,5,6,7,3,8,标准抗原稀释：1：10，1：20，1：40，1：80，1：160相当抗原浓度：100mg50mg25mg12.5mg6.25mg/L沉淀环直径：7mm6mm5mm4mm3mmLg值：2.01.6991.3981.0970.796,0.51.01.52.02.53.0,9,【实验方法】1.制备1.0%免疫盐水琼脂液取琼脂粉1.0g，加入100ml.NS，混匀加热溶解。加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放56，加入1:2稀释的羊（兔）抗人血清1.25ml，混匀，56保温备用。2.制板：每2人制作1个凝胶板。取清洁玻片一张，在背面一角处标记，用5ml或10ml刻度吸管，每片缓慢滴加3.5-4.0ml琼脂液，待凝。3.打孔：每玻片打孔两个，孔径3mm，孔距1.0-1.2cm，用竹签尖将孔内琼脂挑出。4.加样：用NS将血清稀释）10l血清+190l,NS=1:20混匀3次，吸出10l+10lNS=1;40向琼脂孔内分别加入:20，1:40稀释血清各10l5.保温反应：将琼脂板放湿盒内，37温育24-48h。6.测量沉淀环最大直径，查标准曲线。计算：血清IgG(mg/L)=对应的血清IgG含量（稀释倍数）,以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。,沉淀环直径（毫米）,4,2,5,6,7,3,8,标准抗原稀释：1：10，1：20，1：40，1：80，1：160相当抗原浓度：100mg50mg25mg12.5mg6.25mg/L沉淀环直径：7mm6mm5mm4mm3mmLg值：2.01.6991.3981.0970.796,0.51.01.52.02.53.0,9,Ag,Ag,Ag,Ag,【结果计算】分别量取各孔样品沉淀环的直径，在标准曲线上查出对应的IgG含量。待测血清IgG含量(mg/L)IgGmg/L=标准曲线对应结果4（稀释倍数）参考值:成人血清IgG:7