（分析化学专业论文）基于取样探针的微流控试样引入系统的研究.pdf

浙江太堂簋堂位i 盆玄擅要 摘要 微流控学是在微米级通道中操控微升至飞升级流体的技术与科学，自从二 十世纪九十年代提出以来，已经在分析化学中得到广泛的应用。其目的是将在 常规实验室中进行的试样引入、预处理、混合、反应、分离和检测等分析操作 集成到微型化、自动化的微流控系统中，最终目标是实现分析系统的便携化。 微流控分析系统可以分为均相的流动分析系统和基于液滴的间隔相分析系统， 也可将其分为基于芯片的和基于毛细管的微流控系统。目前，微流控系统发展 的主要瓶颈之一是宏观体系与微流控系统的衔接问题，发展针对不同试样的高 通量试样引入技术，对于微流控分析的发展和应用至关重要。本文对基于取样 探针的微流控试样引入技术进行了研究，分别建立了基于芯片和基于毛细管的 液滴分析筛选系统，以及毛细管薄层色谱系统。 第一章首先综述了基于取样探针的微流控试样引入技术的研究现状，包括 耦合式及一体式的取样探针的加工方法及其应用。同时，对于目前正在兴起的 微流控液滴分析系统的研究进展也进行了相应介绍，包括液滴的生成及操控、 液滴的检测，以及系统的应用。 第二章搭建了基于毛细管和缺口管阵列的微流控液滴分析系统。系统由缺 口型试样管阵列、毛细管和微量注射泵组成，不需要复杂的微加工技术和设备， 操作完全自动化，可以通过调节进样顺序、进样组分、进样时间和流速等参数， 灵活而又精确地控制每个液滴的大小和组成。将该系统初步应用于液滴内多种 反应和液滴间的相问传质研究，展示了该系统在化学、生物学和医学等领域所 具有的广泛的应用前景。 第三章首次建立了基于一体化取样探针和缺口管阵列的微流控芯片液滴分 析系统。将试样引入、试剂加入和液滴生成等单元集成于一体化取样探针内， 实现对不同试样的高通量试样引入及液滴生成。该系统集成度高，自动化程度 高，可达到很高的换样通量，为目前微流控液滴分析系统提供了一种新的试样 引入方法。该系统被成功应用于蛋白结晶实验中沉淀剂的筛选以及酶抑制分析 中的抑制剂筛选。 第四章提出了种基于玻璃毛细管的薄层色谱分离方法。在拉尖的毛细管 内填充薄层色谱硅胶固定相，利用手工点样和缺口管技术完成进样，采用简易 和缺口管阵列两种展开模式。系统具有点样方法简单，操作方便，展开剂消耗 少的特点。该系统被初步应用于混合染料和中药大青叶的分离。 关键词：试样引入。微流控芯片，毛细管，高通量，液滴分析，薄层色谱 a b s t r a c t m i c r o f l u i d i c si st h es c i e n c ea n dt e c h n o l o g yt h a tm a n i p u l a t es m a l l ( n l f ls c a l e ) a m o u n t so ff l u i d s i nc h a n n e l sw i t hd i m e n s i o n so ft e n st oh u n d r e d so fm i c r o m e t e r , w h i c hh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di na n a l y t i c a lc h e m i s t r y i t so b j e c t i v ei st oi n t e g r a t e a l lo ft h em o d u l e sp e r f o r m e di nr o u t i n el a b o r a t o r i e s ，i n c l u d i n gs a m p l ei n t r o d u c t i o n ， p r e t r e a t m e n t ，t r a n s p o r t a t i o n ，m i x i n g ，r e a c t i o n ，s e p a r a t i o na n dd e t e c t i o n ，i n t oa c o m p a c td e v i c et oa c h i e v et h em i n i a t u r i z a t i o n ，a u t o m a t i z a t i o na n di n t e g r a t i o no ft h e w h o l ea n a l y t i c a ls y s t e m s ，p r o v i d i n ga d v a n t a g e so fh i g ht h r o u g h p u t ，l o ws a m p l e sa n d r e a g e n t sc o n s u m p t i o na n dl o wc o s t n e v e r t h e l e s s ，o n eo ft h em a j o rb o t t l e n e c ki nt h e d e v e l o p m e n to fm i c r o f l u i d i ca n a l y t i c a ls y s t e m sl i e si nw o r l d - t o c h i pi n t e r f a c e ，w h i c h m e a n ss a m p l ei n t r o d u c t i o nf r o me x t e r n a ls y s t e m s ( 止m ls c a l e ) i n t om i c r o f l u i d i c s y s t e m s ( b e l o wn ls c a l e ) i so fg r e a ts i g n i f i c a n c et om i c r o f l u i d i c s t h i sd i s s e r t a t i o ni sd e d i c a t e dt or e l a t et h ed e v e l o p m e n to fm i c r o f l u i d i cs a m p l e i n t r o d u c t i o nt e c h n i q u e sb a s e do ns a m p l i n gp r o b e sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n s i n c h i p b a s e da n dc a p i l l a r y - b a s e dd r o p l e ta n a l y s i s 。w e l l 鹤i nt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) i nc h a p t e ro n e ，t h ed e v e l o p m e n to fs a m p l ei n t r o d u c t i o nt e c h n i q u e sb a s e do n s a m p l i n gp r o b e s ，a n dt h er e c e n tp r o g r e s si nm i c r o f l u i d i cd r o p l e ta n a l y t i c a ls y s t e m s w e r ed e t a i l e d l yr e v i e w e d i nc h a p t e rt w o ，ac a p i l l a r y - b a s e dd r o p l e ta n a l y t i c a ls y s t e mb a s e do nac a p i l l a r y a n das l o t t e d - v i a la r r a y ( s v a ) s a m p l ep r e s e n t i n gd e v i c ew a sb u i l t ，w h i c hc a p a b l eo f p r o d u c i n gm u l t i c o m p o n e n td r o p l e t si nt h en a n o l i t e rr a n g e t h ep r e s e n ts y s t e mw a s a p p l i e di nv a r i o u sd r o p l e tm i c r o r e a c t o r s ，t od e m o n s t r a t ei t sa p p l i c a t i o np o t e n t i a l si n c h e m i s t r y , b i o l o g ya n dm e d i c i n e i nc h a p t e rt h r e e ，am i c r o c h i p b a s e dd r o p l e ta n a l y s i ss y s t e mw i t ham o n o l i t h i c s a m p l i n gp r o b ew a sd e v e l o p e df o rt h ei n - s tt i m e ，t oa c h i e v eh i g h t h r o u g h p u ts a m p l e i n t r o d u c t i o nf o rd i f f e r e n ts a m p l e si nd r o p l e t - b a s e da n a l y s i s t h es a m p l i n gp r o b e i n t e g r a t i n gf u n c t i o n so fs a m p l ei n t r o d u c t i o n ，m e r g i n gw i t hr e a g e n t sa n dg e n e r a t i n g d r o p l e t ，w a se m p l o y e dt op r o d u c ed i v e r s ed r o p l e tm i c r o r e a c t o r sa u t o m a t i c a l l ya n d c o n t i n u o u s l yb yc o u p l i n gw i t has v as y s t e m t h ep e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a s d e m o n s t r a t e di ne v a l u a t i n gp r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o n sa n ds c r e e n i n gi n h i b i t o r s f o re n z y m er e a c t i o n ap o s s i b l eh i g h e s ts a m p l i n gt h r o u g h p u to f10 ，0 0 0s a m p l e s hf o r d i f f e r e n ts c r e e n i n gr e a g e n t sc o u l db ea c h i e v e db yu s i n gt h i s s a m p l ei n t r o d u c t i o n t e c h n i q u e i nc h a p t e rf o u r , as i m p l ec a p i l l a r yb a s e dt l c s y s t e mw a sd e v e l o p e d at a p e r e d g l a s sc a p i l l a r yp a c k e dw i t hs i l i c ag e lw a su s e da s s a m p l i n gp r o b e a n d c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nf o rt l c t h ep e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a sd e m o n s t r a t e d i nt h e s e p a r a t i o n o fc a m a gt e s t d y em i x t u r e ia n dat r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e f o l i u mi s a t i d i s k e y w o r d s ：s a m p l ei n t r o d u c t i o n ，m i c r o f l u i d i cc h i p ，c a p i l l a r y , h i g h t h r o u g h p u t ， d r o p l e ta n a l y s i s ，t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 刊、豪。 签字日期：2 0 0 9 年7 月2 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 引、象 导师签名： 签字日期：2 0 0 9 年7 月2 1 日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 月 y 平7 压 年易姗 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下完成的成 果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国家知识产权法保护。在学期间或 毕业后以任何形式公开发表本论文中的内容或以本论文中的内容申请专利，均 需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任 何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。 学位论文作者签名 刭、袅 日期：2 0 0 9 年7 月2 1 日 1 1 引言 第一章绪论 微流控学( m i c r o f l u i d i c s ) 是利用尺度在数十至数百微米的微通道结构，处 理和操纵i l l 至f l 级流体的科学和技术【1 ，2 1 。1 9 9 2 年，m a n z 和h a r r i s o n 发表了其首 篇在微加工芯片上完成毛细管电泳分离的论文3 ，4 1 ，从此微流控学逐渐发展为最 前沿的科技领域之一。微流控分析系统是以分析化学为基础，以微机电加工 ( m i c r oe l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 技术为手段，以微通道为结构特征， 目前主要以生命科学为应用对象的前沿领域，其目标是把整个生化实验室的功 能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离和检测等集成到一起，构建微型全 分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，p t a s ) ，实现生化分析，细胞和生 物大分子操控，反应合成和药物筛选等系统的整体微型化、自动化、集成化与 便携化。 在近十几年间，世界各地有许多研究组投身于微流控分析系统的研究当中， 共同推动了该学科的发展。目前，微流控分析系统可分为两大类1 5 】，一是互溶相 的流动分析系统，很多在常规体系下建立的成熟的分析技术已经被应用到该领 域，如流动注射分析、顺序注射分析、电泳和色谱分析等。还有一类是最近几 年兴起的基于液滴的间隔相分析系统，该技术在分析原理上类似于多孔板阵列 技术，但在操作模式上又极具微流控的特色，在系统集成度、系统自动化、系 统成本、试剂耗材消耗和分析通量等方面都优于前者，有望发展成为一种应用 领域广泛的高通量分析技术。 然而，无论是互溶相的微流控分析系统还是基于液滴的间隔相微流控分析 系统，都不得不面对与宏观体系的衔接问题，即如何将宏观体系的分析试样引 入到微流控系统中的问题。这也是当前微流控分析系统发展所面临的主要问题 之f 鲫】。微流控系统内进行的是纳升级以下流体的操控，而需要引入的外部试 样通常是在微升至毫升级体积水平上。据文献报道，现阶段大多数的微流控系 统，均采用在芯片上固定储液池的手工间歇式试样引入方法，操作步骤繁琐费 时，效率低。因此，只有发展自动化的微流控高通量试样引入技术，才能真正 发挥微流控系统高速分析的优势。目前，按接口结构的不同，高通量试样引入 系统主要包括储液池式 1 0 - 1 2 】、流通式 1 3 - 1 6 1 以及取样探针式系统 1 7 - 2 3 】。 根据与本研究工作的相关性，本章集中对微流控取样探针式高通量试样引 入技术进行综述。同时，也对该技术在基于液滴的间隔相分析系统中的应用进 展进行了介绍。 1 2 取样探针式微流控试样引入技术 由于储液池式试样引入系统不易实现进样自动化，流通池式系统试样消耗 量较大，且大部分试样无法回收，为了在高通量试样引入的同时降低试样消耗， 出现了取样探针式微流控试样引入技术。该技术是将取样探针插入到微流控系 统外部的试样储存管进行试样引入。目前，按取样探针结构的不同可将其分为 耦合式取样探针和一体式取样探针。采用取样探针引样技术可显著降低试样引 入过程中试样的消耗，特别是一体式的取样探针可将取样通道的死体积降到最 低，而且该技术较易实现自动化，非常适合样品种类繁多、样品量稀少的高通 量筛选分析。 1 2 1 耦合式取样探针 耦合式取样探针一般是将毛细管与微流控芯片的微通道耦合，以毛细管作 为芯片的取样探针，插入储液池中进行取样。芯片上与毛细管连接的耦合通道 的加工主要采用刻蚀法和打孔法。此类耦合方法已经成功应用到了商品化的仪 器中。此外，这种与芯片耦合的毛细管不但可以作为取样探针完成试样引入操 2 作还可以作为试样的出口与其它分析检测系统联用，如色谱，质谱陋2 ， 激光诱导荧光检测器口7 i 等。 c - r a y 等t 2 8 垤道了种插拔式的毛细管芯片耦台接口，如图li 所示通过 深度反应离了刻蚀，在硅片上刻蚀出刚好能够容纳毛细管的垂直接口，其上方 为喇叭形的聚甲醛塑料用于密封固定毛细管，当加热至2 5 0 。c 时与硅芯片熔为 一体，毛细管可以在该接口处进行反复插拔。c b e n 等”9 幢利用类似的插拔式接 口设计了多层硅芯片系统。p t m t a m b e k a r 等 ”t 了一种更坚同的插入式接口， 可以承受1 0 0 l m i n 的流速和i ，0 0 0p a 的压力。然而此娄基于捅拔式的耦台接 口大多加。r 在硅材质的芯”上，不但需蜚m e m s 技术，加工成本高，且芯片不易 施加高电压，较少用于分析目的，一般用于建立固定床式的微反应器p 。 r g u r e l1c a p i l l a r y ds i l i c o ng i s m n n e c tu s i n gap r e s s - f i te o u p e r l ”q z h a n g 等t ”坪0 用化学刻蚀在芯片通道的进样端和出口端刻蚀出两个直径3 9 0 蛐的圆形f 导通道，用阿根毛细管分别作为试样引 接e l 和连接质谱检测器的 电喷雾接口，实现与石英毛细管的耦台。装置如图l2 所示，芯片水平放置通 过耦合外径3 7 5v m ，内径2 0 0p m ，长i5c m 的毛细管，从垂直固定在三维平移 台上的9 6 孔板上进行取样，有效降低了试样引入时问和死体积。试样引入过程 中，利用真空负压将外部试样通过毛细管引入到芯片通道中，使试样充满微通 道采样环( 长i5 m m ，约6 6n l ) 然后对分离通道施加电压进行电泳分离。分 离后的试样进入电喷雾毛细管( 长3c m ，内径2 5 岬，外径3 7 5 岬) ，进行质谱 检测。利用泵在贮液池中旌加正压完成通道的清洗。试样引入和通道清洗所需 的时间分别为2s 和3s ，试样消耗量为5 0 0n l 。 一一掣 矧 i lc = = = ；：二i 翻 扦广薯y 嗣 f i g u r e12o v e r a l ld e s i g no ft h ec o u p l i n go fn mn n c r o w e l lp l a t es a m p l ed e l i v e t y s y s t e me q u i p p e d w i t ha t n i c r o d e v i c e f o r h i g h t h r o u g h p u ts e p a r a t i o n - m sa m l y s i s b i n g s 等利削麻花钻头从芯 侧壁打孔的方法，实现了毛细管与芯片的耦 合，显著降低了接口处的死体积，如图i3 所示，芯片通道宽4 0 i n n ，耦合的毛 细管内径为5 0 岬外径为1 8 5p m 。采用2 0 0 n 的钨钢钻头沿微通道出口的中 心打孔通常得到的孔的底部为锥形，存在较大的死体积( 约07n l ) ，会带来 电泳区带的显著展宽。而采用鱼尾状平头钻头打孔，可巳上得到平底的接口，进 一步降低了接u 处的死体积。作者使用该系统分离了异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的氩基酸塔短数达到了理论值的9 8 0 。 蕊蕊 爿一一、 f i g u r e l 3 c a p i l l a r y 叽d m i c r o c h i p i n t e r f a c e f a b f i c a t j c d b y m t - t i p p e d n i l 口2 l 杜文斌等【i ”建立了基于微流控芯片的流动注射分析系统，采用芯片耦台石 英毛细管取样探针和一维缺口管阵列实现n l 级试样引入和注射操作。系统装置 如图i4 所水。系统采用重力作为试样引入、试样与试剂混台、传输和反应的驱 动力，并在芯片末端耦合液芯波导( l i q u i d - c o r ew a v e g u i d e l c w ) 管作为吸收 光度法的检测池进行在线检测。最高分析通量达到1 ，0 0 0 样d 时，每次测定试 样总消耗仅为0 6 1 3n l 。 飞墨= ：鬯国 t y o o nc u b ew a $ t qr o s e o 口 f i g u r 0 1 4s c h e m t i cd i a g r n mo f t h e m c m c h i p b a s e df i as y s t e m 何巧红等【1 1 将一根长35c l t l ，内径5 0g m ，外径3 7 5 啪的石英毛细管弯成 “z ”型与玻璃芯片耦合，作为电泳进样的取样探针，结合一维缺口管阵列，连 续自动地引入不同的样品到分离通道( 如图i5 ) 。系统应用于f i t ( ；标记氨基酸 的分离，分析通量为3 6 样d , 时，每次测定样品消耗2 4 0 n l 。 f i g u r e1 5s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ea u t o m a t e de l e c t r o k i n c t i cc o n t i n u o u ss a m p l e i n t r o d u c t i o ns y s t e m f o r m i c r o c h i p c a p i l l a r ye l e c l m p h o r e s i s c a l i p e rl i f es c i e n c e s 公司研制的e zr e a d e r 系列药物筛选平台是种基于毛 绑管取样探针的“吸样式”芯片，如图1 6 所示，在芯片h a 成了垂直于芯片的 石英毛细管探针通过三维移动9 6 或3 8 4 孔板，使吸样针插入板孔中的反应物 溶液，在负压的作用f 通过芯片底部的吸样针吸取到芯片内部的通道中进行电 泳分离和检测。仪器还可以根据设定的时间间隔将样品吸入芯片中进行分析， 具有实时动力学检测功能。此外，该公司还开发了类似结构的商品化仪器 l a b c h i p9 0 和l a b c h i p3 0 0 0 ，可用于d n a 片段分离、蛋白质分析、细胞膜电势分 析等i 。 升g u r e l 6s i p p e rc h i p s o f c a l i p e r l i f es c i c a c 船u s e d i n e zr e a d 乱o 采用毛细管与芯片耦合方法加工取样探针的局限性是加工难度较大，需要 一定的操作技巧。而且由于芯片通道的横截面为梯形，毛细管的横截面为圆形， 在两者的接口处易产生死体积并会形成试样陋带的展宽，增加系统的携出教 渣 应。此外耦台接口处一般使用胶粘剂进行密封，从而降低了芯片对腐蚀性溶 剂或溶液的耐受性及使用寿命。 1 2 2 一体式取样探针 在基于毛细管构建的微流控分析系统中，通常毛细管的入口端即作为取样 探针使用。此种情况是一体式取样探针技术的一种特殊表现形式。在这些系统 中，通常使用一根毛细管代替微流控芯片完成试样目i 入、试样反应、试样分离 及试样检测等分析工作。由于毛细管本身就是一个探针形状，可以实现与样品 储液池间的无缝衔接，因此以其作为取样探针，小但可以避免复杂的接口加工， 而且还可以发展成为一种更加简单实用的试样引入技术。 杜文斌等【2 0 】建立了基于短毛细管的激光诱导荧光检测微流控顺序注射分析 系统( 如图17 ) 。该系统无需使用微加工技术，无需借助阀和泵等设备，实现 了高通量纳升级消耗的顺序注射分析，并对试样区佑在毛细管内的分散现象进 行了理论研究和实验验证，进行了扩散系数测定和酶抑制分析等应用研究。此 外，除激光诱导荧光检测方法讣，他们还尝试将该顺序注射分析系统与化学发 光检测和吸收光度检测系统联用分别应用于鲁米诺一过氧化氢铁氰化钾化学发 光体系和邻菲哼啉f 印n 昆色体系删，如图18 和圈19 所示。 f b u r * 1 7 s c h e m a t i c d i a g r a mo f t h ea s i a s y s t e m w i t h l e t - i n d u c e d i f i u o r e d e t e c t i o n f i g u r e1 - 8s c h l i cd i a g r a mo fm el i s ns y s t e mw i t hl i q u i d w a v e g u i d e a b s o r b 肌d e t e c t i o n f w f i g u r e l 9s c h e m a t i c d i a g r m o f t h e p s i as y s t e m w i t hc h e m l l e d e t e c t i o n 徐章润等吲用一根7 5c m 长的液芯波导管同时作为取样探针、分离通道及 检测流通池，并且在波导管入口处沉积层铂做为电极结合圆盘式缺口管阵 列实现了毛细管电泳系统电动进样的自动化( 如图l1 0 ) 。系统应用干氨基酸的 电泳分离及激光诱导荧光检测，每次分离样品的消耗仅为2i l l 分析通量可运 6 0 样，j 、时。 三- ：；= 薯勺 爹群。 f i g u r e11 0s c h t i ci l l u s t r a t i o no f t h em i n i a t u r i z e dc es y s t e mw i t h t h e i m p r o v e da u t o c o de o n f i a u o 璐s a m p l e i n t r o d u c t i o ns y s t e m 张婷等口”剥用表面张力自发进样，在一根短毛细管中实现了皮升级试样引 入以及高速毛细管电泳分离( 图11 1 ) 。系统分析性能与微流控芯片电泳相当甚 至更优于芯片电泳，在1 5g r i m 的分离距离内，采用自由区带电泳模式，5 4s 实现 了5 种f i t c 标记的氨基酸的分离，塔板高度达到0 4 0 岫。在5 1 次连续分离中， 信号峰高的r s d 仅为12 一37 。将分离距离延长到5 0m m 时，在2 i s 内实现 了8 种氨基酸的分离，塔板高度可达0 , 3 l 02 0u 同时，该系统也被应用到 毛细管胶束电动色谱中在6 5s 内实现了手性氨基酸的分离。 封 p b r mn ge 巾 f i g u r e l 1 1s c b c m t i c d i a g r a m o f t h e l u g h s dc a p i l l a l 3 , e t t r o p h o r e s l ss y s t e m 潘建章等时1 报导了一种手持式的微型分光光度计( 如图l1 4 ) ，体积 1 0 45 x 18c 一。光度计内集成了试样引入、l e d 光源、流通池、光电二极管检 测器、单片机控制电路、数据处理和显示系统，以及卟可充电的锂离子电池， 可提供连续2 0 小时的工作。采用液芯波导管作为取样探针，同时也作为长光程 ( 5n t l i ) 吸收光度检测池。采用指压式试样引入及更换方法每次测定试样消 耗仅为2 5 0n l 。 f i g u m1 1 2s c h e m t i ei l l u s t r a t i o n o ft h eh a n d h e l dp b o t o m e t e rw i t ht w o s a m p l ei n t r o d u c t i o ns y s t e m s1 3 1 v a nb e r k e l 研究组 殳计了一种用于表面取样的套管式取样探针( 如图 i1 3 ) 用于将薄层色谱分离后的组分送入电喷雾质谱中分析。通过取样探针的 外管将载流试剂引 到薄层板上，将薄层板上的组分洗脱进入取样探针的内管 道道内，再引入到质谱中进行分析。薄层板固定在电脑控制的二维平移台上， 依次将分离开的谱带移动到取样探针f 完成顺序进样。 f i g u r e l 1 3s c h n c i l l u s t r a t i o n 女o w i n g t h es a m p l i n g p r o b e 【 当需要进行一些复杂的微流控操作时有时用单一的一根毛细管并不能满 足要求。在进行复杂的微流体操控方面，微流控芯片与毛细管相比，具有优势。 但芯片与外界试样的接口技术直是微流控系统展的个瓶颈问题。些研 究组通过在芯片上加工出外形类似于毛细管的体化取样探针米完战试样的引 入。 c h e n 等在一块7 0 1 4 x l5m m 3 的聚甲蛙丙烯酸甲酯( p m m a ) 芯片的分 离通道端，将通道两侧多余的p m m a 切除加工山一个8 x 2 x 15m m 3 的取样探 针如图11 4 所示。将该探针直接插八针睹渡池中通过电进样完成试样引入， 然后再将探针插a n 盛有缓冲液的储液池中，进行电泳分离。l i u 等呻“i 在聚二 甲基硅氧烷( p d m s ) 芯片分离递道的两端加工了两个形状相似的探针，卟作 为取样探针进行试样引 ，另个则插入到缓冲液储液池中。系统被应用于f i t c 标记氨基酸及蛋白质的分离。 f i g u r e l 1 4 p h o t o g r a p ho f t h e f m a l p m m a m i c r o c h i p w i t has h a r p i n l e t 耐2 。1 除塑料芯片外，c h e r t 等i9 1 还报道了一种在玻璃芯片上加工取样探针的方法， 如图l1 5 所示。通过控制取样探针在储液池中的停留时间及电压来控制进样体 积，建立了连续试样引入- 毛细管电泳分离一安培检测的分析系统。系统试样引入 操作采用手动方法进行，分析速度达1 0 0 样4 时，对t n t 组分的分析精度为37 ( n - 1 0 0 ) 。 f i g u r e11 5s c h t i cd i a g r a mo ft h es h a r pc em i c r o c h l pf o rs i m p l i f i e d s a m p l c i n t r o d u c t i o n l 述几种基于芯片一体化取样探针的试样引入系统，均采用手t 洁将取样探 针插入到不同的储液池巾完成试样更换或试样与缓神液之间的更换操作，操作 费时费力，且会对实验结果带来误差。何巧红等l ”艋破璃芯片l 加工了一个与 毛细管外径相当的取样探针，与缺口管阵列相结合，建立了高通量、低消耗的 自动化连续试样引入毛细管电泳分离的分析系统。整个系统具有结构简单、集 成度商、工作稳定等优点。系统琏续分析f i t c 标记的氨基酸混合样品1 1 次，精 氨酸、f i t c 和苯两氨酸峰高的r s d 分别为36 33 和35 。系统连续工作2 小时，测定氪基酸酸混合样品6 0 次，各组分峰高的r s d 均在8 以内。系统每 次测定所需试样消耗量为3 0n l ，分析速度选3 0 一6 0 样4 时。此外，试样引入 系统对不同试样分析的携出量小于1o 。 f l g u m l 1 6s c h e m a t i cd i a g n mo f t h e m o n o l i t h i cs a m p l i n gp r o b o b a s h s y s t e mm ra u t o t e da n dc o n t i n u o u s m d l ei n t i x x i u c t i o nmm i c r o c h i p c a p i l l a r y d o c t t o p h o r e s i s a b d e i g a w a d c 4 等 4o 恨导了一种混台型的试样引入接口将基于液滴的数字微 流控芯片与通道型的p d m s 芯片结合到一起，用p d m s 芯片上暴露在外丽的分离 通道直接从液滴内取样，如图11 7 所示。利用电润湿作用先在数字微流控芯片 上进行试样的预处理，将试样和试剂两个独市的液滴融合到一起完成反应后， 冉将整个液滴( 5 止) 移动到p d m s 芯片的入口处，实现纳升级的电进样、电 泳分离和激光诱导荧光检测。该系统被应用于进行细胞裂解物中氨基酸的荧光 标记、标准多肽的酶解，然后将产物引入分离通道进行m e c k 分离。 目瞳 f i g u r e l l 7s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h eh y t , t _ i dd i g i t a l c h 珊e l m i c r o f l u i d i cd e v i c e 4 l 】 1 3 微流控液滴分析技术 在徽流控系统中，一些在宏观流动体系中可以忽略的物理效应表现得异常 显著，如层流效应、扩散效应、吸附效应和表面张力效应等，这些效应在某些 条件下会带来系统的效率和稳定性下降。 首先，对层流效应来说，在均相流动微流控分析系统中，低雷诺数下流动 的流体所具有的层流效应不利于反应物间的混合，会导致混合时间增长，混合 效率下降，如图1 1 8 上圈。而在基于液蒲的间隔相微流控系统中在互不相溶 相剪切力的作用下，每个液滴内会产生有效的对流棍台( 如图l1 8 下图) ，而且 纳升至皮升级大小的液滴具有较高的表面积体积比使包裹在液漓内的反应物 传质速度更快。当液滴悬浮于互不相溶相中，还有效地抑制了反应物的扩散， 因此每个液滴可看作是一个单独的微反应器。相比于均相微流控系统，液滴反 应器通常具有更高的分析通量。 、= 端怒i “p “ “ 摹殍；孝 l i 。”；0 i 嚣。 f i g u r e11 8c o m p a r i s o no far e a c t i o nb e t w e e nt w oi n p u t si nap r c s s l i r ed r i v e nm i c r o f l u i d i c d e v i f o ras i n g l e d h n es y s l c m 8 0 p ) a n d f o r ad r o p l m - l m s e ds y s t e mc o o t l o m ) l 对扩散效应而言，在均相微流控体系中通道内壁对内部流体的剪切力， 使流体的流速在通道横截面上呈现抛物线流型，靠近壁面的流体流速为零而在 通道中部的流速最大。因此，样品和试剂在通道内存在泰勒扩i 敦现象，产生试 样区带被分散稀释的问题，容易造成样品问的交叉污染以及多样品区带问的混 合不完全。虽然泰勒扩散可以使医带问相接触的区域较快地进行混合，但是由 于两端的区带扩散到载流中使得整个试样区带不易实现完全的混台，影响混 台及反应效率；而在基于液滴的微流控体系中通过将所有参与反应的组分局 限在分隔开的液滴中消除了样品区带的泰勒扩散，保证了所有进入到液滴内 的样品和试剂都参与到了混合及反应中。对于纳升甚至皮升级大小的波滴，其 表面积体积比较大，液蒲内不同组分间扩散和传质距离更短，混合速度更快 通常在液滴形成后瞬间即可完成混合及反应。此外，可通过测量液滴的迁移距 离及流速计算出精确的反应时间或孵育时间，从而使得液滴微流控系统特别 适用于那些对反应物量及反应时间要求严格的生化反应如高通量的反应条筛 选。 对分析系统的分析通量而言在均相微流控体系中如欲提高井行实验的 数量，通常需要设计具有多个通道阵列的微流控装置，这就增加了系统加工的 复杂性，并使装置体积变大，目前相应的阵列检测仪器也未成熟，且不易实现 微型化。而基于液滴的微流控系统可以在不增加装置体积及复杂性的前提下， 以数h z 到数千h z 的速度产生具有高度单分散性的纳升甚至皮升级液滴，每个 液滴便可作为一个独立的反应容器。相邻液滴间有互不相溶的气相或油相的间 隔，通道的表面经过改性使液滴悬浮于通道内，由此避免了微通道内的表面吸 附和液滴之间的交叉污染，从而可以同时进行大量的平行实验。因此，液滴分 析技术也可以看作是多孔板阵列技术的延伸，但其消耗试剂更少，反应时间更 快。 近年来，对微流控液滴分析系统的研究正在逐渐兴起，其系统已被成功应 用于化学合成 4 2 , 4 3 】、酶分析 4 4 , 4 5 】、d n a 分析 4 6 - 5 0 1 、细胞分析t 5 1 , 5 2 j 和蛋白分析【5 3 - c o l 等领域。同时，也带动了一系列基于液滴的微流控技术的发展，包括液滴的生 成( g e n e r a t i o n ) 、液滴的操控( m a n i p u l a t i o n ) 、液滴的分裂融合( f i s s i o n f u s s i o n ) 、 试剂与液滴的混和( m i x i n g ) 、液滴的分选( s o r t i n g ) 和液滴的检测( d e t e c t i o n ) 等，本节将着重介绍与本工作密切相关的液滴生成和液滴检测技术。 1 3 1 液滴的生成 目前，利用微流控技术形成和操纵液滴的方法按驱动方式分，可分为压力 驱动、电驱动 6 1 - 7 2 】、表面声波驱动7 3 , 7 4 1 、热驱动【7 5 1 、光驱动嗍以及气动法【7 7 】( 如 图1 1 9 ) 。按操作平台分，主要可分为两大类，基于通道的和基于平面的微流控 液滴生成技术【7 8 】，如图1 2 0 所示。 r 基于芯片的ft 型结构( c r o s s o o w i “g ) ，压力驱动j ( c h i p - b 3 s e d ) 【+ 字结构( f l o w f o c u 5 ”g ) 羹r “”m ”“。c 轩a p i l l a r y - b a s 的e 艨：i ：i = 挲州 液l 挚j 电动驱动f 电润湿法( e l e 。”8 川“g 。“叫剖。d “ 塞1 ( e l 。黑d y n a m i c sl 介电电泳法( o i e f e c i r o p h o r e a c ) 和ld r i v e n ) 。 爨lf 热毛细法盯h e r m o c a p m a 吖) 喜 其它外力驱动j 激光致动法( l a s e ra c t u a t i o n ) ( o t h e r s ) i 表面声波法( s u r f a c ea c o u s t i cw a v e ) l 气动法( p n e u m a u cp m s s u r e ) f i g u r e l 1 9 1 h er n i c m f l u i d i c t e c h n l q u 嚣f o r g c n h a t i n g 出o p l c t s 嬲徽蓉骶， d o 蝴m k d m m m f i g u