（化学工程专业论文）基于罗丹明b及芘的新型阳离子荧光分子探针的研究.pdf

y u a ny l j a n b s ( h u n a nu n i v e r s i t yo fa r t sa n ds c i e n c e ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e i n c h e m i c a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz h a n gx i a o b i n ga n ds e n i o re n g i n e e rc h e nl i g u o m a y , 2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 蟊司 日期：少i 年o l , q 矿e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名：功纵 导师签名：妖唯雩， 了锄l 阿 e l 期：五叫年口莎月矿日 e t 期：乃ff 年。歹月旷日 工程硕士学位论文 摘要 由于荧光分析法具有灵敏度高，选择性好，对样品无破坏，对细胞损伤小等 优点，因此荧光分子探针已被广泛用匆金属离子的检测。近十年来，检测重金属 和过渡金属离子的小分子荧光探针得到了极大的发展。其中增强型离子荧光探针 得到了极大关注，因为相比于荧光淬灭型探针，增强型探针更适合应用于生物体 系。然而很多重金属离子( 如汞离子和铜离子) 对荧光染料有较强的淬灭作用。 因此，设计合成荧光增强型重金属和过渡金属离子荧光探针已成为目前研究的热 点和难点。本论文设计合成了三种增强型荧光分子探针用于检测汞离子和铜离子。 具体内容如下： 1 在第2 章中，利用罗丹明衍生物螺内酰胺结构开环可导致颜色和荧光发生 显著变化的特性，我们研制了以罗丹明b 为载体的硫螺环结构荧光分子探针，用 于汞离子的检测。该探针分子用对p h 不敏感的硫原子直接形成硫螺环，由于硫 原子对汞离子有较强的亲和性，这不仅提高了载体分子识别汞离子的能力，还有 效的避免了汞离子与荧光分子的自旋轨道耦合作用而淬灭荧光物质的荧光。汞离 子加入前，探针分子在溶液( d m f 水( 1 ：9 ，v v ) ) 中无色，无吸收，无荧光；汞 离子加入后，诱导硫螺环结构开环，其荧光和吸收光谱都有显著增强。我们考察 了该探针分子对汞离子的响应特性，结果表明，该探针分子对汞离子的线性响应 范围为1 0 1 0 培m 到1 o 1 0 币m ，检测下限低至2 5 1 0 4 m 。在p h3 6 1 1 2 范围 内，该探针对汞离子的响应几乎不受p h 的影响。此外，该探针对汞离子表现出 很好的选择性。 2 在第3 章中，基于第2 章罗丹明衍生物同样的特性，我们设计了以硫代 罗丹明b 一邻氨基酚为载体的荧光分子探针用于水相中汞离子的测定。我们用s 原 子取代罗丹明b 螺环上的酰胺o 作为一个汞离子的识别位点，一个酚氧负离子作 为一个强亲核试剂，引入一个苯环在立体结构上促进亲核加成反应的快速完成。 由于快速的亲核加成反应提高了该探针对汞离子检测的灵敏度。该探针对汞离子 的线性检测区间为1 0 1 0 一1 o l o 击m ，检测下限为3 o 1 0 母m ，因此该探针能够 应用于自然水体系和生物样品中汞离子的检测。该探针对汞离子具有高选择性， 不受p h 影响，响应时间快等优点，将其初步应用于检测活细胞中的汞离子，得 到了令人满意的结果。 3 在第4 章中，基于铜离子可以催化水解酰肼结构，最后形成羧基的原理， 我们研制了以芘酰肼为载体的增强型铜离子荧光探针。加入铜离子前，探针本身 在3 7 5n m 处荧光较弱，铜离子的加入使得芘酰肼结构被催化水解，形成芘羧酸 结构，从而在3 7 5n m 处荧光显著增强，优化实验条件，得到探针分子对铜离子 基于罗丹明b 及芘衍生物的新型阳离子荧光分子探针的研究 的线性响应范围为3 o 1 0 8 m 到3 0 l o 。6m ，检测下限为8 0 1 0 。9 m 。此外，该探 针对铜离子有较好的选择性。 关键词：荧光探针；荧光增强；罗丹明；芘；汞离子；铜离子 i a b s t r a c t d u et 。i t sh i g hs e n s i t i v i t y ，n i c es e l e c t i v i t y , f a s ta n a l y s i sw i t hs p a t i a l r e s 。1 u t i 。n a n dn o ns a m p l e - d e s t r u c t i n go r1 e s s c e l l - d a m a g i n g ，f l u o r e s c e n c ep r o b em i g h tb et h e b e s tc h o i c ef o rm e t a li o n sd e t e c t i o n t h el a s td e c a d eh a ss e e nag r e a t l yi n c r e a s i n g i n t e r e s ti nt h ed e v e l o p m e n to fs m a l l - m o l e c u l e f l u o r e s c e n tp r o b e sf o rh e a v ya n d t r a n s i t i o nm e t a li o n s a m o n gt h e m ，p r o b e s w i t hf l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t t o r a n a i v t e sh a v ea t t r a c t e dp a r t i c u l a ra t t e n t i o n a ss u c h p r o b e sa f f o r d “t u m - o n ”r e s p o n s e s t o w a r dm e t a li o n sw h i c ha r em o r es u i t a b l ef o rb i o i m a g i n ga p p l i c a t i o n s a n dp r a c t l c a l s 锄p l e st h a nt h o s ep r o b e sb a s e do nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g m e c h a n l s m h o w e v e r m a n yh e a v ya n dt r a n s i t i o n m e t a li o n s ( e gh 9 2 + ，c u 2 + ) a r ek n o w na sf l u o r e s c e n t q u e n c h e r s t h e r e f o r e ，i t i ss t i l lo n eo ft h ed i f f i c u l t a n dh o ts p o t st 0d e s l g n a n d s y n t h e s i sh ig h l y s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ep r o b e s w i t hf l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t r e s p o n s e st o w a r dt r a n s i t i o nm e t a li o n s i nt h i st h e s i s ，t h r e e n o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b e s f o rh ，+ o fc u 2 + d e t e c t i o nw i t h “t u r n o n r e s p o n s e sw e r ei n v e s t i g a t e d a sf 0 1 1 0 w s ： 1 i nc h a p t e r2 ，ah i g h l ys e n s i t i v e f l u o r e s c e n c ep r o b eb a s e do nr h o d a m l n eb d e r i v a t i v ef o rh 9 2 + d e t e c t i o n i nd m f w a t e rw a sd e v e l o p e d t h e f l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n to ft h ep r o b ei sb a s e do nah 9 2 + i n d u c e dr i n g 。o p e n i n g m e c h a n i s m t h e r h o d a m i n ebt h i o s p i r o c y c l i cw a ss y n t h e s i z e db ya na c c i d e n t a lr e a c t i o n d u e t oas a t o mi n t r o d u c e di n t ot h em o l e c u l ea st h eu n i q u e r e c og n i t i o nm o i e t y ，t h ep r o b e c o u i d a f f o r dav e r yn i c es e l e c t i v i t yf o rh 9 2 + d e t e c t i o n o v e ro t h e rc o m m o nm e t a li o n s i t1 sa c o l o r l e s s ， n o n f l u o r e s c e n tc o m p o u n d ， w i t ht h ei n t r o d u c t i o n o fh g ”，t h ep r o b e i n s t a n t l ve x h i b i t s ap i n kc o l o r ，a c o m p a n i e d w i t ha l lo r a n g e f l u o r e s c e n c e l n d m f - w a t e r ( 1 ：9 ，v i v ) s o l u t i o n w i t ht h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s o p t i m i z e d - t h ep r o b e 。 e x h i b i t sad y n a m i cr e s p 。n s ec 。n c e n t r a t i 。nr a n g ef o rh 9 2 + f r o m l 0 10 8t o1 o 10 。 m w i t had e t e c t i o nl i m i to f2 5x 10 一m i na d d i t i o n ，t h ep e r f o 珊a n c eo ft h ep r o b e c a nn o tb ei n t e r f e r e dd u r i n gab r o a dp h v a l u ef r o m3 6t o 1l 2 2 i nc h a p t e r3 ，an e wf l u o r e s c e n tp r o b eo fn o v e lr h o d a n m i n et h l o s p l r o l a c t a m d e r i v a t i v ew a sd e v e l o p e df o rs e l e c t i v ed e t e c t i o no f h 9 2 + i np u r ea q u e o u ss a m p l e s i n t h ew e l ld e s i g n e dp r o b e ，t h et h i o s p i r o l a c t a m s e r v e sa sb o t hh g z + b i n d i n gu n i t a n d p r e e l e c t r o n d e f e c tcc e n t r e ，ap h e n o x i d ea n i o nw i t hv e r y s t r o n gn u c l e o p h i l i c i t y 1 s c h o s e na st h ea t t a c k i n gu n i t ，a n dab e n z e n er i n gi si n t r o d u c e d o nt h el i n k e rt oa f f o r d s t e r i ce f f e c t ，w h i c hb e n e f i t sf o ram o r ee f f i c i e n tn u c l e o p h i l i cr e a c t i o n t h a np r e v l o u s i y i v r e p o r t e dp r o b e s ，a n dt h u sa ni m p r o v e ds e n s i t i v i t yt o w a r d sh g 计i te x h i b i t sas t a b l e r e s p o n s ef o rh 9 2 + o v e rac o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m 1 0 1 0 。8t o1 0 x 1 0 一m ，w i t ha d e t e c t i o nl i m i to f4 0 x10 一m m o s ti m p o r t a n t l y , d u et ot h eh i g he f f i c i e n c yo ft h e n u c l e o p h i l i cr e a c t i o n i tw o r k sw e l li na q u e o u sm e d i aw i t hn o a d d i t i o n a lo r g a n i c e o s o l v e n t ，w h i c hm a k ei tp o s s i b l ef o rt h ep r o b et od e t e c t i o no fh g z + i np u r ea q u e o u s s a m p l e ss u c ha sn a t u r a lw a t e rs a m p l e sa n db i o l o g i c a ls a m p l e s t h er e s p o n s eo f t h e p r o b et oh 9 2 + i sh i g h l ys e l e c t i v ea n dp h - i n s e n s i t i v e ，w i t haf a s tr e s p o n s et i m e a l l t h e s eu n i q u ef e a t u r e sm a k ei t p a r t i c u l a r l y f a v o r a b l ef o rc e l l u l a rh 9 2 + i m a g i n g a p p l i c a t i o n s i th a sb e e np r e l i m i n a r i l yu s e df o rh i g h l ys e n s i t i v em o n i t o r i n go fh g z + l e v e li nl i v i n gc e l l sw i t hs a t i s f y i n gr e s u l t 3 i nc h a p t e r4 ，c o p p e ri o n sc a nc a t a l y t i ch y d r o l y s i sh y d r a z i d es t r u c t u r et of o r m e a r b o x y l i e w e h a v ed e v e l o p e d p y r e n eh y d r a z i n eb a s e d f l u o r e s c e n tp r o b ef o r d e t e c t i o no fc o p p e ri o n si ni t se t h a n 0 1 w a t e r ( 1 ：1 ，v v ) s o l u t i o n t h ep y r e n eh y d r a z i d e s t r u c t u r ec a nb ec a t a l y z e dh y d r o l y s i sb yc o p p e ri o n s ，a n dt h e nf o r m a t i o no fp y r e n e e a r b o x y l i ca c i ds t r u c t u r e ，r e s u l t i n gi ns i g n i f i c a n t l ye n h a n c e df l u o r e s c e n c ea t3 7 5n m w i t ht h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so p t i m i z e d ，t h ep r o b ee x h i b i t sad y n a m i cr e s p o n s e c o n t e n t r a t i o nr a n g ef o rc u 2 + f r o m4 0 x10 t o1 0 x10 一m ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f 1 4x10 一m i na d d i t i o n ，t h ep r o b es h o w sg o o ds e l e c t i v i t yf o rc o p p e ri o n s k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e ；f l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t ；r h o d a m i n eb ： p y r e n e ；m e r c u r i ci o n s ；c o p p e ri o n s v 工程硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 荧光分子探针的结构2 1 3 荧光分子探针的设计原理2 1 3 1 结合一信号输出法2 1 3 2 置换法3 1 3 3 化学计量计4 1 4 荧光探针的响应机理5 1 4 1 光诱导电子转移( p e t , p h o t o - i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 5 1 4 2 分子内电荷转移( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e ) 7 1 4 3 荧光共振能量转移( f r e t , f l u o r e s c e n c er e s o n a t ee n e r g yt r a n s f e r ) 一8 1 4 4 激基缔合物( e x c i m e r e x c i p l e x ) 9 1 5 有机载体在荧光分子探针中的应用1 0 1 5 1 罗丹明1 0 1 5 2 芘13 1 6 本论文的研究工作1 4 第2 章基于罗丹明b 硫螺环增强型汞离子荧光分子探针的研究1 6 2 1 引言1 6 2 2 实验部分17 2 2 1 仪器与试剂1 7 2 2 2 化合物的合成1 7 2 2 3 荧光强度的测定1 8 2 3 结果与讨论1 9 2 3 1 光谱性质1 9 2 3 2 测定原理2 0 2 3 3p h 的影响2 2 v i 基于罗丹明b 及芘衍生物的新型阳离子荧光分子探针的研究 2 3 4 选择性2 2 2 4 小结2 3 第3 章基于硫代罗丹明邻氨基酚荧光增强型汞离子分子探针的研究2 4 3 1 引言2 4 3 2 实验部分2 6 3 2 1 仪器与试剂2 6 3 2 2 化合物的合成2 6 3 2 3 测量过程2 8 3 2 4 细胞培养和成像2 9 3 3 结果与讨论2 9 3 3 1 汞离子化学计量计的优化设计与合成2 9 3 3 2 吸收光谱性质3 0 3 3 3 荧光光谱性质3 1 3 3 4 p h 的影响3 2 3 3 5 选择性3 3 3 3 6 响应时间3 4 3 3 7 汞离子催化反应机理3 4 3 3 8 细胞内汞离子检测3 5 3 4 小结3 5 第4 章基于芘酰肼铜离子增强型荧光探针的研究3 7 4 1 引言3 7 4 2 实验部分38 4 2 1 仪器与试剂3 8 4 2 2 化合物的合成3 8 4 3 结果与讨论3 9 4 3 1 光谱性质3 9 4 3 2 测定原理一4 0 4 3 3p h 的影响4 1 4 3 4 选择性4 2 4 3 5 响应时间4 2 4 4d 、结4 3 结论4 4 参考文献4 5 v t 程硕士学位论文 附录a 攻读学位期间发表及完成的论文目录5 6 致谢5 7 v i i i 工程硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 荧光分子探针建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础之上，它能选择性 地将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号。荧光分子探针 受到周围环境( 如温度、酸度、粘度、溶剂，特别是外来化学或生物物种等) 的 影响，使其荧光发射( 如光谱和强度) 发生变化，从而使人们获知其周围环境的 特征或者环境中存在的某种特定信息。 由于荧光存在高灵敏度、测量信号丰富以及探头设计简便等优点，采用荧光 信号作为检测手段的光化学传感器，已得到广泛的应用。荧光分子探针指的是有 着分子尺寸、在与被分析物相互作用时能够给出荧光输出信号的一种分子器件， 因其具有灵敏度高、使用方便、费用低、不需要预处理、不受外界磁影响等优点 而受到广泛关注。 环境污染问题已成为全球共同关注的一个热点，也是我国经济和社会可持续 发展面临的主要问题之一，对环境污染物监测方法的研究已成为当今世界范围内 包括环境科学、化学、材料科学等学科共同关注的一大热点。在我国，水体污染 控制与治理已被设立为国家中长期科学和技术发展规划纲要( 2 0 0 6 2 0 2 0 年) 中的十六个重大科技专项之一。在各种环境毒性物质中，重金属离子( 尤是汞离 子) 由于其对生命物质及整个水系的生态平衡的不可逆破坏( 即使痕量存在) 而 尤为引人关注。关于痕量重金属离子的监测方法的研究已引起了包括环境化学、 有机化学、分析化学等多个学科的科研工作者浓厚的兴趣。 传统的重金属离子检测方法，如冷原子吸收法( a a s ) 【l j 、x 射线荧光光度 法【2 1 、质谱( m s ) 3 - 5 1 电感耦合等离子体原子发射光谱法( i c p a e s ) n - 7 】、冷原 子荧光光度法【8 】和阳极溶出伏安法【9 】等，都存在仪器昂贵、分析步骤复杂、运行 成本高等缺点，难以满足现场快速检测的实际需要。而荧光分子探针，由于具有 灵敏度高、选择性好、无需参比、不受电场、磁场的影响、可用于原位检测以及 利用光纤进行远距离监测等优点受到了极大关注。目前，荧光分子探针已被广泛 用于金属离子的检测。 基于罗丹明b 及芘的新型阳离子荧光分子探针的研究 1 2 荧光分子探针的结构 s t r o n g l yf l u o r e s c e n t 图1 1 荧光探针的结构 荧光分子探针【lo 】( 如图1 1 所示) 通常由三部分组成：( 1 ) 识别基团 ( r e c e p t o r ) ，能选择性地与被分析物结合或发生化学反应，使探针分子所处的化 学环境发生改变；( 2 ) 荧光基团( f l u o r o p h o r e ) ，把识别基团与被分析物结合所引 起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号一荧光( 荧光强度的变化，荧光 光谱的移动，荧光寿命的变化) ；( 3 ) 连接体部分( s p a c e r ) ，用以连接识别基团 和报告基团。在组成荧光探针的这三部分中，识别基团和报告基团起着决定性的 作用：识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，报告基团则决定了识别的灵 敏度，而连接体部分则可起到分子识别枢纽的作用。 理想的荧光探针应具备如下几个特点：( 1 ) 选择性好，选择性是设计荧光探 针首先要注意的，探针的选择性包括识别部件结合的选择性和报告部件光学性质 的选择性，即探针对某一种离子有选择性响应才有意义；( 2 ) 检测限低，低的检 测限实际应用的意义才更大；( 3 ) 水溶性好，实际应用中，尤其在生物样品中，水 溶液都是优先考虑的作用介质，因此，探针分子必须具有一定的水溶性。 1 3 荧光分子探针的设计原理 目前已经报道的荧光探针的设计原理【1 1 】主要有以下几种：结合一信号输出 法、置换法和化学计量计法等。 1 3 1 结合一信号输出法 荧光基团连接体识别基团被分析物 信号输出 图1 2 基于结合一信号输出法原理设计的荧光探针 工程硕士学位论文 如图1 2 所示，结合一信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团通过 共价键连接来设计荧光探针的方法。当识别基团与被分析物结合时会引起荧光基 团的化学环境发生变化，通过颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的增减等现象 来表现，这些变化可被裸眼或者仪器识别。这是目前设计荧光探针中应用最广泛 的方法。如图1 3 所示，j u n g 等【l2 j 设计并合成了以邻氨基苯硫醚香豆素醛为载体 的锌离子荧光探针( 化合物1 ) 。作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨 基苯硫醚以席夫碱相连，汞离子加入后， 及香豆素上的氧原子配位得到化合物2 ， 荧光从无到有的变化。 1 3 2 置换法 与硫醚上的硫原子、席夫碱上的氮原子 抑制了席夫碱上c = n 键的旋转，实现了 2 图1 3 基于结合一信号输出法设计的锌离子荧光探针 识别基团被分析物 结合荧光基团 猩型蓑宴妊砌 荧光基团 结合被分析物 八儿坐叫 图1 4 基于置换法设计的荧光探针 置换法的原理是利用识别基团分别与报告基团和被分析物结合能力的不同来 实现对被分析物的检测。如图1 4 所示，识别基团和荧光基团先形成络合物，当 被分析物加入到该体系中时，由于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基 团与荧光基团的结合能力，因此被分析物将荧光基团置换出来，从而引起了整个 体系荧光等化学参数的变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离 子荧光探针。 饕 基于罗丹明b 及芘的新型阳离子荧光分子探针的研究 + c u ( c n ) 2 3 4 图1 5 基于置换法设计的氰根离子荧光探针 如图1 5 所示，g u l i y e v 等【1 3 1 设计了化合物3 ，氟硼荧上修饰的d p a 先与铜 离子络合形成的化合物3 荧光微弱，加入氰根后，由于铜离子与氰根离子的结合 常数更大，从而把作为荧光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到化合 物4 ，使之进入溶液，荧光恢复，而其它的阴离子不能把铜离子置换出来，因此 可以实现对氰根的检测。 1 3 3 化学计量计 o + o 一 探针分子 被分析物新物质a o + o 一一 i 探针分子被分析物中间体 新物质b 新物质c i i 图1 6 基于化学计量计法设计的荧光探针 ( i ) 被分析物和探针分子反应形成共价化合物；( i i ) 被分析物催化探针分子反应生成两种 新物质 化学计量计是利用探针分子和被分析物之间发生的特定化学反应( 一般是不 可逆反应) 来改变探针所处的化学环境，从而对被分析物进行识别的一种方法。 根据化学计量计法设计的探针可以称为化学计量计，大致分为两种类型，如图1 6 所示：一类是探针分子和被分析物发生化学反应后形成共价化合物( i ) ；另一类 是被分析物催化探针分子反应生成两种新物质( i i ) 。一般而言，基于化学计量 计原理设计的荧光探针分子通常具有不可逆性和较好的选择性。 工程硕士学位论文 5 6 7 图1 7 基于化学计量计设计的次氯酸根离子荧光探针 如图1 7 所示，c h a t t e r j e e 等1 4 】根据次氯酸根可以氧化羟胺的特性，设计合成 了化合物5 ，当次氯酸根存在时可氧化羟胺结构，使罗丹明开环，从而形成结构6 ， 最终进一步水解为罗丹明6 g 一结构7 ，而产生强烈的荧光。而其它氧化性分子没 有这样的特性，因此该探针可以实现对水相中次氯酸根的高选择性检测。 1 4 荧光探针的响应机理 目前报道的荧光分子探针主要有如下几种响应机理【1 5 。1 7 】：光诱导电子转移 ( p e t ，p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 、分子内电荷转移( i c t ，i n t r a m o l e c u l a r c h a r g et r a n s f e r ) 、荧光共振能量转移( f r e t , f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) ， 激基缔合物( e x e i m e r e x c i p l e x ) 和其他一些机理等。 1 4 1 光诱导电子转移( p e t , p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 光诱导电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与 电子受体之间发生电子转移的过程。p e t 过程如图1 8 所示，识别基团与被分析物 结合之前，荧光基团受激发，最终被光激发到激发态的电子不能跃迁到基态，使 得荧光基团的荧光淬灭。而识别基团与被分析物结合后，p e t 过程受阻，荧光基 团的荧光得以恢复。如图1 8 所示。 w e a k l yf l u o r e s c e n t s t r o n g l yf l u o r e s c e n t 图1 8p e t 识别分析物理论示意图 p e t 过程可以用前线轨道理论具体解释：当识别基团不存在时，荧光团被光 激发后，其最高占据轨道( h o m o ) 的一个电子跃迁到最低空轨道( l u m o ) ， 能够产生荧光；若外来识别基团的h o m o 或l o m o 轨道介于荧光团两轨道能量 之间，此时就可以发生识别基团与荧光团之间的电子转移而导致荧光的猝灭。即 第二种是荧光基团对识别基团的电子转移( p e t 2 ) ，如图1 1 0 所示，即识别基 团的l u m o 轨道介于荧光团的h u m o 和l u m o 轨道之间，当被分析物不存在时， 荧光基团被激发后，荧光基团l u m o 轨道上的电子转移到就近的识别基团的 l u m o 轨道上，无法回到其基态而难以产生荧光，导致荧光淬灭，耳0 p e t 2 过程发 生，当被分析物与识别基团结合后，识别基团的l u m o 的能量升高，p e t 过程受 阻，荧光基团的激发态电子可以返回基态，荧光恢复。 总的来说，识别基团对荧光基团的电子转移，即识别基团的h u m o 轨道上的 电子占据了荧光基团的h o m o 轨道；荧光基团对识别基团的电子转移( p e t 2 ) ，即识 别基团l u m o 消耗掉了荧光基团被激发的电子，两者最终导致荧光基团被激发的 电子不能回到基态，使荧光被淬灭。 工程硕士学位论文 基于识别基团对荧光基团的电子转移( p e t l ) 过程比较常见，化合物8 是z e n g 等【l8 】设计的p e t l 机理探针( 如图1 1 1 ) ，该探针以氟硼荧为荧光基团，氮杂硫醚为 识别基团。当c u + 不存在时，识别基团中的氮原子上的孤对电子的能量介于氟硼 荧的h o m o 和l u m o 轨道能量之间，被光激发后，氮上的孤对电子可以转移到氟 硼荧的h o m o 轨道，荧光团被激发到激发态的电子不能回到基态，导致荧光基团 的荧光淬灭，即发生了光诱导电子转移( p e t l ) 过程。当c u + 存在时，c u + 与氮上 的孤对电子配位，束缚了氮上的孤对电子，降低了其h o m o 轨道的能量，使发生 在氮原子和荧光团之间的p e t l 被禁阻，荧光强度大幅度增强。实验结果也证明了 此过程，p h = 7 的h e p e s 缓冲液中，识别基团与一倍当量的c u + 络合后，量子产率 可从o 0 1 6 增加至0 1 3 ，荧光增强1 0 倍，且此探针的选择性很好，且c u 2 + 没有干扰。 s 图1 1 1 基于p e t 原理的荧光探针 1 4 2 分子内电荷转移( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e ) 分子内电荷转移是指分子在激发态时发生分子内电子转移，造成正负电荷分 离，形成分子电荷转移态。分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团上同时连 有推电子基团( 电子给体，d o n o r ) 和吸电子基团( 电子受体，a e c e p t o r ) ，通过 兀键提供电子转移的通道，形成强的推一拉作用的共轭体系，其吸电子基团或推 电子基团本身充当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，作为识别 基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电能力发生的改变，整个体系的的兀电子 结构重新分布，从而导致吸收光谱和发射光谱发生变化，主要是光谱红移或蓝移 ( 如图1 6 所示) 。 共轭度减小审光谱蓝移 被分析物与供电子基团( 电子给体，d ) 结合，荧光光谱蓝移 基于罗丹明b 及芘的新型阳离子荧光分子探针的研究 - i 岭共轭度增大冷光谱红移 被分析物与吸电子基团( 电子受体，a ) 结合，荧光光谱红移 图1 1 2 识别基团分别为电子供体和电子受体的i c t 过程光谱移动示意图( 其中d 、a 分别 表示电子给体和电子受体) 化合物9 是y u a n 等【l9 】设计的香豆素荧光探针( 如图1 1 3 ) ，在香豆素的3 号 位以烯键连接了一个拉电子基，7 号位修饰了一个二乙胺基供电子基，构成了推 拉电子体系的荧光分子探针。当羟基自由基存在时，能够将化合物9 氧化为化合 物1 0 ，这样化合物1 0 共轭度大大扩大，氮原子带正电荷增强了其拉电子能力， 使整个体系兀电荷离域程度增大，从而导致吸收光谱和荧光光谱分别红移了6 0n m 和1 5 6r i m ，发射波长已位于近红外，基本不受样品荧光背景的干扰，荧光颜色由 绿色变为红色，该探针可对细胞中的羟基自由基进行比率检测，比率信号高至2 1 0 倍。 n 9 1 0 图1 1 3 基于i c t 机理的荧光探针 1 4 3 荧光共振能量转移( f r e t , f l u o r e s c e n c er e s o n a c ee n e r g yt r a n s f e r ) 荧光共振能量转移指一个荧光体系含有两个荧光团，一个充当能量供体d ， 另一个为能量受体a ，当用供体d 的激发去激发荧光体系时，可以发生从d 到a 的非辐射能量转移，从而发射出受体荧光团的荧光。荧光共振能量转移发生必须 具备以下几个条件：( 1 ) 能量供体荧光团d 的荧光发射位于短波长处，且发射光 谱和能量受体荧光团a 的吸收光谱有一定重叠，能量受体能够在能量供体的发射 波长处吸收能量；( 2 ) 能量供体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之间的碰 撞直径( 有时甚至为7 0 1 0 0 a ) ；( 3 ) 能量供体与能量受体还必须以适当的方式 排列。 工程硕士学位论文 化合物1 1 是z h a n g 等【2 0 】以氟硼荧和罗丹明为荧光团设计的f r e t 荧光探针 ( 如图1 1 4 ) ，由于氟硼荧的荧光发射光谱与罗丹明的吸收光谱有较大范围重叠， 通过连接臂连接，氟硼荧作为能量供体，罗丹明作为能量受体，加入被分析物后， 荧光共振能量转移过程便能实现。加入汞离子之前，表现为氟硼荧的绿色荧光， 汞离子的存在能促使氨基硫脲形成嗯二唑酮类化合物而致使罗