（发酵工程专业论文）mitsuaria+sp1412产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备.pdf

m i t s u a r i as p 1 4 1 - 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 摘要 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，在食品、医药、环保领域有着广泛的应用。 但普通壳聚糖分子量大、粘度高、水溶性差，使得其应用受到限制，而低分子量壳 聚糖在其应用方面具有优越的性质。传统工业上，通过酸解或氧化法制备低分子量， 但其工艺复杂，成本高，易形成副产物，且污染环境。壳聚糖酶酶法处理方式能够 选择性地、特异性地切断壳聚糖的糖为1 3 - 1 ，4 一糖苷键，降解过程和降解产物的分子量 易于控制，而且具有条件温和、产率高、污染小等优点，成为近年来的研究热点。 本课题以自主分离到的一株产壳聚糖酶的菌株m i t s u a r i as p 1 4 1 2 为研究对象， 研究了其生理特性；优化其产壳聚糖酶条件；分离纯化了壳聚糖酶并测定其相对分 子质量；成功制备了低分子量壳聚糖，抗菌实验验证了其抗菌活性。具体研究结果 如下： l 、研究了菌株m i t s u a r i as p 1 4 1 2 的生理特性，结果表明，该菌最适培养条件 为温度2 8 ，p h = 6 8 ；其可以利用碳源的有：葡萄糖，氨基葡萄糖，麦芽糖，甘 油，柠檬酸；该菌可以利用氨态氮，不能利用硝态氮，也不能利用尿素。同时该菌 不产生纤维素酶和淀粉酶。 2 、优化了菌株m i t s u a r i as p 1 4 1 2 产壳聚糖酶的发酵条件。最适培养基组分为： 壳聚糖( 0 5 ) ，胰蛋白胨( 0 0 5 7 ) ，七水硫酸镁( 0 0 5 ) ，磷酸二氢钾( o 0 3 ) ，磷酸 氢二钾( 0 0 7 ) 。此条件下，m i t s u a r i as p 1 4 1 2 发酵液中的壳聚糖酶活可达到3 5 3 u m l 。发酵进行到1 2h 时，将发酵液p h 调至5 7 ，可使发酵液酶活从3 5 3 u m l 提 高至4 3 u m l 。 3 、用d e a e s e p h a r o s ec l - 6 b 离子交换色谱对菌株m i t s u a r i as p l 4 1 2 所产胞外 壳聚糖酶进行了分离纯化，s d s p a g e 测定其相对分子质量，结果显示，该酶的相 对分子质量为3 1 0 0k u 。 4 、采用单因素实验对壳聚糖酶酶法制备低分子量壳聚糖的条件进行了研究，结 果显示菌株m i t s u a r i as p 1 4 1 2 所产壳聚糖酶的最适作用条件为p h5 0 ，温度6 5 ， 加酶量6 0u g 壳聚糖，最适底物浓度为4 。通过酶解液还原糖浓度和粘度测定以 及寡糖组分分析可以得出，该壳聚糖酶只具有内切活性。用凝胶渗透色谱法和粘度 法测定了制备的低分子量壳聚糖样品相对分子质量，结果显示采用上述优化条件， 酶解3 0m i n 后，壳聚糖的相对分子质量从2 9 8 3 3k u 迅速降至2 6 1 4k u ，1h 后降至 1 0 5 9k u ，2h 后则降至7 4 7 4k u ，3h 后降至3 8 2 2k u 。 5 、壳聚糖相对分子质量的降低使得其晶体结构发生转变且水溶性增强，考查了 不同相对分子质量壳聚糖对大肠杆菌和酵母生长的影响，结果表明，c h i t o s a n 一0 ， c h i t o s a n 一0 5 ，c h i t o s a n 1 对大肠杆菌k 9 9 与酵母菌6 2 1 生长有明显抑制作用，而 c h i t o s a n 一2 和c h i t o s a n 一3 却对大肠杆菌k 9 9 与酵母菌6 2 1 生长无明显抑制作用。 关键词：壳聚糖；壳聚糖酶；低分子量壳聚糖；酶降解 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t c h i t o s a ni st h en - d e a c e t y l a t e dd e r i v a t i v eo fc h i t i n ，i ti su s e f u lf o ra p p l i c a t i o n si nf o o d ， p h a r m a c e u t i c sa n dc o s m e t i c s h o w e v e r , t h e i rh i g hm o l e c u l a rw e i g h t s ，h i g hv i s c o s i t ya n d p o o rs o l u b i l i t y r e s t r i c tt h eu s e l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( l m w c ) r e v e a l s s i g n i f i c a t i o nd i f f e r e n tc h a r a c t e r i z a t i o ni na p p l i c a t i o n t h em e t h o d sf o rp r e p a r i n gl m w c i sc h e m i c a lo ro x i d a t i o n ，t h e yh a v es e v e r a ld e f e c t s ：c o m p l e xp r o c e s s ，h i 。g hc o s t s ， b y - p r o d u c t sf o r m e da n dh a r s hc o n d i t i o n p 一1 ，4 - g l y c o s i d i cb o n d si nc h i t o s a nc a nb es p l i t s p e c i f i c a l l ya n ds e l e c t i v e l y h y d r o l y s i sp r o c e s sa n dt h em o l e c u l a rw e i g h t so fp r o d u c t i o n s a r ec o n t r o l l e d e a s i l y b e s i d e s ，e n z y m e so p e r a t eu n d e rm i l d e rc o n d i t i o n s ；y i e l do f p r o d u c t i o ni sh i g h ；p o l l u t i o ni ss l i g h t t h e r e f o r e ，i ti sa t t r a c t i n gg r o w i n gi n t e r e s t an e wi s o l a t e ds t r a i nm i t s u a r i as p 141 2w a se m p l o y e di nt h i ss t u d y t h em a x i m a l c h i t o s a n n a s ea c t i v i t yw a so p t i m i z e d ；t h ec h i t o s a n a s ew a sp u r i f i e da n di t sm o l e c u l a r w e i g h tw a sd e t e r m i n e d ；l m w cw a so b t a i n e ds u c c e s s f u l l y ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a s p r o v e dw i t ha s s a yf o ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t y t h er e s u l t si nd e t a i lw e r ea sf o l l o w s ： 1 p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i co fm i t s u a r i as p 14 1 2w a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a t ，t h eo p t i m a lg r o w t hw a so b s e r v e da t2 8 ，p h6 8 a b l et ou t i l i z ean u m b e ro f c a r b o nc o m p o u n d s ，s u c ha sg l u c o s e ，g l u c o s a m i n e ，m a l t o s e ，g l y c e r o l ，c i t r a t e a m m o n i a n c a nb eu t i l i z e db yt h i s s t r a i n ，n i t r a t ec a nn o tb eu t i l i z e d ，n e g a t i v ef o rc e l l u l a s ea n d a m y l a s e 2 t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rc h i t o s a n a s ep r o d u c t i o nw e r ed e t e r m i n e da s f o l l o w e d ：c h i t o s a n ( 0 5 ) ，t r y p t o n e ( 0 0 5 7 ) ，m g s 0 4 7 h 2 0 ( 0 0 5 ) ，k h 2 p 0 4 ( 0 0 3 ) ， k 2 h p 0 4 ( 0 0 7 ) t h em a x i m u mc h i t o s a n a s ea c t i v i t yw a s3 6u m lu s i n gt h i sb r o t h t h e c h i t o s a n a s ea c t i v i t yi n c r e a s e dt o4 2u m l f r o m3 6u m lb ya d j u s t i n gp ho f l i q u i dt o5 7 u s i n g1m o l m ln a o h a t12ho ff e r m e n t a t i o np r o c e s s 3 t h ee x t r a c e l l u l a rc h i t o s a n a s ep r o d u c e db ys t r a i nm i t s u a r i as pl41 2w a sp u r i f i e d u s i n gd e a e - - s e p h a r o s ec l6 bi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s d e t e r m i n e db ym e a n so fs d s p a g e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h i s e n z y m ew a s3 1k u 4 t h i sp a p e rs t u d i e dt h ec o n d i t i o n su n d e rw h i c hl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n s ( l m w c ) c o u l db ep r e p a r e db yd e g r a d a t i o no fc h i t o s a nu s i n gc h i t o s a n a s eb ys i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s i tw a sf o u n dt h a tt h ec h i t o s a n a s ef r o ms t r a i nm i t s u a r i as p 14 1 2s h o w e d o p t i m u md e p o l y m e r i z a t i o nu n d e rt h ec o n d i t i o n sa sf o l l o w e d ：p h5 0 ，t e m p e r a t u r e6 5 ， a n de n z y m ea d d e d6 0 u gc h i t o s a n ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e4 t h e nt h ep a p e r d e t e r m i n e dt h ec o n c e n t r a t i o no fr e d u c i n gs u g a ri ne n z y m a t i cs o l u t i o na n dv i s c o s i t ya n d a n a l y s e dt h eo l i g o s a c c h a r i d ec o m p o n e n t s ，w h i c hs h o w e dt h a tt h ec h i t o s a n a s ea c t e do n i i m i t s u a r i as p 1 4 1 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 c h i t o s a ni ne n d o r s p l i t t i n gm a n l i e ro n l y t h ed e t e r m i n a t i o no fm o l e c u l a rw e i g h to f s a m p l e sp r e p a r e db ym e a n s o f g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n d v i s c o m e t r i c m e a s u r e m e n t si n d i c a t e dt h a tu n d e rt h ea b o v eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h em o l e c u l a rw e i g h to f c h i t o s a nd r o p p e df r o m2 9 8 3 3k ut o2 6 1 4k ua f t e r3 0m i no f e n z y m eh y d r o l y s i s ；t o1 0 5 9 k ua f t e r1h ；t o6 4 7 7k ua f t e r2h ；t o3 8 2 2k ua f t e r3h 5 1 1 1 ed e c r e a s eo fm o l e c u l a rw e i g h tl e dt ot r a n s f o r m a t i o no fc r y s t a ls t r u c t u r ea n dt h e i n c r e a s eo fw a t e rs o l u b i l i t y , t h ea c t i o no fc h i t o s a n aw i t hm o l e c u l a rw e i g h to nt h eg r o w t h o fe s c h e r i c h i ac o l ik 9 9a n dg t r o p i c a l i s6 21w e r ee x p l o r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ， c h i t o s a n - 0 ，c h i t o s a n 一0 5 ，c h i t o s a n 一1i n h i b i tg r o w t ho fe c o l ik 9 9 a n dg t r o p i c a l i s6 21 ， b u tb o t hc h i t o s a n 2a n dc h i t o s a n - 3d i dn o t k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；c h i t o s a n s e ；l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 不 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 v 2 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：矗整也近 时间： 矿。厂年多月5 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数 据股份有限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编、复制，发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：稗够造 导师签名：缪乡呼 签名b 翔：豆。宇年s 茂i 如签名疆翔：妒尹年 刍茂，皇甚 i 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 m i t s u a r i as p 1 4 1 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 _ - 一 1 月i j 吾 1 1 壳聚糖概述 甲壳素是一种质硬且无弹性的多糖，呈白色。它是节肢动物表皮和真菌细胞壁 中含有的一种“含氮多聚糖”。甲壳素是一种线性高分子，属于直链氨基多糖。其单 体是n 乙酰氨基葡萄糖，单体间通过b 1 ，4 键连接。甲壳素不溶于与水和绝大数的 有机溶剂。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化后的产物，它能够溶解在p h 值较低的稀的 有机酸溶液中。脱乙酰度是测定壳聚糖溶解性的一个重要参数( d e g r e eo f d e a c e t y l a t i o nd d ) 。同甲壳素相比，壳聚糖的d d 增加，这使得了壳聚糖分子的电荷 分布发生了改变。一般而言，甲壳素的乙酰度大约是9 0 。甲壳素经碱液处理后， 部分地或全部地脱去甲壳素上的乙酰基，而转变成壳聚糖。除了d d 外，聚合度也 会对壳聚糖的物理化学特性产生影响。壳寡糖和低分子量的壳聚糖在聚合度上并没 有严格的区分，通常认为，壳寡糖的分子量在1 0l ( u 以下。在制备不同相对分子质 量壳聚糖的过程中，粘度常常被作为一个参数，用于测定壳聚糖相对分子质量。 跟大多数多糖不同的是，壳聚糖和低分子量的壳聚糖带正电荷。这主要是因为 乙酰氨基葡萄糖单元上的乙酰基被去除了的缘故。这一化学特性使得壳聚糖和低分 子量的壳聚糖能够结合到带负电荷的介质表面，这与已经观察到的生物学特性相一 致。此外，壳聚糖和低分子量壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，降解产 物一般对人体无毒副作用，这极大的推动了它们的应用。 尽管，甲壳素和壳聚糖的来源很多，但目前生产壳聚糖和甲壳素的主要生物原 料仍然是虾壳和蟹壳( m u z z a r e l l ie t a l ，1 9 9 4 ) 。自然界中的甲壳素大多总是和不溶于 水的无机盐及蛋白质紧密结合在一起。人们为了获取甲壳素，往往将甲壳动物的外 壳通过化学法或微生物法来制备。当前，工业上主要采用化学法，其主要步骤概括 如下：第一步，用3 5 的n a o h 溶液处理虾壳或蟹壳，以脱去蛋白质，从而避免蛋 白质对产品的污染，再用3 一5 的h c l 溶液处理脱去蛋白的壳聚糖，以脱去钙离子， 就可以得到白色或者粉红色的甲壳素。然后将甲壳素与4 0 4 5 的n a o h 溶液混合， 于9 0 1 2 0 加热，反应4 5h 后，用蒸馏水冲洗干净，干燥后即可得到阳离子的壳聚 糖粗品。将壳聚糖粗品溶解在2 的醋酸溶液中，搅拌，过滤，除去不溶物，随后向 滤液中加入n a o h 溶液，壳聚糖即以白色沉淀的形式析出( h i r a n o ，1 9 9 6 ) 。将甲壳素在 强碱液中加热处理，其分子结构中的乙酰胺基就会发生水解，从而脱去乙酰基，留 下游离的氨基，但一些乙酰基团仍有可能保留在氨基基团上，并以随机方式分布于 壳聚糖分子上。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 2 壳聚糖酶的研究进展 1 2 1 壳聚糖酶的来源 壳聚糖酶是作用于壳聚糖的水解酶，壳聚糖是由氨基葡萄糖残基通过p ( 1 _ 4 ) 连接而成的多聚物。在特定相对分子质量的壳聚糖的生产中，壳聚糖酶得到了广泛 应用。壳聚糖及甲壳素是自然界比较丰富的多聚糖。保守估计，全球每年由甲壳纲 动物产生的甲壳就多达1 5 0 x 1 0 3 公吨，其中大部分被倾入海洋中，造成了潜在的环 境污染问题。如此大量的壳聚糖和甲壳素，客观上要求对其进行大规模地处理。通 过壳聚糖酶和几丁质酶的作用，壳聚糖和甲壳素将被分别降解为氨基葡萄糖和乙酰 氨基葡萄糖。 壳聚糖酶作为一种水解酶，广泛存在于植物，细菌和真菌中。壳聚糖酶和甲壳 素酶之间没有明显的区别，二者均能降解不同乙酰化水平的壳聚糖。能够很好的降 解较高n 乙酰化水平的多聚物的甲壳素酶在降解较低乙酰化水平的壳聚糖时却更 加有效( o h t a k a r ae ta 1 ，1 9 8 8 ) 。通过比较壳聚糖酶和甲壳素酶的表观分子量，可以将 二者区分开来。 大多数细菌和真菌分泌的壳聚糖酶属于胞外酶( c h o ie ta 1 ，2 0 0 4 ；h e d g e sa n d w o l f e ，1 9 7 4 ；t o m i n a g aa n dt s u j i s a k a ，1 9 7 5 ) ，极少的壳聚糖酶属于胞内酶，它们主要 出现在植物中( o u a k f a o u ia n d a s s e l i n ，1 9 9 2 ；y e d i d i ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。不同微生物来源的壳 聚糖酶在降解壳聚糖时具有不同的作用模式，这与底物的乙酰化水平相关( s e i n oe t a 1 ，1 9 9 1 ) 。到目前为止，自然界发现的绝大多数的壳聚糖酶均是内切酶，该酶水解 壳聚糖后主要生成壳二糖，三糖，四糖等寡糖。n a n j o 等从n o c a r d i a 的滤液中纯化 得到了一种能够水解壳聚糖的外切酶，该酶从壳聚糖或壳寡糖的非还原端开始，以 氨基葡萄糖为单位，逐步作用于p 1 ，4 糖苷键，生成氨基葡萄糖洲a n j oe ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 1 2 2 壳聚糖酶活力的测定 壳聚糖极难以溶于水，且不同批次的壳聚糖产品存在较大差异，从而使得壳聚 糖酶的动力学测定相对困难。 通常通过测定底物的消失量或者产物的生成量来监测酶促反应的过程。对于溶 解在醋酸缓冲液的壳聚糖或者可溶性的壳聚糖的衍生物( 比如乙二醇壳聚糖) ，常用 前一种方法来测定它们的粘度变化，这种方法在探测降解反应的早期具有一定的潜 力，但其灵敏性相对较差；也有通过测定溶液的浊度的方法来了解胶体降解情况的。 壳聚糖降解产物的测定有很多方式，其中最为常见的是测定降解过程中产生的还原 糖基团。一些学者使用了显色剂，这种显色剂能与氨基葡萄糖发生特定的显色反应 ( r o n d l ea n dm o r g a n ，1 9 5 5 ) ；还有部分学者使用了纸色谱或薄层色谱，用于分析壳聚 糖酶解后的寡糖组分。 2 m i t s u a r i as p 1 4 1 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 1 2 3 壳聚糖酶的纯化 通过传统的方法使用，如硫酸铵沉淀，凝胶排阻色谱，离子交换色谱和等点聚 焦等，已经将各种来源的壳聚糖酶进行了纯化。s t r e p t o m y c e ss p n o 6 与s t r e p t o m y c e s n o 一1 7 4 所产壳聚糖酶不能用传统的实验方法进行沉淀( b o u c h e r e ta 1 ，1 9 9 2 ，p r i c e a n d s t o r c k ，1 9 7 5 ) ，因此，只能通过使用聚乙二醇的膜透析来完成发酵酶滤液的浓缩， 尽管这可能造成壳聚糖酶的损失。s a k a i 等( 1 9 9 1 ) 通过使用键合了壳三糖的s e p h a r o s e 4 b 柱，对壳聚糖酶进行专一性的亲合层析，分离得到了壳聚糖酶。 1 2 4 壳聚糖酶性质 ( 1 ) 壳聚糖酶的分子量 大多数壳聚糖酶的表观分子量均在1 0 - - - 5 0k u 之间。菌株b a c i l l u sm e g a t e r i u mp 1 可产生三种壳聚糖酶，其相对分子质量分别为4 3 ，3 9 5 和2 2k u ( s d s g a g e ) ( p e l l e t i e r a n ds y g u s c h ，19 9 0 ) 。 ( 2 ) 底物特异性 壳聚糖广泛存在于真菌以及霉菌的细胞壁中，此外，还能以甲壳素为原料脱乙 酰制备能溶解于稀酸的壳聚糖，但脱乙酰化并不是彻底的。因此，一些乙酰基团会 残留在壳聚糖分子上。壳聚糖的相对分子质量范围较大，少则几l ( u ，多则达到2 0 0 0 k u 。 壳聚糖酶不仅可以降解壳聚糖，还可以降解壳聚糖的衍生物，如乙二醇壳聚糖， 羧甲基壳聚糖以及胶体壳聚糖。有的壳聚糖酶除可降解壳聚糖外，还能降解羧甲基 纤维素( s e i n oe ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 ( 3 ) 温度和p h 对壳聚糖酶活力的影响 已经报道的壳聚糖酶的最适作用温度和p h 分别在3 0 - - - 7 0 和4 0 - - - 8 0 之间。 壳聚糖酶的等电点在4 0 1 0 1 之间。c i t r u ss i n e n s i s 所产壳聚糖酶的最适作用温度为 6 0 ( o s s w a l d e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。向s t r e p t o m y c e sn 一17 4 和b a c i l l u sm e g a t e r i u mp 1 所产壳 聚糖酶溶液中加入小牛血清白蛋白后，其温度的热稳定性得到提高。 ( 4 ) 壳聚糖酶的作用模式 壳聚糖酶来源各不同，其降解底物的模式也各不相同。一般地，壳聚糖酶的作 用模式可以分为内切和外切两类。目前报道的大多数来源各异的壳聚糖酶均属于内 切酶，降解后的主要产物是二糖，三糖，以及三糖以上聚合度较高的壳寡糖。 壳聚糖是壳聚糖酶的天然最适作用底物，其乙酰化水平会对壳聚糖酶的降解效 率产生很大的影响。s t r e p t o m y c e sn 17 4 所产壳聚糖酶能够对乙酰化水平分布较宽的 壳聚糖进行降解，因此它对底物壳聚糖的乙酰化水平要求不严( b o u c h e r e ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。b a c i l l u sc i r c u l a n sm h k 1 所产壳聚糖酶在对脱乙酰度为8 0 的壳聚糖底物作 用时活性最高，该酶的这种降解特性表明，壳聚糖分子中存在一定数量乙酰氨基葡 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 萄糖残基，将有利于壳聚糖酶的高效降解( y a b u k ie ta 1 ，1 9 8 8 ) 。菌株b a c i l l u sk c c t 所 产壳聚糖酶只能降解壳三糖及其以上聚合度的壳寡糖以及壳多糖。 ( 5 ) 影响壳聚糖酶生物合成的因素 许多研究结果显示，大多数的壳聚糖酶均是诱导性酶。壳聚糖作为唯一碳源， 可以支持菌株s t r e p t o m y c e sn 1 7 4 生长，并诱导其产生壳聚糖酶。同时，d 氨基葡萄 糖也能够作为唯一碳源，支持菌株s t r e p t o m y c e sn 一1 7 4 生长，并诱导其产生壳聚糖酶， 但酶活力水平要低于前者，仅相当于前者的1 5 2 5 ( b o u c h e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。对菌株 a m y c o l a t o p s i sc s o 一2 而言，它只有依赖于壳聚糖诱导，才能表达壳聚糖酶；氨基葡 萄糖，乙酰氨基葡萄糖不能诱导其产酶，尽管二者都能够支持菌椒l m y c o l a t o p s i s c s o 一2 的生长( o k a j i m ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。少数植物在真菌v a m 的诱导下也可以产生壳聚糖 酶( d u m a sg a u d o t e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。向含有葡萄糖或不含葡萄糖的培养基中加入氨基葡萄 糖，可诱导菌株s t r e p t o m y c e ss p n o 6 分泌表达壳聚糖酶，壳聚糖酶活在对数生长期 可以检测到，而在平稳期，由于壳聚糖酶得以积累而迅速上升。此外半乳糖对产壳 聚糖酶也有一定的诱导作用，但乙酰氨基葡萄糖和乳糖对产壳聚糖酶没有诱导作用。 f s o l u n i 能够在含有2 的乙酰氨基葡萄糖( 唯一氮源) 的培养基上生长，并产生2 8 u m l 的壳聚糖酶，但当其生长在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上时，壳聚糖酶活 力却只有0 5 8u m l 。氨基葡萄糖不能诱导菌株f s o l u n i 表达壳聚糖酶，尽管它能够 很好的促进菌体的生长。有菌株在以0 2 5 的壳聚糖作为唯一碳源的培养基上完全不 能生长，这种生长的停歇可能是壳聚糖对这种菌株的生长产生了抑制作用，而不是 菌株对壳聚糖的利用有抑制作用，因为它在含有葡萄糖和壳聚糖的培养基上也不能 生长，推测这种菌株可能属于产壳聚糖酶的组成型菌株。酵母抽提物，蛋白胨对提 高壳聚糖酶的产量有积极作用( s h i m o s a k ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。组成型壳聚糖酶菌株近来也 有报道。 ( 6 ) 壳聚糖酶的分子生物学研究 菌株s t r e p t o m y c e sn 1 7 4 的壳聚糖酶基因已经被成功克隆，并以p l j7 0 2 为载体将 其在s t r e p t o m y c e sl i v i d a n st k 2 4 中进行了表达。s t r e p t o m y c e sn 1 7 4 所产壳聚糖酶活 力在1 5 2 2u m l 之间，而携带来自s t r e p t o m y c e sn 一1 7 4 壳聚糖酶基因工程菌能够产生 高达3 5 - 4 0u m l 的壳聚糖酶( f i n ke ta 1 ，1 9 9 1 ) 。s t r e p t o m y c e sn 1 7 4 的壳聚糖酶的氨 基酸被测定，并与其它内切糖苷酶进行了比较。序列包含一个编码2 3 8 个氨基酸的蛋 白的大的开放阅读框。还原端氨基酸序列主要编码一信号肽，它能够被s t r e p t o m y c e s 分泌系统识别。氨基酸序列同b a c i l l u sc i r c u l a n sm h k 1 壳聚糖酶氨基酸序列有很高的 同源。 生( m a s s o ne ta 1 。19 9 4 ) 。 ( 7 ) 壳聚糖酶的生物学角色 壳聚糖酶可降解壳聚糖，这使得生长在壳聚糖和甲壳素上的微生物可以获得营 养物质( s a k a ie ta 1 ，1 9 9 3 ) 。在几种无病植物的不同部位曾检测到了壳聚糖酶活 ( o u a k f a o u ia n da s s e l i n ，1 9 9 2 ) ，但很难发现壳聚糖酶活力与植物的代谢存在着一定的 4 矗捃“口，缸s p 1 4 1 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 相关性。o s s w a l d 等( 1 9 9 4 ) 从植物中分离出了一种酸性水解酶，该酶不仅具有壳 聚糖酶活性，而且还具有甲壳素酶活性。o s s w a l d 等人认为，这种双功能酸性水解酶 使得植物能够抵抗各种植物昆虫的攻击，同时他们还认为，从能量的观点来看，多 功能酶可以为生命体系节约更多的能量。 1 3 壳聚糖的应用 1 2 1 在医药卫生方面的应用 近十几年来，国内外对甲壳素和壳聚糖在医学方面作了大量研究。毒理学方面， 证明它们是无毒的；药理学方面，证明它们对鼠类神经系统、心血管和呼吸系统均 无不良影响，且具有防治动脉粥样硬化、凝血、抗肿瘤和抗感染等作用。1 9 8 5 年， s u z u k i 等( 1 9 8 6 ) 报道，在移植了s 1 8 0 的d d y 白鼠上注射壳六糖，结果7 天后发现明 显的肿瘤细胞抑制作用。采用1 0 0m g k g d ，连续注射5d ，能完全抑制肿瘤生长。 另外证明，壳六糖也对m m 4 6 实体瘤、m e t h a 瘤细胞有明显的抑制作用( t o k r oe t a l ， 1 9 9 8 ) 。王中和等( 1 9 9 7 ) 矛u 用低分子壳聚糖口服液对临床患者进行辅助治疗，结果发 现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，t 淋巴细胞的数量显著上升，说明该产品在 调整机体免疫机能，减少放疗对患者免疫功能的影响方面，有显著的疗效。 甲壳素和壳聚糖也作为药剂辅料和制剂得到了广泛的应用。在药物辅料方面， 精制的甲壳细粉可用于制备粉剂，如与柠檬酸钙细粉混合制成粉剂，局部撤布，或 喷雾，或加到绷带上，能明显促进愈合，愈合速度提高5 5 ；用壳聚糖与相关药物 制成颗粒剂，可改善口服制剂在胃肠道尤其在胃内的滞留时间，以提高药物的生物 利用率，如壳聚糖与消炎痛制成一种新型的缓释颗粒，含药5 0 ，体外溶出试验表 明，药物释放缓慢，且释放率几近1 0 0 ；另外，壳聚糖还可以作为片剂、微囊剂、 膜剂等药物辅料，提高药物利用率。在药物制剂方面，甲壳素和壳聚糖是一类很有 发展前途的新药，国内已研究制成了创伤愈合剂，洛美沙星壳聚糖口腔溃疡膜，滴 眼液，人工泪液等多种制剂，有些已投入临床应用，展示了甲壳素和壳聚糖在促进 伤口愈合，药物缓释等方面的重要作用( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 在食品工业上的应用 在保健方面，壳聚糖是促生长因子( b f ) 的一种重要种类，它们能调节动物肠道 内微生物的代谢活动，改善肠道微生物区系的分布，促进双歧杆菌繁殖，从而提高 机体免疫力，使肠道p h 值下降，抑制肠道有害菌的生长，产生b 族维生素，分解 致癌物质，促进肠蠕动，增进蛋白质吸收( 杜星光等，1 9 9 7 ) 。在食品包装和添加剂 方面，壳聚糖和淀粉制作成的水不溶性可食薄膜，能在水中保持原状，可包装水分 含量高的食品；壳聚糖粘度比较大，能与酸性物质结合，可用作果汁和蔬菜的除酸 剂、食品增稠剂；壳聚糖的其它功能还可用作酒类和各种饮料的除浊剂、食醋的防 沉淀剂、糖汁和糖蜜的纯化剂等( 李兆龙等，1 9 9 1 ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 低分子量的壳聚糖在食品中还有一定的抗菌作用，研究表明相对分子量为1 5 0 0 的寡糖，浓度1g m ，p h6 0 时，具有很好的抑菌效果；相对分子量为4 4 0 0 0 0 的壳 聚糖，浓度为2 5 班，p h5 2 时，抑菌效果与前者相当( 夏文水等，1 9 9 8 ) 。 1 2 3 在饲料工业上的应用 由于甲壳寡糖和壳寡糖具有提高机体免疫力、促进双歧杆菌生长、提高机体病 能力等功能，把它们作为饲料添加剂与动物饲料混合，可制成多功能饲料，提高牲 畜的产量和质量。早在1 9 9 4 年，日本生产的1 3 的壳寡糖便已用作饲料添加剂，4 0 的猪饲料都添加了这类寡糖( 石宝明等，2 0 0 0 ) 。目前，这类产品在亚洲、北美、欧 洲的产和使用都呈上升势头。我国动物营养界从2 0 世纪9 0 年代中后期才接触到此 类添加剂，并受到了国家的极度重视，业界也普遍看好这类产品的应用前景。甲壳 寡糖和壳寡糖作为一种新的功能性饲料添加剂，已成为动物营养研究的新动向，这 也是甲壳素、壳聚糖被誉为第六大生命要素的原因之一。 1 4 低分子量壳聚糖和壳寡糖的制备方法 尽管壳聚糖有着重要的生物学功能，但不良的水溶性，使其在食品和生物医药 领域的应用相当困难。与壳聚糖不同的是，其水解产物和壳寡糖易溶于水，这主要 是因为分子链短以及氨基葡萄糖单元上存在着自由氨基基团( j e o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。壳 寡糖在中性p h 条件下，较低的粘度和很好的水溶性已经吸引了许多研究者，以寡糖 的形式来利用壳聚糖是他们非常感兴趣的。 与多糖相似，由于壳聚糖中存在不稳定的糖苷键，这些糖苷键能够被水解试剂 裂解。这些方法主要包括，酸解( n i n aa n dv a r l a m o v , 2 0 0 4 ) ，酶法降解，氧化降解( s h i r u i e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，超声波降解( c h e na n dc h e n ，2 0 0 0 ) ，化学一酶法( a k i y a m ae ta 1 ，19 9 5 ) 和重 组法( s a m a i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。通过上述各种方法，壳聚糖分子吸收能量，使其化学键发 生断裂，若断裂的键属于o 一糖苷键，则壳聚糖分子量将会下降。 1 4 1 酸水解法 1 9 5 8 年，b a r k e r 用盐酸水解制备壳寡糖，得到聚合度为2 7 的寡糖以及单糖； c a p o n 与f o s t e r 用盐酸处理甲壳素，制备壳寡糖，并研究了聚合度和分布；r u p l e y = g 较系统地研究了浓盐酸对甲壳素的水解情况。磷酸和氢氟酸也可以水解得到壳寡糖 ( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 酸解法普遍用于壳聚糖糖苷键的裂解，研究历史也较为悠久，但产物收率低， 而且大多数产物为单糖。因此，酸解法制备的低分子量壳聚糖和壳寡糖，由于其可 能被有毒化学物质污染而不被看好。因此，近年来，壳聚糖的酶法降解被视为一种 很好的方法，成为研究的热点。 6 m i t s u a r i as p 1 4 1 - 2 产壳聚糖酶发酵条件研究及低分子量壳聚糖的制备 1 4 2 氧化法 氧化降解法近来研究较多，其中以过氧化氢法为主，已经用于生产。过氧化氢 法有酸法、碱法和中性法三种。 酸法是均相反应，将壳聚糖溶于1 的乙酸中，加入适量的h 2 0 2 水溶液，调节p h 值为3 - - - 5 进行降解；碱法是非均相反应，调节壳聚糖的p h 值为1 1 5 ，温度7 0 度左右， 分批加入h 2 0 2 水溶液，进行降解反应；中性法是指壳聚糖不溶于稀酸中，也不调碱， 而是直接将壳聚糖分散在水中，加热到所需温度，在搅拌下分批加入h 2 0 2 水溶液， 进行反应。利用这些方法均可以达到水溶性壳寡糖，科研人员研究了不同反应条件 下，不同介质，不同h 2 0 2 浓度对降解的影响( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 此外还有硼酸钠法和次氯酸钠法。硼酸钠法的特点是反应条件温和，过程较易 控制，价格低廉，但产物分子量较高，后处理也较为麻烦。次氯酸钠法得到分子质 量在1 0 0 0 以下的低聚糖。 1 4 3 酶法 许多不同的酶均可以用于降解壳聚糖( a i b a ，1 9 9 4 ；a i b a ，1 9 9 4 ) 。壳聚糖酶可以有 效地降解壳聚糖，它来源于不同的微生物，包括细菌和真菌。此外，一些碳水化合 物的酶类和蛋白质酶类也可以降解壳聚糖，降解产物为不同分子量的壳低聚糖和壳 寡糖( z h a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。壳聚糖分子中的糖苷键的结构会对酶解的进程产生影响。 不同脱乙酰度的壳聚糖糖苷键有四种，它们随机的分布在壳聚糖分子内部。主要包 括两个n 一乙酰化的单元间的连接( a a ) ，乙酰化与脱乙酰化单元之间的连接( a d ) ， 脱乙酰化与乙酰化单元之间的连接( d a ) ，脱乙酰化与脱乙酰化单元之间的连接 ( d d ) 。甲壳素酶通过识别部分乙酰化的壳聚糖分子上的乙酰氨基葡萄糖残基而对 壳聚糖进行降解，但是当甲壳素酶和壳聚糖酶对壳聚糖进行降解时，二者并无什么 区别。不同来源的壳聚糖酶在对壳聚糖进行降解时，受壳聚糖分子内部糖苷键的结 构影响，常也会有所不同，这主要取决于壳聚糖的脱乙酰度( k u f i m ，1 9 9 8 ) 。 1 5 壳寡糖的生物活性 壳寡糖具有许多生物活性，比如抗真菌( h i r a n oa n dn a g a o ，1 9 8 9 ) ，抗细菌( j e o n a n dk i m ，2 0 01 ；j e o na n dk i m ，2 0 0 0 ；j e o n ，e ta 1 ，2 0 01 ) 抗癌( j e o na n dk i m ，2 0 0 2 ) ，抗感 染( j e o ne ta l ，2 0 0 0 ) 。这些生物活性会受到壳寡