（发酵工程专业论文）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究.pdf

摘要 螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，是当前国内外研究与开发规模最大的经济微藻。其 中富含的藻蓝蛋白是具有荧光特性的一类生理活性蛋白，具有很高的理论研究与开发 利用价值。藻蓝蛋白不仅可作为天然色素用于食品、化妆品等行业，而且因其具有提 高机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老和防治贫血等功效而广泛用于医药保健领域。 同时，利用其特有的光滑雪活性制成的荧光分子探针和光敏剂，在临床医学诊断、免 疫化学、生物工程及肿瘤激光治疗等领域也有很好的应用前景。 本论文研究了顿项螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化，藻蓝蛋白的稳定性，以及藻蓝 蛋白和其酶解产物在抑制肿瘤细胞牛长方面的生物活性。 顿顶螺旋藻中的蛋白成分经固体硫酸铵沉淀，羟基磷灰石( h a ) 柱层析可得到 纯品藻蓝蛋白。羟基磷灰石柱层析可把藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开，羟基磷灰石柱是 分离纯化的关键。通过对藻蓝蛋白的稳定性进行实验研究，发现藻蓝蛋白在2 0 c 和 3 0 c 时保持稳定，在4 0 。c 以上稳定性下降。在p h 为7 0 、8 o 时，藻蓝蛋白稳定性良 好。用m t t 法研究表明，藻蓝蛋白和其胰蛋白酶酶解产物对人宫颈癌h e l a 细胞株的 体外生长抑制作用有明显的剂量效应，当藻蓝蛋白的浓度达到1 0 0m g l 时，其抑制 率可达2 9 9 。酶解时间为l h 、2 h 的酶解产物的抗肿瘤活性明显高于1 0 0m g l 的藻 蓝蛋白。比色法检测了c a s p a s e 3 活性的变化均较正常值有明显增高，在藻蓝蛋白作 用h e l a 细胞1 2 h 后c a s p a s e 3 活性迅速增高并达到峰值，为对照组的5 7 0 倍。推断 其抗肿瘤的机制可能是通过启动c a s p a s e 途径从而诱导h e l a 细胞的凋亡。 关键词：藻蓝蛋白；分离纯化；酶解；抗肿瘤；c a s p a s e 一3 ； s t a d i e so nt h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo ft h ep h y c o c y a n i nf r o m s p i r u l i n ap l a t e n s i sa n d i t sh y d r o l y s a t e s a b s tr u c t s p i r u l i n ap l a t e n s i si sm u l t i - c e l lf i l a m e n t o ub l u e g r e e na l g a , a n di t i sa ne c o n o m i c m i c r o a g l a i nt h el a r g e s ts c a l eo fr e s e a r c ha n de x p l o i t u r ei n l a n da n da b r o a d n 妃 p h y c o b i l i p r o t e i n sa r ek i n d so fa c t i v ep r o t e i nw h i c he x t e n s i v e l ye x i s t si ns p i r u l i n a ，a n dt h e y b e a rp h y c o b i l i n 、撕t hf l u o r e s c e n c ei d i o s y n c r a s y , s ot h ep h y c o b i l i p r o t e i n sp o s s e s s e sg r e a t v a l u e si nt h e o r yr e s e a r c ha sw e l la se x p l o i t u r e 刀 ep h y e o b i l i p r o t e i n sn o to n l yc a nb eu s e d a sn a t u r e a lp i g m e n t si nf o o d , c o s m e t i ca n dd y ei n d u s t r i e s ，b u ta l s oc a l lb ea p p l i e di nt h e a r e ao fm e d i c a m e n t sa n dh e a l t h yf o o d ss i n c ei tc a ni m p r o v ei m m u n ec a p a b i l i t ya n dt u r n o u t , r a d i a t i o n ，e a d u c i t y , a n a e m i aa n ds o0 1 1 i na d d i t i o n , a sf l u o r e s c e n c em o l e c u l a rp r o b ea n d p h o t o s e n s i t i v er e a g e n t , i th a sf i n ep r o s p e c ti nc l i n i c a ld i a g n o s e s ，i m m u n o c h e m i s t r y , b i o e n g i n e e r i n ga n dr u m o rl a s e rt h e r a p y p h y c o e y a n i ni ss e p a r a t e df r o mc r u d ep h y c o b i l i p r o t e i n sw h e ns p i r u l i n ap l a t e n s i sa r e p r e c i p i t a t e di ns o i l da m m o n i u ms u l p h a t ea n dt h e nc h r o m a t o g r a p h e do n ah y d r o x y l a p a t i t e c o l o m t h o u g hp h y c o c y a n i np r o p e r t ye x p e r i m e n t s ，p h y c o c y a n i ni ss t e a d yi n3 0 。c ，b u ti t w i l lb ed e n a t u r e da b o v e4 0 ce n v i r o n m e n t p h y e o c y a n i ni ss t e a d yo nc o n d i t i o nt h a tp h v a l u ei sn e u t r a l ，e l s ei f , i tw o u l db ed e n a t u r e d t h em 耵a s s a yi se m p l o y e dt oe v a l u a t et h e e f f e c t so fp h y c o c y a n i na n di t sh y d r o l y s a t e so nt h ei n h i b i t i o no fh e l ac e l l s c o l o r i m e t r i c m e t h o dw e r eu s e dt om e a s u r et h ea c t i v i t i e so fc a s p a s e 3o fi - i e l a i ti n d i c a t e dt h a t p h y c o c y a n i n sh a v eo b v i o u si n h i b i t i o ne f f e c to nh e l a c e l l si nv i t r o 1 1 1 ei n h i b i t i o nr a t eo n c a n c e rc e l l si s2 9 2 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp h y c o c y a n i ni s10 0m g r la n dt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s a t e sc a ni n h i b i t5 6 5 h e l ac e l l s t h ea c t i v ep r o t e i no fc a s p a s e 。3c a n b ef o u n dw h e nh e l ac e l l sa r et r e a t e d 晰n 1c p h y c o c y a n i n ( 1o o m g l ) 12hl a t e r k e yw o r d s ：s p i r u l i n a p l a t e n s i s ；p h y c o c y a n i n ；p u r i f i c a t i o n ；h y d r o l y s i s ；a n t i t u m o r a c t i v i t y ；c a s p a s e - 3 ： d ir e c t e db y ：p r o f d u a nk a i h o n g p r o f w a n gx u e q i n g a p p iic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：f a nmin ( m a s t e ro f f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g ) ( c o l l e g eo f b i o e n g i n e e r i n g , i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h m a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢时 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：地基日期：型墨二垂：翌 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，印：研 究生在攻读学位期闻论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文酶复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内客除外) ，粥彰印缩印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 冒 期： 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 l 引言 1 1 螺旋藻简介 螺旋藻f s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 是一类低等植物，属于蓝藻f - j ( y a n o p h y t a ) 、颤藻科 ( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。螺 旋藻通常为多细胞构成的丝状体、圆柱状，呈疏松或紧密而规则的螺旋状弯曲，但形 状往往受生长环境的影响而发生改变，有的甚至产生稳定的直线形变异。螺旋藻性喜 高温( 2 5 3 6 ) 、高碱( p h 8 1 2 ) ，营光合自养，但也能利用环境中的一些有机 物作兼养生长，行无性繁殖，通常依靠藻丝体中横隔的产生或藻丝体中伪空胞的产生 而形成藻殖段。 螺旋藻含有大量蛋白质、极其丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，其细胞 壁几乎不含纤维素，因此极易被人体消化吸收，研究表明螺旋藻的消化吸收率在9 4 以上，其蛋白消化率达7 5 ，是一种优良的纯天然食品，被联合国粮农组织推荐为“全 球人类最理想的食品”。 螺旋藻蛋白质含量高达5 0 7 0 ，由1 8 种氨基酸组成，其中人体与动物所必须的 8 种氨基酸的含量接近或超过 f a o 推荐的标准，是自然界中具有重大开发价值的食 用和饵料蛋白资源，具有一定的医疗保健作用【l 。 螺旋藻还含有七种维生素，其中维生素e 是一种天然抗氧化剂，b 一胡萝卜素是 活性最高的维生素a 源，维生素a 是一种自由基清除剂，对肿瘤( 尤其是上皮组织癌变) 的防治有明显效果。 螺旋藻多糖和藻胆蛋白更有着显著的生理活性和多方面的药用价值，如防治肿瘤 和溃疡、提高机体免疫功能、调节血压、促进动物血细胞再生等。综上所述，螺旋藻 及其活性成分在功能性食品研究与开发方面有着广阔的应用前景。 2 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 裹1i o o g 螺旋藻的主要成分 1 2 藻胆蛋白的组成及分类 藻胆蛋白是存在于红藻、蓝绿藻和隐藻中的捕光天线色素复合物，在红藻和蓝绿 藻内藻胆蛋白按一定的结构组装成藻胆体而附着在类囊体膜上嘲。藻胆蛋自具有强烈 的荧光性，发橙红色荧光，而其本身则呈红色、紫色或蓝色等，故称其为有色多肽。 根据藻胆蛋白的吸收光谱可以将它们分为藻红蛋白( p e 和p e c ) 、藻蓝蛋白( p c ) 和别藻 蓝蛋白( a p c ) 。p e 根据其组成和光谱特性可分为r - p e 、c p e 、b - p e 和b - p e 四种，p c 有c - p c 和r - p c 两种。最初r - 、c 和b 分别代表藻胆蛋白来源于红藻f - ( r h o d o p h y t a ) 、 蓝藻f ( c y a n o p h y t a ) 和f f 藻中的红毛菜纲明曲蜘脚餐麓后的研究表明同一种类 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 型的藻胆蛋白既可以从红藻中又可以从蓝藻中分离到，因此，现在这些前缀只表示光 谱特性不表示来源【6 7 1 。 藻胆蛋白是一类水溶性的寡聚蛋白，大都由两个同源性较高的肽链l l i 】a 和b 亚基组 成，伍、p 亚基的分子量在1 5 k d - 2 0 k d 之间，这两种亚基以l ：1 的比例构成单体( 口p ) ， 它们是藻胆蛋白的基本结构单位( s l 。每种亚基由脱辅基蛋白( a p o p m t e i l l ) 和开链的四吡 咯环发色团藻胆素组成，藻胆素通过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基共价连 接。藻胆蛋白的( a p ) 单体倾向于形成较高的聚集体( a p ) n ，常见的聚集体的形式为( q p ) 3 或( a 1 3 ) 6 纯化的藻胆蛋白a 和9 亚基的聚集体的形式往往与藻胆蛋白的种类、蛋白浓度、 溶液的p h 值和离子强度等因素有关，依条件的不同，在各聚集体之存在着一定的动 态平衡关系f 3 9 】。 螺旋藻蛋白含量高，其中又以藻胆蛋白( p h y e o b i l i p r o t e i n s ，p b p ) 的含量为最高， 一般认为螺旋藻藻胆体内只含有两种藻胆蛋白：藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白1 2 】。螺旋藻藻 胆蛋白是由脱辅基蛋白( a p o p r o t e i n ) 通过一个或两个硫醚键共价连接藻蓝素 ( p h y c o c y a n o b i l i n s ，p c b ) ( 一种开链四毗咯发色团) 组成的( 图1 ) ，连接位点通常 在啦4 ( a 亚基第8 4 位氨基酸) 和b “( d 亚基第8 4 位氨基酸) 等保守位点上【，i 。在藻胆 蛋白内，藻蓝胆素以半环状和伸展状两种构象存在。一个藻胆蛋白中的藻胆素可以分 为两种类型，一种是能够吸收能量并相应地产生荧光的“荧光型”发色团；另一种称为 “敏化型”发色团，它能吸收能量并将吸收的能量快速高效地传递给“荧光型”发色团， 自身不能产生荧光。 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的亚基( 尤其是相同亚基) 之间的氨基酸序列同源性很高 i t o t t l 。杜林方等( 1 9 9 4 ) 测定了钝顶螺旋藻的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的氨基酸组成。从 测定结果，大致也可看出【矧：两者的氨基酸组成、含量很相近，只是酸性氨基酸和碱 性氨基酸之间的比例略有不同，从而导致两者的等电点略有不同，藻蓝蛋白为4 4 ， 别藻蓝蛋白为4 6 。 田i 藻蓝素链状分子结构 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 1 3 藻蓝蛋白的性质及影响 藻蓝蛋白分子由于结合发色团的位置、类型以及数量上的不同，其光学性质也不 一样。两种主要的藻蓝蛋自的光学特征 4 0 l 如下：c p c 在6 1 5 - 6 2 0 n m 。处有最大特征吸 收峰，最大荧光发射峰在6 3 5 6 4 7 n m 之间。r - p c 在6 15 - 6 2 0 n m 处有最大吸收峰，与c p c 不同的是它在5 5 6 n m 。左右有一个稍小的吸收峰，最大荧光发射峰之间6 3 5 6 4 0 r i m 之 间。藻蓝蛋白的等电点稳定，有报道的p i 值一般在4 6 _ 4 6 5 。 藻蓝蛋白及其色素的稳定性受多种因素如温度、p h 值、金属离子等影响。当加 热温度达至6 0 时，色素降解速度较快，而超过7 0 时，在3 0 m i n 内蓝色素变为绿色； 在中性范围内，藻蓝色素稳定性较好，离开这个范围越远，其稳定性越差。在有锌和 铁离子存在时，色素会慢慢出现沉淀，随着锌和铁离子强度的增大，色素颜色由蓝色 变绿后转黄色。而钙和钾离子对色素没有影响。蔗糖的存在基本上不对色素产生影响， 而葡萄糖的存在则加快了藻蓝色素的降解，产生大量绿色沉淀。另外，食品添加剂中 的抗氧剂h 2 0 2 、酸味剂柠檬酸、抗坏血酸、防腐剂山梨酸、尼泊金酯也会影响色素， 使色素产生褪色。所以，如何保持藻蓝色素的稳定性是一个很重要的问题【1 2 】。 1 4 藻蓝蛋白的提取与纯化技术 蓝藻中的藻蓝蛋白往往经提取与纯化后，作为高附加值的深加工产品用于食品、 化妆品、医药保健和检测试剂等领域，不同的应用领域对其纯度有不同的要求。藻蓝 蛋白的纯度通常以纯度值( 或纯度系数) 表示，即其在可见光区的最大吸光值与2 8 0 r i m 吸光值的比值。用作分子荧光探针和光敏剂的藻蓝蛋白，其纯度值一般需大于4 0 。 近年来，国内外在藻胆蛋白的提取与纯化方面作了大量研究，所报道的技术工艺因所 选材料和研究目的不同而各具特色。但从总体上说，绝大多数的工艺技术方法都包括 细胞破碎、蛋白分级和柱层析纯化这三个重要步骤。 1 4 1 细胞破碎 藻蓝蛋白属于胞内蛋白质，首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其溶出，细胞破 碎程度越高，藻蓝蛋白的得率也越高。目前用于藻蓝蛋白提取分离过程中的细胞破碎 方法，主要有反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法和超声波法。 1 4 1 1 反复冻融法 反复冻融法是将细胞反复冰冻和融解数次，利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓 度增高引起溶胀使细胞破碎。通常都将鲜藻泥或藻粉悬浮于蒸馏水或低浓度磷酸缓冲 液中，经2 0 以下冰冻，再在4 左右融解，反复数次后离心获得藻胆蛋白粗提液6 】。 如z h a n g 等( 1 9 9 9 ) 运用该法破碎钝项螺旋藻细胞，得到了p c 纯度值为1 1 4 的粗提液。 冻融的次数与藻类品种、材料含水量和冰冻温度等有关。因冻融法操作简单，不需要 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 特殊的仪器设备，故在藻蓝蛋白提取中是最常用的一种的细胞破碎方法。 1 4 1 2 化学试剂处理法 某些化学试剂可破坏藻体细胞的细胞壁和细胞膜，使藻蓝蛋白渗出。( 1 9 9 8 ) 用 0 3m m o l l 的十二烷基苯磺酸钠提取钝项螺旋藻中的藻胆蛋白，林卫红等提取率达到 9 8 。张成武等( 1 9 9 6 ) 将收集的藻体重新悬浮于等体积的0 0 1m ( p n7 0 ) 的磷酸盐缓冲 液中，加入o 1m t r i t o nx 1 0 0 ，于2 0 冰箱中反复冻融两次，细胞破碎率接近1 0 0 。 此外，溶菌酶也可用于溶解藻体细胞壁，获得较高得率的藻蓝蛋白。但需要注意的是， 加入化学试剂后，使后期纯化处理的难度增加，且操作不慎易会引起藻蓝蛋白交性。 1 4 1 3 溶胀法 溶胀法是直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放出藻蓝 蛋白。余九九等( 1 9 9 7 ) 在比较液氮冻融、超声波破碎和蒸馏水低温( 4 ) 自溶等方法对 极大螺旋藻藻胆蛋白的提取效果时发现，水自溶法提取效果最好，叶绿素复合蛋白含 量少，而藻胆蛋白含量高：但针对蒸馏水自溶提取周期长( 一般需l o d ) 的问题，他们 又比较了几种低盐溶液对藻胆蛋白的提取效果，发现利用低浓度的c a c l 2 替代蒸馏水 可使自溶时间缩短至3 - - - 4 d 。但这与超声波等其它方法相比，提取周期仍较长。 1 4 1 4 超声波法 超声波法是运用超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。该法常作为藻 胆蛋白提取中的辅助方法。胡一兵等( 2 0 0 2 ) 利用超声波破碎新鲜藻体细胞，得到- f p c 纯度值( a 6 2 0 n m a 2 8 0n m ) 为1 2 0 的粗提液。超声波的功率和作用时间等对藻体细胞的 破碎率影响较大，破碎处理过程中需避免因升温及机械力引起的蛋白质变性。 1 4 2 粗提物的蛋白分级 因螺旋藻等藻类中的蛋白质不仅种类多，而且总含量一般都占干藻重的5 0 以 上。藻胆蛋白在粗提液中的含量虽然较高，但仍含有多种杂蛋白，直接影响其分离纯 化效果。因此，一般在利用柱层析等纯化前，先要利用盐析和结晶等方法进行分级， 以去除尽可能多的杂蛋白。 1 4 2 1 盐析法 盐析法通过加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。藻胆蛋白粗提液中常用的盐溶液为硫 酸铵，其沉淀效果也得到普遍认可。但是关于硫酸铵的盐析浓度存在多种看法。较多 的是采用5 0 、5 5 或6 0 饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀( 张成武，1 9 9 6 ；林卫红，1 9 9 8 ； 温少红等，1 9 9 9 ；韦萍，1 9 9 9 ) 。俞丽君等( 1 9 9 9 ) 和周志刚等( 2 0 0 2 ) 采用2 0 4 0 的饱 6钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 和度，杜林方等( 1 9 9 4 ) 采用2 0 - 5 0 的饱和度的硫酸铵溶液沉淀藻胆蛋白。欧瑜 ( 2 0 0 4 ) 等用2 5 - - - 3 0 和5 5 - - - 6 0 的饱和度的硫酸铵溶液分别沉淀藻蓝蛋白和别藻 蓝蛋白。胡一兵等( 2 0 0 2 ) 采用不同浓度的硫酸铵溶液，分段梯度盐析分离纯化钝顶螺 旋藻的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，效果良好。 1 4 2 2 结晶法 结晶法是利用不同藻胆蛋白在低浓度硫酸铵中可产生不同晶体的特点，用结晶的 方法来提取藻胆蛋白。程凌江等( 1 9 9 0 ) 将条斑紫菜粗提液用硫酸铵盐析使溶液中的藻 胆蛋白凝聚成无定型沉淀，将沉淀在4 下保存约2 0 天以后，转化为晶型沉淀，再根 据r 藻红蛋白和c 藻蓝蛋白微晶在浓度较低的硫酸铵溶液中的溶解度的差异，用饱和 度为15 的硫酸铵溶解c 藻蓝蛋白和无定型藻胆蛋白，得到了纯度值高达4 0 的r 藻红 蛋白的微晶，这在粗提方法中是较为难得的。虽然结晶法是粗提中效果较好的方法， 但是提取周期较长。 1 4 2 3 等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，通过调节溶液p h 值 至藻蓝蛋白的等电点，使藻蓝蛋白溶解度下降而析出沉淀。汤朝晖等( 1 9 9 3 ) 用该法沉 淀得到了含有三种藻胆蛋白的混合物，并研究了藻胆蛋白在不同p h 下的稳定性，认 为藻胆蛋白对p h 较敏感。因此，用该法沉淀藻胆蛋白必须要注意藻胆蛋白随p h 变化 而发生的变性。 1 4 3 柱层析纯化 常用的柱层析纯化方法有离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析通 常采用d e a e 纤维素( s e p h a c e l ) 、x 连接琼n n ( q s e p h a r o s e ) 和羟基磷灰石( 姒) 柱层析 等。凝胶过滤柱层析通常采用葡聚糖( s e p h a d e x ) 和x 一链葡聚糖( s e p h a c 巧1 ) 柱层析等。 实际应用中要根据不同的藻的来源、样品前处理方法及产品的纯度要求采用不同的纯 化策略。 1 4 3 1 一步柱层析 有些研究者经一步层析即达到纯化目的。温少红等( 2 0 0 1 ) 将紫球藻的藻胆蛋白粗 提液经硫酸铵沉淀透析后，分别用羟基磷灰石帆) 和s e p h a d e xg - 1 0 0 两种柱层析方法 纯化藻红蛋白，均可分离纯化出b 藻红蛋白0 3 p e ) ，纯度值分别为4 9 2 和3 7 8 。也有 一些研究者先用其他方法得到纯度值较高的藻胆蛋白，最后再经一步过柱获得更高纯 度要求的藻胆蛋白。k m m i n k o v a 等( 2 0 0 3 ) 将s p i r u l i n a f u s i f o 删捃经多步处理后，得到 纯度值为4 1 的藻蓝蛋白，最后再经一步s e p h a d e x ( 3 - 2 5 凝胶过滤柱层析得到了纯度值 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 为4 3 的藻蓝蛋白。 1 4 3 2 两步柱层析 两步层析纯化藻胆蛋白最为常见，通常采用两次离子交换柱层析联用或离子交换 柱层析和凝胶过滤柱层析联用的方法。殷钢等( 2 0 0 0 ) 先采用d e a es c p h a r o s ef f 离子交 换柱层析从钝项螺旋藻中分离得到藻胆蛋白混合物，再利用羟基磷灰石柱层析对藻胆 蛋白进行进一步分离纯化，得到了p c 和a p c 纯品。j u l i o 等( 1 9 9 8 ) 经b u t y l s e p h a r o s e 和 q - s e p h a r o s e 两次柱层析从s y n e c h o c o c c u ss p 1 0 9 2 0 1 中得到了电泳纯的藻蓝蛋白。 m a c a r m e n 等( 2 0 0 3 ) 将c a l o t h r i xs p 藻胆蛋白粗提液经q s e p h a r o s ef a s t f l o w 阴离子交换 层析和疏水相互作用色谱分离后，得到了纯的藻蓝蛋白。杜林方等( 1 9 9 4 ) 将钝顶螺旋 藻的藻胆蛋白粗提液用3 0 饱和度的硫酸铵沉淀得c p c ，5 0 硫酸铵沉淀得a p c ，分 别用羟基磷灰石柱层析进行纯化，再分别用s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶柱层析进一步纯化， 得到了p c 和a p c 纯品。胡一兵等( 2 0 0 2 ) 采用分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻 s p ( n s ) 9 0 0 2 0 的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，将透析后的p c 和a p c 分别经羟基磷灰石层 析，其纯度值分别提高到4 8 和3 7 ，所得p c 和a p c 经透析脱盐、浓缩后再过s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶过滤层析柱，其纯度分别提高到5 1 和4 3 以上，可达电泳纯度标准。 1 4 3 3 三步柱层析 有些研究者用三步柱层析联用的方法，纯化纯度要求较高的藻胆蛋白。张成武等 ( 1 9 9 6 ) 经_ 两次羟基磷灰石( h a ) 柱层析分离得到钝项螺旋藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，再 经一次s e p h a d e xg - 1 0 0 柱层析制备出纯度值分别到4 7 1 和5 6 2 的p c 和a p c 。欧瑜等 ( 2 0 0 4 ) 经d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 、羟基磷灰石和s e p h a c r y lh - 2 0 0 z 步柱层析纯化出 了盐生隐杆藻的藻蓝蛋白( c p c ) 和别藻蓝蛋f j ( a a c ) ，纯度值分别达到5 5 和5 o 。 1 5 藻蓝蛋白的抗肿瘤功能和分子机理研究 1 5 1 体内体外抗肿瘤效应 国内外众多研究表明，藻胆蛋白能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免 疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进动物血细胞 再生，并且具有显著的抗肿瘤活性【3 i 】。刘宇峰等( 2 0 0 0 ) 研究了螺旋藻藻蓝蛋白对人体 血癌细胞k 5 6 2 生长的影响，发现藻蓝蛋白能有效的抑制血癌细胞k 5 6 2 的生长。张成 武等( 2 0 0 0 ) 所作的体外培养试验证实，螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株h l - 6 0 ，k 5 6 2 和u 9 3 7 均有不同程度的抑制作用，并显示出显著的浓度剂量效应。v a d i r a j a 等( 1 9 9 8 ) 研究表明螺旋藻c 藻蓝蛋白能有效抑制大鼠肝癌细胞的生长。r i c a r d o 等( 1 9 9 9 ) 通过动 物试验发现螺旋藻c 藻蓝蛋白对大肠癌细胞有较强的抑制作用。l i j i m a 等发现，给注 射有肝癌细胞的小白鼠口服藻蓝蛋白后，成活率明显提高，小白鼠的淋巴细胞活性也 8钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 明显增高。因此他们认为藻蓝蛋白能促进免疫系统，以抵抗各种疾病。 m o r e o s 等( 1 9 8 8 ) 首先发现了藻蓝蛋白的激光致细胞毒作用。他们用藻蓝蛋白处 理培养的小鼠骨髓癌细胞，再经激光辐射，发现癌细胞的存活率仅为1 5 ：而单独运 用激光辐射细胞，存活率为6 9 。蔡心涵等( 1 9 9 5 ) 采用不同浓度藻蓝蛋白液处理人大 肠瘤细胞株h r 8 3 4 8 作体内外激光治癌试验，发现癌细胞存活率随藻蓝蛋白浓度降低 而增高，呈良好的浓度剂量效应，并具有一定的杀伤作用。 黄蓓等( 2 0 0 2 ) 从螺旋藻藻蓝蛋白酶解产物中分离得到的色素肽，检测色素肽对体 外培养的小鼠s 1 8 0 肉瘤光动力疗法( p d t ) 效果的结果表明三种色素肽c c p l 、c c p 2 和c c p 3 都有良好的p d t 效应，这暗示有可能是通过诱发凋亡途径导致细胞死亡 的。其中c c p l 及c c p 3 分子量小、无毒副作用，且有一定的荧光活性，可作为新 一代光敏剂。 1 5 2 藻蓝蛋自可以诱导肿瘤细胞的凋亡 尽管已经有很多文献报道，藻蓝蛋白具有体外体内的抗肿瘤功效。但人们对藻蓝 蛋白的抗肿瘤机制却所知甚少。来自印度的科学家j a g us u b h a s h i n i 等在该方面作出了 突出的贡献。 他们首先发现藻蓝蛋白可在体外诱导脂多糖激发的r a w 2 6 4 7 巨噬细胞的凋亡， 开启了对藻蓝蛋白抗肿瘤分子机理的研究【3 8 1 。研究显示，c p c 对巨噬细胞的生长和繁 殖有剂量依赖的抑制。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜证明这种细胞数量上的减少缘 于c p c 介导的调亡。用2 0 l x mc - p c 处理过的细胞显示了典型的细胞核浓缩现象，并 有1 6 6 细胞处于s u b g 0 g l ，p h a s e 。这些细胞同时也显示了剂量依赖的d n a 片断化裂 解和p a r p 的断裂。c p c 诱导的r a w 2 6 4 7 细胞的凋亡可能通过线粒体细胞色素c 的释 放来介导，且不依赖于b e l 2 的表达。 致力于研究c p c 抗癌机理的印度科学家在后来的实验中又发现，藻蓝蛋白可以 在体外显著杀伤a k - 5 组织瘤细胞和人类慢性骨髓白血病细胞k 5 6 2 ，并诱导这两种肿 瘤细胞的凋亡。这无疑是藻蓝蛋白体外抗肿瘤细胞分子机理研究的重大进展。 通过荧光和电子显微镜，可以观测到c p c 诱导的人类慢性骨髓自血病细胞k 5 6 2 显著的凋亡的特征【柏】。比如，细胞的皱缩，膜泡的出现，细胞核的浓缩及凋亡小体的 出现等。琼脂糖凝胶电泳显示c - p c 处理的细胞典型的d n a 片段化现象。流式细胞分 析仪显示，2 5 9 m 和5 0 9 m 的c - p c 处理细胞4 8 小时分别有1 4 1 1 和2 0 9 3 处于亚 g 0 g 1 。进一步的检测发现细胞色素c 释放和p a r p 分裂，抗凋亡基因b c l 一2 水平的下 调。但是，促凋亡的b a x 基因却没有任何变化，从而导致b c l b a x 的比率的下调。 在c - p c 介导a k 5 组织肿瘤细胞的凋亡研究中发现，凋亡过程伴随b c l 一2 基因水平 的下调和r o s 的产生。妪5 细胞经藻蓝蛋白处理后被诱导进入细胞程序性死亡，同 时伴随c a s p a s e 一3 激活。藻蓝蛋白介导产生的氧活性自由基( r o s ) 诱导细胞中大分子 内蒙古农业大学硕士学位论文9 物质损伤，最终导致细胞的凋巳。因此，自由基清除剂可以抑制藻蓝蛋白对a k 一5 细 胞凋亡的诱导。研究还发现，凋抑制剂b c l 2 可调节r o s 的牛成。经b c l 2 基因转染 的a k 5 细胞显示可以抵抗藻蓝蛋白诱导的凋亡，而b c l 2 的过量表达抑制经藻蓝蛋白 处理的a k - 5 细胞r o s 的牛成。因此，可以认为藻蓝蛋白介导的a k - 5 细胞的凋亡。受 b c l 2 表达的抑制，这种抑制通过调节自由基的牛成来实现。藻蓝蛋白同时还诱导b c l - 2 基因表达水平下调，而b c l 2 众所周知在凋亡过程扮演很关键的角色。因此藻蓝蛋白 的处理导致b c l 2 表达水平的下调，还可以使细胞对其他抗肿瘤药物更加敏感。 1 6 藻蓝蛋白酶解肽的生理功能 藻胆蛋白颜色鲜艳，营养丰富，在天然使用色素方面有广泛的应用前景，但同合 成色素相比其稳定性较差，且易沉淀1 4 1 1 。在实际应用中，许多因素影响了螺旋藻藻蓝 蛋白及其色素的稳定性，因此可以通过用蛋白酶酶解的方法来制备藻胆蛋白色基短 肽。这些色基短肽既保留了原来鲜艳的颜色、丰富的营养等优点，还克服了藻胆蛋白 稳定性差的缺点。蛋白酶解是使其得到更合理、更充分利用的一种好方法。与传统的 碱水解、酸水解相比，酶解的蛋白水解液中一般具有更多的营养成分，研究己经发现 蛋白经酶解后，其水解产物的功能特性发牛了极大的变化，这主要是因为大的蛋白分 子被酶切成了大小不等的肽段和游离氨基酸，改变了原有蛋白的特性。m en a i m e y 等 发现经过蛋白酶解后，蛋白的功能会变得更加和谐。蛋白质经酶解作用降解后，功能 和品质得到了进一步的提高，蛋白酶解产生的分子量较小的肽可以被人体直接吸收， 而且小肽比单个的氨基酸有着更好的消化吸收性能，同时具有更优越的营养和牛理功 效。蛋白酶作为生产蛋白水解产物的工具越来越受到人们的重视。不同工具酶的选择， 产生的产物差别是巨大的，由于对生命有机体而言，蛋白酶在隹理上是必不可少的， 所以从动植物到微生物，它广泛存在于整个生物界。现在应用于酶解的蛋白酶多来自 动物、植物、微生物，可根据产物需求，选择不同的蛋白酶。 不同蛋白酶的选择会极大的影响水解产物的理化功能特性，这丰要是因为，不同 的蛋白酶酶解海洋蛋白后，由于酶切位点的位置及多少的不同，会造成酶解片断分子 量大小的差异和氨基酸组成的变化。比如象胰蛋白酶酶解位点较少，只有a r g 和l y s 右侧的肽键，所以用它作用蛋白资源后，一般酶解的片断都较大。 研究表明藻胆蛋白通过蛋白酶酶解，生物功能性价值可得到明显提高。如c 一藻 蓝蛋白经过胰蛋白酶酶解后的产物清除自由基的能力和降血压能力显著增强【s 2 】。在酶 解过程中，藻蓝蛋白中蛋白质的构象变化对藻蓝蛋白的抗癌活性有何影响，至今尚未 见系统报道。 1 7 立题意义 癌症是严重危害人类健康的丰要疾病之一攻克癌症一一直是世界瞩目的研究课 10 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 题。2 0 世纪后期近3 0 年癌症发病一直呈上升的趋势，据世界卫生组织w h o 报告，至 2 0 2 0 年随着世界人口达8 0 亿，将有2 ，0 0 0 万新发癌症病例，其中死亡人数将达l ，2 0 0 万， 且其中绝大部分将发生在发展中国家。 螺旋藻是迄今研究最多的无毒蓝藻，具有巨大的食用及药用价值。从中提取的藻 蓝蛋白作为一种天然色素，可以安全应用于食品、化妆品和医药等领域。作为一种荧 光物质，藻蓝蛋自在生物标记等方面有广阔的应用前景。越来越多的研究表明，藻蓝 蛋白对肿瘤细胞有细胞毒性作用，在人类防癌抗癌的斗争中，藻蓝蛋白的药用价值将 进一步体现。 用酶解的方法可提高蛋白质的利用率和价值，越来越多的研究表明，有些生物活 性肽是以非活性的状态存在于蛋白质的氨基酸长链中的。这些活性肽一旦通过蛋白酶 的作用被释放出来，就可能发挥出许多生物活性，如抗高血压活性( k o h a m a ， 1 9 9 1 ；s u e t s u n a ，1 9 9 3 ；w a k o ，1 9 9 9 ) 、促生长活性、抑制肿瘤的活性、抗氧化活性等 ( s u e t s u n aa n dc h e n ，2 0 0 1 ；o u e r a r d ，2 0 0 1 ) 。目前对从海洋蛋自酶解产物中分离具有生 物活性的功能肽是一个研究热点，受到国内外研究者的普遍关注。螺旋藻及藻蓝蛋白 因其营养丰富，更具有极高的开发应用前景，近年来己从海藻的酶解物中发现了的具 有新的氨基酸序列的降压肽【6 2 1 。 1 8 论文主要研究内容 1 摸索出一套螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化的工艺路线 藻蓝蛋白往往经提取与纯化后，作为高附加值的深加工产品用于食品、化妆品、 医药保健和检测试剂等领域，不同的应用领域对其纯度有不同的要求。总体上来说工 艺技术方法包括细胞破碎、蛋白分级和柱层析纯化这三个重要步骤。 2 藻蓝蛋白稳定性研究 主要对藻蓝蛋白的热稳定性及酸碱稳定性进行了研究。 3 藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 采用肿瘤细胞损害的直接观察和肿瘤细胞的体外培养，这种方法简便，可供大规 模筛选。以人宫颈癌h e l a 细胞株作为研究对象，将藻蓝蛋白及其酶解产物处理h e l a 细 胞后，m t t 法测定细胞生长抑制率，倒置显微镜直接观察细胞形态学变化。 4 c a s p a s e - 3 活性检测 比色法检狈l j c a s p a s e 3 活性变化，计算不同的作用时间对h e l a 细胞c a s p a s e - 3 酶活性 的影响，对抗肿瘤机理进行了初步的研究。 内蒙古农业大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 藻种和肿瘤细胞株 钝项螺旋藻，中科院典型培养物保藏委员会淡水藻种库； 人宫颈癌细胞h e l a ，由天津血研所提供。 2 1 2 主要试剂 r p m i 1 6 4 0 培养基 m t t 胎牛血清 胰蛋白酶 d m s o c a s p a s e 3 试剂盒 羟基磷灰石( h a ) 胰蛋白酶 p e g 2 0 0 0 其它试剂均为国产分析纯试剂 海克隆生物化学试剂( 北京) 有限公司 s i g m a 公司 杭州四季青生物制品厂 s i g m a 公司 b i o s i e e n e e 公司 碧云天生物技术研究所 四川大学生物材料工程研究中心 s i g m a 公司 华美生物工程公司 2 1 3 主要仪器 不绣钢立式自动压力蒸汽灭菌器l d z x 4 0 b q 型 上海中安医疗器械厂 循环水式多用真空泵s h b i i i 型 郑州长城科工贸有限公司 光照培养箱h p g 2 8 0 b x 型哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 w x j 9 3 8 8 紫外检测仪上海琪特分析仪器有限公司 h l 2 b 数显恒流泵上海沪西分析仪器有限公司 层析柱( 2 6 c m 3 0 c m )上海华美实验仪器厂 电子显微镜x s p 18 a宁波江南仪器厂 y c 1 型层析实验冷柜北京博医康实验仪器有限公司 u v 一2 1 0 0 分光光度计尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 高速冷冻离心机 s i g m a 公司 透析袋m w ：8 0 0 0 1 4 0 0 0上海运泉日化品灌装有限公司 h w s 2 4 型电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司 p h s 3 c 精密p h 计 天津市盛邦科学仪器技术公司 h w s 2 4 型电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司 w h 8 4 0 1 5 0 型多功能电动力搅拌器 天津市威华仪器设备有限公司 1 2 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性研究 倒置显微镜 c 0 2 培养箱s l 型 酶标分析仪 超净工作台 d t 1 0 0 型光电天平 蒸汽消毒器 低速离心机l d 4 2 移液器单道，2 0 2 0 0 p 1 液氮灌 血球计数器2 5 * 1 6 型 2 2 试验方法 北京赛百奥科贸中心生产 美国s h e l l a b 公司 北京宏润达科技发展有限公司 苏州净化设备有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海三申医疗器械有限公司 北京医用离心机厂 北京吉诺思科贸有限公司 乐山市东亚机电工贸有限公司 延陵医疗器械厂 2 2 1 钝顶螺旋藻藻的制备 2 2 1 1 培养基配制 实验中钝顶螺旋藻采用a b 培养基，其具体配制如下： ( 1 ) 按照表1 配制p i v 金属溶液； ( 2 ) 按照表2 配制a 5 溶液； ( 3 ) 再按照表3 所示的配方依次加入各种无机盐和溶液，配制成a b 培养基。 襄1p i v 金属溶液配方 试剂含量( g l ) n a 2 e d t a f e c l 3 6 h 2 0 m n c l 2 4 h 2 0 z n c l 2 c o c l 2 6 h 2 p n a 2 m 0 0 4 2 2 0 注：按照从上至下的