（发酵工程专业论文）产丁二酸菌种筛选及发酵工艺条件优化的研究.pdf

摘要 摘要 琥珀酸是一种二元羧酸，在三羧酸循环中产生，同时也是厌氧发酵的代谢产物之一。 琥珀酸作为一种重要的化学合成前体，广泛应用于食品、化学和医药工业。微生物发酵 法生产琥珀酸成为绿色工艺不仅是因为利用可再生资源，而且在发酵过程利用c 0 2 减少 了温室效应。因此，微生物发酵法生产琥珀酸是具有发展前景的方法之一。本论文对厌 氧发酵琥珀酸产生菌的筛选、初步鉴定及发酵工艺进行了研究，主要研究内容和结果如 下： 建立一种快速经济的琥珀酸定性半定量分析方法化学荧光圈法。能满足菌种筛选过 程对琥珀酸分析的要求，是经济、有效的分离和筛选产琥珀酸菌种的方法。 研究了用于分析有机酸的h p l c 条件。高效液相色谱仪为安捷伦1 1 0 0 ，色谱柱为安 捷伦z o r b a xs b a q 柱( 1 5 0m m x 4 6 衄，5 岫) ，进样量1 0 此，流动相流速0 5m l m i n ， 检测波长2 1 0r l l t l ，流动相：0 5 乙腈、9 9 5 o 0 2m o l lk h 2 p 0 4 、调p h 至2 0 ( 用磷酸 调节1 ，柱温3 0 。 从牛的瘤胃中分离得到产琥珀酸菌株j n u b e 0 7 0 9 ，初步发酵实验琥珀酸浓度为9 4 5 g l ，且该菌产生的杂酸种类相对较少，以甲酸、乙酸为主，因此将j n u b e 0 7 0 9 作为本 论文实验的出发菌。对产琥珀酸j n u b e 0 7 0 9 基本生理生化性质鉴定，多数生理生化特征 与琥珀酸放线杆菌相似。初步鉴定此菌种为产琥珀酸放线杆菌。 通过单因素试验确定影响j n u b e 0 7 0 9 发酵产琥珀酸三个显著因素，并进一步采用 响应面分析显著因素的浓度范围。优化后最佳发酵培养基组成为( g l ) ：麦芽糖5 1 1 ， 酵母膏2 4 5 ，k h 2 p 0 43 ，k c l3 ，n a c l3 ，m n c l 2o 0 6 ，m g c 0 34 0 4 ，p h 自然。在优化 条件下琥珀酸的产量达到3 3 4 5g l ，比优化前的产量提高了7 4 4 9 。研究了j n u b e 0 7 0 9 发酵产琥珀酸的工艺条件，实验结果表明最佳培养条件为：1 0 0m l 厌氧瓶装液量2 5m l ， 接种量为5 ，转速2 0 0r m i n ，发酵温度为3 7 。c ，发酵周期4 8h 。 关键词：琥珀酸，琥珀酸放线杆菌，化学荧光圈，分离筛选，菌种鉴定，响应面优化 a b s t r a c t s u c c i n i ca c i di sad i c a r b o x y l i ca c i dw h i c hi sp r o d u c e da sa ni n t e r m e d i a t eo ft r i c a r b o x y l i c a c i dc y c l ea n da l s oa so n eo ft h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t so fa n a e r o b i cm e t a b o l i s m i ti sa n i m p o r t a n ti n t e r m e d i a t ef o rc h e m i c a ls y n t h e s i sa n di ti sw i d e l yu s e di nf o o d ，c h e m i c a l ，a n d p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s t h ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o no fs u c c i n i ca c i dc a n b er e g a r d e da sa g r e e nt e c h n o l o g yn o to n l yb e c a u s er e n e w a b l es u b s t r a t e sa r eu s e df o ri t sp r o d u c t i o n ，b u ta l s o b e c a u s ec 0 2 ，ag r e e n h o u s eg a s ，i si n c o r p o r a t e di n t os u c c i n i ca c i dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n t h e r e f o r e ，t h ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o no fs u c c i n i ca c i db e c o m e sm o r ea n dm o r ea t t r a c t i v e t h i sp a p e rf o c u s e do nt h es t u d yo fs c r e e n i n gp r o c e d u r ef o ri d e n t i f i c a t i o no fs u c c i n a t e p r o d u c i n gs t r a i n sa n df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea s f o l l o w s t h em e t h o do fc h e m i c a lf l u o r e s c e n tr i n gw a se s t a b l i s h e d i tw a sas e m i - q u a n t i t a t i v e m e t h o da n ds u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ea n a l y s i ss u c c j l l i ca c i d i tw a sas i m p l ea n dc o s t e f f e c t i v em e t h o dt h a tc o u l db eu t i l i z e dt os c r e e na n a e r o b i cs t r a i n sp r o d u c i n gs u c c i n i ca c i d t h ec o n d i t i o nt oa n a l y z eo r g a n i ca c i do ff e r m e n t a t i o nb r o t hw i t hh p l cw a ss t u d i e d t h e c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s w e r ea s f o l l o w s c h r o m a t o g r a p h w a sa g i l e n t l1 0 0a n dt h e c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nw a sa g i l e n tz o r b a xs b a q ( 15 0m m x 4 6m l n ，5 肛m ) t h eb u f f e r c o n s i s t e do fa c e t o n i t r i l e p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e ( ( 0 0 2 ) m o l l ) ( 0 5 ：9 9 5 ，p h = 2 0 ， a d j u s t e db yp h o s p h o r i ca c i d ) a n dt h em o b i l ep h a s ef l o wr a t ew a s0 5m l m i n t h eu v d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s210 n ma t30 。cc o l u m nt e m p e r a t u r ea n dt h ei n je c t i o nv o l u m ew a s 1 0 “1 t h es t r a i nj n u b e 0 7 0 9c o u l dp r o d u c e9 4 5g ls u c c i n i ca c i dw h i c hw a si s o l a t e df r o m b o v i n er u m e n t h eo r g a n i ca c i d sw h i c hw a sp r o d u c e db yt h es t r a i nw e r eq u i t ef e ww h i c h m a i n l yw e r ea c e t i ca c i da n df o r m i ca c i d t h e r e f o r ey n u b e 0 7 0 9w a sc h o s e nf o rf u r t h e r s t u d y a c c o r d i n gt op h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i nj n u b e 0 7 0 9 ，i tw a s s i m i l a rt oa c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e s t h i ss t r a i nw a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e da sa c t i n o b a c i l l u s s u c c i n o g e n e s t h r e es i g n i f i c a n tf a c t o r sw e r ed e t e r m i n e db ys i n g l ef a c t o rm e t h o d t h ec o n c e n t r a t i o no f t h r e es i g n i f i c a n tf a c t o r sw e r ea n a l y s i s e dw i t hr e s p o n s es u r f a c em e t h o df u r t h e r l y t h eo p t i c a l f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sa sf o l l o w s ：m a l t o s e51 1 l ，y e a s te x t r a c t2 4 5g l ，k h 2 p 0 43 g l ，k c l3 班，n a c l3g l ，m n c l 20 0 6g l ，m g c 0 34 0 4 叽，n a t u r a lp h a tt h eo p t i m a l c u l t u r ec o n d i t i o n t h es u c c i n a t ec o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e db y7 4 4 9 a n dr e a c h e d3 3 。4 5w 1 t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fj n u b e 0 7 0 9w e r ei n v e s t i g a t e df o rs u c c i n a t ep r o d u c t i o n t h e o p t i m u mv a l u e so fl i q u i dv o l u m e ，i n o c u l a t i o nv o l u m e ，s h a k i n gs p e e d ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e a n dr e a c t i o nt i m ew e r e2 5m l 10 0m la n a e r o b i cf l a s k , 5 ，2 0 0 r p m ，37 。ca n d4 8h ， r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：s u c c i n a t e ，a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e s ，c h e m i c a lf l u o r e s c e n tr i n g ，i s o l a t i o na n d s c r e e n i n g ，s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yo p t i m i z a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究_ t - 作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同3 - 作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 盘卤 日 期： 墨丛坚 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件乖磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名i 导师签名： 2 00 譬6 、2 - 期： 2 伊飞占g 3 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 琥珀酸又称琥珀酸是一种重要的有机化合物，广泛地用于医药、农药、染料、香料、 油漆、食品、塑料和照相材料工业【l 】。因为琥珀酸是合成3 0 多种重要商业产品关键化合 物，所以它具有很高的商业价值。在食品工业上广泛应用和作为化学原料使得琥珀酸成 为非常重要的工业化合物 2 】。琥珀酸是合成其他很多重要工业化学制品的中间物质，例 如：丁二醇、四氢呋喃、丫丁内酯、油漆、聚合体等【3 。 近年来，由于不断开拓新的应用领域，琥珀酸国际市场需求量猛增。当前，工业级 琥珀酸的销售量超过1 50 0 0t ，大体上是通过石化法，从丁烷通过顺式丁烯二酐( 马来 酸酐) 生产 4 】。化学合成法生产琥珀酸会造成大量的污染，而且化学合成法的原料是不 可再生的石油化工产品。在石油资源日益枯竭的今天，发展环境友好的绿色生物技术成 为一种趋势，所以发酵法生产琥珀酸越来越引起人们的兴趣 5 】。近年来发酵琥珀酸作为 一种重要的四碳平台化合物，通过生物转化法，经过合理的过程优化，具有巨大的发展 潜力，展现出新的工业应用前景。 1 2 琥珀酸理化性质 琥珀酸( s u c c i n a t e ) ，又称丁二酸，分子式为c 4 h 6 0 4 ，分子量为1 1 8 0 9 ，是一种常 见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物的代谢物中 6 1 。 1 2 1 琥珀酸物理性质 琥珀酸为无色至白色单斜晶体，伐型在1 3 7 以下稳定，b 型在1 3 7 以上稳定。琥 珀酸无臭，有特殊酸味，低毒，可燃。比重1 5 7 2 ，熔点1 8 0 1 8 7 ，沸点2 3 5 ( 分解) 。 在熔点以下加热时，琥珀酸升华，脱水生成琥珀酸酐。琥珀酸或其盐类在灼烧管中予以 强热，则有白色升华物琥珀酸酐( c 4 i - 1 4 0 3 ) 形成，同时有刺激性的蒸气释出。假定灼烧 在白金箔上或在破碎的瓷片上进行，则其蒸气因燃烧而发生蓝色火焰，同时留下碳的残 渣。琥珀酸几乎不溶于苯，二硫化碳，四氯化碳和乙醚。 1 2 2 琥珀酸化学性质 琥珀酸是二元羧酸，在1 3 4 8 两个羧基可脱水生成琥珀酸酐( c 4 i - 1 4 0 3 ) 。在水溶 液中琥珀酸解离为质子和琥珀酸根阴离子，在2 5 时，琥珀酸的解离常数分别为 k l = 6 5 2 6 6 5x1 0 一，k 2 2 2 2 7 x1 0 一，o 1m 水溶液的p h 为2 7 。 琥珀酸及琥珀酸盐化学反应： ( 1 ) 氧化反应：与h 2 0 2 反应，氧化为过氧琥珀酸。在k m n 0 4 作用下生成草酸，羟 基琥珀酸和酒石酸混合物。 ( 2 ) 还原反应：催化剂作用下还原为1 ，4 丁二醇和四氢呋喃。 ( 3 ) 与浓硫酸反应：琥珀酸或其盐类溶解于温热而浓的硫酸中并不发焦；倘将其溶 液予以强热，则微微发焦，并有二氧化硫形成。 1 坚查奎兰翌主堂篁笙奎 ( 4 ) 与硝酸银溶液反应：琥珀酸盐与硝酸银在中性溶液中作用时，即有白色琥珀酸 银 c 2 h 4 ( c 0 2 a g ) 2 沉淀形成，此沉淀易溶于稀氨液。 c 2 - i , ( c q n a ) 2 + 2 a g n q 专c 2 峨( c 0 2 a g ) 24 - 2 n a n q ( 5 ) 酯化反应：脱水可得一系列单酯和双酯。 ( 6 ) 与氯化铁溶液反应：氯化铁溶液与琥珀酸盐在中性溶液中作用时，即有碱式琥 珀酸铁的淡棕色沉淀形成；同时有若干游离的琥珀酸生成，致溶液呈酸性反应。 3 g 凰( c 0 2 n a ) 2 + 2 f e c l 3 + 2 9 2 0 专2 c 2 峨( c d 2 ) 2f e ( o h ) + 6 n a c i + c 2 凰( c q h ) 2 ( 7 ) 与氯化钡溶液反应：在中性或微氨性溶液中，氯化钡溶液与琥珀酸盐作用时， 则有白色琥珀酸钡 c 2 i - - 1 4 ( c 0 2 ) 2 b a 沉淀形成。在稀溶液中沉淀进行缓慢，但可借剧烈振 摇或用玻璃棒摩擦其试管内壁，加速其反应。 c 2 凰( c o z n a ) ，+ b a c l 2 专c 2 h 4 ( c d 22 肋+ 2 n a c l ( 8 ) 与氨类化合物反应，生成丁二酰亚胺。 o 一。h n o o h n h 。 o 乓h 2 c c o 卜訾毗1 c 邺 2 第一草绪论 用于合成化学药物的中间体例。 在化学工业中，琥珀酸的主要用途是：作为离子螯和剂，用于在电镀行业防止金属 的溶蚀和点蚀；是一种良好的表面活性剂，是去垢剂、肥皂和破乳剂的组分；可用于生 产脱毛剂、牙膏、清洗剂、高效去皱美容酯；还用于润滑剂、添加剂、弹性体中；纺织 品加工中可上浆防收缩，改进染色性，改进己内酰胺黏度与防火性等【1 0 1 。 除了以上所列的用途之外，琥珀酸还被用于农业生产中处理种子以提高发芽率，促 进作物生长。还用来处理大麦黑穗病，用作除草剂的添加剂；琥珀酸可作为小猪和其他 单胃动物的缓冲物和能量来源。赖氨酸残基的琥珀酸酰化能提高食品中大豆蛋白的物理 和功能属性；生产改性的琥珀酸酰亚胺用于燃料的组成成分和水的净化；纤维素的琥珀 酸酰化可以提高水的吸收性；琥珀酸酰化淀粉作为增稠剂等。 当前，工业级琥珀酸的销售量超过150 0 0t ，大体上是通过石化法，从丁烷通过顺式 丁烯二酐( 马来酸酐) 生产。它的现售价大约为5 9 8 8 $ k g ，具体价格取决于它的纯度。 目前，只有食品市场的琥珀酸是发酵法生产的。但是新的发酵工艺能使琥珀酸的销售价 格降为2 2 0 $ 瓜g ( 年产50 0 0t ) ，当年产量为7 50 0 0t 时，其销售价格将低于0 5 5 $ k g 。这 种价格可使琥珀酸打开新的商品化化学制品市场【l ，其中包括己二酸、1 ，4 丁二醇、四 氢呋喃、n 甲基吡咯烷、2 吡咯烷和y 丁内酯( 图1 1 ) 。另外，琥珀酸还可以用来合成 生物可将解的聚合物，例如，聚丁烯琥珀酸酯( p b s ) ，聚酰胺( 尼龙) 和各种无污染的 溶剂。这使得琥珀酸的每年的市场量将高达2 7 6 1 0 6t 。一旦实现了琥珀酸发酵的大规 模生产，就可以以琥珀酸取代一些石油化工产品，发酵法生产琥珀酸将是一种很好的绿 色平台化合物。 图1 1 琥珀酸衍生严品分布图 f i g 1 - 1m a po fr o u t e st os u c c i n i ca c i d b a s e dp r o d u c t s 琥珀酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品，但目前大都还是用化学方法 生产。尽管总的经济成本仍然限制生物方法生产琥珀酸，但是原料成本的估算和潜在市 场大小的评估很清楚的表明在不久的将来生物发酵的方法生产琥珀酸将取代化学的方 法。 1 4 琥珀酸的制备方法 3 江南大学硕士学位论文 1 4 1 化学合成法 由化学法生产琥珀酸可通过多种途径，采用何种生产方法取决于原料的来源、生产 费用和能耗情况。常见的方法有如下几种： 1 。4 1 。1 石蜡氧化法【1 2 】 石蜡在钙、锰催化下氧化得到混合二元酸氧化石蜡，后者经过热水蒸汽蒸馏，去除 不稳定羟基油性酸及酯，水相含琥珀酸，经过除水得到琥珀酸的结晶。 1 4 1 2 氯乙酸甲酯的氰化水解法 c l c h 2 c o o c h 3 + n a c n + n c c h c o o c h 3 + n c c 心c o o c h 3 c h c o o c h n c - - c h - - c o o c i - l c h 2 c o o h i + h c l + n h 4 c i + c h ，o h c i - l c o o c h ， c h 2 c o o h 一 1 4 1 3 加氢法 顺丁烯二酸或反丁烯二酸在催化剂作用下加氢反应，生成琥珀酸，然后分解得到成 品。催化剂为镍以及其他一些贵金属，反应温度约为1 3 0 1 4 0 。该方法为目前采用化 学合成法制备琥珀酸的主要方法。 + h 2 叫( c h 2 c 0 0 h ) 2 此外生产琥珀酸的方法还有，环烷酸在钒催化作用下与i - i - n 0 3 反应生产琥珀酸，环 烯的臭氧( 或h 2 0 2 ) 氧化，糠醛的h 2 0 2 氧化，0 c 丁烯气相催化氧化，丙烯、n a c n 和h 2 0 的 混合物用钯催化热压法制得琥珀酸盐，马来酸电解还原法等。 1 4 2 生物转化法 生物转化法主要是指以富马酸为底物，通过富马酸还原酶的催化作用转化为琥珀 酸。通过根霉生产的富马酸产酸率、转化率均较高，可直接用富马酸酶法转换成琥珀酸， 反应式如下【1 3 j ： o n a d h 2 o h - o o 韩国c h o n n a mn a t i o n a lu n i v e r s i t y 的h w a - w o nr y u 等x t l 4 】筛选到了一株粪肠球菌 e n t e r o c o c c u s f a e c a l i sr k y l 。该菌在以葡萄糖或甘油为碳源发酵时可以产生延胡索酸还 原酶将富马酸转化为琥珀酸( 琥珀酸为主要产物) 。 生物转化法为琥珀酸生产开拓了一条新的途径，但是由于使用了大量的底物富马酸， 所以其生产的经济性还有待进一步研究。 1 4 3 微生物发酵法 所谓微生物发酵法就是利用微生物菌种以农产物玉米、木薯等或直接以糖为原料通 过微生物发酵积累琥珀酸 7 】。通过发酵过程，不仅可以得到安全的食品医药级产品，同 4 第一章绪论 时还能为农产品的深加工及转化为高附加值产品提供条可行的途径。其一般流程如图 1 。2 。在发酵得到琥珀酸以后，可以通过进一步的化学过程将其转变为多种的衍生产品， 用于生产中。 产品 回收 。 化学 产品 o 商业 产品 图1 - 2 微生物发酵法法生产琥珀酸的流程 f i g 1 2t h ep r o c e s so f t h es u c c i n i ca c i dp r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o n 化学合成法生产琥珀酸会造成大量的污染，而且化学合成法的原料是不可再生的石 油化工产品。在石油资源日益枯竭的今天，发展环境友好的绿色生物技术成为一种趋势。 与化学法相比，微生物发酵法有以下优点： ( 1 ) 发酵法生产琥珀酸使用可再生的成本低廉的原料，如玉米、乳清、废木料水解 液等；石化法生产琥珀酸需要用石油这种价格较高并且不可再生的自然资源，而且生产 过程产生大量的有毒、有害产品。中国玉米产量丰富，由于其可再生性，造成每年的 储藏量很大，以玉米为原料发酵琥珀酸将为玉米和其他粮食作物的生产开辟新的出路。 除以玉米为原料以外，欧洲和美洲过剩的乳清产品也是生产琥珀酸的良好碳源。不仅能 够减轻废乳清的污染，还能够生产出高附加值的琥珀酸。通过选育特定的菌株，还能够 以垃圾或造纸等行业的废料为原料发酵生产琥珀酸。这将消除很大的环境污染，而且实 现了资源的循环利用。 ( 2 ) 微生物发酵生产琥珀酸过程中可固定二氧化碳，绿色环保。每生产1k g 琥珀酸， 将会有0 3 7 埏的二氧化碳被固定。将此生产过程和另一大宗发酵产品乙醇的生产过程相 连将非常有利于对乙醇发酵的二氧化碳副产物的综合利用，减少温室气体的排放。 1 5 产琥珀酸的主要微生物 琥珀酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。丙酸盐生产菌、典 型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌琥珀酸。据报道一些乳酸( l a c t o b a c i l l u s ) 也能在特 定的培养基上不同程度地产生琥珀酸【l5 1 。由于天然菌株的产琥珀酸能力非常低，发酵产 物多种多样，对糖或琥珀酸的耐受性比较差而使其基本不具有使用价值。因此必须运用 生物工程技术对现有的菌种进行改造。目前主要的研究进展集中在产琥珀酸厌氧螺菌 ( a n a e r o b i o s p i r i l l u ms u c c i n i p r o d u c e n s ) ，产琥珀酸放线杆菌( a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e s ) ， m a n n h e i m i as u c c i n i c i p r o d u c e n s 和重组大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 等菌种上。 江南大学硕士学位论文 1 5 1 产琥珀酸厌氧螺茵的研究进展 产琥珀酸厌氧螺菌( a t c c2 9 3 0 5 ) 是从小猎犬的口腔中分离得到的一种革兰氏阴性 严格厌氧菌，以葡萄糖乳糖为碳源发酵主产物为琥珀酸和乙酸，同时生成少量的甲酸、 乙醇和乳酸【1 6 】。一般认为产琥珀酸厌氧螺菌的代谢路径如图1 3 所示。其中最主要的控 制酶为p e p 羧激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸脱氢酶。产琥珀酸厌氧螺菌发酵 过程中，c 0 2 浓度控锖r p e p 的流向；在低c 0 2 浓度时( 0 1 1m o lc 0 2 t o o l 葡萄糖) 以乳酸作 为还原的产物；而在高c 0 2 浓度时( 1m o lc 0 2 m o l 葡萄糖) 更多的流向还原臂，琥珀酸 是主要的产物，仅有微量的乳酸产生。在最优条件下( p h6 2 ，高浓度c 0 2 ) ，琥珀酸的 产量可以达到3 5g l ；有6 5 的葡萄糖被用于琥珀酸的生产【1 7 j 。在此情况下，可以检测 到固定c 0 2 的关键酶，p e p 羧激酶浓度升高。此酶被进一步分离纯化，并进行了特性研 究【1 8 2 。发现其满足米氏方程动力学模型，并且需要m n 2 + 、c d + 、m 9 2 + 来表现最大活 力。l a i v e m e k s 等人【2 2 j 进一步对编码p e p 羧激酶的矽c 触基因进行了克隆、测序，发现产 琥珀酸厌氧螺菌的p e p 羧激酶和大肠杆菌的p e p 羧激酶具有6 7 3 的同源性，7 9 2 的相 似性。但在大肠杆菌中成功表达后却并未导致琥珀酸的产量升高。之后，j a b a l q u i n t o 等 人 2 3 , 2 4 j 又运用定点突变的技术对此关键酶的动力学参数和催化活力中心进行了研究。 g l a s s n e r 等人【2 5 j 以产琥珀酸厌氧螺菌( a t c c2 9 0 3 5 ) 为出发菌株，通过筛选得到了比出发 菌株更耐单氟乙酸钠的自发突变株f a 1 0 ( a t c c5 5 6 1 7 ) 。此菌株的发酵产物中琥珀酸 乙酸的比例由大概4 ：1 提高多j 8 0 ：1 。此菌株对初始糖浓度最高耐受浓度为6 0g l ，最优初 始糖浓度为3 0 5 0g l 。在最优发酵条件下琥珀酸的产量可以超过3 0g l ，得率超过7 0 ， 并有一定程度的丙酮酸积累。s a m u e l o v 等人l l7 j 的研究结果表明，在最适条件下，产琥珀 酸厌氧螺菌琥珀酸的产率可以达到1 2 0m o f l 0 0m o l 葡萄糖。最高浓度为6 5g l 。研究结 果一般认为产琥珀酸厌氧螺菌具有以下发酵特性 2 6 2 9 】： ( 1 ) 可以利用的发酵底物比较广泛，可以以通常的碳水化合物为底物，例如葡萄糖、 乳糖、甘油等。采用山梨糖醇为底物时会促进代谢向有利于产琥珀酸的方向代谢。 ( 2 ) 厌氧发酵过程中，通入c 0 2 对琥珀酸的代谢具有关键的作用，通入氢气可能会 有利于琥珀酸的产生，最优c 0 2 i - 1 2 比例一般在9 5 ：5 。 ( 3 ) 一般不能耐受高渗透压，最优底物葡萄糖浓度一般在2 0 - - 8 0g l 之间，而且不能 耐受高浓度的琥珀酸盐。因此对分离步骤操作要求比较高。 ( 4 ) 发酵最优p h 一般为5 8 6 6 ，似乎较低p h 有利于琥珀酸的生产。一般为混合酸发 酵，乙酸为主要的副产物。 1 5 2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展 产琥珀酸放线杆菌( a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e sa t c c5 5 6 1 8 ) 是从瘤胃中分离得到 的一种革兰氏阴性新菌株，经1 6sr r n a 鉴定为巴斯德菌科放线杆菌属。它是一种兼性 厌氧菌，能够利用多种碳源，并能够耐受高浓度的琥珀酸盐，而生长不受影响【3 0 1 。以葡 萄糖为底物时，发酵产生琥珀酸、乙酸以及少量的甲酸和乙醇。与产琥珀酸厌氧螺菌相 似，c 0 2 对琥珀酸的产量有很大影响。还原性底物有利于琥珀酸和乙醇的发酵产生。能 6 够利用外源氢气作为电子供体，并以富马酸作为电子受体【3 1 i 。一般条件下琥珀酸的最后 发酵含量可达5 0g l ，当使用1 0 0 氢气时，琥珀酸的产量可达11 0g l t 3 ij ，其代谢途径 如图1 3 。g u e t t l e r 等人【3 2 】以产琥珀酸放线杆n 1 3 0 z ( a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e sa t c c 5 5 6 1 8 ) 为出发菌株，筛选出对单氟乙酸抗性的自发突变株。此菌株发酵产物中的琥珀酸 乙酸比例高达8 5 ：1 ；琥珀酸甲酸比例高达1 6 0 ：1 。在最适条件下，此抗性株的琥珀酸产 量可以达到8 0 1 1 0g l ，发酵时间4 8h ，得率高达9 7 。此菌株的主要研究工作由m b i ( m i c h i g a n b i o t e c h n o l o g yi n s t i t u t e ) 完成。目前还没有其他研究单位的公开文献。从m b i 对于此菌的产酸特性研究以及代谢方面的研究中总结，产琥珀酸放线杆菌中包含有 e m p 、p p 途径的关键酶，而且其磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的 活性明显高于大肠杆菌k 1 2 【3 2 】。k i m 等 3 2 境隆并在大肠杆菌中表达了此菌的磷酸烯醇式 丙酮酸羧激酶，当敲除原菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶后，琥珀酸产率增加6 5 倍。虽然 研究较少，但此菌株是迄今为止报道的耐高糖和高盐的菌种，已经具备初步工业化生产 的能力【3 引。 g l u c o s e 沙觚p 卜、a d p highco，lowc02 图1 - 3 产琥珀酸厌氧螺菌和产琥珀酸放线杆菌代谢路径 f i g 1 - 3s u c c i n i ca c i dm e t a b o l i cp a t h w a y so f a s u c c i n i p r o d u c e n sa n da s u c c i n o g e n e s 1 5 3 大肠杆菌的研究进展 大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，通常发酵糖或其衍生物为甲酸、乙酸、乳酸、琥珀 酸、乙醇等产物3 4 1 。通常情况下，大肠杆菌不会过量合成琥珀酸，因此其琥珀酸的产量 很低，一般在0 1 2m o l m o l 葡萄糖。虽然大肠杆菌琥珀酸产量比较低，但因为其基础研 究比较深入，能够采用各种分子生物学的技术对菌种进行改造，所以采用大肠杆菌发酵 琥珀酸已经成为一个热点。一般认为大肠杆菌的琥珀酸合成途径如图1 4 所示，可以看 7 翌堕奎兰堡主堂垡堡奎 到在大肠杆菌中产琥珀酸的途径比较复杂，可以多达6 种【3 5 1 。综合文献的研究结果，可 以概括为如下： ( 1 ) 以野生型大肠杆菌w 1 4 8 5 为出发菌株：w 1 4 8 5 鸯e 够利用大部分糖及其衍生物进 行厌氧发酵。在l b 培养基上生长旺盛，大约6 8h 后到达稳定期。发酵产物为琥珀酸、 乳酸、甲酸、乙酸和乙醇，其中乙醇、乙酸、甲酸的产量最大，琥珀酸产量一般为0 1 5 0 2 m o l m o l 葡萄糖【”】。c l a r k 等人【3 5 】通过插入抗性基因的方法构建了丙酮酸甲酸裂解酶觑和 乳酸脱氢酶l d h 3 的插入失活菌株n z n l1 1 ( f - p f l a ：c a m ；l d h a ：k a n ) 。n z n l1 1 不能以 葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成琥珀 酸、乙酸和乙醇。s t o l s 等人1 3 6 , 3 ”】发现，在大肠杆菌突变株n z n l1 1 中，表j 区_ a s c a r i ss u u m 苹果酸酶能够使其生长恢复，琥珀酸的得率提高n o 3 9m o l m o l 葡萄糖，琥珀酸是主要 的发酵产物；进一步的研究发现，在n z n l l1 中表达_ n h d + 依赖的大肠杆菌苹果酸酶后 几乎进行单一的琥珀酸发酵，最优条件下发酵琥珀酸的得率能够达到1 1 2 g 葡萄糖。 c h a r t e r j e e 等 3 8 1 ；对n z n l11 在含有卡那霉素的琼脂平板上培养后筛选到了能够重新发酵 葡萄糖的自发突变株a f p l1 1 。a f p l11 能够发酵葡萄糖产生琥珀酸、乙酸和乙醇；并且 能够利用外源氢为还原剂。当使用1 0 0 的c 0 2 时，琥珀酸的产量可以增j h 蛰 4 5g l ，生 产能力可以达到1 6 ( l h ) ，得率可达至1 j 9 9 。通过对a f p l1 1 的进一步研究发现其自发 突变位置在编码p e p 转移酶的基 p t s o ，对于许多大肠杆菌和产乳酸杆菌的矽幻g 基因突 变后都能够导致琥珀酸的产量上升 3 8 1 。v e m u r i 等人 3 9 】进一步将编码r h i z o b i u me t l i 丙酮酸 羧化酶基因的质粒转移到舡p 1 11 ( a f p l1 1 pt r c 9 9 a - p y c ) ，通过i p t g 诱导表达后，导 致了琥珀酸产量的进一步提高。经过测定发酵过程中的酶活力发现，在a f p l1 1 有氧生 长时，葡萄糖激酶和异柠檬酸裂解酶的活力上升。因此推测在a f p l l l 中，存在两种葡 萄糖的转运体系，并且乙醛酸循环占有一定比例。通过对a f p l1 1 pt r c 9 9 a - p y c 的发酵条 件研究发现，在两步法培养( 即先有氧培养，然后无氧发酵产酸) 中转换时间的选择对其 产酸具有决定作用。在最适的转换条件下( 即溶氧浓度开始下降，但仍为9 0 时) ，琥珀 酸的最终浓度可达至1 j 9 9 2g l ，得率为1 1 0 ，生产能力11 3g ( l h ) 4 0 】。 ( 2 ) p a n 等人【4 i j 以大肠杆菌w 3 1 1 0 作为受体菌株，构建了乙酸和乳酸形成缺陷的双重 突变株s s 3 7 3 ( w 3 11 0p t a ：t n l 0l d h a ：k a n ) 。s s 3 7 3 大肠杆菌能够在葡萄糖培养基上厌 氧条件下生长，因为它可以产生乙酰辅酶a ，而大肠杆菌n z n l1 1 却不能。在两步法培养 中，琥珀酸和丙酮酸是主要的发酵产物。当使用非p t s 糖类发酵时，可以发酵产生几乎 纯的琥珀酸。l e e 研究组 4 2 】最近发表了一篇采用将大肠杆菌和肱s u c c i n i c i p r o d u c e n s 基因 组进行比较，从而识别提高大肠杆菌琥珀酸产量的关键基因的方法。依照此方法识别出 了p t s g 、肛、s d h a 、p y m 、m q o 和a c e b a 等关键基因。虽然全部敲除这些基因并没 有导致琥珀酸的增产，但通过这些基因的组合，确实找到t p t s g 、p y k f 、p y k a 的组合， 基因敲除后，琥珀酸的产率可以提高7 倍。 ( 3 ) m i l l a r d 等人j 通过在大肠杆菌j c l12 0 8 中过量表走- k p e p 羧化酶，可以使其产量提 高3 5 倍，但过量表达p e p 羧激酶却没有任何效果。g o r k a n 等人畔】通过在大肠杆菌j c l l 2 4 2 中表燃h i z o b i u me t l 的丙酮酸羧化酶基因发现，p y c 的表达不影响糖的消耗速率和细胞的 r 第一苹绪论 生长速率。在无氧条件下，p y c 的表达使琥珀酸的产量提高了2 7 倍，同时乳酸的得率明 显下降。 ( 4 ) r i c e 大学s a n 研究组最近连续发表多篇论文 4 5 4 8 】及专利 4 9 , 5 0 1 论述了一系列大肠 杆菌产琥珀酸研究。由于有氧条件下大肠杆菌具有高代谢速度和产物生成的优点，首先 他们对大肠杆菌进行了基因工程改造以适应有氧发酵的条件。通过s d h a b 、i c d 、p o x b 、 a c k a - p t a 、i c l r 等5 个基因的敲除可以实现对有氧条件下乙酸代谢副产物的消除以及乙醛 酸循环的激活，从而使琥珀酸成为主要的发酵产物。但仍旧有相当量的柠檬酸和异柠檬 酸发酵产生。以s d h a b 、p o x b 、a c k a - p t a 、i c l r 四个基因敲除菌为平台，进一步通过p 盼g 基因敲除和p e p 羧化酶的表达将有氧发酵产琥珀酸的得率提高到了理论值1m o l m o l 葡 萄糖，从而显示了大规模有氧生产的潜力。厌氧情况下，其主要采取的策略为通过基因缺 失来消除代谢副产物的生成。首先发现在a d h e 、l d h a 双缺失菌s b s l1 0 m g 中表达丙酮酸 羧化酶能够大幅度提高琥珀酸的得率到11 2m o l m o l 葡萄糖；他们通过进一步引入a r c a 、 a c k - p t a 、i c l r 基因缺失构建一系列菌株，发现在以上5 个基因缺失菌s b s 6 6 0 m g 中共同表 达柠檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶可以将厌氧琥珀酸的得率提高到接近理论值的1 1 7 m o l m o l 葡萄糖，同时可以在2 4h 内完全利用1 8g l 的葡萄糖。其在厌氧条件下的实验设 计具有很高的理论价值，但在所有的实验中均采用了一种大接种量的接种方法( 6 0 0 = 2 0 ) 。在比较高的接种量下可以部分克服基因工程菌生长缓慢的缺点，但具体到工业化 可能还需要做很多的工作。关于以上设计为何会导致高琥珀酸得率的理论问题，他们主 要认为除了减少代谢副产物的消耗外，以上基因操作还使细胞内的可利用还原型n a d h 增加，从而有利于需要更多还原力的琥珀酸发酵。 9 江南大学硕士学位论文 g l u c o s e l 。p e ，m p 哪e 图1 4 大肠杆菌代谢途径 f i g 1 - 4t h em e t a b o l i cp a t h w a yo f e c o l i 1 5 4 产琥珀龇n n h e i m i as u c c i n i c i p r o d u c e n s 的研究进展 l e es y 等 5 1 , 5 2 1 连续发表了有关产琥珀酸新菌种m a n n h e i m i as u c c i n i c i p r o d u c e n s m b e l 5 5 e 的多篇论文。此菌株为兼性厌氧革兰氏阴性菌，在p h 为6 0 7 。5 时生长良好。 厌氧发酵产生琥珀酸、乙酸、甲酸的比例为2 ：1 ：1 。之后，他们进一步对此菌种的p e p 羧 激酶进行了克隆、测序和特性研究 5 3 1 ，并且在2 0 0 4 年对此菌株进行了全基因组测序以及 基因组规模的代谢通量分析和代谢特点研究 5 4 】。研究结果发现，此菌株非常适应c