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灵芝菌在茶汁中产多酚氧化酶及动力学研究 摘要 论文进行了灵芝菌在低档绿茶汁中产多酚氧化酶的菌种选育，并 对高产菌的产酶条件、酶学性质和多酚氧化酶的产酶动力学模型进行 了深入的研究。 首先进行了高产多酚氧化酶菌株的选育，利用变色圈法初筛和摇 瓶发酵复筛法获得了产该酶能力较高的曲阜灵芝c q 0 3 0 1 0 2 ：考察了 无机盐对菌种扩培的影响，同时在茶汁发酵过程中优化了该菌株培养 基组成及发酵条件，试验发现该菌株在茶汁发酵中的最佳产多酚氧化 酶培养基组成是：茶汁2 5g 1 0 0 m l 、蛋白胨0 7 5g 1 0 0 m l 、蔗糖 2 5g 1 0 0 m l 、k h 2 p 0 40 2 0g 1 0 0 m l ；最适产酶工艺条件为：接种量 1 0 、装液量2 0 、发酵时间7d 、初始p h 值5 0 、摇床温度3 0 和 摇床转速2 0 0r p m ，而且通气量越大产酶水平越高，适宜的接种量有 利于获得较高的酶产量。本研究通过培养基组分和发酵条件优化，使 该灵芝菌发酵产多酚氧化酶能力提高1 8 5 。 曲阜灵芝c q 0 3 0 1 0 2 在茶汁中发酵分离得多酚氧化酶粗酶液，该 粗酶液酶解邻苯二酚的最适酶解条件为p h 值5 o 、3 0 、3 0r n i n 和底物浓度为0 0 1 2m o l l 。并发现1 4m i n 时测得的酶反应速度可 视为该酶的反应初速度。在上述试验基础上，进一步考察了多酚氧化 酶温度和p h 值稳定性，并对多酚氧化酶催化动力学和反应热力学进 行了研究，同时对多酚氧化酶抑制反应动力学进行了讨论，描述了抑 制剂柠檬酸抑制多酚氧化酶催化反应机理，拟合模型参数如 - f ：k 肼= 1 6 1 8 0 1 0 m o l m l ，= 0 0 1 7 0 3 m i n ，幺= 1 8 6 4 k j m o l ， k 仁8 0 9 1 0 m o l m l 。 研究认为茶汁中茶多酚作为一种多酚氧化酶催化底物对菌体产 该酶有一定的诱导作用，但对菌体生长有一定的限制作用。根据曲阜 灵芝c q 0 3 01 0 2 产多酚氧化酶过程菌体生长、发酵产酶、灵芝菌胞外 多糖以及茶多酚余量变化等规律，提出了曲阜灵芝c q 0 3 0 1 0 2 菌丝体 生长、茵体胞外多糖和多酚氧化酶产酶动力学模型，用计算机软件 c u r v ee x p e r t1 3 优化，得到了模型参数，并结合拟合过程中产生的标 准误差和相关系数，比较模型计算结果和实验数据拟合效果，结果表 明，摇瓶分批发酵过程模型拟合效果能较好地反映菌体发酵过程。 关键词：多酚氧化酶，灵芝菌，低档绿茶，邻苯二酚，动力学， 抑制剂 t h es t u d i e so nt h ep r o d u c t i o no f p o l y p h e n o lo x i d a s eb yg a n d e r m al u c i d u m c q 0 3 0 1 0 2i nt e af e r m e n t a t i o na n d t h e k e t i c s a b s t r a c t i nt h i sw o r k , t h es c r e e n i n gw a sc a r d e do u tf o rs o m ek i n d so fg a n o d e r m a l u c i d u m sp r o d u c i n gt h ep o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) i nt h el o w g r a d eg r e e nt e a t h e c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s f o rh i g hp r o d u c t i v i t ys w a i n s ，t h ep r o p e r t i e so fp p oa n dt h e k i n e t i c so fp p o p r o d u c t i o nw e r es t u d i e di nd e p t h u s i n gt h em e t h o d s o fc o l o r - c h a n g i n gc i r c l ea n dt h es c r e e ns h a k i n gf l a s k , as t r a g m o fg 1 u c i d u m ，q u f u0 3 0 10 2 ( c 0 0 3 0 1 0 2 ) ，w h i c hi sh i 曲i np p op r o d u c t i o n ，w a g i s o l a t e d t h ee f f e c to ft h ei n o r g a n i cs a l ti ns e e dm e d i u mo nt h ed r yw e i g h to fm y c e l i a o fc q 0 3 0 1 0 2w a se v a l u a t e d m e a n w h i l e ，t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o n ，w h i c h w a so b t a i n e db ye m p l o y i n gs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a lo p t i m i z a t i o np r o c e d u r e s ，w a g a s f o l l o w i n g ( g 10 0 m l ) ：2 5l o w g r a d eg r e e nt e a , 0 7 5p e p t o n e ，2 5s u c r o s e ，0 2 k h 2 p 0 4 , a n dt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n o c u l u mq u a n t i t yp e r c e n t10 ， c u l t i v a t i n gl i q u o rp e r c e n t2 0 ，c u l t i v a t i n gt i m e7d ，i n i t i a lp hv a l u eo f5 0 ，t h e i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo f3 0 a n dt h et a b l es p e e do f2 0 0r p m i tw a sf o u n dt h a t 1 0 w e rm e d i u mv o l u m ei nf l a s ka n ds u i t a b l ei n o c u l u ma m o u n tw a sa b l et oi n c r e a s e p p o p r o d u c t i o n t h eo p t i m u mr e a c t i v ec o n d i t i o n so fc r u d ep p of r o mc q 0 3 010 2i nl o w g r a d et e a w e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：p h 5 0 ，3 0 ，3 0m i na n dt h eb e s ts u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n o f0 0 1 2m 0 1 l i tw a sf o u n dt h a tt h ei n i t i a lv e l o c i t yo fp p ow a si n1 4m i n u t e s a f t e r t h a t ，t h et e m p e r a t u r ea n dp hs t a b i l i t yo fp p ow e r ee v a l u a t e d i tw a sa l s os t u d i e do n t h er e a c t i o nk i n e t i c s ，t h ee n e r g yo fr e a c t i o na n dt h ei n h i b i t i o nr e a c t i o nk i n e t i c sf o r p p o t h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s mo ft h ec i t r i ca c i dw a sd e s c r i b e di n t h i se n z y m e r e a c t i o n t h em a t t l e m a t i c a lm o d e lp a r a n l e t e r sw e r e雒f o i l o w ：k 。= 1 618 0 1 0 3 m o 妇l l ，y 哪= o 0 1 7 0 3 i i l i n 一，r = 1 8 6 4 i o m o l 一k f = 8 0 9 x1 0 - 3 m o l i n l t h et e ap o l y p h c n o lc i p ) i nt h el o w g r a d eg r e e nt e aw a so n eo fp p oc a t a l y z i n g s u b s t r a t ea n dc o u l di n d u c ec q 0 3 010 2p r o d u c i n gp p o ，b u ti ti n h i b i t e dt h es t r a i no f c q 0 3 0 1 0 2t og r o w am a t h e m a t i c a lm o d e lo fp p op r o d u c t i o nb yc q 0 3 0 l 0 2 ， c o n s i d e r i n gt h em y c e l i u mg r o w t h 。t h ep p op r o d u c t i o nd u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s ， t h ee x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) s e c r e t i o na n dt h ec h a n g eo ft h el e f t o v e r1 pm t h ef e r m e n t a t i o nl i q u i d ，w a sp r o p o s e di nt h ew o r kb a s e do i lt h ee x p e r i m e n tr e s u l t s t h em o d e lp a r a m e t e r sw e r ec o r r e l a t e df r o mt h ee x p e r i m e n td a t ab yac u r v ee x p e r t 1 3p r o g r a m t h eg o o da g r e e m e n tb e t w e e nt h ec a l c u l a t e dr e s u l t sa n dt h ee x p e r i m e n t d a t ai n d i c a t e dt h a tm o d e lw a sc a p a b l et os i m u l a t et h ep p o p r o d u c t i o nb yc q 0 3 0 1 0 2 k e yw o r d s ：p o l y p h e n o lo x i d a s e ，g a n o d e r m al u c i d u m , l o w - g r a d eg r e e nt e a ， c a t e c h o l ，r e a c t i o nk i n e t i c s ，i n h i b i t i o nm e c h a n i s m 符号说明表 l 一一- _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ g 1 u c i d u m g a n o d e r m al u c i d u m 灵芝( 菌) q u f u0 3 0 1 0 2 t e ap o l y p h e n o l d r yw e i g h t e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e m i n u t e h o u r d a y g r a m m i l l i g r a m n a n o m e t e r l i t r e m i l l i l i t r e m i l l i g r a mp e rm i l l i l i t r e m o l ep e rl i t r e h y d r o g e ni o n c e n c e n t r a t i o n r a t a t i o np e rm i n u t e d i a m e t e r a b s o r b e n c y 曲阜灵芝 酶活单位 茶多酚 菌体干重 胞外多糖 分钟 小时 天 克 毫克 纳米 升 毫升 毫克，毫升 摩尔，升 p h 值 转愉 直径 吸光度 米氏常数 最大酶反应速度 酶促反应活化能 酶反应初速度 初始菌丝体重 良 菌丝体生长常数 一_ _ _ 一 u 即 州 聃 亘 h d g 呈 m l 札咖酬 州 呻。 a k k 铲 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本入在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密瓯在主年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 秒 参 日期：o s 年 日期：辨 ，；、 1 i 其b 够月刃日 弘了 一 名名签签 者师作导 浙江工业大学硕士学位论文 - 上- j 一 刖吾 多酚氧化酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e ，p p o ) 一般是指儿茶酚酶( c a t e c h o lo x i d a s e ) 和漆酶( 1 a c c a s e ) 的统称。它广泛存在于茶叶、桃子、苹果、马铃薯、鳄梨等 植物体和部分微生物中口3 】，在茶叶和果蔬加工中占有极为重要的地位。1 8 8 3 年， y o g h i d 发现日本漆树树汁变硬可能和某种活性物质有关h 1 。1 8 9 4 年，b e t r a n d 首 次详细研究了该物质，发现它是一种酶蛋白，并定名为l a c c a s e ，即漆酶嵋1 。1 9 3 4 年，r i c h e r 研究了马铃薯酚氧化酶抑制剂饰1 。1 9 3 8 年k e i l i nd 和m a n ng 研究 了蘑菇酚氧化酶提取、纯化以及活性测定方法，他们把这类酶称为p o l y p h e n o l o x i d a s e 。1 9 7 3 年，k u b o w i t z 在w a r b u r g 实验室中第1 次分离出多酚氧化酶盯1 。 此后，国内外对多酚氧化酶的研究不断地深入，多酚氧化酶的应用也不断地扩大。 多酚氧化酶应用领域主要包括食品加工、植物病虫害防御和环境保护等。它 在食品加工中具有举足轻重的作用，如有中国木瓜、荔枝、茶叶、甘薯阳1 、西红 柿、蚕豆、马铃薯、葡萄、菠菜、苹果、甘蔗、烟草、杏、梨、桃、日本枇杷等， 特别是在茶叶深加工中，多酚氧化酶的作用尤为重要，除绿茶类，其它各种茶类 的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所谓的“发酵 过程。 多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、茶红素和其它的氧 化聚合物，同时伴随儿茶素的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前体发生偶联氧化， 产生各种各样的香气化合物，并形成红茶的基本风味、滋味、香气阳1 。近来有学 者将微生物多酚氧化酶应用于红茶速溶茶加工中，其效果优于传统工艺，成本廉 价，具有较好的发展前景；多酚氧化酶与抗病性的关系，人们已进行了较为广泛 的研究0 ”1 ，一般认为植物抵御病原微生物主要是通过酚类代谢系统中的一些酶 和病原相关蛋白家族多酚氧化酶催化木质素以及醌类化合物，形成保护性屏蔽， 使细胞免受病菌的侵害，或是通过形成醌类物质直接发挥抗病作用；在环境保护 方面，利用多酚氧化酶降解污水中的酚类物质，进行生物除污；另外还可用于合 成染料和造纸厂排出物的去色处理以及除草剂的分解等n3 1 。 多酚氧化酶应用新领域也在不断发展，如用真菌生产多酚氧化酶在工业中可 渐江工业大学硕士学位论文 用于去木质化、乙醇的生产、药物分析、氧化烯烃、葡萄酒的净化；也有从植物 药中分离天然的活性成分，用于黄褐斑、雀斑等色素增加性皮肤病的治疗，而且 还用于美容化妆品等；已有学者研究测定酚类化合物的生物传感器，目前已经达 到了较好的灵敏度和准确度，如使用蘑菇中p p o 制成的生物传感器可定量地检 测龙胆酸n 1 ，也有掺杂有铱的电极做成的生物传感器n 副，不仅在环境检测领域， 更有望在临床，医学检测领域得到广泛应用；另外，有报道表明昆虫外甲硬化， 其体内多酚氧化酶起着关键作用n 引。 多酚氧化酶与人类生产生活有着密切的关系，一方面，植物体产多酚氧化酶 对自身的成熟或褐变过程起着重要作用，人类对这种作用要不断进行研究和控 制；另一方面，则是利用自然界产多酚氧化酶生物种群进行目的多酚氧化酶的大 量生产以用于多种人类生产实践。目前多酚氧化酶的应用主要集中在两个方面， 首先是食品加工领域，只不过有的是利用多酚氧化酶作用，而有的则是抑制该酶 活性；另一方面主要集中在多酚氧化酶分子生物学研究，包括其分子生物学特征、 基因表达、活性酶的形成以及相关的作用机理，尤其在环保和医药上的应用，开 创了多酚氧化酶研究的新热点n 刀。 近几年来，关于植物中多酚氧化酶的分离、纯化及生化特性的研究报道比较 多n 8 2 ，对于微生物多酚氧化酶( m p p o ) 和利用多酚氧化酶方面的报道相对比 较少。本论文针对于多酚氧化酶应用的两个重要方面，展开了灵芝菌产多酚氧化 酶产酶菌的筛选，进而考察产酶条件和规律，研究酶学特性，并进行了动力学方 面的研究，通过灵芝菌在低档茶汁中产多酚氧化酶的研究，迸一步了解发酵过程 茶汁与灵芝菌的相互影响，为低档茶叶深加工特别是结合开发功能性保健品提供 理论基础。 2 浙江工业大学硕- t - t 位论文 第一章文献综述 早年，前苏联在红茶初揉时加入葡萄皮帮助鲜叶发酵，生产出品质良好的红 茶拉2 1 ，随后，日本、美国等也有利用多酚氧化酶进行红茶发酵，提高产品的茶黄 素( t f ) 含量。但由于从植物、动物体得到的多酚氧化酶成本较高2 3 1 ，因此不 利于工业化推广。近年来，现代生物学技术的不断发展，微生物来源的多酚氧化 酶与发酵红茶理论相结合，取得了较大的突破。应用生物学技术，一方面，易于 提高多酚氧化酶活性，有时，可以在不改变微生物遗传特性的情况下，通过改变 培养条件也能增加酶活性；另一方面，从微生物获取多酚氧化酶，生产成本低， 又能提高红茶品质。随着对多酚氧化酶来源及其性质了解的不断深入，多酚氧化 酶在食品加工等加工工艺中的利用已获得了很好的成就。对不同微生物来源的多 酚氧化酶的菌种选育，发酵动力学，酶学研究及分子生物学研究一直在进行中， 并不断地深入，多酚氧化酶的应用也越来越广泛。 1 1 多酚氧化酶研究现状 多酚氧化酶是一类结构、催化机理复杂的含铜金属氧化还原酶，广泛存在于 动植物和微生物体内。在自然界中对果蔬成熟，褐变和植物抗病性( 有学者认为 不具普遍性) 等方面起着重要作用。1 9 7 3 年k u b o w i t z 在w a r b u r g 实验室中第1 次分离出多酚氧化酶，此后，对多酚氧化酶的研究不断地深入，多酚氧化酶的应 用也不断地扩大，特别是近几十年来受到越来越多的重视，尤其是在生化、生理 学性质方面取得了较大的进展，主要成果可分为以下几个方面：p p o 的克隆幢“2 5 1 ， p p o 的生化特征及其活性控制幢6 2 ，潜伏p p o 的诱导和活化0 3 1 1 ，p p o 的生理功 能2 3 ，p p o 的催化机制n 孔3 ”以及p p o 的应用n 卜曲1 等方面。 1 1 1 多酚氧化酶的命名和分类 多酚氧化酶来源比较广泛，结构和功能也比较复杂，随着研究的不断深人， 街江工皇大学硕士学位论文 般将它分为单酚单氧化酶 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) ，e c 1 1 4 1 8 1 、双酚氧化酶 儿茶酚氧化酶( c a t e c h o lo x i d a s e ) ，e c 1 1 0 3 2 、漆酶( 1 a c c a s e ，e c 1 1 0 3 1 ) ， 现在所说的多酚氧化酶般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。该酶属于六大类酶 中的第一大类氧化还原酶m 1 ，是核编码的铜金属酶，近几十年来受到越来越 多的重视，特别是微生物多酚氧化酶国内报道不多。 1 。1 2 多酚氧化酶的提取方法及活性测定 多酚氧化酶是一种重要的末端氧化酶，不管是对其进行性质、同工酶、活性 以及影响因子的研究，还是对生理功能、基因克隆等方面的研究，都需要把多酚 氧化酶从物体中分离纯化出来。1 9 1 1 - - - 1 9 1 2 年间，b e r n a l d 和w e l t e r 沿用m a m 的酶 提取方法( 乙醇提取) ，分离得到了多酚氧化酶，但大多数酶是不溶性，活力很低。 后来学者在提取介质中加入多酚吸附剂，才分离出可溶的多酚氧化酶，并指出高 效多酚吸附剂，如p o l y c a r - a t ( p v p ) 的使用对任何富含多酚的植物酶学都是有必 要的。1 9 9 3 年，c o g g o n 等采用液氮低温冷冻提取介质( p h7 o ) ，加入吐温一8 0 或 葡聚糖凝胶g 5 0 ，该改良方法可获得活力较高的可溶性多酚氧化酶。在苹果研究 中，发现品种不同，酶活亦不同，为了有效的控制酶促褐变，有学者h n 利用乳化 剂( t r i t o nx 1 0 0 ) 和酚结合剂一聚乙烯毗咯烷酮( p v p p ) 相结合的方式提取多酚氧 化酶，从而解决了单纯用丙酮粉法预处理而导致的酶特性的改变。在一般材料中 的多酚氧化酶的研究多采用丙酮粉法和缓冲液匀浆法。如有的学者进行小麦活性 检测“2 3 采用的是缓冲液匀浆法，而在枣果实多酚氧化酶性质的研究中有的学者旧1 则采用的是丙酮粉法。综上所述，多酚氧化酶一般采用如下几种提取方法：l 、 丙酮粉法( 常规法) ；2 、匀浆法；3 、匀浆浸提法。在这些方法中，有实验者表 明m 1 丙酮粉法对多酚氧化酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉活性尚 可、体积小和便于贮存，可直接应用；缓冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液 本身活性较高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到应用的要求。另 据报道采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法，是一种很好的提酶方法。多酚氧 化酶活性的测定方法一般是：1 、检压法就是在一定的温度、p h 值和基质浓度下， 多酚氧化酶氧化基质的速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比。因此用 瓦氏呼吸计测定耗氧率知多酚氧化酶活性的高低；2 、氧电极法主要是利用氧电 4 浙江工业大学硕士学位论文 极测定反应中的耗氧量来表示酶活力；3 、比色法主要是多酚氧化酶催化邻苯二 酚氧化生成有色产物，单位时间内有色产物在4 0 0n m 处的光密度与酶活性强弱 成正比；4 、碘量滴定法。其中比色法操作简便，结果较准确，目前最为常用。 1 1 3 多酚氧化酶的性质和作用方式( 模式) 多酚氧化酶是一类相对比较稳定的氧化还原酶，有人已在腐烂的植物残渣上 检测到了该酶的活性m 1 。一般在偏酸性环境下具有较好的活性，最适p h 为3 5 6 5 。多酚氧化酶可羟基化单酚，形成邻羟基酚，而该酶作用最快的是具有邻羟 基的多元酚物质，7 当多酚氧化酶作用于多元酚时发生如下反应： il ，、 寸百v ； z 多酚氧化酶 + h 船 l 坠黑色素 多酚氧化酶含有不可透析的铜离子，其催化生化机理可以从配位体的配位键 来阐明。该酶在催化作用时，酚酶底物先与许多金属离子络合，c a 2 + 离子形成的 配位物中的配位数为4 或6 m 1 ，多酚氧化酶的多肽链通过自身的折叠卷曲，形成具 有一定构象的高级结构，c u 2 + 与多肽链上的氨基酸残基以配位键相连，作为铜离 子的配基主要是h i s h i s 和c y s h i s 残基，这就是具有特定立体结构的活性部位。 当邻苯二酚基或其它底物存在时，由于其“靠近”及“定向 效应，使多肽链和 底物的空间构象发生改变，相互契合，从而使底物进入活性中心，邻苯二酚基上 的二个羟基与多肽链上的氨基酸残基以氢键相连，形成酶与底物的复合物。由于 复合物的不稳定性，多肽链构象发生扭曲，氢键断裂，h 被附着在多肽链上。酶 与底物不再契合，两者都同时发生构象转变，于是产物脱离了活性部位，成为邻 醌，邻醌可发生系列次生氧化作用，形成了多种氧化产物，邻醌可与其他醌类、 氨基酸和蛋白质聚合生成有色物质。酶又通过脱氢作用，发生构象回转，恢复以 前的天然构象，重新成为具有催化能力的蛋白质。 此酶的活性受氰化物和铜锌磷的抑制，还受k c n 、n a n 3 、c o 和h 2 s 所抑 制n 。在酶活测定时，可用偏磷酸、0 2 n a 2 s 0 3 、e d t a 碱液、0 2 n a h s 0 3 、 晰江工业大学硕士学位论文 6 m o l l 尿素m 1 来抑制酶，终止反应。这些试剂均有一个共同的特点，能和c u 离 子形成配位化合物，配合物形成后，酶易失去活性。m a s o n 认为当多酚氧化酶催 化底物时，酶活性部位上的二价铜离子可转变为一价，而r e r t e s z 则反对此观点， 他认为洋菇的多酚氧化酶起催化作用时，铜的状态始终保持二价，无一价与二价 互变“9 1 。 酪氨酸酶是能把单酚和邻苯二酚催化成邻醌的一类氧化还原酶，该酶根据内 部结构的不同，存在两种作用形式e n l 和e o x ： 睢一：妻0 叫叁 _ ，弓n u - - 订 n 。 e ie 。 单酚都能被上述两种形式催化，而且无论是单酚羟基化后氧化，还是邻苯二 酚的氧化，产物邻醌，相当地不稳定，可以通过无酶反应再生成邻苯二酚，邻苯 二酚就可以通过循环在培养基里积累，同时也完成了e m 和e o 。的互相转化，通 过这样的网状关系反应，最后达到稳定状态嵋们，当然邻醌也可以在外界的干扰下， 进一步发生不可逆氧化，生成黑色素。 儿茶酚酶的催化作用与两个带有铜离子的复合结构密切相关，该酶能催化邻 羟基苯酚( d t b c h 2 ) ，生成邻醌结构( d t b q ) ，儿茶酚酶催化底物的基本反应 和两个复合结构： 救：备救 i c u j , i l x c f j s o j ) 2 ( h 上o ) j ( c f j s 0 3 h ( 1 ) 其实儿茶酶催化d t b c h ：到d t b q 是一个十分复杂的过程。 漆酶是发现最早的多酚氧化酶，是具有单电子转移和氧活化双重功能的含有 4 个铜( i i ) 的胞外氧化酶，能催化氧化邻、对苯二酚和邻、对苯二胺类底物， 6 浙江工业大学硕士学位论文 比如卜萘酚多聚体1 、儿茶酚胺类魄1 、对苯二酚3 等。 1 1 4 多酚氧化酶催化多酚动力学 目前植物体来源的多酚氧化酶研究报道比较多，主要目的是为了防止果蔬酶 促褐变。催化动力学方面的研究也主要集中在研究酶的抑制机理上陆毛踟。因为多 酚氧化酶酶促反应主要是三种物质：多元酚、多酚氧化酶和氧气，而实验室实验 是在敞开容器中进行的，溶氧较大且恒定，所以当溶氧充分的前提下，酶反应可 看成单底物酶促反应，当底物浓度较小时，酶促反应初速度对底物浓度符合 m i c h a e l i s m e n t e n 方程。由于不同来源的多酚氧化酶，结构和功能有所区别，因 此即使是在催化单底物时，有时也有较为复杂的中间产物，酶催化机理和动力学 也较为复杂。 目前，多酚氧化酶反应抑制剂研究较多的有苯甲酸、柠檬酸、亚硫酸钠、抗 坏血酸、肉桂酸、硫酸铜、e d t a 等，这些抑制都属于竞争性抑制嘲3 。但现在有 两种观点，一种认为抑制剂抑制酶反应主要原因是多酚氧化生成的醌，而醌不与 其他醌类、氨基酸或蛋白质聚合生成有色物质，而直接与抑制剂结合形成了一种 新的产物旧1 ，抑制酶反应；而另一种观点则认为抑制剂直接和酶发生作用，并使 其活性下降呻1 ，目前有研究者认为前一种抑制机理比较合理。另外，有研究者认 为多酚氧化酶在较低温度下，酶催化反应热力学符合a r r h e n i u s 公式，反应随温 度的升高而增加凹1 。 1 1 5 多酚氧化酶结构与分子生物学 对多酚氧化酶结构的认识近来获得了重大进展，g e r d e m a n n 等在成熟的儿茶 酚氧化酶和章鱼血蓝蛋白3 d 结构的基础上，建立了红芋中潜伏儿茶酚氧化酶前 体肽的立体结构模型油一在红芋多酚氧化酶c d n a 克隆的c 末端延伸肽上存在 3 个组氨酸残基和起阻断作用的亮氨酸( l e u 4 3 9 ) ，它们可能导致对活性中心的屏 蔽作用，使前体肽不具酶活性而以潜伏形式存在。但是，在成熟的儿茶酚氧化酶 中，由于延伸肽被切断，解除了其对活性中心的屏蔽作用，使得成熟肽具有酶活 性。在该晶体结构模型中，成熟肽的晶体结构和延伸肽之间存在大约3 5 个氨基 酸残基的区域( 3 4 2 - - - 3 7 4 ) ，它们的功能尚不清楚，但是这个区域增加了儿茶酚氧 7 晰江工业大学硕士学位论文 化酶立体结构的可塑性，可能在没有断裂的情况下解除延伸肽对活性中心的屏 蔽，起到活化前体肽的作用。植物来源的多酚氧化酶前体肽由n 端延伸区、催 化单元和c 端延伸区组成，其中n 端的转运肽负责前体肽向叶绿体中的运输， 而催化单元则包括两个含铜的高度保守区c u a 和c u b 。对多种植物多酚氧化酶 的序列m 2 棚1 分析后可以看到，各种植物酚酶序列的两个铜保守区有着高度的同源 性，这是维持该酶活性中心所必需的。 通过比较杂交后代与亲本的同功酶谱、p o l y ( a ) m r n a 的体外翻译和不同 水平多酚氧化酶的突变体的遗传学等研究，所得的结果都表明多酚氧化酶是一种 核基因编码的蛋白质。但有关多酚氧化酶刚合成时的分子量大小、成熟后具活性 形式的分子量大小、以及合成后转运至质体的机制等方面的报道结果不一，多酚 氧化酶活性形式常被报道是约4 5k d 的分子旧1 ，但其它大小形式如5 9k d 和 6 5 , - - , 6 8k d 也有报道惜1 。多酚氧化酶是一个基因家族编码的，它所处位置的明显 可变性以及大小的不均一性可能起因于它的转运方式及各种基因产物的可能修 饰的不同。虽然某些多酚氧化酶的多重性具有同一个遗传基础，但它们也受额外 因子的影响。多酚氧化酶反应产物的次级反应可产生变性的、修饰的和交联的酶 蛋白，这可能有利于蛋白分解作用，因此，报道的多酚氧化酶明显的大小和位置 的不同很可能是由于酚类底物氧化产物的反应或酶蛋白本身的分解所致。 不同来源的多酚氧化酶基因具有不同的表达模式，在同一来源体内也存在着 不同的信号传导途径和反式作用因子来开启不同的酶基因，使多酚氧化酶家族中 的基因在不同条件下选择性地表达，基因家族中的基因开启和关闭以及表达量都 存在差异汹明，表现出不同的时空表达模式汹1 。不仅如此，不同多酚氧化酶基因 所形成的同工酶由于其不同的生化特性和体内功能而呈现出发育上的特异性旧1 。 基因家族成员表达的这些时空差异性和多样性是多酚氧化酶基因表达的显著特 征，它保证了多酚氧化酶在细胞生命活动中充当各自不同的作用，以满足生物体 复杂、多变的生理活动。 浙江工业大学硕士学位论文 1 1 6 多酚氧化酶生理功能 高等植物组织发生褐变主要是多酚氧化酶活动的结果。多酚氧化酶催化单酚 羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌，醌聚合，并与细胞内蛋白质、氨基酸反应， 结果产生黑色或褐色素沉淀，导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失。 所以在实际生产中，为了防止水果褐变，保持水果的新鲜性，生产上运用多种方 法来降低水果中的多酚氧化酶含量，例如：涂以抗坏血酸、柠檬酸为主剂的复合 护色剂；杏用沸水烫4r a i n 基本控制多酚氧化酶活性；对莱阳梨进行套袋抑制多 酚氧化酶活性等。多酚氧化酶与啤酒的生产过程中啤酒风味陈化密切相关，可通 过调节多酚氧化酶的含量和活性来达到最佳风味。多酚氧化酶又是决定红茶品质 形成的关键酶类，工业上还可以通过低温诱导等方式改变多酚氧化酶活性。 多酚氧化酶作为一种氧化还原酶，还在光合作用中发挥作用。如能调节叶绿 体中有害的光氧化反应速度。参与其中电子传递。多酚氧化酶还可促进伤口的愈 。 合，也可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮 纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的 抗性等。总地来说多酚氧化酶的作用方式有： ( 1 ) 如番茄的具腺毛状体中含有大量m r 为5 9 0 0 0 的多酚氧化酶，多酚氧化 酶氧化毛状体受食草昆虫侵害而分泌出的物质，变硬能捕获小昆虫，多酚氧化酶 存在表皮中、无非活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用m 1 ； ( 2 ) 通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制，直接抵御病原体订羽； ( 3 ) 醌的毒性直接发挥抗病作用h 羽： ( 4 ) 如番茄中多酚氧化酶克隆的反义表达可对基因家族的各成员进行负调 节，对病原体产生超敏感性( 感受性过敏) 口4 l ； ( 5 ) 邻醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散订副。 1 1 7 多酚氧化酶的分布 研究表明，多酚氧化酶的普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，是在细胞 质中合成的。其实对于多酚氧化酶在细胞中的定位问题一直存在分歧，如l i b o n n e r ( 1 9 4 7 、1 9 5 0 ) 证实多酚氧化酶与叶绿体相结合；t a k e o ( 1 9 6 6 ) 认为多 酚氧化酶聚集于象线粒体这样小的粒子的膜状结构中：b o k u c h a v a 和p o p o v 9 浙江工业大学硕士学位论文 ( 1 9 7 0 ) 认为多酚氧化酶不仅与叶绿体结合，还与线粒体结合；加藤( 1 9 7 6 ) 、 t e t o ( 1 9 7 6 ) 都认为多酚氧化酶与过氧化氢体、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶这类 标记物结合在一起。有研究者认为叶绿体的多酚氧化酶存在于内囊体上，其它类 型质体的多酚氧化酶存在于各种囊泡上。定位于内囊体的多酚氧化酶究竟是结合 于内囊体膜上，还是溶解在膜腔中，目前尚无定论。在果蔬细胞组织中，多酚氧 化酶存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中多酚氧化 酶活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有多 酚氧化酶，含量大约与蛋白质部分相同口刀，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最 高，幼叶和成熟块茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的多酚氧化 酶可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态多酚氧化酶，而后 者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异 部位结合呈不溶态h 盯，s t e p h e n t h a n a r a js n ( 1 9 9 0 ) 研究了茶树新梢中多酚氧化 酶活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现多酚氧化酶活性强，多酚含量高，对 红茶品质有利m 1 ，相反则利于绿茶的生产。在采摘的鲜苹果中，多酚氧化酶几乎 存在叶绿体和线粒体中，从这两部分分别制备的多酚氧化酶，其底物专一性稍有 差异呻1 。刘乾刚认为，多酚氧化酶在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细 胞壁也可能存在多酚氧化酶，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有多酚氧 化酶的作用。在动物中( 如鼠、兔) ，多酚氧化酶也得到了分离。多酚氧化酶是 一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中阻，缺乏质体的 组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多 酚氧化酶，如c 植物叶。众所周知，多酚氧化酶存在着6 - - - , 7 种同工酶，它不可 能是一个单点定位，而是多点分布的状态，只是各点上的作用不尽相同哺朗，但对 多酚氧化酶同工酶的定位，还需进一步的研究探讨。 1 1 8 多酚氧化酶应用 多酚氧化酶与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究嫡3 8 钉。植物在抵御病原 微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统 中的一些酶和病原相关蛋白家族多酚氧化酶通过催化木质素及醌类化合物形成， 构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗 1 0 晰江工业文学硕士学位论文 病作用。目前，有关抗性相关酶在植物感病的过程中的变化情况已有大量报道， 如利用番茄、黄瓜等植株作为试材，考察相关病后菌侵染对p p o 、p o d 和f a l 高抗性相关酶的活性都会提高，这三种酶与植物抗性的获得呈现明显的相关性。 多酚氧化酶催化酚类化合物形成的醌类化合物具有更大的毒性，有关多酚氧化酶 及其同工酶与植物抗病虫等抗性关系的研究已有报道嘲1 。多酚氧化酶是黑色素生 物合成过程中的主要限速酶m 7 1 。大多数皮肤病脱色剂都是通过抑制该酶活性来阻 断皮肤黑色素生成。在临床用于黄褐斑、雀斑等色素增加性皮肤病的治疗，也用 于美容化妆品。 茶多酚是茶叶中重要的化学组分，而多酚氧化酶是催化酚类物质的关键酶， 因此对多酚氧化酶的研究对于深入考察茶汁中灵芝菌发酵尤为重要，因为除绿茶 类，其它各种茶类的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所 谓的“发酵”过程。多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、 茶红素和其它的氧化聚合物，同时伴随儿茶素的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气 前体发生偶联氧化，产生各种各样的香气化合物，并形成红茶的基本风味( 滋味、 香气) 。费尔利等利用无花果、土豆的愈伤组织产生的多酚氧化酶应用于红茶加 工中，可以促进红茶的发酵，但这种酶的成本太高。m i y u k i k i 等在红茶加工中加 入0 1 的微生物多酚氧化酶( a l t e r r a r i at e n u i sa 一2 ) ，结果缩短了茶叶发酵时间， 茶黄素、茶红素( 含量明显提高，改善了红茶汤色，微生物多酚氧化酶应用 于红茶速溶茶加工中，很有发展前途嘞1 。有的学者在红碎茶加工中，利用茶幼果 作为外源多酚氧化酶的载体，以一定比例用于红碎茶加工过程，结果发现能明显 提高成茶的t f 含量，减少茶褐素( t b ) 含量。还有的学者进行了内源酶发酵研究， 以期望能在茶饮料中有所应用，改善滋味。 当然多酚氧化酶是果蔬引起酶促褐变的主要酶类，多酚氧化酶催化果蔬原料 中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。 这些情况对生产者与消费者均是不希望看到的，仅在少数几种食品的生产中，人 们利用了多酚氧化酶的作用，如茶叶、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶。 浙江工业大学硕士学位论文 1 。1 9 多酚氧化酶固定化 酶的固定化技术是本世纪5 0 年代发展起来的一种新的酶工程技术，近三、四 十年得到迅锰发展。它是利用物理的或化学的方法将酶固定在一定的载体上，来 进行催化反应。我们知道，水活性酶是极不稳定的，反应后酶不易与产物分离，酶 难以再利用。而固定化酶可将水溶性酶转化为不溶性酶，且能保持酶原有的高度 特异性和高催化效率，提高酶的稳定性和机械强度，易与产物分离，可反复使用， 而引起学者们的高度兴趣，成为当前酶工程领域的热点旧1 。1 9 9 6 年，钟瑾呻1 用自 制壳聚糖与戊二醛交联对p p o 固定化进行了初步探讨，表明当戊二醛浓度为2 时，酶活力最高，并提出在确定给酶量时，要兼顾酶活和回收率二者的影响，以达 到最佳。1 9 9 7 年，对于p p o 的固定化而言，有了一个较大的突破，李荣林等胁1 应用 海藻酸钠和戊二醛交联法对p p o 进行包埋，取得了成功，对其性质进行了系统研 究啪1 ，发现：酶活基本保留，酶的最适p h 上移至7 0 ，最适温度上升至4 0 ，对金 属离子的适应性增强，对抑制剂敏感性下降，低温贮存下，半衰期由3 个月上升到 2 2 1 d 。提出了固定化技术因子的最佳组合。 1 2 微生物发酵法产多酚氧化酶研究 微生物多酚氧化酶( m p p o ) 可通过从产多酚氧化酶微生物中选育高产菌株， 一般以液体发酵培养为主，进行产酶情况研究。 1 2 1 适合发酵产多酚氧化酶的微生物菌种 目前国内外报道最多的产多酚氧化酶的菌种主要是大型真菌，比如有采绒革 盖茵、黄孢原毛平革菌、白腐菌、侧耳、鸡腿蘑、木耳、多孔菌、猴头、平菇、 金针菇等。这些作为菌种选育的出发菌株。筛