（生态学专业论文）磷脂酶d的低温信号转导作用.pdf

摘要 低温冻害影响限制着植物自然分布、栽培区带、生长发育以及作物产量和质量。近年来对涉 及低温驯化方面的基冈研究越来越受到重视，但是对植物感知低温刺激和信号导入细胞核，进而 激活基因提高抗冻性的过程仍然知之甚少。 磷脂酶d ( p l d ) 不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶，而且是一类重要的跨膜信号转导酶类。 它的作用不仅在于通过催化膜脂降解从而影响膜的结构、功能和稳定性，而且在细胞的信息转递、 激素作用的发挥、膜运输、细胞增殖、细胞骨架组装、细胞的防御反应、分化和生殖等过程都有 重要作用。p l d 对生物和非生物逆境以及激素的信号转导功能已经成为近年细胞信号转导领域的 研究热点。 p l d 在低温逆境下的作用机理较为复杂，因为p l d 的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植 物的抗冻性。本研究以p l d a 、p l d p 、p l d y l 、p l d y 2 和p l d y 3 被抑制的拟南芥突变体及其野生 型为材料，进行低温驯化和冻害胁迫处理，鉴定参与低温信号转导作用的p l d s ，并对其作用途径 进行分析。主要研究结果如下： ( 1 ) p l d a 基冈参与组成型调控植物的抗冻性，p l d p 和p l d t 2 两个基因参与低温信号转导过 程，p l d t l 和p l d y 3 两个基因既未参与组成型调控植物的抗冻性，也未参与低温信号转导过程。 ( 2 ) p l d b 和p l d t 2 与低温信号激素a b a 不在同一条信号转导途径。 ( 3 ) p l d b 和p l d y 2 参与渗透调节途径，主要参与脯氨酸调控途径，但未参与可溶性糖含量调 控途径。 ( 4 ) p u ) b 参与抗氧化系统的调控，主要介导过氧化氢酶( c a t ) 活性调控途径，而p l d t 2 未参 与抗氧化系统的调控。 关键词：磷脂酶d ，拟南芥，低温驯化，信号转导 a b s t r a c t l o wt e m p e r a t u r ei so n eo ft h em a j o re n v i r o n m e n t a lf a c t o r st h a tl i m i tp l a n tg r o w t h ，p r o d u c t i v i t ya n d g e o g r a p h yd i s t r i b u t i o n i nr e c e n ty e a r s ，g r e a tp r o g r e s sh a sb e e nm a d et o w a r di n d e n t i f y i n gg e n e s i n v o l v e di nc o l da c c l i m a t i o n v e r yl i t t l ei sk n o w na b o u tt h es i g n a l i n gp r o c e s s e sb yw h i c hp l a n t sp e r c e i v e t h el o wt e m p e r a t u r es t i m u l u sa n dt r a n s d u c ei ti n t ot h en u c l e u st oa c t i v a t eg e n e sn e e d e df o ri n c r e a s e d f r e e z i n gt o l e r a n c e p h o s p h o l i p a s e sdi sak e ye n z y m et h a tc a t a l y z e st h eh y d r o l y s i so fm e m b r a n ep h o s p h o l i p i d si n t o p h o s p h a t i d i ca c i d ( p a ) a n dah y d r o p h i l i ch e a d g r o u p ，w h i c ha r et h eb a c k b o n e so fb i o l o g i c a lm e m b r a n e s p l di sa l s oak e ye n z y m et h a tc a np a r t i c i p a t ei ns i g n a lt r a n s d u c t i o n t h ea c t i v i t i e so ft h e s ee n z y m e sn o t o n l yh a v ea ni m p o r t a n ti m p a c to nt h es t r u c t u r ea n ds t a b i l i t yo fc e l l u l a rm e m b r a n e sb u ta l s op l a ya p i v o t a lr o l ei nr e g u l a t i n gm a n yc r i t i c a lc e l l u l a rf u n c t i o n s ，i n c l u d i n gc e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o n ，l i p i d m e t a b o l i s m , v e s i c l et r a f f i c k i n g ，c e l lp r o l i f e r a t i o n ，c e l l u a rb a c k b o n ef o r m a t i o na n ds e n s e s c e n c e i nr e c e n t y e a r st h es i g n a lt r a n s d u c t i o no fp l di nb i o l o g i c a la n dn o n - b i o l o g i c a ls t r e s sa n dh o r m o n e sh a sb e c o m ea n e wf o c u si nt h ef i e l do fs i g n a lt r a n s d u c t i o nr e s e a r c h t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s mo fp l di nt h el o wt e m p e r a t u r er e s p o n s e so fp l a n t si s c o m p l i c a t e d b e c a u s eb o t hi t sp h o s p h o l i p i dd e g r a d a t i o nf u n c t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o nf u n c t i o na l la f f e c tp l a n t f r e e z i n gt o l e r a n c e i nt h i ss t u d y , a r a b i d o p s i st h a l i a n am u t a n t si nw h i c hp l d a ，p l d l 3 ，p l d y l ，p u w 2 ， a n dp l d y 3w e r ed e f i c i e n ta n dw i l d t y p ew e r eu s e da sm a t e r i a l s t h ef i v em u t a n t sa n dw i l d - t y p ew e r e c o l da c c l i m a t e da n df r e e z i n gs t r e s s e du s i n gac l i m a t ec h a m b e ri no r d e rt oi d e n t i f yt h ep l di s o f o r m st h a t m e d i a t e dl o wt e m p e r a t u r es i g n a l i n g t h e r e a f t e r , t h ep o t e n t i a la c t i o np a t h w a y sw e r es u b s e q u e n t l y a n a l y z e d t h er e s u l t sa r e a st h ef o l l o w i n g ： 1 p l d o tg e n ec o n s t i t u t i v e l yr e g u l a t ep l a n tf r e e z i n gt o l e r a n c e ；p l d i ba n dp l d 丫2m e d i a t e ds i g n a l t r a n s d u c t i o no fl o wt e m p e r a t u r e ；p l d r la n dp l d v 3n e i t h e rm e d i a t er e g u l a t i o no fc o n s t i t u t i v ef r e e z i n g t o l e r a n c en o rl o wt e m p e r a t u r es i g n a l i n g 2 p l d l 3a n dp l i ) y 2g e n e sa n dl o wt e m p e r a t u r es i g n a lh o r m o n ea b aa l l m e d i a t el o w t e m p e r a t u r es i g n a l i n g ，b u tw e r ep r o v e d t ob en o ti nas a m ep a t h w a y 3 p l d l 3a n dp l d , 2w e r ei n v o l v e d i no s m o t i ca d j u s t m e n tp a t h w a yi nt h ep r o c e s so fl o w t e m p e r a t u r es i g n a lt r a n s d u c t i o nm a i n l yb yr e g u l a t i n gp r o l i n el e v e l ，n o ts o l u b l es u g a rl e v e l 4 p l d l 3w a si n v o l v e di na n t i o x i d a t i o ns y s t e mr e g u l a t i o na n dp l d l 3g e n em e d i a t e dt h ep a t h w a y t h r o u g hw h i c hc a t w e r ea c t i v a t e d p l i ) y 2g e n ew a sn o ti n v o l v e di na n t i - o x i d a t i o ns y s t e mr e g u l a t i o n k e yw o r d ：p h o s p h o l i p a s ed ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，c o l da c c l i m a t i o n ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n 英文缩略表 v v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 起鹏时间：2 。8 年占月6 r 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：走卸鸥 时间：2 口口8 年占月莎同 导师签名： 时间：训莎年石月f 刀同 中同农q k 科学院硕f j 学位论文第一辛绪论 第一章绪论弟一早瑁化 1 1 引言 植物生长发育过程中经常会遇到显著偏离于植物最适生活条件的环境，如低温、高温、干旱、 洪涝、盐渍等。这些不良环境的胁迫会引起植物体内一系列的生理代谢反应和生化过程，胁迫程 度较低时代谢过程和生长发育产生可逆性的抑制，而严重时就会产生不可逆的伤害甚至死亡。 温度是重要的环境因子之一，影响限制着植物自然分布、栽培区带、生长发育以及作物产量和 质量。当环境温度低于植物生活所要求的最低温度时，就会对植物造成伤害，即所谓的低温胁迫。 低温胁迫可分为冷害( o 以上的低温对植物的伤害) 和冻害( o 以下的低温引起植物体内结冰导致 的伤害) 。 目前世界处于全球变暖的温室效应背景下，但是局部地区的剧烈低温天气变化却频繁发生并 有加剧趋势。据统计每年世界冈低温寒害造成的损失十分巨大，达2 0 0 0 亿美元( 卢存福，2 0 0 4 ) 。在 我国每年遭受到的各种低温灾害相当严重，给经济带来极大的损失。例如2 0 0 4 - 2 0 0 5 年度黄淮冬麦 区和长江中下游两大冬麦主产区发生了大面积的冻害。这一年黄淮海地区冬小麦播种面积达1 0 6 7 万h m 2 ，占全国小麦播种面积的6 0 ，其中优质专用小麦播种面积达到5 0 4 万h m 2 ，占全国的7 0 以上。全国冬小麦发生冻害面积共达4 0 6 7 万h m 2 ，其中4 0 多万h m 2 是严重冻害。严重冻害的麦田至 少减产5 0 以上；甚至绝收。南方地区低温灾害也相当严重。1 9 9 9 年冬到2 0 0 0 年春仅福建省果树 龙眼、荔枝等因冻害损失就达5 0 多亿元，浙江省柑橘的冻害达6 0 以上，江西、湖南、湖北等省 柑橘冻害也很严重。1 9 9 6 年2 月，广东地区因霜冻害造成的经济损失高达3 0 亿元( 利容千，2 0 0 2 ) 。 以上数据足以让我们了解低温灾害对生产生活的危害程度。 因此，各国政府及研究部门一直把植物低温适应性问题作为一个重要的研究课题。然而，至 今还未找到低温胁迫对植物伤害的根本解决途径。随着分子生物学和遗传学研究不断深入，植物 抗低温逆境信号转导已经成为研究的重点。本研究利用遗传突变体为材料，通过生理生化的方法 探索低温驯化过程中磷脂酶d 信号转导作用特性，试图探索提高植物抗冻性的新途径和方法。 1 2 植物抗冻性的研究 关于植物抗冻性机理的研究，不仅有着重要的科学理论意义，而且具有相当重要的实际生产 应用价值。长期以来，已有多种学科，如植物生理学、形态学、遗传育种学、生物化学、生物物 理学、细胞生物学及分子生物学等等，从多个不同方面对植物抗冻性机理进行了广泛的研究。 早期关于植物抗冻性方面的研究主要是从比较抗冻性的植物与对低温敏感植物以及比较低温 驯化植物和未驯化植物的试验设计入手，分析水分平衡，细胞壁特性，原生质膜及各细胞器的结 构功能及其稳定性，生长调节物质的作用，膜脂去饱和作用，抗氧化系统等方面。研究结果表明： 中国农q p 科学院硕t 学位论文 第。审绪论 植物抗寒力与可溶性糖、膜磷脂、游离氨基酸( 特别是脯氨酸) 、脱落酸、膜脂肪酸的不饱和度等 有着一定关系，同时指出维持膜系统的稳定性是维持和发展植物抗低温能力的基础( 简令成等， 1 9 9 2 ；李美茹等，2 0 0 0 ；沈漫等，1 9 9 7 ) 。但以上研究并不能直接论证它们与植物抗冻能力有着具 体的因果关系。 2 0 世纪8 0 年代以来，较多的研究工作集中于植物膜保护系统组分和活性，如利用抗氧化酶体 系提高膜结构对冷胁迫的抗性以及对一些特异性蛋白的研究，如热激蛋白、热稳定蛋白、脱水蛋 白、抗冻蛋白等，而后逐渐进入利用分子遗传学和基因工程的方法获得转基因抗冻性植物( 丁国华 等，2 0 0 3 ；陈曦等，2 0 0 2 ；费云标等，1 9 9 4 ) 。同时人们还利用物理、化学、数学的方法，从植物 形态解剖学、生理学、生态学等角度研究形态解剖结构变化与植物抗冻性的关系( 苗芳等，2 0 0 6 ； 费松林等，1 9 9 9 ；简令成等，1 9 8 6 ) 。但这些并未能完全真正揭示出植物抗冻性的机理。 近年来随着生物工程技术的发展和分子手段的广泛应用，使研究得到进一步深入，使得一些 关键物质和关键基因逐渐显现，特别是在低温信号转导方面研究的进展，初步描绘出了植物低温 信号转导网络示意图，奠定了揭示植物抗冻性调控机理研究新的理论基础，也为我们提高植物抗 冻性提供了新的思路，即通过对植物感知低温信号机制的研究，逐步鉴定和明确参与低温驯化的 基因以及基因调节表达的调控机制。 1 。2 1 细胞膜系与植物抗冻性关系 膜系统是细胞骨架之一，膜的稳定性和流动性是细胞及整个生命活动赖以生存的基础。 同时，生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构，各种逆境对细胞的影响首先作用 于质膜。在1 9 7 0 年，l y o n s 和r a i s o n 提出著名的“膜脂相变寒害”假说，认为植物低温冷害来自 膜脂物理性质的改变，在植物遭受低温伤害时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，这时膜 脂从液晶相变为凝胶相，膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列，膜的外型和厚度发 生变化，膜上产生龟裂因而膜的透性增大，膜内可溶性物质、电解质大量向外渗漏，破坏 了细胞内外的离子平衡以及与膜结合酶的结构改变，从而导致植物细胞生理代谢的变化和 功能的紊乱。所以逐步提出解决抗冻性的一条思路，即植物体内凡能降低细胞膜系相变温 度的因素都将有助于植物抗寒能力的提高。 那么如何降低细胞膜系相变温度? 许多研究报道指出，膜脂中的类脂和脂肪酸成分明 显影响着膜脂的相变温度；增加膜脂中的不饱和类脂或脂肪酸含量能降低膜脂的相变温度。 般是膜脂上的不饱和脂肪酸成分越多，该植物的相变温度越低，抗寒性也越强。许多实 验也证实，抗寒植物一般具有较高的膜脂不饱和度，可能在较低温度下保持流动性，维持 正常的生理功能，因而其膜脂相变温度低于不抗寒植物。膜脂不饱和度既有遗传稳定的一 面，也有随温度降低可诱导的一面。 研究发现，许多植物对低温反应的一种重要表现就是增加不饱和度较高的脂肪酸如油 酸、亚油酸和砸麻酸在总脂肪中的比例。一系列实验证明了这点。l a t s a g u e 等( 1 9 9 2 ) 报道， 智利罗汉松科的3 个品种在冬季，总极性脂中的磷脂、糖脂增加，而大多数极性脂的亚麻酸 ( 1 8 ：3 ) 量增加，在针叶致死温度与针叶中高含量亚麻酸之间存在着相关性，所有脂组分中 亚麻酸优先累积似乎是抗寒植物所以具有较高抗寒力的普遍机制，而在抗寒力较弱的树种 2 中同农业科学院硕 ：学位论丈 第一审绪论 中，这种亚麻酸优先累积只出现在某些脂组分中。y o s h i d a 等( 1 9 7 9 ) 对桑树抗冻力进行研究 发现，随着抗冻力的降低，桑树树皮质膜中亚油酸含量逐渐下降而棕榈酸含量明显增加， 不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值也明显下降。王洪春等在水稻、玉米和葡萄等的低温实 验中发现低温驯化后，植株膜脂的不饱和脂肪酸含量，随植株抗寒能力和细胞膜冷稳定性 的增加而增加。 同时近年来对于膜脂中磷脂酰甘油( p g ) 的研究表明，p g 因具有较多的饱和脂肪酸，而 成为决定膜脂相变的主要因素，p g 的脂肪酸组成及其相变温度与植物抗寒性密切相关。杨 玲、苏维埃等发现水稻抗冷性的差异与它们膜脂中的p g 相变温度有关，p g 的饱和脂肪酸水 平影响着p g 的相变温度。m u r a t a 等( 19 8 3 ) 对12 种抗冷植物和9 种冷敏感植物中的p g 脂肪酸 饱和度进行了分析，发现在8 种冷敏感植物中( 除番茄p t ) p g 的饱和脂肪酸含量比较高，占总 脂肪酸的6 0 7 5 ，而1 1 种抗冷植物中的则为5 0 5 7 ，说明p g 的饱和度与植物的抗 冷性明显的相关。 但是有些研究结果却相反，如h a m a d a 等( 1 9 9 8 ) 将微粒体的6 3 脂肪酸去饱和酶基因转 入烟草，尽管提高了根和叶中1 8 ：3 n 一亚麻酸的含量，但对植物的抗冷性无影响。再如抗冷 性很强的花茎甘蓝的膜系中，不饱和脂肪酸含量较抗冷性弱的大豆膜中不饱和脂肪酸含量 更低。因此，有些研究者认为，膜脂脂肪酸饱和度与植物抗寒性无关，可见植物对低温胁 迫响应的复杂性。 在“膜脂相变冷害”假说之后，1 9 7 4 年y a m a k i 等提出了另一假说，即膜蛋白能够提高膜 稳定性的重要机制。y a m a k i 等在对冷贮藏的番薯进行研究时，发现冷贮藏过程中膜脂没有 发生相变，却观测到磷脂从膜上被释放出来，推测原因可能是低温造成膜蛋白结构上的改 变，而使膜蛋白对磷脂的束缚能力降低。p e a r c e 和w i l l i s o n ( 1 9 8 5 ) 通过冰冻蚀刻技术研究小 麦冰冻损伤的机制时发现，细胞外结冰会使质膜内表面形成“无颗粒斑点区”，即蛋白质颗 粒从质膜上脱落下来。u e m u r a 等( 1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 利用分离纯化的膜质研究了膜脂和脂蛋白的动 态关系与抗寒性的相关性，并在鸭茅草和冬黑麦低温驯化过程中发现膜脂膜蛋白的比值显 著提高。 综上所述，研究生物膜的动态变化对揭示植物抗寒性机理有重要意义，细胞膜系统稳 定性的提高是形成抗寒力的关键。 1 2 2 细胞抗氧化能力与植物抗冻性关系 在低温胁迫条件下，植物体内的生物自由基超常积聚，而消除自由基的能力下降，从 而使植物遭到伤害。 生物自由基是通过生物体自身代谢产生的一类带有一个或几个不配对电子的分子或原 子，这类物质都是由氧转化而成的代谢物及其衍生物，如超氧根阴离子( 0 2 一) 、羟自由基 ( o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 、氢氧化根离子( o h - ) 及脂类过氧化物( r o 和r 0 0 ) 等，是比氧活泼的含氧化合物，统称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。活性氧具有 很强的氧化能力，对许多生物功能分子具有破坏作用，形成氧化损伤。 细胞中r o s 的产生加速，而清除r o s 的能力下降，导致r o s 水平的提高。高水平的活 1 中同农、i k 科学院硕f 学伊论丈 第一帚绪论 性氧可能加速膜脂过氧化和膜蛋白的聚合，从而破坏膜结构功能。植物体内存在许多参与 r o s 消除的物质，这些物质统称为r o s 消除剂，主要可分为酶促防御系统和非酶促防御系 统( 即抗氧化酶和抗氧化剂) 两人类。植物中的酶促防御系统包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、谷胱甘肽还原酶( g s h r ) 等，非酶促防御系统包括谷 胱甘肽( g s h ) 、抗坏血酸( a s a ) 、维生素e 、胡萝卜素( c a r ) 等抗氧化物质，构成了植物的抗 氧化系统，保护植物免受r o s 的伤害。 实验证明抗氧化系统的抗氧化能力与植物的抗寒力有着密切关系，植物不同的抗寒力 与其细胞中具有不同水平的抗氧化酶活性和内源抗氧化剂含量相关，并且抗寒植物比冷敏 感植物具有更高水平的抗氧化能力。p r a s a dtk ( 1 9 9 4 ) 等用氨基三唑抑制c a t 活性后，发现 消除了冷驯化提高玉米幼苗的抗冷力的效果，可见c a l 在玉米苗冷驯化过程中起着很关键 的作用。刘鸿先和曾韶平等( 1 9 8 1 ) 研究发现抗寒品种的水稻在低温胁迫下体内的s o d 活性 高于不抗寒品种。李美茹( 1 9 9 9 ) 等利用h 2 0 2 和甲基紫精( w r y ) 对水稻幼苗作三种不同程度的 氧化胁迫预处理，结果表明：轻度氧化预处理提高了水稻幼苗的抗冷力，严重氧化胁迫预 处理则削弱水稻幼苗的抗冷力。氧化胁迫预处理刺激了水稻幼苗叶片抗氧化酶( s o d ，c a t ， p o d 和a p x ) 的活性，轻度氧化胁迫预处理使幼苗保持较高的抗氧化酶活性，减轻了由冷胁 迫引起的膜脂过氧化和细胞膜的渗漏程度，而严重氧化胁迫预处理则相反。k a n ga n d s a l t v e i t 报道( 2 0 0 2 ) 水杨酸能提高黄瓜和玉米的抗冷性，与谷胱甘肽还原酶( g r ) 和p o d 活性 的增加有关。植物体内所含的抗坏血酸和过氧化氢酶越多，越能有效地清除体内因低温而 引起的活性氧积累，则由活性氧引起的对植物细胞的伤害就越小。h o s h i d a h ( 2 0 0 0 ) 等认为 过量表达水稻叶绿体谷氨酰胺合成酶( g s ) 的水稻植株的抗冷性得到了提高。 低温胁迫下，细胞产生大量自由基，攻击膜系统，从而使膜脂脂肪酸的不饱和键被过 氧化，造成丙二醛( m d a ) 含量增加，严重损伤细胞膜，导致膜流动性的降低，干扰植物细 胞的光合、呼吸以及其他代谢过程，甚至死亡。马德华等( 1 9 9 8 ) 研究了低温对黄瓜幼苗膜 脂过氧化的影响，结果表明：低温下细胞的膜脂过氧化程度明显加剧，m d a 含量显著增加， 过氧化物酶活性上升，过氧化氢酶活性明显下降，m d a 含量与黄瓜幼苗抗低温能力呈极显 著负相关，p o d 和c a t 活性与黄瓜幼苗抗寒性分别呈正相关和显著正相关。王以柔等( 1 9 8 6 ) 研究发现，光照和黑暗不同条件的低温胁迫，水稻幼苗的m d a 含量明显增加。 当然也有相反的报道，如f o y e r 等( 1 9 9 4 ) i 物中超表烛i s o d 等抗氧化酶就具有 正、中、负的效应。v a n c a m p 等( 1 9 9 6 ) 发现外源f e s o d 在烟草叶绿体中超表达，对低温引 发的光抑制无抗性。所以抗氧化酶系统与植物抗寒能力方面的研究还需进一步探索。 1 2 3 抗冻基因表达与植物抗冻性关系 多数植物在与寒冻漫长的相互作用过程中，逐渐进化形成了一套感受和转导寒冷信号 的系统，并能产生一系列适应低温的变化，以增强抗寒性。植物冷冻抗性是种可遗传的诱 导性状，经过冷驯化( 即低温锻炼，经过一段时间的零上低温锻炼可提高抗寒能力) ，抗寒 力明显增强。 w e i s e r 等( 1 9 7 0 ) 首次提出植物在适应低温的过程中基因表达发生改变的观点。g u y 等 4 中囝农q k 科学院硕 ：学位论文 第一章绪论 量曼曼鼍曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼皇曼量i秭i；i鼍曼曼皇量曼皇曼皇曼鼍曼曼曼曼曼量曼曼曼曼邑曼曼曼量曼曼曼量 ( 1 9 9 0 ) 研究发现冷驯化能诱导和增强一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。这些冷 诱导基因表达的产物可以分为两类。一类是调控性蛋白，调控寒冷信号转导、抗寒基因表 达和抗寒蛋白活性；另一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋白。 1 2 3 1 调控性蛋白 植物在感受和转导寒冷信号的过程中，有多种调控基因参与编码产生信号传递因子和 调控蛋白，包括各种转录因子和蛋白激酶，如d r e b 转录因子、c a 2 + 依赖性蛋白激酶、细胞 分裂蛋白激活激酶等。目前有关导入抗寒调控基因的研究主要围绕着一种与抵抗寒冻所导 致的渗透胁迫相关的冷诱导基冈转录因子d r e b 展开。 植物在抵抗寒冻所造成的渗透胁迫过程中，有多种基因得以诱导表达，且发现多数在 转录水平调节的冷诱导基因和水分胁迫诱导基因的启动子区域有一个顺式( c i s ) 作用元件 t a c c g a c a t ，是这些胁迫诱导基因表达所必需的调控区，与冷调节信号的作用有关，被 称为脱水反应因子d r e ( t h ed e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e m t ) 。与这些顺式作用元件相结合的 为转录因子，分别依次确定为c b f i ，c b f 2 和c b f 3 或称为d r e b l b ，瞰船c i 和d r e b l a 。 j a g l o - o t t o s e n 等( 1 9 9 8 ) 将从拟南芥中分离得至i j c b f l 蛋白基因导入未经冷驯化的拟南芥中，大 量表达后能诱导冷诱导基因在常温下表达，增强了拟南芥的抗寒力。k a s u g a 等( 1 9 9 9 ) 研究 发现，用组成型强启动子3 5 s c a m v 启动d r e i a 或c b f i 表达的转基因植物，能增强植物抗寒 力。“u 等( 1 9 9 8 ) 筛选出可以超表达刀r 船m 的拟南芥，并发王1 j d , d r e b i a 表达不仅增强植株的 抗冻性，也增强抗旱性。同时证明，c b f 3 可提高脯氨酸含量和总糖的含量，包括蔗糖、棉 苏糖、果糖等。 1 2 3 2 功能性蛋白 在冷驯化过程中出现众多生理、生化和分子生物学上的变化包括糖、甜菜碱和脯氨酸 等渗透调节物质，同时还有多种冷调节蛋白得以诱导表达从而使膜结构与组成发生改变。 这些蛋白质都含有大量的亲水性氨基酸，具有热稳定性，如u a ，c o r ，w c s 等，其中的 多数蛋白质具有重复的氨基酸序列和相对简单的氨基酸组成，基因启动子区域含有d r e 顺 式作用元件。目前在低温胁迫这方面的研究较深入的是u a 蛋白基因和c o r 家族蛋白的基 因。除了这两种功能性蛋白还有抗冻蛋白。 u a 蛋白是在正常性种子发育后期伴随脱水干燥过程形成的一类低分子量蛋白( 大部 分m r 在1 0 k d 3 0 k d ，少部分在3 0 k d 以上) ，它广泛存在于高等植物的种子中，能够在水 分亏缺时保护膜系统及其它生物大分子免受破坏。但与储藏蛋白不同，l e a 蛋白不局限在 生长的种子中，在水分亏缺、盐胁迫、渗透胁迫和冷害条件下的植物组织中都积累该蛋白， 如将番茄l e a 2 5 基因导入酿酒酵母能提高其抗寒能力。l e a 蛋白具高亲水性和热稳定性， 并具有高度保守的氨基酸序列，u ! a 可能有三方面的作用：一是作为渗透调节蛋白，参与 调节细胞的渗透压，保住水分；二是作为脱水保护剂，起分子伴侣的作用，保护其它蛋白 和膜的结构稳定性，并能抑制细胞质的结晶化，聚集因失水而进入细胞的无序离子，使细 胞结构和代谢机制免受伤害；三是通过与核酸结合调节细胞内其他基因的表达。h o n g 等 ( 1 9 8 8 ) 指出，大麦在冷驯化过程中能诱导i - i v a l 蛋白基因表达产生一种l e a 家族的蛋白 质。x u 等( 1 9 9 6 ) 将h v a l 蛋白基因转入水稻中，结果表明转基因水稻提高了对水分胁迫和高 盐胁迫的抗受性。u a 1 1 3 类蛋白在抗寒过程中也能起重要作用。i m a i 等( 1 9 9 6 ) 将西红柿的 5 中围农业科学院硕十学位论文 第一审绪论 曼皇量曼曼鲁曼曼皇曼鼍i iiii 皇曼曼皇皇曼曼皇曼曼鼍 l e a 2 5 基因转入酵母中使其大量表达，显著提高了酵母细胞的抗寒和抗盐性。 c o r 家族蛋白是在植物的低温诱导过程中产生的与植物的抗冷性密切相关的一类蛋 白，又叫做冷驯化蛋e l ( c o l da c c l i m a t i o np r o t e i n s ，c a i p s ) 或冷调节蛋i 与( c o l dr e g u l a t e d p r o t e i n s ，c o r p s ) 。c o r 是一种诱导型基因。在低温作用下，多种c o r 基因被诱导启动表达， 进而转录翻译成c o r p s 。例如拟南芥在冷驯化过程中能产生c o r 6 6 ，c o r l 5 a ，c o r 7 8 以 及与u a 蛋白同源的c o r 4 7 。c o r p s 的功能表现为：一是作为抗冻剂，阻止冰晶的生成； 二是作为防脱水剂，防止脱水伤害细胞；三是具有直接的保护功能；四是维持低温下细胞 的主要代谢活动，并与细胞内信号转导有关。 k u r k e l a 和f r a n k 等( 1 9 9 2 ) 从4 低温或a b a 处理的拟南芥中分离到两个基因k i n l 和 k i n 2 ，发现这两个基因对应的蛋白质与比目鱼的a f p s 氨基酸结构相似，推测这两种蛋白质 是a f p s ，可作为冰晶的阻止子来降低胞液的冰点。a r t u s 等( 1 9 9 6 ) 使c o r l 5 a m 多肽在转基因 拟南芥中大量组成型表达后，与野生型相比，转基因植物分别提高了叶绿体和原生质体的 寒冷耐受性并增强了原生质膜的稳定性，减轻了寒冻所造成的损伤。虽然植物的冷诱导基 因众多，能诱导产生许多不同的c o r p s ，但目前真正被分离和纯化出来的c o r p s 并不多， 并且它们在细胞中的定位、氨基酸序列、功能、作用方式及基因表达调控仍不清楚，通过 诱导冷调节基冈生成c o r p s 或直接加入c o r p s 来提高植物抗冷力的技术还需进一步研究。 抗冻蛋白具有降低溶液冰点、修饰冰晶形态和抑制重结晶的功能。u r r u t i a 等( 1 9 9 2 ) 认为抗 冻蛋白( a f p ) 对膜系统可能提供一种保护作用，即避免胞外冰品透过细胞而使胞内液体结冰。早 期抗冻蛋白基因多取自于极地鱼类或高寒地区的昆虫。后来黄永芬等( 1 9 9 7 ) 用花粉管通道和子 房注射法将整合在t i 质粒上的美洲拟蝶a f p 基因导入番茄中，提高了番茄的抗冻性。关于抗冻 蛋白的作用机理有多种假设，但普遍认为是通过对冰晶的吸附抑制，即吸附在冰晶表面，通 过蛋白分子的氢键键合于冰晶晶格上，引起冰在吸附的分子间逐步生长，由此通过k e l v i n 效应 抑制冰晶的生长。尽管植物体内的a f p 与鱼类的a f p 有相似之处，但浓度与活性却不像鱼类和昆 虫那样高。植物a f p 降低冰点的效应低于鱼类和昆虫a f p 的作用，即植物a f p 的热滞效应大大低于 鱼类和昆虫a f p 的热滞效应。因此，植物a f p 的作用除了降低冰点外，更重要的是降低过冷点和 抑制重晶化等作用，因为这些作用比冰晶生长的抑制作用更容易实现。 1 2 4 低温信号转导方面的研究 从2 0 0 4 年第七届国际植物抗寒会议的报告和提交论文情况来看，信号转导和基因调节，基因 组学和代谢组学等方面已成为抗低温领域的研究热点。科学家开始理解植物感知低温信号的机制， 鉴定参与低温驯化的基因以及这些基因表达的调控机制，进而通过基因转化使植物抗寒性得以提 高。 所谓细胞信号转导，简单言之就是：外界环境刺激因子和细胞间通讯信号分子等，作用于细 胞表面( 或胞内) 受体后，跨膜转换形成胞内第二信使，以及经过其后的信号途径组分级联传递、 引起细胞生理反应和诱导基因表达的过程。我们所研究的低温信号转导就是让植物感知低温刺激， 进而明确低温信号在胞内传递的方式以及抗冻性能力的表达形式。 在低温信号转导方面，目前仍不清楚植物如何感知低温信号并传递低温信号到核内激活转录 6 中罔农、i k 科学院硕 j 学位论丈第一章绪论 量曼曼曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼罾量曼曼曼曼曼曼曼笪曼曼曼曼皇曼量曼曼曼曼曼曼皇量曼量量曼量曼曼曼曼曼量曼量曼鼍吕曼皇量曼曼兽皇量量曼曼量量量舅1 量 因子，进而调节基因转录或引起一系列生理生化反应。生理生化和遗传学实验表明低温驯化的信 号系统与其他逆境( 如干旱、高盐) 信号系统存在交叉性的信号物质和途径。因此，可以认为植物 体内存在一个平行的、多分支的信号网络调控植物抗寒性。 对于低温信号转导现在研究较多的是a b a 信号转导途径，钙离子信号转导途径。当然，还有其 它很多途径比如蛋白激酶途径、磷脂酰肌醇信号途径和磷脂酶d 信号转导途径等。近来随着在信号 转导方面研究的不断深入，发现磷脂酶d 是一类重要的跨膜信号转导酶类，可能介导各种逆境，所 以我们将重点研究此途径。 1 2 4 1a b a 信号转导途径 a b a 是重要的逆境信号，有逆境激素之称，逆境下a b a 结合蛋白与a b a 结合活性提高， 可能是感知和传递环境信号的重要环节。 生长温度( 2 2 ) 下a b a 处理可以增加包括拟南芥在内的许多植物的抗寒性；低温驯化 使内源a b a 含量迅速增加；a b a 缺陷型突变体( a b a - 1 ) 经过低温驯化后抗寒能力削弱，且外 源a b a 处理可以使其抗寒性恢复到野生植株的水平；a b a 不敏感突变体( a b i 一1 ) 可以诱导 c o r 基因表达，但外源施用a b a 不能产生低温驯化作用。这说明a b i 1 突变体中a b a 的下游 信号被切断，而突变体a b a - 1 中缺少的是a b a 的上游信号；低温和a b a 处理均可以诱导c o r 基因表达，但是低温也诱导a b a 缺陷型( a b a - 1 ) 和不敏感突变体( a b i 一1 ) c o r 基因表达，推测 可能存在不依赖a b a 的信号转导途径。所以根据其表达对a b a 的依赖与否至少可将低温信 号转导途径分为两类：一是依赖a b a 的信号转导途径；二是不依赖a b a 的信号转导途径。 1 2 4 2 钙离子信号转导途径 钙离子是一个主要的第二信使。k n i g h t 等( 1 9 9 6 ) 发现低温信号会刺激胞质钙离子升高， 而钙离子一部分来源于胞外，一部分来源于液胞。说明外界低温信号转入植物细胞可能有 钙离子信号的介导。 m o n r o y 等( 1 9 9 5 ) 以苜蓿细胞为实验材料，用e g t a 螯合细胞壁中的钙离子用口+ 阻塞质 膜上钙离子通道，发现低温驯化诱导的抗冷力完全消失，低温驯化专一性基冈c a s l 5 和c a s l 8 的转录受到强烈的抑制，说明阻止细胞擘中的钙离子流向胞质，可以阻断低温驯化的作用。 同时发现c a 2 + 螯合剂和c a 2 + 通道堵塞剂抑$ , j c o r 基因表达，c a 2 + 的载体可以通过产生c a 2 + 流而在常温下诱导c o r 基因表达，这表明细胞d i a c a 2 + 的变化可能参与感受环境温度的变化， 参与低温信号转导。 胞质钙离子浓度增加介导植物对低温的反应，但是如果胞质内钙离子长期保持高的浓 度，将会干扰细胞内有磷酸参与的能量代谢，引起中毒。因此细胞内精细的钙离子稳衡机 制将完成应答反应后的钙离子通过c a 2 + 一a t p a s e 、c a 2 + 矿逆向运输等方式，使胞质1 勾c a 2 + 恢 复到静息水平。即c a 2 + a t p a s e 、c a ，矿活性与植物抗低温能力关系密切。 1 2 4 3 磷脂酶d 信号转导的研究 磷脂不仅是生物细胞膜的主要结构骨架，而且能通过水解后产生的产物来参与多种生理以及 环境刺激引起的细胞反应，在细胞生命活动中起着重要作用。磷脂在磷脂酶的作用下，水解为自 由脂肪酸( f f a 、肌醇三磷脂( 口3 ) 、磷脂酸( p a ) 、二脂酰甘油( d a g ) 和乙酰胆碱( a c h ) 等。根据水解 磷脂的部位不同可以把磷脂酶分为5 类，即磷脂酶a i ( p l a l ) 、磷脂酶a 2 ( p l a 2 ) 、磷脂酶b ( p l b ) 、 磷脂酶c ( p l c ) 和磷脂酶d ( p l d ) ( 见图1 - 1 ) 。关于p l a l 和p l b 的研究报告至今仍很少，p l a 2 和p l c 7 中同农业科学院硕+ 学付论文 第一帚绪论 的细胞信号转导功能发现较早，研究信息也较多。p l d 于上世纪4 0 年代在植物中被发现，普遍存 在于植物组织中，它催化水解磷脂末端的磷酸二酯键形成p a 和亲水性的胆碱等。早期的研究关注 它在植物衰老和机械损伤时催化膜脂降解的这一功能。自1 9 9 4 年w a n g 等利用萌发的蓖麻种子，首 次获得有活性的p l d 酶，并进而利用反转录技术获得p l d 的c d n a 后，p l d 信号转导方面的研究才 逐渐展开。之后一系列实验发现各种环境刺激，包括低温、水分胁迫、病原菌激发和激素等刺激 均会迅速激活p l d 。在a b a 的信号转导中，抑制p l d 活性会导致信号转递全部部分受阻( 受阻程度 因细胞类型而异) 。这些都肯定了p l d 是重要的跨膜信号转导酶，在信号转导方面有着重要作用。 植物中p l d 基冈家族比其他生物体中要复杂( l i s c o v i t c hm ，2 0 0 0 ) ，拟南芥中有1 2 个p l d 基因被 鉴定。根据基因的结构和它们编码的p l d 的序列相似性、域结构、生化特性以及c d n a 克隆的顺序， 可分成6 种类型，p l d a ( 3 ) ，p l d l 3 ( 2 ) ，p e d r o ) ，p l d g ，p l d e 和p l d ( 2 ) 。根据植物p l d 的总体域 结构，p l d 家族可以分为两个亚家族，c 2 域p l d s 和p x p h 域p l d s 。c 2 域是一个c a 2 + 和磷脂结合的 折叠区域，该结构域中二分环上f f j 4 - - 一5 个氨基酸的性质与c a 2 + 的结合有关。p x p h 区域指的是两 个不同的磷脂肌醇相互结构折叠，分别是p h o x 异体同型和p l e c k s t r i n 异体同型。1 2 个拟南芥p l d 中 有1 0 个包含c 2 区域。p l d c = 家族包含p x 和p h 区域，并且这个区域结构存在于哺乳动物p l d 家族中。 p u ) ( 家族的全部序列比