（林产化学加工工程专业论文）树干毕赤酵母cdna文库构建及est序列测定.pdf

摘要 将植物纤维水解液中3 0 左右的术糖有效利用转化为酒精是降低酒精生产成本的关 键。树干毕券酵母是研究得最多、最具工业应用前景的木糖发酵酵母，目前对于树干毕赤 酵母木糖代谢的生理学孝惩铡还赧之甚少。 以e d n a 文瘁为基舔靛e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表遮窿歹| j 标签) 羧术是一秘 快速的进行撼因功能分卡斤及发现新基因的有效方法。本论文构建了树干毕赤酵母p 5 7 7 6 ( p i c h i a s t i p i t i s c b s5 7 7 6 ) 的e d n a 文库，并以该文库为材料进彳亍了大规模的5 端e s t 疼列溅定，为黪母鲍基因沩能分辑、本耱我落途径磷究蚨及舞选蠢芙瞧状基困爨供了基礁 l 工其。 以具有不同生长速率的树干毕赤酵母为材料提取r n a ，发现处于对数中期( o d 6 0 0 约 为2 1 ) 的酵母细胞易于提取出总r n a ；分别以匀浆法、玻砂法、液氮研磨法以及液氮速 冻宓硅滚氯磷黪的方法酸碜缀驻，再分嬲蔽t r i z o l ( 苯酸弱买酸酸鬣黢蕊均一溅会镑) 弱 交性裂解滚( 主要成分楚一巯基乙醇粒异硫酸氰瓢) 为试剂在溶解p 5 7 7 6 细胞缀分的同时 保持其中r n a 的完整性，通过苯酚和飘仿多次抽撮除净杂蛋白，以异丙醇沉淀回收特异 的保留在水朦中的r n a ，最后经乙醇洗涤得到备用r n a 。结果发现，运用变憔裂解液， 采取滚氧速冻趣滚氮骚壤麴方法提取黪霹缎鼹r n a ，效果夷好。零论文鞋约9 0 0 m g ( 干 逮) 酵母为奄季科提取获得了豹1 2 m g 总r n a ，提取褥率达到1 3 ，提取出豹r n a 具备 完整性，质激高，是e d n a 文库构建的良好材料。 以提取出的r n a 为树料，纯化出m r n a ( m e s s a g e rr n a ，信使r n a ) ，经反转录酶反 转录出c d n a 第一链，戳嚣换会戏法会残e d n a 双链，逶过荻筑铯溺羧瓣方滚薅透窭其 中大于5 0 0 b p 的片段与载体连接，最詹两电转化法转化宿主菌，构建出树干毕券酵母p 5 ，7 6 的e d n a 文库，经质量检测，初级文库滴度达到1 0 1 0 6 p f u ( p l a q u ef o r m i n gu n i t s ，噬菌斑 形成单位) m e ，扩增文库总克隆数达到1 2 5 1 0 9 ，文库中7 1 的重组子插入片段大于 3 0 0 b p ，这蘸e d n a 文疼稳建要求，竞念哥鞋弱予大筑模e s t 窍舞溅定及数鬃努褥。 将扩增好的p 5 7 7 6e d n a 文库铺布麓自斑筛选平板，挑取其中的自斑( 即黧组子) 经 活化培养后，运用v i t a g e n e * 9 6 e a s y 质糍d n a 制各试剂盒以碱裂解法共提取出5 8 板( 9 6 孔板) ，即5 ，0 0 0 余个重组予克隆的离质量质粒d n a ；提取好的质粒以t 3 ( 遗接载体上 其有该雩 黪r n a 聚合酶褒动子) 为雩| 锈经p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚会酶链式 反应) 扩增出重组子插入片段，标记上荧光染料后强a b ip r i s m * 3 1 0 0 测序仪上经毛细管 电泳完成了5 ，0 0 0 余条5 端e s t 序列的测定工l 乍，初步筛选出4 ，7 4 7 条质缀较好的 e s t 序列，疑筛选德到的e s t 中9 0 以上具有大予5 0 0 b p 的可读序列，每一e s t 序列中 不可读辕蓥数小手5 。 今后主鼹工作设想怒进行e s t 数据分析，并结合c d n a 文库制备树干毕赤酵母d n a 芯片，为木糖发酵酵母的缴物信息学研究提供基础。 关键调；本糖；楗予擎赤酵母；c d n a 文疼；表达摩歹瑟签 c o n s t r u c t i o no fe d n a l i b r a r ya n d e s t s s e q u e n c i n g o fp i c h i a s t 驷i t s f a ny i m i n s u p e r v i s e db yp r o f e s s o r sy us h i - y u a na n dh u a n g m i n r e n ( c o l l e g eo fc h e m i c a le n g i n e e r i n g ，n a n j i n gf o r e s t r yu n i v e r s i t y ，2 1 0 0 3 7 ) a p r i l ，2 0 0 5 a b s t r a c t x y l o s ef e r m e n t a t i o ni se s s e n t i a lt ot h eb i o c o n v e r s i o no f1 i g n o c e l l u l o s i cm a t e r i a l s t of u e l e t h a n o ls i n c e x y l o s e a c c o u n t sf o r30 o fs u g a r si n l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e s p i c h i as t i p i t i si st h em o s tp r o s p e c ty e a s tw h i c h c a nf e r m e n tx y l o s e t oe t h a n o la n dh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l y ，b u ta tp r e s e n tl i t t l ei sk n o w na b o u ti t s p h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) t e c h n o l o g yb a s e d o ne d n a l i b r a r yi sa ne f f i c i e n t a p p r o a c ht oa n a l y z eg e n ef u n c t i o na n dt od i s c o v e rn e v vg e n e s ， i nt h i sr e s e a r c ha e d n al i b r a r yo fp 5 7 7 6 ( p i c h i as t 护i t i sc b s5 7 7 6 ) w a sc o n s t r u c t e da n di t s5 * e s t sw a ss e q u e n c e d t h i sw o r kl a y saf o u n d a t i o nf o rg e n ea n a l y s i s ，x y l o s e m e t a b o l i s ma n dg e n es c r e e n i n g 。 y e a s t sw h i c hh a v ed i f f e r e n tg r o w i n g - r a t ew e r eu s e dt oe x t r a c tt o t a lr n a t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ti tw a se a s yt oo b t a i n e dt o t a lr n aw h e nc e l l sw e r ei n l o g a r i t h m i cp h a s e w i t ha no d 6 0 0o fa b o u t2 1 ，f o u rm e t h o d sw e r eu s e dt oe x t r a c t t o t a lr n ai nt h i s s t u d y ：h o m o g e n i z i n g ，b e a d i n g ，l i q u i d n i t r o g e ng r i n d i n g ，a n d l i q u i d n i t r o g e ng r i n d i n gw i t hd e e pf r e e z i n gi nl i q u i d - n i t r o g e n t w om a i nr e a g e n t s w e r eu s e d ，o n ew a st r i z o l ( am o n o p h a s es o l u t i o no fp h e n o la n dg u a n i d i n e i s o t h i o c y a 矬撞t e ，t h eo t h e rw a sap r o t e i n d e n a t u r a n t ( m a i n l yc o m p o s e do f 圣 * m e f c a p t o e t h a n o ia n dg u a n i d i n ei s o t h i o e y a n a t e ) t h et w or e a g e n t sm a i n t a i n e d t h e i n t e g r i t y o ft h er n aw h i l ed i s r u p t i n ga n d d i s s o l v i n g p i c h i a s t i p i t i s c e l l c o m p o n e n t s a f t e rt h ea d d i t i o no fc h l o r o f o r ma n d p h e n o l f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n ，t h es o l u t i o nw a ss e p a r a t e di n t oa na q u e o u sp h a s ea n da no r g a n i c p h a s e ，t h e nt h er n a r e m a i n e di n a q u e o u sp h a s ew a sp r e c i p i t a t e db yi s o p r o p y l a l c o h o la n dw a s h e db ye t h a n o lf o rr e a d y t o u s e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tg r i n d i n g y e a s tc e l l st op o w d e rw i t hd e e pf r e e z i n gi nl i q u i d n i t r o g e nc o u l dg r e a t l yi m p r o v e t h eq u a l i t ya n dt h ey i e l do fr n ae x t r a c t e df r o mp i c h i as t i p i r i s i nt h i sm e t h o d a b o u t1 2 m gi n t a c tt o t a lr n aw a so b t a i n e df r o m9 0 0 m go f d r yp i c h i as t i t i sc e l l s a n dt h et o t a lr n a y i e l dr e a c h e d1 3 e n o u g ht oc o n s t r u c t ae d n a l i b r a r y t o t a tr n aw a sf o r t h e rp u r i f i e dt oo b t a i nm r n a ( m e s s a g e rr n a ) ，t h el u t t e rw a s s y n t h e s i z e dt ot h ef i r s ts t r a n do fc d n a w i t hr t ( r e v e r s et r a n s e r i p t a s e ) 。f u r t h e r c h a n g e dt od o u b l e e d n as t r a n d sw a sr e a l i z e db yu s i n g “n i c k - t r a n s l a t e ”m e t h o d t h ee d n aw a st h e nf r a c t i o n a t e db ye l e c t r o p h o r e s i sa n dt h ef r a g m e n t sl o n g e rt h a n 5 0 0 b p w e r er e n o v a t e db yg e l p u r i f i c a t i o na n d l i g a t e dt ot h ev e c t o rt ot r a n s f o r mt h e h o s t b ye l e e t r o p o r a t o 扎f i n a l l y t h ee d n a l i b r a r y o fp i c h i a s t 多i t i s w a s c o n s t r u c t e d t h ec l o n e so fa m p l i f i e dl i b r a r yr e a c h e d1 2 5 1o f r o ml 。o lo 。 p f u ( p l a q u ef o r m i n gu n i t s ) m lp r i m a r ye d n al i b r a r y ，i nw h i c hr e c o m b i n a n t sw i t h 3 0 0 b pi n s e r tf r a g m e n t s e x c e e d s7l o ft o t a lr e c o m b i n a n t s t h e r e f o r ea h i g h q u a l i t ye d n al i b r a r yo f p i c h i as t i p i t i sw a sc o n s t r u c t e dw h i c hi ss u i t e df o re s t s s e q u e n c i n g t h ea m p l i f i e dl i b r a r yo fp i c h i as t f p i r i sw a ss c r e e n e do nw h i t e b l u ep l a t e s ，a n d m o r et h a n5 ，0 0 0w h i t e * c l o n e sw e r es e l e c t e df r o mc u l t u r ei n9 6 。w e l lp l a t e s 。t h e h i g hq u a l i t yp l a s m i d so fw h i t e - c l o n e sw e r ee x t r a c t e db yt r a d i t i o n a la l k a l i n e - l y s i s m e t h o d u s i n g t h e v i t a g e n e 9 6 一e a s yp l a s m i d e x t r a c t k i t t h r o u g h p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p r i m e r e db yt 3 ( t h ev e c t o rh a st 3r n a p o l y m e r a s ep r o m o t e r ) ，t h et a r g e tf r a g m e n t so fi n s e r t sw e r eo b t a i n e d 。t h e nt h e i n s e r t sw e r e t a g g e db y f o u rd i f f e r e n t f l u o r e s c e n c e d y e s a n df r a c t i o n a t e d b y c a p i l l a r y i na b i p r i s m ”s e q u e n c e r m o r et h a n5 ，0 0 05 - e s t sh a db e e n s e q u e n c e d a n d 4 ，7 4 7 e s t sw e r es e l e c t e da s q u a l i f i e d f o rf u r t h e rr e s e a r c h 。 a m o n g t h es e l e c t e de s s ，m o r et h a n9 0 h a dal e n g t hl o n g e rt h a n5 0 0 b p 。a n di n e v e r ys e q u e n c et h eb a s e su n a b l et or e a dw e r el e s st h a n5 t os u m u p ，i nt h i ss t u d y ae d n a l i b r a r yo f p i c h i as t 秘i t i sw a sf i r s tc o n s t r u c t e da n d 5 - e s t sw e r es e q u e n c e d t h i sc o u l de n r i c ht h ey e a s tg e n o m er e s e a r c hd a t a b a s e ， p r o m o t et h es t u d yo fx y l o s e m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ，a n de n h a n c et h er e s e a r c ho n t h eb i o c o n v e r s i o no f l i g n o c e l l u l o s i cm a t e r i a l st oe t h a n 0 1 t h em a i nw o r ki nf u t u r e i s 如a n a l y z et h ee s t sd a t aa n d t op r e p a r ed n a c l i p s 。 k e yw o r d s ：x y l o s e ；p i c h i as t i p i t i s ；e d n al i b r a r y ；e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 2 致谢 本论文是在导师余世袁教授的悉心指导下完成的，导师严谨求实的科学 态度，精滚渊博的学识修菸，使学生终生受益。攻读硕士学饺期阚，在擎零、 ：季争磺争生活等答方蟊均得到导甥麓谤多关心静帮劲，为本谂文戆颞利完成倾 注了大量心血。值此毕业之际向导师致以我最诚挚的感谢和敬意! 本论文主要在我校林木遗传与育神实验囊完成，论文的究成离不开黄敏 仁教授的指导和帮助，黄老师勤奋认真的敬业精神，一熬不荀的科学态度， 对学生毫竞保留戆务识传授；| 领我走向分子羹耪学这座秘圣的殿堂，在垂毛毕 业之时向黄老帮致淡我最衷心盼漆悫和数意! 三年来，生物化工教研组勇强老烯、徐勇老师、宋向阳老师、陈牧老师 和欧阳嘉老师等均给予了裁极大的关心和支持，给予了我蜜赍的关怀和荣麟， 在此深表谢意! 特别感谢林木遗传与育种实验室的陈英老师、张新叶博士、 张溥建士等所给予酶热情帮动。感潦奉察验室酌全体帮兄绛丧簌、师弟辉殊翻， 和嫁织结下戆友谊、和髂钠菸渡鲢时竞蒋或为裁今后人生麓美好回忆。还要 感谢阿丰和刘哲同学在完成论文期间所给予的帮助。 籍此论文完成之际，落向给予我热帻指导静帮助过酌各位老师、爨喾致 以诚挚的谢意! 滚君，感谢所有美爱我砖家人释麓友对我麓支持和鼓励l 范一民 2 0 0 5 年6 月 导师：。豢氍熬 刖吾 人类能源长期依赖于不可再生的石油( 矿物) 燃料，直到“石油危机”爆发，地球 上积累了几千万年的燃料日趋殆尽，人类才将目光转向了替代能源的寻找；同时，由于石 油燃料的过度使用，加剧了环境污染，尤其在“温室效应”问题提出后，许多国家都对环 境法规进行了不断的完善，开始寻找对环境友好的燃料。 酒精是最具吸引力的绿色环保型的可再生替代能源。其一，作为发酵酒精的植物纤 维原料是地球上分布广、价格廉的可再生资源；其二，从全球碳循环角度出发，由于酒精 燃烧后释放的二氧化碳与绿色植物光合作用吸收的二氧化碳相平衡，几乎不额外增加大气 中的二氧化碳含量，从而不会导致温室效应。 早在十九世纪八十年代，h e n r yf o r d l l l 就已经提出用酒精作为汽车燃料，然而随着石 油燃料的出现，石油燃料以其低成本迅速占领了市场。因此，如何降低燃料酒精的生产成 本是燃料酒精工业化的关键所在，也是以酒精代替或部分代替汽油作为燃料可行性的关键 所在。在制取酒精的植物纤维原料中，纤维素占4 0 - - 6 0 ，半纤维素占1 5 2 5 。过去， 人们一直认为半纤维素中的木糖不能被微生物发酵成为酒精，因此，传统酒精发酵主要是 利用纤维素中的葡萄糖【2 1 。直n - - - - 十世纪八十年代，木糖这一植物纤维水解液中最主要的 五碳糖可被一些微生物发酵成酒精的观点提出后，在全球范围内掀起了木糖发酵酒精的研 究热潮，如何将植物纤维水解液中3 0 左右的由半纤维素水解得到的木糖发酵成为酒精 则是降低酒精生产成本的关键，也是决定植物纤维资源生产酒精经济可行的关键。 随着植物纤维水解技术的不断改进和发展，特别是蒸汽爆破技术的应用，回收较纯 的半纤维素已不成问题，因此，微生物本身代谢木糖的能力，已成为决定植物纤维原料水 解液木糖发酵成败的关键刚】。木糖发酵微生物中，酵母的木糖发酵能力最强，其中树干 毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 【5 】是目前研究得最多且最具工业应用前景的酵母菌种之一。但 树干毕赤酵母发酵木糖成酒精的过程需在“限制性供氧”条件下发生，对供氧量要求严格， 使其在工业应用方面受到局限，从而掀起了利用基因工程手段进行菌种改良的热潮。迄今 为止，利用基因重组技术已构建了一批工程细菌和工程酵母，然而重组菌尽管能利用木糖， 但糖利用率和产率却很低，构建既能发酵六碳糖又能发酵五碳糖的高产酒精酵母依然是一 大挑战。目前，对于树干毕赤酵母中木糖代谢的基本元件已有所了解，但有关速率控制步 骤以及发酵调节机制还有待于进一步研究1 6 ，因此，更全面透彻的理解木糖发酵菌种中基 因与功能的关系，分析木糖代谢途径十分必要，将为降低木糖发酵成本提供依据，为基因 重组指明方向。e d n a 文库正是筛选并克隆有关性状基因，分析基因表达的基本工具：以 e d n a 文库为材料的e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表达序列标签) 技术则是寻找和发现新 基因，探索基因与功能关系，进行基因功能注释的基本手段。 自二十世纪七十年代中叶首例e d n a 克隆问世以来，作为基因克隆的重要方法之一的 e d n a 文库构建技术引起了人们的关注，同时由于e d n a 文库在研究基因表达和功能鉴定 方面的特殊优势以及e d n a 文库实用性强的特点，使得e d n a 文库在生物学领域具有了广 泛用途。围绕e d n a 文库的技术发展概括起来可分为两大部分：一项是e d n a 文库的构建 技术；另一项是e d n a 文库的成用技术，即如何快捷高效地从文库中获得有关目的基因的 序捌及功能方面的信息。最近发震起来的e s t 技术逶实现c d n a 文库应掰价值的重要途径， 是棚应各物种基因组计划的重要补充，将e s t 技术与基因芯片技术相结合则构成了功能基 因缀学的蘸要内容。 e s t 计划最初是在人类基因组计划开始时提如，作为人类基因缎计划的重要事 充， 髓精一些模式生物的基阂组计划和e s t 计划也相继展开，如小鼠、栗蛹、线虫等，其中 也包括酵母。随羲酵母麓因组计划鲍扇动，1 9 9 6 年酿澄黪母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 全基因组序列被测出，为酵母蒸因功能的比对分析提供了基础平台，使得通过构建树干毕 赤酵母e d n a 文疼了鼹基因功能具备了可& 性和可霉性，以构建如的树于毕券酵母e d n a 文库为材料进行e s t 序列测定，进而进行e s t 数据分析则是酵母基因缀计划的重要补充， 也是酵母( 尤其楚本糖发酵酵姆) 基因功能研究的基本等段之一。 本论文旨在以最具工业威用前景的木糖发酵菌种树干毕赤酵母为材料，构建出该菌 静藏质量麴c d n a 文露，溅定其e s t 序列，默期职究基因功熬，阑述本糖代谢途径以及 筛选目的熬因，同时为蕊因重组技术提供平台。总体研究思路如下： ( p o l y a t w a c tm r n a 分离系统) 匡卤(茈pb料luaes文cr霹ipt构i建ix试r箭盒， 功能已知黼t功能手舭盯 筛选有用基因、基因芯片制备分离、鍪定新基因” 基因功能分析、木糖代谢机理研究一 卤 1 本糖发酵 1 1 燃料酒糟 第一章文献综述 在过去的二十余年中，从廉价箍又可再生的植物纤缎原糕中制取灏糖受到了j “泛的 关注h 。“。巴器、美国淡及欧黢豹农篷致繁帮分剐麓定了生产商鲎潘精豹工整诗巅”o l 。 1 9 8 5 年，巴西的新汽车市场中有9 0 的车辆以酒精作为燃料，达到了酒糟利用的新高度， 将酒精进一步脱水后添加适量汽油形成的变性燃料酒精被视为替代和节约汽油的最健燃 料，矮有豢徐、演法、嚣保、灾全、可再生簿优点【l ”。鞭静巴西将无水酒精 乍为汽漓添 热潮，班2 2 2 4 的院铡与汽涟滋合作为撩秘。1 9 9 6 年，美鋈国家速矮综合考察帮瓣镑 研究报告【i 埘指出：作为汽油增辍剂的m t b e ( m e t h y lt - b u t y le t h e r ，甲基叔丁基醚) 狂减少 空气污染的同时却增加了水质污染。为此，1 9 9 9 年美国环保局与国会合作，针对m t b e 对 承资源熬污染，掰究铡订了2 0 0 2 2 0 1 0 年期耀颓的国家“滤涪燃籽替戴诗剡”。2 0 0 2 年3 月2 l 霸，美联邦政府发表了取消侵霜m t b e 麓声明，转两推广使霜车熏乙醇汽漓，不健在 一定程度上可以缓解石油供求的矛盾，同时述有效地降低了汽车尾气中的有害气体排放， 改善丁生态环境和空气质量，经济和社会效靛显著。福特公司已于1 9 9 8 年率先推出1 5 万辆 甄戆以乙醇为燃秘，毽能以汽油必燃辩的通鼷毽汽车，这懑妹羞滔精将戏梵一耱越寒越重 要静燃辩l | “。霹髓，美国将由囊物质原籽生产静酒精戬t 0 的院俩与汽浊混合作为清洁燃 料。欧洲通过立法规定增加生物质在电力和燃料方面的成用，新的欧洲指示则要求在2 0 0 5 年生物质燃料要占到交通运输的2 ，在2 0 1 0 年则要达n 5 7 5 。 传统溪精发黪潋粮食为主，但戳粮食翻敷滔耱技绥舄爨，燕其农审雹这样一个久西 大匿，粮食资源逐相对欠缺的情况下使用粮食生产酒精极大遣限制了燃料酒精的能源效 益，丽植物纤维原料中碳水化食物占7 0 ，阑其廉价而成为了重要的生产酒精的原料【1 3 】。 由于植物纤维水解液中的木糖发酵机理复杂，发酵条件要求高，并且葡麓糖等己糖的存在 会蘩枣l 本赣发酵，瓣筵与铸统粮食发酵稳毙，接镑纾维原料戆发酵存糕凑穗兰豹难发。 1 2 植物纤绒原料 植物纤维原料是地球上最丰富的可再生赞源，每年大约合成1 0 1 1 吨【1 2 4 1 ，是十分具 有游力豹低成本生物痿涟精魏缀籽。其一，戳植魏绥维原辩生耱转纯铡取淫耱，替代域嫠 分替代石油燃料，w 以缓解石油臼益桔竭的熊源压力，实现能源供应静w 持续发展；其二， 由植物纤维原料，主产的燃料酒精净增极少量的c 0 2 ，燃烧污染较少，具肖绿色环保的社会 效益l i ”j ；其三，将分布相当广泛的农林废弃物中大量存谯的植物纤维暇料作为廉价豹碳 拳豫合镶资源送行宠分豹稳爱，骞效获取溪耱，其奏霹菠趣经济效益，愁薤凌农鼗及葵蘧 相关行业的经济发展【l l l 。 植物纤维原料由纤维素、半纤维素和术质素构成。纤维素和半纤维索是植物纤维原 料的主要组分，占6 0 - - 7 0 。终维索是高分子量的葡萄糖聚合物，占植物纾维原料豹 4 0 - 6 0 ，其水解摁到懿壤蔑糖自g 够被微生物直接发酵成灏糖；拳绎维素占 壹物野维原料 的1 5 2 0 ，不同来源的半纤维索其单糖的组成各界，如术糖、树胶醛糖、甘露糖、半乳 糖等fj s j 9 1 ，其中本糖是墩主要黪五碳壤，是爨然爨巾含量仅次予麓甍糖躯糖努，在攮鐾绥 维水解液中占到1 7 3 1 。 本糖过去一焱被认必不能被徽玺糖发黪戏淫糖。k a r e z e w s k a 予1 9 5 9 冬善次捉密了臻 木糖发酵酒精【2 0 】，但这个发现朱引起人们的足够重视。直到1 9 8 0 年。w a n g 等人提出木 糖可被一些微生物发酵残懑赣簸，在嚣际上擞起了一羧本耱潘耱发酵戆辑究熬滏。经涮算， 植物纤维原料中半纤维紊组分的有效利用有可能使燃料酒精的生产成本降低2 5 ，这显 然蔹羧手本糖翁炎分秽f l i t 1 。撩镄绎镰嚣瓣镱敬滔糖懿工艺路线强蚕1 ： 檀麓纾维藩瓣 1 3 本糖代遴途径 纾壤豢 半纾缎 一二 。粤栩糖里l r _ 术酮凇 一本糖一 i 陌网 木质綮( 不能转化成酒精) 豳1 - 1 梭物纤维原料制取酒精的上艺路线 酒精 二十多年来，人们在木糖发酵机耀的研究上获得了许多进展，主要集中在微生物代 漆木糖方面。t a n a k a k 等久莸d 一术耱在乳杼蔼中静两种不同代谢途径以及木糖浓度对产 率系数的影响 2 1 1 进行了研究。提出了水糖在乳酸菌中的代谢示意图；z a l d i v a rj i t 等人则 在燃料酒精的研究中提了植物纤维原料的代谢途径，这其中也包括术糖代谢途径； z a l d i v a rj 1 2 2 j 等人还在酿洒酵母的代谢工程的研究中涉及到了木糖和蔼萄糖的代谢。 蒺于对木糖代谢的研究，入们总结出了术糖代谢的基本机域；木糖在微生物细胞中 首先被转化成木酮糖，木酮糖磷黢化厝避入磷酸戊糖途径，经一系歹鞋的生物化学反应生成 酒精。在不问的微生物中，木糖转化为术酮糖的途径不同：在酵母细胞中，术糖首先以 n a d p h n a d h 为辅酶，在术糖还鼹酶的作用下被还原成本糖黪，本糖醇髯跌 n a d p + n a d + 为辅酶，经术糖醇脱氢酶的作用氧化成木酮糖；而在细菌中，木糖经过术糖 异槐懿一步反应生成本酮糖，如图1 1 2 ； 4 木糖辩构酶木黼糖激酶 1 4 菌稀选育 圈1 - 2 本糖捉谢途径 乙薅 隧着霹发酵本糖菌种蜘发现，出纾缨素农鳃褥到的穰麓糖_ 季日i 是半纾维素水姆缛到的 术糖均有望被转化为酒精，因此越发激发了人们对植物纤维原料生产酒精的研究兴趣，在 莹秽选育上墩皴了大量的王律。 在高产酒精酵母的筛选及骧定中筛选出的高产菌株缎鉴定为酵母属中的酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 田j ，酿淫戆母亦蹩传统躲在王救生产应翊孛有上蔻年历史豹 高产酒精发酵菌种，但该菌种只能发酵葡萄糖，不能发酵水糖。 迄今兔建已笈现1 0 0 多秘微生穆黪发酵本糖生成疆穰渤】，包糕缨蓥、真菌、酵母楚。 许多绷菌和冀菌可以发酵术糖产生酒精，但是伴有大嫩副产物生成并且木糖利用缓慢无法 潢是蘧数纯淄糖生产豹要浓。本糠发酵微生魏巾酵母豹本耱发獒熊力爨强，基藜入粕磷究 晟多的木糖发酵酵母菌有3 种，即管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i a s t i p i t i s ) 蠢体啥塔骰丝酵母( c a n d i d a s h e c h a t s e ) 。 凝近研究发现，树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母的洒精发酵速率怒管囊酵母的2 。3 倍p j ，瑟其中榜手肇赤酵母能够快速您量豹健谗本糖产淫壤，量足孚不产本糖簿，爨其 工业威用前燎。并鼠，树干毕赤酵母发酵木糖对维生索没有绝对的要求，可以利用更加广 泛懿食糖豢瓣拉耐。在基嚣工程方蠢，褥子毕蠢酵母楚一罩孛凝鍪熬夕 源慕濯表达系统，嚣 有关树干毕赤酵母的转化研究则有助于推进酵母木糖代谢相关基因以及木糖代谢途檄的 研究遴震溺。 2 树予毕赤酵母 2 1 遗传基因研究 树干毕赤酵母因具有将木糖发酵成酒精的能力以及在基因工程应用方面的优势而成 失了磺究热点。月融，随鬻传统发酵技术的成熟，基因改良手段的兴起，人们逐渐将鼹光 5 转向_ 分子领域的研究，尤其怒对树干毕赤酵母中的基因遄传信息的研究。 t s e g am e l a k e 等汉褥予牮赤酵母( p i c h i as a p i t i sc b s 5 7 7 3 、c b s5 7 7 4 、c b s5 7 7 6 以及p i c h i a s h p i t i sc b s6 0 5 4 等) 是实验鼹株专门研究了本耱发酵蕊秘撼予毕赤酵母戆綦困 系统特征，认为野生型树干毕赤酵母为肇倍体细胞，仅具锯一个基因组，并获得了树干毕 赤酵母生长、繁殖以及衰兹过稷中的一些基因信息；l up 【6 】等人则针对术糖代谢中速率 控制步骤醣教发酵调节机稍述襻在着许多需溪研究躺遣方遽一情况，予t 9 9 8 年建立了树干 鼙蠢黪母( p i c h 秘s t i p i t i sc b s 6 0 5 4 ) 懿基爨缀文痒， 譬凌褥于擎蠹酵母中至少存在餐6 条 染色体，并邋过关键基因的过餐农达及其中断技术来进程研究，从而获得了关于树干毕赤 酵母的遗传悭状及蒸发酵酒精的调控机制的些认识。 另外，由于辩母基圈结构紧密，肉含予少，是激简单的真核生物，素有“真梭生物 孛豹大弱抒蘩”之称，因鼗蔽辩母终受麓羧互程孛熬寮主蘩逛弓| 越了久襄广泛翁兴趣。臻 酒酵母是研究得最多的酵母宿激表达系统i 2 ”，然而酿酒酵母在获得外源蛋白产物方面还 存在赣一些不足之处。不足之跫缺少强的紧密鲍庙勰予，这对予瘫水平驰产如雏派爨自 是十分重要的i 不跫之二鼹没裔恰当的分泌外源蛋白的盾转录系绕。酿溺酵母的这魏髑限 经需舞寻我霹替鼗靛酵霉褒这系统藤予激瓣决。撵予肇券簿母就是藜豹酵母袭这系统之 。h o f 2 9 】等在1 9 9 1 年就描述了有关树干毕赤酵母的转化，之后y a n g 划等人成功地构建了 基- 7 = u r a t 基因款蠢效的樾子皆券酵母袭达系绫。d e nh a a nr 。 3 1 1 等戳鬃氏本嚣中f 羧x y n 2 ( 术聚糖酶熬因) 为报道基因，研究辩于毕赤酵母中x y l i ( 木糖还原酶基因) 、t k l 腐动 予懿袭达戆力虢没酸滔酵母串终滚襄动予擎g k l ( 袋羧营濑激酶鏊函) 褒褥子肇赤熬姆牵 的表达情况，结果发现酿酒酵母中的p g k l 启动子能够在树干毕赤酵母中诱导蒸因表达。 、 2 。2 基鞠改魏 微生蘩簇因敬嶷蘸胃戳扩大鼗生貔薅蘩震戆痘掰范潮，又鹫黻萼| 掺徽生赣进程特定 的代谢途径。生产酒精峭“毛”l 。 避过对樾予举券酵母蕊西缀遗传镄惑懿矮究，霆懿懑经够魄较窭爨逮扶掰予攀赤 酵母中克隆得到编码x r ( x y l o s er e d u e t a s e ，水糖还原酶) 翡綦因x y l i 和编码x d h ( x y t i t o l d e h y d r o g e n a s e ，零糖醇聪氯酶) 鹃基n x y l 2 ( x r 移x d h 褥释酶程本瓣发酵滔精串起关 键作用) 。而酿酒醉母具有耗糖快、乙醇耐受力高、对水解糖液中肖毒物质抗性强等优点， 一妻建溪壤燮产中疆豢照鬻秘。骧淫酵蹲不黢鬟曩本糖，帮缝将本羽耱我游戏淫壤，溺越， 以树干毕赤酵母和酿酒酵母为纂础的纂因改良技术全谣鼹开。途径之一是将控翩x r 稻 x d h 豹基函袋者怒控镧本糖异构酶熬鏊因转入酿疆辩母巾瑷梅建潮臻本糖豹醮浮熬簿， 也是目前构建工程酵母菌的主簧途径：谂径之二是利用树干毕赤酵母可以作为外源基因表 这系统豹特缝，将藩溪酵鸯串控露l 沃氧发酵憝基因转入本耱发簿蘩拣辩予毕赤懿蹲审，秘 建弼以在厌裁条件下发酵的树于毕赤酵蹲。 钟对酿滔酵姆在植物纤维瓣辩水解糖液发酵生产滔精中不髓有效将本糖转化成淄精 的问题，鲍晓明等采用p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反威) 技术克隆嗜热菌 c l o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l f u r i m 中静零耱异擒酶基西x y l a ，成功转移至涨酒酵蹲 | l5 8 受 体藏审，褥劐重缀酵母转健予h 6 1 2 ，舞瑷t 在酿滔醪母书褥到本糖雾旋酶的添性表达， 6 为进一步在酿酒酵母中建立新的木糖代谢途径打下了基础，但在酒精生产上并未取得成 功。迄今，将不同细菌的木糖异构酶基因导入酿酒酵母中构建木糖利用酵母均未获得较大 进展 3 4 】。a l t e r t h u mf 1 3 5 1 等将树干毕赤酵母中的x y l i 和x y l 2 基因转入大肠杆菌k 0 11 中，获得了一定成功。由此，许多学者尝试将树干毕赤氏酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢 酶途径导入酿酒酵母中：w a l f r i d s s o n l 3 6 1 等人曾于1 9 9 7 年构建了用于表达树干毕赤酵母中 的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的重组酿酒酵母，但酒精得率不高；鲍晓明1 37 】等以 e c o l i - s c e r e v i s a e ( 大肠杆菌酿酒酵母) 穿梭质粒y e p 2 4 为载体，将树干毕赤酵母( p i c h i a s t i p i t i s c b s6 0 5 4 ) 的x y l l 及x y l 2 基因分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的a d h i ( 乙醇脱氢酶) 启动子和p g k ( 磷酸甘油激酶) 启动子下，构建不同x y l i 及x y l 2 的重组 质粒。将这些重组质粒分别转化酿酒酵母佤c e r e v i s a eh 1 5 8 ) 受体菌，得到的重组菌株表现出 不同的基因表达水平，发现酒精产率和x r 与x d h 的酶比活力比值相关；另外，山东大学 的汪天虹等 3 8 1 采用双载体系统，以携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒 p a j 4 0 1 x d h l 转化已带有树干毕赤酵母x y l l 基因的重组酿酒酵母h 4 7 5 ，构建了同时带 有树干毕赤酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母h x l 。 另一方面，针对树干毕赤酵母不能厌氧发酵的问题，j e f f r i e st w 1 3 9 】等将酿酒酵母中 的u r a 3 基因转入树干毕赤酵母中，s c u r a 3 基因编码二氢乳清酸脱氢酶，该酶能够以延 胡索酸( 盐) 作为电子受体替代氧气，从而赋予微生物厌氧发酵的能力。经研究发现，携 带有s c u r a 3 基因的树干毕赤酵母能够在补充了葡萄糖的木糖培养基上存活较长时间，但 不能在单独的木糖上生长，该研究是以基因工程手段使树干毕赤酵母厌氧发酵的首次报 道，开启了基因改良技术的一个新途径。 综上所述，二十多年来，人们在基因遗传信息及基因改良方面作了许多尝试，但均 末获得突破性进展。究其原因，是因为对于木糖发酵菌种树干毕赤酵母中诱导戊糖代谢的 生理学机制还知之甚少，因此以e d n a 文库及e s t 序列为基本工具研究树干毕赤的基因表 达情况十分必要。 3 c d n a 文库 e d n a 文库是一类重要的基因文库。基因文库是指采用体外克隆技术得到的一个重 组d n a 分子群体。群体中的每个重组分子独立寄存在适当的宿主细胞中( 如大肠杆菌) ， 通过这些宿主细胞繁殖，不仅能使文库中的各种d n a 分子得到维持和拷贝数扩增，而且 还可以通过对这些宿主细胞的基因型或者表达产物的检测分析，从文库中分离出人们感兴 趣的目的基因，开展进一步的理论和开发研究。 按照组成基因文库的重组d n a 片段的供体来源，基因文库可分为基因组文库和 e d n a 文库两大类。 3 1 基因组文库与e d n a 文库 在基因组文库中，重组的d n a 片段来源于某种特定生物个体的基因组d n a 。将提 取出来的染色体基因组d n a 经过机械剪切或适当的限制性内切酶消化处理，形成一定大 小的d n a 片段，将这些d n a 片段克隆到适当的高容量载体上，将带有基因组d n a 片段 7 的载体导入适当宿主细胞( 酵母或大肠杆菌) 中，使重组d n a 片段克隧化，即可获得一 令毽食该生钫个体萋因缝全都序列倍爨懿基鬻经文津。基戮缓文簿主要麓予鏊鬻缝黪疆图 谱的构建、基因组序列分析、基因在染色体上