（应用化学专业论文）基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 本论文设计了2 类基因载体阳离子类脂，合成、提纯了计4 0 个化合物，其中大部 分为新化合物，全部产品经过限，1 h n m r ，”c n m r ，h r m s 或m s 表征结构正确，纯度 符合转染要求。 所合成阳离子类脂可制成阳离子脂质体( 囊泡) ，采用t e m ，动态光散射，及z e t a - 电位仪等手段对其进行研究，初步得到阳离子类脂及由其所制备出的阳离子脂质体的结 构与性能的关系。所制备的阳离子脂质体可和d n a 形成脂质体d n a 复合物。采用琼 脂糖凝胶电泳的方法对脂质体d n a 复合物进行表征。 采用所制备的阳离子脂质体作为基因运载工具，转运质粒d n ap g l 3 c o n t r o l 对 c o s 。7 细胞株及h e p 2 细胞株进行细胞转染实验，以2 种商品化基因转染试剂 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 及s o f 嬲t 进行对照，筛选出6 个转染效率较高的阳离子脂质体。采用 所筛选出来的6 个基因载体阳离子脂质体转运质粒d n ap g l 3 c o n t r o l 在另外3 种哺乳 动物细胞株b 1 6 ，m c f 7 ，h e p a l 6 中进行细胞转染校验实验；采用所筛选出来的6 个 基因载体阳离子脂质体转运质粒d n ap g f p n 2 在5 种细胞株c o s 一7 ，h e p 2 ，b 1 6 ， m c f 7 ，h e p a l 6 中进行细胞转染校验实验，证实所筛选出的6 个阳离子脂质体基因载 体的转染效率高于或相当于2 种商品化基因转染试剂。采用m t t 方法对所筛选出的6 个阳离子脂质体的细胞毒性进行了测量，证实所筛选出的6 个阳离子脂质体基因载体的 细胞毒性很低，具有作为基因载体的应用前景。 对阳离子类脂结构与转染效率的关系进行了分析，从疏水碳链长短，阳离子头部结 构以及平衡阴离子等方面讨论，得出影响转染效率因素的一些初步性结论。 关键词：阳离子脂质体：基因载体；转染；构一效关系 刘栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 d e s i g na n ds y n t h e s i so f c a t i o n i cl i p i d sa n dt h es t u d yo nt h e i rb i o l o g i c a l p e r f o r m a n c e a b s t r a c t 2s e r i e so fc a t i o n i cl i p i d sw e r ed e s i g n e d ，s y n t h e s i z e da n dp u r i f i e d t h ep r e p a r e d4 0 c o m p o u n d s ，m o s to fw h i c ha l en e wc o m p o u n d s 。w e r ea l lc h a r a c t e r i z e dc o r r e c tb vi r 1 h n m r ，”cn m r ，h r m so rm s ，w h i c hc a nb eu s e df o rg e n ed e l i v e r y n l es y n t h e s i z e dc a t i o n i cl i p i d sw e r ep r e p a r e di n t oc a t i o n i cl i p o s o m e s s o m ep r e l i m i n a r y d i s c i l ： l i n ef o rt h es t r u c t u r e - e 腩c t 叫a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec a t i o n i cl i p i d ss t r u c t u r ea n dt h e l i p o s o m e sf o r m e dc o u l db ea b s t r a c t e db ym e a n so ft e m d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n ga n d z e t a - p o t e n t i a lm e a s u r e m e n t t h ep r e p a r e dc a t i o n i ci i p o s o m e sc a r lf o r i l lw i t hp l a s m i dd n a i n t ol i p o s o m e d n ac o m p l e x ，w h i c hc a r tb ec h a r a c t e r i z e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t w op l a s m i dd n a p g l 3 - c o n t r o la n dp g f p - n 2w e r eu s e dt ot r a n s f e c t5m a m m a le e l l l i n e s ，c o s - 7 ，h e p - 2b 1 6 ，m c f - 7a n dh e p a l 一6 ，b ym e a n so ft h ea b o v el i p o s o m e sa sg e n e c a r r i e r , a n dt h ep r e p a r e dc a t i o n i cl i p o s o m e sc a nd e l i v e rd n a i n t oc e l l ss u c c e s s f u l l y b yu s i n g t w oc o m m e r c i a lt r a n s f e c t i o na g e n tl i p o f e c t a r n i n e 2 0 0 0a n ds o f a s ta sc o n t r o l s s o m eo ft h e a b o v ec a t i o n i cl i p o s o m e sg i v eas u p e r i o rp e r f o r m a n c et h a nt h ec o n t r o l s 6l i p o s o m e s 也e nb e s e l e c t e d ，w h i c ha r ep r o m i s i n gf o rf u r t h e ra p p l i c a t i o n c y t o t o x i c i t yt e s tb ym t tg i v ea s a t i s f a c t o r yr e s u l tf o rt h es e l e c t e d6c a t i o n i cl i p o m e s a l s oi nt h ed i s s e r t a t i o n , t h ea f f e c to f t h ec a t i o n i ch e a d s ，t h eh y d r o p h o b i cc a r b o nt a i l s t h e l i n k e rb e t w e e nt h e m a sw e l la st h eb a l a n c ea n i o no nt h et r a n s f e c t i o ne 街c i e n c yw e r e d i s c u s s e d , s o m ep r e l i m i n a r yc o n c l u s i o nb ed r a w nf o r mt h ed i s c u s s i o n k e yw o r d s ：c a t i o n i cl i p o s o m e ；g e n ec a r r i e r ；s t r u c t u r e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p ；t r a n s f e e t i o n i i 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：日期： 大连理工大学博士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： 导师签名 嘉侬莨 截i 鬈拍奄，魏 碴鱼年月立芝日 1 0 0 大连理工大学博士学位论文 引言 基因治疗作为一种革命性的治疗手段，其有效性已得到验证。而基因疗法若要大规 模进入临床治疗，还要做很多基础性的研究。其中高效、低毒、具有靶向性的基因载体 ( g e n ev e c t o r ) 的研究是基因治疗基础研究进一步深入的关键。目前大量应用的病毒类 载体的缺陷是免疫原性高、容量小、制备困难、成本较高。为了克服这些缺点，出现了 非病毒类基因载体( n o n v i r a lg e n ev e c t o r ) 。 非病毒的基因转运手段主要包括裸d n a 法，多聚阳离子d n a 复合物( p o l y p l e x ) 法及脂质体d n a 复合物( l i p o p l e x ) 法。裸d n a 法基因表达持续时间短，多用于局部基 因治疗；多聚阳离子在生理p h 值下带有正电荷，能够与d n a 分子中的磷酸基结合形 成络合物，并有效将链状d n a 压缩成球状，以利于复合物穿透细胞膜。但多聚阳离子 的高电荷密度又会产生很高的细胞毒性( c y t o t o x i c i t y ) 。 脂质体是一种表面活性剂自组装钵，它是由双疏水尾链单极性头基表面活性剂在水 相中自组装而成的一种双层膜包覆微水相的结构。自b a n g h a m 在1 9 6 5 年首次通过电子 显微镜发现这种结构以来，在生命科学领域，它先后被用于细胞膜的模型研究，药物控 释载体，基因治疗的载体等。 脂质体作为药物控释的载体的研究已有三十余年。而将其作为基因载体的研究始于 1 9 8 7 年，由f e i g n e r 首次将脂质体用于转运d n a 。脂质体介导d n a 转运主要是通过细 胞内吞作用( e n d o c y t o s i s ) 实现的。早期研究的天然磷脂形成的脂质体虽具有生物可降 解性与生物相容性，但要对其进行调控改性以实现不同的功能则比较困难。并且由于其 为阴离子或两性表面活性剂，与核酸结合能力较弱。于是，人们合成了大量阳离子类脂 用于脂质体d n a 复合物的研究。阳离子脂质体也是通过静电作用与d n a 分子形成复 合物，但由于其所带的电荷数较少，因此细胞毒性要小于多聚阳离子。此外，合成阳离 子脂质体物理化学性质的可控，即可以用有机合成化学的手段，以分子设计的思想为指 导，构建功能性分子自组装体。 本论文设计合成2 个系列的阳离子类脂，制备脂质体d n a 复合物，进行生物学转 染实验，提出可能的类脂分子结构一转染效率的关系规律，并筛选出若干个有应用前景 的阳离子脂质体基因载体。该研究可为有目的地筛选出有应用价值的阳离子类脂和开发 出有应用前景的基因运载工具材料提供实验及理论基础。 支栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 第一章文献综述 1 1 基因治疗概述 随着生物化学与分子生物学理论的不断发展，人们对核酸功能的认识不断加深，同 时也对各种疾病的分子机理有了迸一步认识。在已知的人类疾病中有数千种疾病是基因 相关的，其中包括与单基因相关的先天性遗传疾病与多基因相关的后天疾病。大部分后 天疾病是各种内外因素作用于人体的遗传物质使其功能发生紊乱而造成的。导致疾病的 原因主要是基因缺陷与基因缺失。基因治疗的原理即是把适当的外源基因引入人体细胞 内，以弥补缺陷或缺失的基因，表达出相应的蛋白质，从根本上消除产生疾病症状的内 在因素。 基因治疗作为一种新的、具有革命性的治疗手段，它的有效性已得到临床验证【l 训。 基因治疗与传统疗法相比较具有无可争议的优越性，它修正了疾病产生的最根本原因， 可以选择性的治疗患病的细胞或组织即细胞或组织的自修复，且疗效具有长期性。目前 全世界各地尤其是美国、欧洲等发达国家有很多科研小组进行此领域的研究，是当今化 学和生命科学领域的研究热点之一【5 j 。 但是基因治疗并未因此而迅速推广开来。基因治疗要想取得实质性突破，必须解 决三个关键问题：( 1 ) 高效、具靶向性的基因导入系统( 2 ) 外源基因表达的调控( 3 ) 开发更多、更有效的治疗基因，其中，基因导入系统的开发是制约基因治疗发展的瓶 颈，它的开发必将推动基因治疗向常规治疗方法转变 6 1 。 1 1 1 基因载体概览 将外源基因直接引入细胞中，d n a 会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞、甚 至未达到靶器官便被降解成小分子核苷酸，从而失去治疗作用。基因载体的作用之一就 是通过与外源d n a 相结合，对其在体内运输的过程中起到保护其免受核酸酶的降解作 用。此外，基因载体还能协助d n a 穿透细胞壁，并与外源d n a 一起进入细胞。 目前已用于临床的基因载体可大致分为两类，即病毒载体和非病毒载体【7 1 。 1 1 1 1 病毒载体 病毒已进化了上亿年，它们有着自己的一套侵染细胞的策略。将病毒用作基因治疗 的载体，正是应用了这一策略，去除了病毒的致病部分，将治疗基因包装进入病毒载体 内，以求进入细胞并表达出相应的蛋白质。病毒载体中应用较多的是腺病毒、逆转录病 毒等。而病毒载体也存在着安全问题。病毒载体具有很高的免疫原性，人类自身的免疫 系统会识别出病毒，并产生大量抗体从而使病毒与所携带的d n a 被免疫系统吞噬并降 解。此外，病毒载体还具有操作复杂，成本高，容量小的缺点。这使得非病毒载体的开 2 大连理工大学博士学位论文 发成为必然【4 j 。 1 1 1 2 非病毒载体 非病毒载体的本质是将基因治疗中的治疗基因看作药物，从药剂和药理学角度考虑 如何把基因导入靶细胞、组织、或器官，并进行表达。目前所应用的非病毒基因导入方 法主要有裸d n a 法，脂质体d n a 复合物，多聚阳离子d n a 复合物及一些物理方法。 其中，裸d n a 法基因表达持续时间短，只能在局部应用。多聚阳离子可以有效的压缩 d n a ，使之成为小的微球体，以利于透过细胞膜的转运，所以转染效率比脂质体要高， 但是正电荷的密度过高却对细胞有很大的毒性。脂质体作为一种体内药物传递系统，已 经在靶向性，抵御调理作用方面取得了很大成功。脂质体用于基因导入则始于2 0 世纪 8 0 年代后期。这里提到的脂质体主要是阳离子脂质体。它的作用原理是阳离子脂质体与 d n a 通过静电相互作用形成脂质体d n a 复合物( 1 i p o p l e x ) 。由于化学合成的脂质体具 有物理化学性质的可控性，所以很有希望投入到临床应用中。脂质体作为药物载体的发 展过程中所积累的经验，也可以在研究基因载体的过程中借鉴。脂质体在所有已应用于 临床试验的方法中仅次于病毒载体居第二位，以下详细介绍脂质体。 1 2 脂质体概述 脂质体( l i p o s o m e ) 又称为囊泡( v e s i c l e ) ，是类脂分子在水相中的自组装体。它 含有一个或多个类脂双层膜( b i l a y e r ) ，在每个双层膜结构中，类脂分子中的疏水部分 通过疏水相互作用结合在一起，极性亲水部分指向环境中的水相。单层的脂质体示意图 如f i 9 1 1 所示： f i g1 1s t r u c t u r eo fl i p o s o m e - 脂质体最初是由英国学者b a n g h a m l 8 】将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。由 于脂质体具有与细胞膜相似的结构，因此早期的脂质体多用于细胞膜的结构与功能的研 究。g r e g o r i a d i s 等于1 9 7 1 年首次将脂质体用于生物活性物质的的转运【9 j 。 用于制备脂质体的类脂分子包括天然类脂及合成类脂。天然类脂中应用较多的是天 然磷脂，如卵磷脂，脑磷脂等；合成类脂主要是用于基因转移的类脂分子如d o t m a ， d o p e ，d m r i e 等，其结构如f i g1 2 和f i g1 3 所示： 3 刘栋是：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 叶、旷一 j r 为油酰基 f i g1 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f n a t u r a lp h o s p h o l i p i dp e 早“2 。c h 2 t 四2 ) 7 c 啪h ( c h 2 ) c 屿 ( ；h o c h z ( c h = t c h = c h ( c h = ) t c h c h 2 n ( c h 3 ) 3 d o t m a 1 2 c h 3 t 2 c h 3 c h 2 n ( c h a b c h 2 c h 2 0 h d m 砒e 臣h z o c h z ( c h z ) 三( c h 3 ) z 谪c h 意i i 曲 弗地 ( 2 ) 2 n i c or v 、几， 占心矗( c h 出c 也c 屿商m 。 b d m 砌 d o c l - m ；f i g1 3s y n t h e t i cl i p i d sf o r g e n et r a n s f e r 由天然卵磷脂与合成类脂的分子结构可以看出，类脂分子中除了d c c h o l 以外，分 子结构有一个共同的特点，印都是由两条疏水尾链与一个亲水的极性头部构成的。大部 分类脂是通过甘油骨架的连接部分通过酯键、酰胺键、醚键等将亲水部分与疏水部分连 接起来的。分子结构中的疏水尾链会影响所形成脂质体的稳定性与滚动性。丽阳离子头 部的电荷特性则会影响到所形成脂质体的表面特性，因此，亲疏水平衡对脂质体的物理 4 麓 肛+cc， 一吼鬻 。 大连理工大学博士学位论文 化学性质至关重要。 脂质体是超微型球状体。按结构和粒径主要分为：1 单室脂质体：球径约_ ”弋p “v o h 0 “ c 以环氧氯丙烷为起始原料的合成路线8 9 】： 。，型坐。v 入叫3 o f 。 o f 。c 叱 h h 4 d 以氯丙二醇为起始原料的合成路线 h a r “一”1 分析以上几条合成路线，a 的合成路线要用到溴素进行加成，毒性、成本均较大， 不是一条很好的合成路线，故不采用。路线b 相对较长，总收率必然较低，这条路线也 不是一条好的路线。c 和d 实际上是一条路线，只是起始原料不同，c 中的环氧氯丙烷 经水解后得到氯丙二醇后下面的反应即是d ，考虑到每增加一步反应收率必然会受到影 响，并且路线d 的起始原料已有大批量生产，可以购买，故确定采用路线d 来制各卜 二甲氨基一2 ，3 一丙二醇。 为了提高反应收率，参照文献【9 5 】的合成条件，做了一组反应条件正交试验【9 6 】，选取 的四个考察因素为反应温度、反应时间、物料配比及= 甲胺水溶液的浓度，赋予每个因 素三个不同的值，如t a b l e2 1 所示。 t a b l e 2 1l 4 3 0 r t h o g o n a t e s t o f r e a c t i o n c o n d i t i o n 段 个 寺 一 刘栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 以反应温度为例，这个因素中3 个不同数值3 0 。c ，4 0 。c 和5 0 c 下的收率之和分别为 1 1 0 5 ，9 9 1 9 ， 2 7 2 3 和2 8 0 4 ，最大值1 2 7 2 3 为在3 0 。c 下反应获得的值，说明3 0 是最佳 反应温度。其它几个因素的最佳值可以同样的方法确定。 通过正交试验，获得一组较好的反应条件，即二甲胺浓度3 3 ，氯丙二醇与二甲胺 的配比为1 ：1 3 ，反应温度为3 0 ，反应时间为2 4 d 时。在此反应条件下，粗产品收率 与文献报道接近，提纯后产品的收率可将近6 0 。 3 中间体对甲基苯磺酸酯的合成【9 7 】 q c q 一。 r = c t 2 h 2 s + h c ! c 1 4 u 2 9 c 1 6 h 3 3 c l s h 3 7 该中间体的合成方法相对成熟，但由于生成的产品熔点大多较低，所以各步操作均 应在冷冻条件下进行。 4 n ，i 卜二甲基一双烷氧基丙胺的3 明 帕1 r + c 埠一一八r 毽 6 o r c ts h 3 7 此步反应的实质是o 烷基化反应，采用对甲基苯磺酸酯作为o 烷基化试剂也较容易 进行反应，此步反应的难点在于分离提纯，需采用柱层折的方法。以前有入在采用硅胶 柱层析分离类似产物时，所用的洗提液是乙醚石油醚2 ；1 【3 9 1 。笔者开始也是采用此种 洗提液，但乙醚的沸点很低，容易挥发而改变洗提液配比，另外乙醚的毒性较大，是一 种神经麻醉剂，所以尝试着将洗提液改为乙酸乙酯石油醚。通过薄层层析寻找最佳溶 大连理工大学博士学位论文 剂配比条件时，由于目标产物在紫外灯下不显色，所以采用碘薰的方法进行鉴定。在石 油醚k , 酸乙酯2 ：1 作为展开剂时，待分离产物薄层层析后有三个点，刮板经质谱鉴定前 两点分别为原料对甲基苯磺酸酯( r f 约0 8 ) ，目标产物( r f 约0 4 ) ，目标产物后还有一 点( r f 约0 2 ) ，经质谱鉴定其分子量应为单尾产物： 一p + n 卜一一时一+ 一p r 目标产物 单尾产物 由于单尾产物含有强极性基团o h ，所以在薄层层析中的移动速度比目标产物慢。 按照薄层层析找到的洗提液条件进行柱层析分离时，由于不同组分在分离过程中没有明 显颜色，并且在紫外照射下也不显色，很难根据颜色分辨收集产品，所以只能定时收集 洗提液，用薄层层析监控，将相同的成分收集在一起，然后旋转蒸发掉溶剂即得产品。 5 目标分子的制备1 3 9 j ”1 r 2 一r 0 八r 蚶 t e r r r - c i 扎h x - c i 2 k i k r 2 t ：r l = m e ，r l m ，x i _ 2 t g l = m i ，r = c l 热，x w i k r f e lr l k - c i 2 nr 1 q lr i x 。 z # r 】= e t r i x j _ l k r ，- e lr _ c 幽，x w i 2 br l - m ，r i n r 4r l m r - c l 如r 4 2 1 = r 1 日慨r = c i h x ：r ：r l r l _ ，r i r 2 摧玛= 豇r - c l 池r i r 2 er l q r , - c l 临x q z ；r 1 - l ：t , r c i 弛，n r l r i = l g t r c i l x l r 在采用季铵化法制备目标分子时，由于通过柱层析方法得到的阳离子类脂前体的量 很少，故在反应中采用的是使卤代烃过量的方式，使阳离子类脂前体完全转化为阳离子 季铵盐。由于所用到的卤代烃毒性很大，所以在操作时应注意通风，每步操作都应在通 风厨中进行。 6 中间体及产品的表征 所有中间体及产品的物理参数及归属见本章附录，表征谱图见论文附录，从归属分 析可知所得化合物为目标化合物，结构正确。 2 2 2 实验部分 2 2 2 1 仪器( 下同) 化合物的红外数据在t h e r m on i c o l e tn e x u s 智能型中，远红外气相色谱一傅立叶变 换红外光谱联用仪上测定，采用k b r 压片法。 化合物的n m r 数据在v a r i a ni n o v a4 0 0 一m h z 型核磁共振仪上测定，溶剂为 c d c l s ，t m s 为内标。 化合物的质谱数据在h p 6 8 9 0 - h p 5 9 7 3 气。质联用仪或h p l1 0 0 电喷雾离子化质谱仪上 测定，高分辨质谱在l c q t o f 质谱仪上测定。 刘栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 2 2 2 2 试剂 卜氯一2 ，3 一丙二醇，3 3 二甲胺水溶液，正+ 二醇、正十四醇、正十六醇、正十八 醇，对甲基苯磺酰氯，吡啶，碘甲烷、碘乙烷、氯甲烷、氯乙烷为分析纯，直接使用。 t l c 薄板自制，硅胶购自于青岛海洋化工厂。 柱层析用硅胶购自青岛美高硅胶厂。 所有溶剂为分析纯，直接使用。 催化剂叔丁醇钾先为自制，后购买分析纯试剂。制法如下： 在单口瓶中加入叔丁醇，常温搅拌，瓶口用干燥管保护。将金属钾在甲苯或石油醚 中保护，用干燥的镊子和手术刀小心将金属钾切成小块，逐个加入到叔丁醇中，搅拌。 待钾全部溶解后将叔丁醇蒸出。得到略带黄色的固体装入瓶中，用于下一步反应。 2 2 2 3 化合物的合成 ( 1 ) 卜二甲氨基一2 ，3 一丙二醇的合成 般操作步骤： 在2 5 0 m l 的- - - d 瓶中加入7 0 9 9 ( 0 5 2 m o i ) 3 3 二甲胺水溶液，搅拌。称取6 9 氢氧化钠配 置成4 0 的水溶液，待降至室温，加入到三口瓶中，称取4 4 9 ( o 4 t 0 0 1 ) l 一氯一2 ，3 一丙 二醇倒入滴液漏斗中，缓慢滴加入三口瓶中，控制滴加速度1 - 2 滴秒。滴加完毕后，开 始加热计时，3 0 c 下反应2 4 h 。反应完成后，安装蒸馏装置，并逐渐升温至1 0 5 蒸出 过最的二甲胺，蒸馏完毕除去蒸馏装置，将三口瓶敞口加热搅拌，直至逸出气体没有胺 味为止。减压除水。完毕后，减压蒸馏收集1 0 2 1 0 4 c 2 m m h g 的馏分。收率6 0 。 ( 2 ) 对甲基苯磺酸十二酯、对甲基苯磺酸十四酯、对甲基苯磺酸十六酯、对甲基苯 磺酸十八酯的合成 一般操作步骤： 在2 5 0 m l 三口瓶中加入脂肪醇1 2 4 9 m m o l 和3 9 5 9 毗啶，将烧瓶浸在冰水浴中充分 冷却使混和物的温度降到0 c 。在此温度下于2 0 3 0 r a i n 内把2 6 2 5 9 ( 1 3 8 1 m m 0 1 ) 对甲基 苯磺酰氯分批加入瓶中，或调节加料速度使过程中的温度始终不超过2 0 。c 。混和物在 2 0 * ( 2 以下继续搅拌1 2 小时后，用1 0 0 m l 盐酸( 比重1 1 9 ) 和3 0 0 m l 冰水配成的溶液稀释。 结晶出的酯用冰冻过的布氏漏斗过滤并且尽可能吸干。将固体转移到5 0 0 m l 烧杯中，加 1 0 0 m l 甲醇，然后在水浴中加热混和物直至酯熔化。再在不断搅拌下使其在冰水浴中冷 却，酯成很细的沉淀析出。用冰冻过的漏斗过滤，并置于空气中干燥( 温度最好低于2 0 ) 。将粗品用石油醚( 3 0 - 6 0 4 c ) 重结晶，溶液冷却到0 。c ，得到的酯用冰冻过的漏斗 过滤得到产物。收率7 0 8 0 。 ( 3 ) n ，n - 二甲基一双十二烷氧基丙胺、n ，n - - - 甲基一双十四烷氧基丙胺、n ，n 一二 甲基一双十六烷氧基丙胺、n ，n 一二甲基一双十八烷氧基丙胺的合成 2 4 大连理工大学博士学位论文 一般操作步骤： 向瓶口安装有回流冷凝管及三通充排气阀门的1 0 0 m l 单口烧瓶中加入= 甲氨基丙 二醇2 4 9 ，2 0 m m o l ；对甲基苯磺酸酯6 0 m m o h 叔丁醇钾6 7 2 9 ，溶剂二甲苯，用水泵 抽真空，然后充入氮气，加热至1 4 0 。c 回流反应3 小时，冷却后水洗分液，有机相用无 水n a 2 s 0 4 干燥后减压蒸馏除去溶剂。浓缩物采用硅胶柱层析，用石油醚7 , 酸乙酯( 2 ：1 ) 为洗脱剂得到产物。收率2 0 。 ( 4 ) 目标分子的合成 一般操作步骤： 分别在高压釜中加入适当的n ，n - 二甲基双烷氧基丙胺及6 0 当量配比的适当卤代烷 ( 氯甲烷、氯乙烷、碘甲烷、碘乙烷) 。高压釜在7 0 0 c 反应4 8h 。反应完成后将高压釜冷 却到o o c ，在通风厨中打开釜盖，让多余的卤代烃挥发干净( 对氯甲烷及氯乙烷) 。或向 高压釜中加入3 0 m l 石油醚后过滤( 对碘甲烷、碘乙烷) 得到粗产品。粗产品在石油醚 或乙腈中重结晶即得目标产物。收率9 5 。 2 3 双氨基甲酸酯键连接的基因载体阳离子类脂的合成 2 3 ，1 结果与讨论 1 合成路线的设计 分析前面f i g , 2 4 中所设计的双氨基甲酸酯键连接的阳离子类脂的结构，本论文曾 试探着设计双氨基甲酸酯键连接的阳离子类脂基因载体的合成路线如下所示： 一个- 一一佻 6 h 6 h r n h 2 + r n c 一。+ h 臁 r 一n = = c = = o h 仃r o 4 r i c i 一 c h 3 7 r - c 1 2 j c l | h 3 7 人 宴拣良：基因载体阳离子类腊设计合成及生物性能研究 按照上述所设计的合成路线用m s 检测到了中性类脂4 的存在，而且可以通过小心 调节洗提剂的配比用柱层析的方法得到目标产物，说明该合成路线可行。关于阳离子类 脂3 ，按照原设计路线无法得到目标产物，分析其原因，可能是氯丙二醇与三甲胺反应 成盐后在有机溶剂中的溶解性过小，影响其与异氰酸酯进行反应时的传质若将反应溶 剂改为水，则异氰酸酯的溶解性又会大大减弱，同样会影响反应的传质。 另外就算按照以上路线生成了目标阳离子类脂这种盐。则想要将其与原料另一种盐 二羟基氯化丙铵分开也极其困难，若采用柱层析则两种盐的移动速度都很慢，若采用重 结晶的方法，两种盐的量又可能大致相当，很难将其分离提纯。 注意到阳离子类脂3 与中性类脂4 的关系，结合前面2 2 中成功合成出双醚键连接 的基因载体阳离子类腊的经验，本论文考虑是否可将其二者看作是阳离子类脂前体与阳 离子类脂的关系，最终通过采用卤代烃季铵化的方法从中性类脂4 使其转化为阳离子类 脂3 。如果这样的思路可行，那必然要求在合成出中性类脂4 的一步实现产品的分离提 纯，这样当中性类脂4 纯品与卤代烃进行反应时，可通过控制卤代烃过量而使中性类脂 4 完全转化为阳离子类脂3 ，而除去过量的卤代烃相对容易，这样可充分保证得到阳离 子类脂3 的提纯工作容易进行。 基于以上考虑，重新设计氨基甲酸酯连接键阳离子类脂的合成路线如下； ”1 0 一r h 八r + 。一一。一 、，气一、。 l k 丫一牝* 0 rnco 8 撬 鼎： l - r - c j j l b - h l 如 h l 强， - 4 r i b - qw i r 4 按照上述合成路线，涉及中间体卜二甲氨基一2 ，3 - 丙二醇及长碳链异氰酸酯的合成。中 间体卜二甲氨基一2 ，3 - 丙二醇的合成已在2 2 1 中论及，这里讨论长碳链异氰酸酯的合 成。 2 长碳链异氰酸酯的合成 大连理工大学博士学位论文 根据文献记载异氰酸酯的合成一般可以通过如下方法制得 9 8 9 9 1 ： a 交换反应 异氰酸酯的烷基能与二烷基脲的烷基交换，转变成另一种异氰酸酯。 2r i n c o _ r 1 n h c n h r s + 2r 忙c 2 0 r n c s a r n c o r n c o + a r n c s 若采用该方法须有现成的另一种异氰酸酯，故不适合本论文制备。 b 分解反应 由脲制备异氰酸酯，由磷酰胺负离子分解制异氰酸酯。 【( c 2 h s o ) 2 p ( o ) n c 6 h 1 1 + c 呸 ( c 2 h s o ) 2 p ( o ) t l 。，- 卜 【( c 2 h s o ) 2 p ( o ) o + c 6 hi1 n = c = = = o 此方法更适合制备芳香族异氰酸酯，并且由于原料的不易得而未采用。 c 重排、氧化、分解等反应 烷基碳酰氯与叠氮化钠反应，生成酰基叠氮，酰基叠氮在转化成烷基异氰酸酯，同 时放出氮气。 r c o c l + n a n 3 - - lr c o n a 6 0 7 0 rnco+n 2 t 酰基叠氮化物重排法在实验室合成中具有一定的意义，但是由于叠氮化物是一种易 爆炸的物质，本论文未采用这种方法。 d 缩合反应 胺与光气反应： r 一呲+ c l 八c i 一n c 一。 工业上生产正烷基异氰酸酯通常采用此类方法，工艺条件也比较成熟，其反应过程 2 7 rho i 叫h州 或 刘栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 如下所示： o i i n c 18 h 3 7 n h d c l 1 3 0 8 0 p h c i o | | n c 1 8 也7 n h 如i + h c l n c 1 。h 3 7 n c o +hci 但上述反应过程须使用光气，众所周知，由于光气是剧毒性气体，在使用、运输和 贮存过程中存在极大的危险性。 胺与固体光气 二( 三氯甲基) 碳酸酯，b t c 反应i i o o ! ： 一分子的b t c 可在碱的催化下，分解释放出3 分子的光气，这样操作起来相对容 易控制，克服了光气的缺点。故本论文采用固体光气法来制备长碳链异氰酸酯。固体光 气的应用原理如下： 人矧。一人嘁+ 。，叉。+ c - r n h 2 十 r n = c = o r - , c c ：怒 c c l ，6 i h 3 1 - 1 3 ； 以十八胺的反应为例，最初在采用b t c 制备异氰酸酯时，把b t c 完全看作是3 摩 尔的光气，采用了和工业上光气法制备异氰酸酯完全相同的条件，将催化剂毗啶和十八 胺的氯苯溶液加入到b t c 的氯苯溶液中，在8 0 * ( 2 反应3 小时，1 3 04 c 反应l 小时。反应 完成以后，发现有大量的原料十八胺未参与反应。 推测可能是加入的催化剂导致b t c 放出光气的速度过快，使大部分光气未能参与反 。= 人 _ 人 。= 大连理工大学博士学位论文 应就从反应体系逸出。 改进方法是改变加料顺序，将b t c 的氯苯溶液徐徐滴加入混有催化剂吡啶的十八胺 氯苯溶液中，先将理论量的固体光气滴加完毕，之后提高反应体系温度至8 0 ，另外的 一半固体光气长时间缓慢滴加，以保持反应装置内的光气气氛。这样操作虽然能够最终 得到了异氰酸酯产品，但在这种加热条件下进行反应，生成光气仍容易泄露，如果b t c 的滴加速度过快同样会使得生成的光气逃逸出反应体系而没有机会参加反应，使原料十 八胺反应不完全。 b t c 虽然可以在碱催化下释放出光气，但b t c 也有它本身的性质特点，不能简单的 认为它是3 摩尔光气简单的结合。为了控制光气释放速度，改用脂肪胺的c h 2 c 1 2 溶液与 n a c 0 3 饱和水溶液常温下剧烈搅拌，b t c 的c h 2 c 1 2 溶液滴加或直接将固体的b t c 逐批加 入反应体系。反应后经过分液、干燥、和去除溶剂后即可得目标产物【1 0 ”。 3 阳离子类脂前体4 的合成 。l 一一一哗p l r c 1 2 h z ， 4 b r c 4 1 2 9 4 1 r i 汕， “r | c i i h 以十二碳长的反应为例，由于异氰酸酯与活泼羟基的反应很容易进行，所以最初进 行反应的时候直接在室温下进行搅拌，并且用三乙胺作为催化剂及溶剂。经反应1 5h ， 过滤及后处理，对所得产品进行表征，发现i r 谱图中出现3 3 0 0 的州h 峰，说明发生了反 应，但其m s 分子量却为3 9 6 ，与双十二烷基脲的分子量相符，而并不是所期望的5 4 1 。 基于以上数据，推测在强极性溶剂三乙胺中，可能会存在微量水份，而在有机强碱三乙 胺存在的情况下，使得异氰酸酯发生水解生成脂肪胺，进而与剩下的异氰酸酯反应而生 成双十二烷基脲： o r t - c 。：h ：沁詈n c 。2 h z ，n 如晋眦t ；h 2 5 n i - 1 2 + h 2 。+ c 0 2 。 。 e t 3 n ln cl 2 h 2 e n c o m r “2 + 一一。一v f w 3 9 6 刘栋良：基因载体阳离子类脂设计合成及生物性能研究 产品的1 hn m r 表征谱图证实了所做的推测，如f i g2 7 所示： f i g2 71 h - n m ro f d i l a u r y li f l e a f i g2 7 中各峰归属如下：( c d c l s ) 64 3 6 ( s ，2 h ，2 x n h ) ，3 1 4 ( t ，j = 6 4 ，4 h , 2 n c h 2 ) ， 1 4 8 ( s ，4 h ，2 x n c h 2 c h 2 ) ，1 2 6 ( s ，3 6 h2 ( c h 2 ) 9 ) ，o 8 8 ( t ，j = 6 2 ，6 h ，2 c h 3 ) 基于以上分析，为获得无水环境，参考文献1 0 2 1 将溶剂换为甲苯，催化剂三乙胺的 用量也减少为3 4 m r ，在6 0 - 7 0 。c 反应4h 。 反应完成后经过浓缩，仍旧采用硅胶柱层析进行分离，通过薄层层析最终确定采用 氯仿，甲醇( 4 ：1 ，v o l v 0 1 ) 作为洗提液。 与前面双醚型叔胺的分离情况相似，2 2 1 ，通过薄层层析寻找最佳溶剂配比条件 时，由于目标产物在紫外灯下不显色，所以采用碘薰的方法进行鉴定。以氯仿甲醇( 4 ：1 ， v o l v 0 1 ) 作为展开剂时，待分离产物薄层层析后有三个点，刮板经质谱鉴定前两点分别为 原料对异氰酸酯( r f 约0 9 ) ，目标产物( r f 约0 7 ) ，目标产物后还有一点( 对约0 2 ) ，经 质谱鉴定分子量应为单尾产物： h a r ( 一一。业 一a 审( + 人t o fi m m u n n t o x i n ，j c o n t r o lr e l e a s e ， 2 0 0 1 ，7 6 ，2 8 5 - 2 9 5 【2 6 】k o n i n g , ga ，k a m p s ，j a a m 。ds c h e r p h o f , g ，l ，e f f i c i e n ti n t r a c e n u l a rd e l i v e r yo f 5 - f l u o r o d e o x y u r i d i n ei n t oc o l o nc a n c e rc e l l sb yt a r g e t e di m m u n o l i p o s o m e s ，c a n c e rd e t e c tp r e y ，2 0 0 2 ，2 6 ， 2 9 9 3 0 7 2 7 】k a z u o ，m ，n o b u y a t ，t o s h i a k i ，t - ，e ta 1 ，l m m u n o l i p o s o m e sb e a r i n gp o l y e t h y l e n e g l y c o l - c o u p l e d f a b f r a g m e n ts h o wp r o l o n g e dc i r c u l a t i o nt i m ea n dh i g he x t r a v a s a t i o ni n t ot a r g e t e ds o l i di r m o l si nr i v e ， f e b sl a t t ，1 9 9 7 ，4 1 3 ，1 7 7 - 1 8 0 2 8 】m a t s u o , h ，w a k a s u g i ，m ，t a k a n a g a , h ，e t a lp o s s i b i l i t yo f t h er e v e r s a lo f m u l t i d r u gr e s i s t a n c ea n d t h ea v o i d a n c eo fs i d ee f f e c t s b yl i p o s o m e sm o d i f i e d w i t hm r k - 1 6 ，am o n o e l o n a la n t i b o d yt o p g l y c o p r o t e i n ，j c o n t r o lr e l e a s e ，2 0 0 1 ，7 7 ，7 7 8 6 【2 9 】m e r c a d a l ，m ，d o m i n g o ，j c ，p e t r i z , j ，e ta 1 ，p r e p a r a t i o no f i m m u n o l i p o s o m e sb e a r i n gp o l y ( e t h y l e n e g l y e 0 1 ) - 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