（林产化学加工工程专业论文）金针菇产漆酶发酵条件研究.pdf

摘要 零文研究在摇籁中不简发酵条件辩金错菇( f t a m m u l i n av e l u t i p e s ) 漆簿合藏靛影确。 结莱显示，鸯祝羝源较无梳氮源效莱好。用爱裔蒜或酵母浸膏为氮涿的培养藿第8 天静漆 薅懿活公别达到毒5 。7i u m l ，5 3 0i u h n l 。塞氮条馋浓嶷为2 , 0 9 l 豹酵母浸聋、酸裴铵 或蛋叁骤) 有稠予衾铮菇滚酶戆会戏。酶低氮滚发到1 2 9 趣，蚕嚣瓣三秘壤葵基漆赫酶蟋 仅礴原来的2 5 ，8 ，2 5 。4 鄹7 6 3 。不同碳源对金钟菇漆酶诱导的效果是不网的。用 豆汁为碳源所产的漆酶酶活在第1 0 天然到6 2i u m l ，在用淀粉为单独碳源漆酶酶活最火 达到4 2 。1i u m l 。葡萄糖诃提高金针蘸前期漆酶的分泌。加入葡灏糖的培养基第4 天为 5 5 5 阿，狂正，魄不加时提离1 0 8 。富碳祭件有嗣予众钟菇漆酶的合成，第8 天角2 0 9 l 豹淀粉为碳源较7 9 l 和1 2 9 l 的淀粉盒钎菇漆酶酶潘稳离4 倍和2 倍。菌丝滏仡期对金 钱懿漆酶戆会戏澎稳缀大，会逶戆蘩丝溪熊翔踺短期漆懿分泌有利。滔纯4 天熟耱子滚酶 酶溪最凑，菊8 天漆懿黪溪燕2 天秘6 天熬转子壤葬瓣3 接露1 s 售。彀群次数影螭最终 的漆酶酶活霉b 实验的平霉亍性。减少取样次数不同壤莽基第l o 天漆酶黪疆提藏2 8 手鞋8 5 。 同时从4 组平行对比，减少取样次数的平行性较好。通过改变摇床摇速已提高培养熬溶躺 氧程金针菇的漆酶合威中作用不大，但通过改善焱针懿液体培舞基的外部环境熊缀好的提 离焱钎菇漆酶静分泌。通邋改善培养基的外部环境可有效豹提高金针菇培养萋中溶畿获筒 提商漆酶静分泌，爝不同碳氮深的三种培养基在金钟菇滚酶合成串分稍是不改变下躺2 4 嵇，6 傻秘3 6 揍。实验孛煺调节p n 到5 5 - 6 5 骞裂予滚酶熬合成，遐过调麓鲢l ，用蘩 鑫膝必氮瀛鹣墙葵基第l o 天滚酶酶淫必1 4 4 。4 l u 勉l ，楚一般发黪貔3 8 蘩。敬援酵母凝 汁为氮源的培养基在第1 2 天购漆酶黪洒为1 3 4 ，6 h 玎如l ，是一般发黪的2 7 倍。 关键诿；佥针菇；漆瓣 瓣耩发酵；发黪祭箨 p r o d u c t i o no ft h el a c e a s eb yf l a m m u l i n a v e l u t i p e sw a si n v e s t i g a t e du n d e rf l a s kc u l t u r e d i f f e r e n tf e r m e n t a t i v e c o n d i t i o n sw e r ec o m p a r e dt oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n e eo nl a e e a s e s e c r e t e db yf l a m m u l i n a v e l u t i p e s o r g a n i cn i t r o g e n i sb e t t e rt h a nm o r g e n i c n i t r o g e n f o rl a e c a s e s e c r e t e db yf l a m m u l i n av e l u t i p e s , a n du s i n gp e p t o n eo ry e s 瞄t r e la sn i t r o g e ns o u r c ei nt h e c u i t u ma f t e re i g h td a y sf e r m e n t a t i o nt h el a e e a s ea c t i v i t ya r r i v e d4 5 。7 鄹抽毛a n d5 3 0 翻抽l r e s p e c t i v e l y 毯o hn i t r o g e n i sb e t t e rt o o + d i f f e r e n tc 2 婚。琏s o u r c ei nt h ee u i t u r eh a v e d i f f e r e n t l y i n d u c e dt h el a c c a s ea c t i v i t y ：u s i n gp o t a t oj u i c e 勰c a r b o n 姻醢辩t h eh i g h e s ta m o u n to fl a c c a s e a c t i v i t y 6 2h j ，m lw a sf o u n di nt e nd a y s ；a n du s i n gs t a r c hi nt h ec u l t u r el a c e a s ea c t i v i t yw a s 鸵1i u m li nt e nd a y s a d d i t i o n a lg l u c o s ei nt h ec u l t u r ec o u l d p r o m o t el a c c a s ea c t i v i t yi nt h e p r o p h a s c ，t h er e s u l t ss h o w e d w i t hg l u c o s et h el a e c a s ea c t i v i t ya r r i v e d5 5 5i u m l ，w h i c hw 觞 o v e r2t i m e st h a ni tw i t h o u tg l u c o s e r i c hc a r b o ns o u r c ei sg o o df o rl a c c a s es e c r e t e db y f l a m m u l i n av e t u a p e 。a n du s i n gs t a r c h 鞲sc a r b o ns o u r c ei nt h ec u l t u r ea f t e r8d a y sf e r m e n t a t i o n l a c c a s ea c t i v i t yo f t h ec o n c e n t r a t i o no f 2 0 9 lw a s4t i m e sa n d2t i m e st h a nt h ec o n c e n t r a t i o no f 7 蛆a n d1 2 9 n 一，t h em y e e l i u m a g ei sv e r yi m p o r t a n tf o rl a c e a s es e c r e t e db yf t a m m u l i n a v e l u t i p e & a n dp r o p e ra g ec a np r o m o t et h ef l a m m u l i n av e l u e st o s e c r e t el a c e a s e 。t h e m y c e l i u m a g ei sf o u rd a y sc o m p a r e t os i xd a y sa n dt w od a y si n o c u l a t e di n t ot h ec u l t u r ea f t e r e i g h td a y st h el a c e a s ea c t i v i t yi so v e r a l l1 5 f o l da n d3f o l d m o r ef r e q u e n ts a m p l i n gc o u l d i n f l u e n c et h el a c e a s e a c t i v i t ya n d t h e e x p e r i m e n t a lp a r a l l e l ，a n dl a c c a s ea c t i v i t yi nd i f f e r e n t t w o c u l t u r e sr a i s e da b o u t2 8 a n d 8 5 a f t e r 氍缱蛙端d o w n t h ef r e q u e n c yo f s a m p l i n g i th a dl i t t l e e f f e c to nl a c c a s ea c t i v i t yt oc h a n g et h es h a k i n gr a t e ，c h a n g i n gt h eo u t s i d ea i ra r o u n d 妊l l c e s u b s t r a t e ，d i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d , a n dl 粼徽a e t i v i t y i n e r e a s e d2 4 ，6a n d 3 6t i m e sa c c o r d i n g l y i tw a s b e n e f i tf o rl a e e a s e a c t i v i t yt oc h a n g et h es u b s t r a t e sp h t o5 5 - - 6 5 a tt h em i d d l eo f f e r m e n t a t i o n a f t e r c h a n g i n g p hn u m b e r , t h eh i 曲e s t a m o n n to f l a c c a s ea c t i v i t y o f s u b s t r a t e u s i n gp e p t o n e a sn i t r o g e ns o t l i r 忿w a s1 4 4 4 i u m li nt e n d a y s ，w h i c h w a s3 8t i m e s t h a no r i g i n a lf e r m e n t a t i o n , a n dt h eh i g h e s ta m o u n to fl a c c a s ea c t i v i t yu s e d y e a s t r e la sn i t r o g e n s o u r c ea r r i v e d1 3 4 。6 l 班n l 。w h i c h 聪2 + 7t i m e st h a n o r i g i n a lf e r m e n t a t i o n 。 k e y w o r d s ：f l a m m u l i n a v e l u t i p e s ，l a e e a s e f l a s kf e r m e n t a t i o n ，f e r m e n t a t i v e c o n d i t i o n 致谢 本文是在导师余世袁教授悉心指导下完成的。余世袁教授慈祥而留学， 荸| 等着我在辩攀艟黢堂里修心、积慧、学遘。余壁袁教授严谨的治学态度使 我能够论文的每一个环节克勤克俭，一丝不苟；他自由的举术思想，使我们 有了畅快淋漓的辩论和交流，辩中求真、辩中魄璎。本文举仅凝结着条世袁 教授的殷殷教诲，还铯_ 合藩余世袁教授教我做科擘和做人醺嚣理，三年鹿葫， 受用终生。在研究的每一个环节，导师都倾注了大量的心血。在论文究成之 际，对导炳三年来的精心攘导争谆谆教诲表示最真挚蟪感谢。 徐勇老师在实验方法上给作者提了许多宝贵的意见。 几年来，作者在学习、生活上一赢得到生化教研组成荧鹋支持寿美怀， 巍沈我向勇强老师、宋向阳老师、敬阳老师、陈教老师表承衷心的感谢。 本论文的顺利完成还离不开作者祭人的支持和理解，在此表示感谢。 导师： 作者：饶庆隆 7 2 0 0 5 。5 巷誊言 环境绦护惑成为当髓函际关系、经贸合作中的一个极为羹攀的闯蹶，瞧目 蔻梦重魂影嫡麓我溺嚣民缝济豹鹫持续发矮。在我番过去魏十年髂经济发展 中，由予忽视了发展中的环境保护阀题，娶翦鄢壤状敬已经+ 分严峻。j 眨零寒 最采取了大擞控制措施，但环境质爨下降的趋势仍在继续。 造纸工娥是世界上六大污染工妲之一。我薅造纸行业冬捺放壤拳爨迭4 0 亿吨，占全豳工业废水排放量的i 6 。其中宵机污染物( 以b o d 计) 达1 7 0 万吨， 豹蠢全豳工照壤承中有梳浮染豹总蠡的1 4 。程霜植物原料进行化学翩浆与讫 学滋鑫避稳巾，含蠢大爨本震素、拳纾维索鞫蠢害物震嚣凌滚棱捺入浚河湖泊 巾，造成了严整鳇拜境涎染魏生态缓捧。多年来，入嬲不嬲蠛努力，试圈舞发 出光污染和黼效率的制浆造纸新工艺，以减少污染，保护环境。 造纸王她中麴剁浆鞠漂白王序懋污染躲产缀懿主要工廖。蓐化学法鞘魄， 掇然机械法制浆可以大大提高纸浆得举，节省犬鬣的林木资源。但是，磨朱浆 的能萤消耗狠犬，而且成品纸的强浚等质蠢性能不如硫酸虢浆，因而限制了这 瑗按寒熬发鼹。生携技本霹戳黎弦髂决这些润题，其孛最鬃穰孳l 力秘拣藏经酌 怒生勰剃浆姆生憋潆鑫。霞为造纸z 数疫农主簧耄蒸煮黑渡黢漂怠废渡缝残， 采用生物制浆与生物漂囱可以有效减少这些玻液的产生。利用微生物匈微生物 鹣类迸彳予生物制浆与生物漂白其有很大的伉势和潜力，因为微生物极易生长繁 皴，酶整纯艇残其毫褒发警一性，菠痰条箨溢黪，劳置离效秃污染。 木疆素是造纸王堑中脊效裁用纤维索酶障碍之一。在纯学制浆过稳中，虽 然大部分本疆豢霹簌零搴| 、摹类或其它耀豢料瓣纾维串除去，毽锯有3 1 2 的术质索残豳。传统的化学漂白法是多段氯- - 氧化熹c 漂白及碱提取来去除术质 索，在废水巾有大最食筑的、致癌致疃的秘质，妇唳哺、= 嚼英等，意嚣】会造 成严重韵环境污染和生淼破坏。 上世纪8 0 年代初，颈方国家工业污染控制战略出现了擞大变革，以污染预 耱凝代了污染治瑾。芬黧率先将生物预漂自技术弓i 入割制浆造纸工渡巾。阁术 袋糖酶对纸浆逡行鼗漂囱，霹叛减少戆螽静纯学潦囊麓妻l c 豢3 0 4 0 ，蔼藏褒 波中有机氯化镣与零性物禽爨显著减少。至今，瘸子生躲颈漂鑫戆零聚糖懿已 经历了三代发展，从第一代酸性酶，第二代中性酶，到第三代碱性酶。目前， 对第三代术聚糖酶的研究与应用正避入高蜂期，采用基因工程与蛋臼康工程手 歉获得毪质德懿酌瓣热辩虢本聚糖酶已成为备稳关实验室豹研究燕意，期骧不 久螅将米重缌黪会受骞效避应鼷予潆鑫芝艺。 鸯予本聚糖酶处毽王芝是逶逡降勰豫去纸浆褒嚣霉泼襁豹半纤维素等方 式采蘩助化学漯裁漂鑫，本聚赣酶必裁起到髓激熬髂矮，苓戆粪歪磐捉纯学瀑 剂。因此，生物预漂c a 并不能完全替代化学漂白，只能减少污染却不能最终消 除污染，因此簧扶根本上游除骞毒氯漯波的污染，最终实现生搀漂白，器器采 爰黧物手段除去纸浆串残黧的本质素。近年来，翻瘸各静本凝索酶逶霉亍羹物漂 白的研究正在遇速兴起，人们期望利用木质素酶对术质素的赢接作用来实现生 物漂白。许多实验室都在努力研究非术聚糖酶的漂白用酶，涉及的酶类包括木 震豢逑惑佬物酶、锰遘氧织物酶、漆鬻翻纾维二糖腿氢酶等。莛孛，漆酪成失 近肇来的研究熬点。 过去，般都认为漆黼的氧化还原电位太低，不能攻击构成木质索结构 9 0 璇上戆非黔本质素缝誊奄。毽遴入上墩纪9 0 年钱嚣，琴究发瑷当有起襞他还 原串介物作蠲的简单有机纯合物存在对，漆酶不仅麓氧纯菲酚结构，丙息能使 硫酸盐浆脱术质索和脱甲氧基。目前研究较多的中介物有l - 羟基苯并三唑 ( 1 壤y d r o x y b e n 8 0 t r i a z o l ，1 h ) 镣。佐治业大学的研究嚣发现一株漆酶产生菌朱红 密我薤f p y c n o p o r u sc i n n a b a 。r i n u s ) 霹瑷产生基邑戆裁建还蒙孛奔凌3 一羟基铝氨 基笨甲酸( 3 - h y d r o x y a n t h r a n i l i ca c i d ，3 - h a a ) 。漆酶翱3 - h a a 系统不仅能氧化菲 酚模式化合物，而且能降解合成的术威索。日本报道，利用滚酶进行生物漂白， 可以去捧5 0 6 0 的残余术质素，减少氯漂5 0 6 0 ，然而，离真正意义的生 貔漂白还毒一歉逛离。本震豢戆缝擒黪攀复杂，势嚣在纸浆孛本痿素与本聚耱 形成复合体紧密地附着在纤维上，难以除去，仅依赖于一种酶的作用远远举够。 利用木聚糖酶岛木质素酶两种酶的共同作用有塑究全降解纸浆中残留的本质 素，实现真正意义上的生物漂白。 许多微生物均可激产黛漆酶，鎏予囊瘸菌进其它微生戆靛夏快和更泛酶 解术质纤维素f 8 1 ；而且其所产漆酶为胞外酶，便予酶的分离和提纯；此外它还 可以同时产生降解木质素的其它几种酶，因此其有广阔的工业皮用前景。 金铮菇莛一耱豢燕豹食添鑫囊蘩之一，宅虿麸分泌较多静零震素降瓣酶， 因此可以利用它降解木质索。本文研究的主要内容包括：氮源和氮源浓度对金 针懿生产漆酶的影响；碳源和碳氮比对金针菇合成漆酶的影响；种龄、取样次 数对漆酶合成蛇影响；摇速、溶氧和p h 对金针菇产漆酶合成的影响。簿在提 离念赞菇会成潦酶蠡孽能力，舞荛金锌懿产漆酶豹逐续珞葬提供壤论菝摇。 2 第一章文献综述 一百多年蓠日本攀者吉匿蓄次在生漆孛发瑷漆酶，十冬嚣l a b o r d e 等证 燕真蓥也黯分泌漆酶。一百多年过去了，人们对漆酶送行了大量静研究，发现 漆酶是自然界广泛存在的，是多种槭物和大量麓类的分泌物。漆酶是科技界研 究时间最长的酶之一，涉及生物、化学、物理、医学、环境等多个学科领域。 濑手其对本震囊豹黪簇缝力，在期浆造纸、废物处理、嚣壤污染鐾静熙鳃等方 鞲具有较犬的研究价值帮应用潜力。在真菌中人们研究最多的是担子麓中的自 腐菌( w h i t e * r o tf u n g i ) 。本文就木质索的生物降解、漆酶和众针菇研究进展等方 馘进行了综念评论。【j 1 0 1 1 本矮素 在地球上，除苔藓和菌类外，一切植物都含有木质索。据估测，垒球每年 可产生约6 l o l 2 t 木质索，大量的本质素以造纸工业废水翱农作物废羚旗杆形 装存在h l 。疆究本矮素豹生秘洚黧怒嚣豢必要秘紧遥夔。蘩走本囊素怒一秘量 犬而又可再嫩的有机资源。再过几十年或稍长一点时间，前化资源枯竭了，木 脯素将成为肖机化合物( 特别是芳褥族化合物) 的主要来源之一。其次自然界 微生物降解术质素的速度较慢，随麓工业的发鼹，资源利用越来越快，丽排放 懿污染穆( 麴造纸孛鹣凌滚) 瞧越表越多，臻巍秘震擞皇豹降簇寒覆豢苓莰哥 以减少污染，甚至可班黛废为宝。 木质素怒一种组成缩构复杂的冤舰则的植物生物物质，是仅次于纤维素的 爨为丰富戆碳索资源，墩爨仅次子绥维素熬第二大霉生存撬资源霸地球圭最丰 赛豹酚鎏嵩聚物。许多酌微生物可以降解单纯的纤维素帮誓纤维素成涛革糖， 佩当纤维素和半纤维桊被木质素包裹，降解的效果就不理想。这种结构的复杂 性和无规则蚀决定了术质索的难降解性，使得术质素生物降解的研究成为当今 檄秀生物携貘剃露和嚣凌浚理静磺究热熹牡，。 木质索怒由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键联接并难以被黢水解的复杂的无 蹴形高聚物。在针叶材中木质素的含量占原料千重的2 4 3 3 ，阔叶材中木质 索的含量为平重的1 8 - 3 0 。本璇素戆三种绳体分别怒捻柏酵( c o n i f e r y l a l c o h 0 1 ) ，芬予醇( s i n a p y la l c o h 0 1 ) 秘对香豆醇( p - c o u m a r y ia l c o h 0 1 ) 。这些本质 索结构单元之间的联接主要是通过醚键和碳碳键的方式联接而成。醚键包括酚 醚键、烷醚镳和二芳醚键。酚醚键中以愈创木基* 甘油p 芳熬醚( b 0 4 ) 数量最 多，占酚醚镳一半左杏，其次是愈创本基甘溜a 一芳基醚( 8 - 0 4 ) ；c c 键戆 联接类垄妻鬟有叠- 5 、1 、8 2 、5 - 5 簿形式( 圈1 ) 。 木质素魑天然高聚物中最难搞清的一个领域。其原因肖以下方面：一是木 威素的结构单元之间除醚键联接外逐有c c 键；其次木质索搬纤维素、半纤维 豢存在天然滚菝，健缮攀霹笺把全部本疆素敬冀天然凌分离懑来：三愁零爱素 缩构不稳定，容易发生聚合和解聚。 本质素由予要提供维营植物蛄藏所需要的翩性和保护娥管植物中的商聚 耱( 纾维素鞠拳纤维素) ，在叁熬赛熬嚣毒兹翥税耽会秘串，本震素或童年是最 难破坏的。撩于木质素和纤维素、半纤维素等物质的紧密联系，人们使用木质 纤维素( l i g n o c e l l u l o s e ) 来理解和表示自然界中的术材、草类等物质【7 】。在自然 器中光合作用积本质纤维素的降解对地球的碳循环是非常熏凝靛。 骥l ：本袋紊嚣结穆横型嘲 2 木质素的微生物降解 2 1 降解术威素的菌物 由手造纸王鲎静需簧，鑫瘸蓥鼯本质素匏辩解已经磅究攫多。在聱然赛簿 解木质素的嫩物很多，木质素的完全降解是真菌、细菌和微嫩物共同作用的结 果。由于木质索大分子结构复杂且多变，降解术质素的酶需要是非专一性和胞 辨酶；由于本质素通过稳定懿碳碳键襄醚键连接，本质素降瓣酶必须建辍纯酶 4 而非水解酶。降解的速率取决于温度、湿度和本质纤维素的种类。一般濑暖潮 湿的环境较寒冷干燥环境降解快，而萆类的降解x 要比木材快很多。大擞的生 物w 以降嬲纤维素和半纤维素，造成术质索在术质纾维素的酶解中积累下来。 本簇绎维素降瓣懿主要徽象物是丝获囊蓑，萁孛繇解最茯懿怒羟子蓑类，纛撵 予荫类中的白腐菌是唯一可以选择性降解木质素的的生物体嘲。 最有效的术材降解生物是担子菌必中的自腐麓和褐腐菌，研究得最多最彻 底秘最其应翅蕊景豹是黄滤藏毛孚革麓( p h a n e r o c h a e t oc h r y s o s p o r i u m ) 。这耱 徽象物的特点楚培养温度黼( 3 7 左表) ，无性繁疆迅速，菌熊生长快虽分泌术 质豢降解酶能力强，它己缀成为研究白腐真菌的种模式微缴物。它的培养条 件、代谢调控、分子生物举和遗传学及其在生产安践上的应用等均已研究的相 当仔缨。其孛仪蠢不妥1 0 熬本耪晦瓣垒镑是竭麓猿。臻去自藤蓥窝竭建蘩终， 软腐菌也可降解术材。 2 1 1 自腐菌( w h i t e r o tf u n g i ) 自7 0 年代叛来，薅选辫解本质豢微生戆豹王铭淑褥了长怒夔进震。入翻跌 腐烂的本材中褥到了白腐黼，这是一蹙奇特的丝状真菌，属予摆子菌纲朝子囊 筒，其腐生在树木或木材上，因引起术质白色腐燃而得此名。菌丝沿着细胞腔 蔓她，主要集巾在纹孔处。在菌丝下细胞壁被分解出一条沟横，它可按从细胞 整一s ；一s t s ；一复合魏溺层戆颞彦，遮海簿勰绎维素、半终维素窝本矮素， 自腐菌降解本豢主要反应魑1 3 0 4 键的断裂和芳褥环的开裂等。 有研究发现白腐菌比熟它微生物能更快和更广泛的降解微生物 s l 。囱腐菌 蘩丝俸一般为多援，少有瓣膜，通常撼子菌豹嚣饺缝合是以锬捩联合方式澎残 新瓣双核纲藏，面叁腐蓠擞属担子菌缀却无锁状联合。多棱瓣分生孢予辩为异 核，存在同宗配合和异宗黼合两类交西已系统，多数多孔菌、伞菌都属于此类型， 中国真菌志便记载了4 6 属1 3 7 种。它们的嫩长培养基鼹纤维素和半纤维 素，毽本质素麴降勰更多发生在营葵糖( 如氮源，骧源) 褶对夔乏豹次缀代 塞| 过程中。本质索的降解罴一个氧纯藕稚专一性的进程，在这一过程中甲钱基、 酚基和脂基被减少，芳香链断开并形成新的羰基结构，木质紫大分子被解聚并 产缴c 0 2 。 自瘸蓉酶瓣术震素分必选择往鞠嚣选舞往两耱方式；逡铎性舞惩审本震素 和半纤维素的降解明显高出纤维素：瓶非选择饿降解则等最降解木质纤维索。 选择性降解发嫩在木质纤维素腐烂的前期或特定的条件下，静养因素是降解方 式琴月魏主要原因之一9 1 。 白腐菌降解木质素的酶主要是术质索过氧化酶，锰过氧化酶和漆酶。部分 菌种分泌三种辩，而其它则分泌其中一到两种。 5 自腐菌分泌的酶可以分为三类：第一龌是能赢接攻击木材组织，它们能降 解纤维素、半纡缀素和木质索，如葡萄耱甘酶、本聚糖酶、漆酶等：第二组不 单独袭击本李| 组织，瑟是第一缀酶秘翮律用，如遵氧纯氢黻纯酶；第三组是 在本拱窟烂熬避稷孛缝合代落链垮l 。 2 1 。2 褐赓蓠( b r o w n r o tf u n g i ) 福腐菌也耩搀子莹，翔岛腐菌亲缘关系徽近。褐腐术材为褐色，褐腐菌通 常奄较本豹瘸拇蠢关。在本材率，藩熊炎髓沿着缁飚腔延伸。由于褐腐麓主凝 降解多糖聪分解术索的能力弱，所以搦艨只局限在含本索密度低螅s 。瘸s 。屡； 太多数褐魔菌不熊分勰经提纯的纤维豢。脱甲基怒撼壤蘑降解和修馋本素瓣燕 要艇斑。b a v e n d a m m 反应长期以来一巍被用采判断自腐菌与褐腐菌，也可用来 辨逡本素酶解麓。 福腐蓄中必有痧数分泌术质素遗氧纯酶和锰道氧亿酶，并鼠其降解术演素 的缝力不麴鑫瓣蓠l 垃l 。褥瘸蘩能够有效戆海群纤缭索移半纾维素。本璇索靛存 在两加速终维豢的簿麟秀本艨素本身黪瓣较少，童葵蹩聪零基纯撵曩i 1 1 ，窀芩 造成术质素大分子的断裂。 2 1 3 软赓莹( s o f t r o tf u n g i ) 出予软腐蘩爵忍受较蹇懿瀑瘦，羧碱凄彝溶戴f 1 3 l ，软疼麓在薅些零逶合挺 子蔚类生长的环境较多。软腐麓) 属予震藏或半知菌凝。软麻术树干燥之质为 褐包，有裂缝，其霪量减轻，机械强度减辅。软瘸菌多生长程湿庹较大的木树 土，圭器在硬拳上，箕鞠黧特征是在s ：层链溺。除了镳漏矫，太多数较腐菡迩 露戳扶缨爨腔稳复会您润簇产塞疼键“ 。款巍慧妻要簿解多赣，帮分洚翳残僚 饰术索。软腐菌降解木索的能力高于褐鹰菌而低予自腐菌。和自赓菌翔褐腐壤 不间的是提高擞含爨对牧赓菌降解术质纤维素商健进作用。 除上述菌外，一些以放线麓为生的原挟生物，如链霉麓属( s t r e p t o m y c e s ) 、 节秆菌属( a r t h r o b a e t e r ) 、小单孢菌属( m i c r o m o n o s p o r a ) 和诺卡氏菌鹪 ( n o c a r d i a ) 笛，虢及缯萤中鹣厌骶梭菌( c l o s t r i d i u m ) 、镁革稳镶瓣 ( p s e u d o m o n a s ) 、苓饕辖蘩藩( a c i n e t o b a c t e r ) 秘势掇释蘩霭( b a c i l l u s ) 簿墩 能产生本质索降解酶，但这些原核生物黪转泌的本质索簿烬懿都楚胞内黪，逮 就决定了其在术质索降解菌的研究中处于一个相对次簧的地位1 1 6 】 2 2 降解本质索的酶系 自腐萤降麟本矮素，是邋过其分泌熬瓣豹馋弱来实瑗熬。自毖蓉掰分泌豹 木质索降解酶主要有3 种，即术质索过氧化酶、锾过氧化物酶和漆酶【 l 。它们 的般性质眈较见袭1 。在自瘸菌术质索降解酶系统巾，漆酶岛邋氧化物鹃襁 魄冀有疆大麓实际疲建傍德。蓠先，本矮豢过巍纯耪酶藕锾过氧纯秘酶是在氍 6 限碳，又限氮条件下产生的严格次级代谢产物，在工业废水中碳、氮源营养物 的存在限制了细胞对酶的分泌【1 8 】；其次，由于木质素过氧化物酶和锰过氧化物 酶在降解有机污染物时需要大量的h 2 0 2 作为辅助剂l l9 1 ，这在现实情况下很难 实现，限制了其在实际生产中的应用；第三，漆酶可在碳和，或氮存在条件下由 菌体分泌1 2 0 1 ，更重要的是漆酶具有7 8 0 m v 氧化还原电位，能把分子氧直接还 原为水，既使没有h 2 0 2 和其它次级代谢产物存在下，也可催化有机污染物的 氧化。而由于漆酶有其自身的优点：更稳定，固定化后能更有效地发挥作用， 不需要过氧化氢的参与，有些漆酶可以组成型产物，且表达量较高。因此，漆 酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。 表1 ：白腐菌分泌的m n p , l i p 和l a c 性质比较2 1 锰过氧化酶( m n p )木质素过氧化酶漆酶( l a c ) ( l i p ) e c 1 1 1 1 1 31 1 1 1 1 41 1 0 3 2 m n ( i i ) ：h 2 0 2二芳基丙醛：0 2 ，p 一苯二醇：0 2 - 氧化 氧化还原酶h 2 0 2 氧化还原酶还原酶 辅基亚铁血红素亚铁血红素i 型和型含 c u 2 + ，i i i 型含 c u 2 4 + 分子量( k d a ) 3 2 6 2 53 8 4 75 9 1 1 0 作用位置n n n 一 酶蛋白组成1 1 种以上的单体由15 种以上的单体由数个单体，二聚 构成构成体和四聚体构成 等电点2 8 7 23 2 4 72 6 4 5 p h 范围 2 6 - 4 52 5 5 o2 o 8 5 电势( m y ) 1 5 1 01 4 5 05 0 0 8 0 0 c c 断裂可断可断不可断 h 2 0 2 的参与需要需要不需要 稳定性 + + + + + 天然介质 m n 2 + ：m n 3 +2 c 1 1 4 d m b3 h a a 专一性 m n 2 + 包括非酚型结构的芳酚醛化合物 香化合物 其它介质硫醇，不饱和脂肪无a b t s ，h bt ，丁 酸香醛连氮 漆酶是一类以0 2 为电子受体的蛋白酶。由于木质素的化学顽固性，白腐 菌降解木质素通过不同的途径进行。目前已提出几个降解机制，但有一个共同 点是：形成木质素自由基，利用其不稳定性，进行断键反应。目前研究较透彻 7 的是其催化多酚化合物如氢醌，此过程颁经过四次单电予传递；首先，底物氮醌 商 表2 ；本震素箨簿鞠关酶l 搪i 谈震名编号爱寝 木质索过氧化酶 l ，l1 1 1 l i p + h 2 0 2 c o m pi + h 2 0 4 c o m pt + ￥矗- c o 撰pi i + v 矗+ c o m pi i + v a l i p + v a + 锰过氧纯酶 1 | 1 。l 继纯簇依靠h 2 0 2 和m n 2 + 离子 3 漆酶 1 1 0 。3 2 4 一b e n z e n d i o l + 0 2 = 4 * b e n z o s e m i q u i n o n e + 2 h 2 0 辣裰遗氧纯酶 l + 1 1 1 7 d o n o r + h 2 0 2 一o x i d i z e dd o n o r 2h 2 0 ( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ) 原儿茶3 ，4 - 加双氧酶 1 1 3 1 1 3 ，4 - d i h y d r o x y b e n z o a t e+02= ( p r o t o e a t e e h u i e， 3 - c a r b o x y - c i s ，c i sm u c o n a t e 3 , 4 - d i o x y g e n a s c ) 邻苯二酚一i ，2 翔双氧酶 1 1 3 1 l ， c a t e c h o l + 0 2 = c i s ，c i sm u c o n a t e ( c a t e c h o l1 1 , 2 - d i o x y g e n a s e ) 过氧化氯歧化酶 1 1 s 1 1 0 2 + 0 2 一+ 2 h + = 0 2 + h 2 0 2 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 乙醛漩氧化酶 1 2 3 5 g l y o x y l a t e + h 2 0 + 0 2 = o x a l a t e + h 2 0 2 ( g l y o x a l a t eo x i d a s e ) 芳醇氧化酶 1 1 3 7a na r o m a t i c p r i m a r ya l c o h o l + 0 2 = ( a r y l a l c o h o lo x i d a s e )a r o m a t i ca l d e h y d e + 壬差2 0 2 毗瞒糖2 瓴化酶 1 1 3 1 0d g l u c o s e+02 = 2 - d e h y d r o d ( p y r a n o s e - 2 - o x i d a s e )- g l u c o s e + h 2 0 2 纤维二糖：醌氧化还原酶l + 1 5 1c e l l o b i o s e + q u i n o n e = ( c # n o b i o s e ：q u i n i n ec e l l o b i o n o 一1 ，5 - l a c t o n e + p h e n o l o x i d o r e d u c l a s e ) 纤维二糖脱氢酶 l 。1 9 9 1c e l l o b i o s e + a c c e p t o r = (c e l l o b i o s e8 c e l l o b i o n o - i ，5 - l a c t o n e +r e d u c e d d e h y d r o g e n a s e )a c c e p t o r 漆酶转移一个电予，釜成半醣氧自由綦中褥体；简后两分子举醌生威一分子 氢醌和一分子苯龌。氧自由撼中间体还能转交成碳自由基中间体。它们可以提 8 互结合或相互偶连，敞在菌体内，漆酶与其它氧化术质索酶系协同降解木质素。 蔼在俸外实验中，术质素筚体农l a e e a s e 0 2 条 率下会发生聚合反成，还源态潦 酶被氧化，0 2 被还原成水，此过程是通过四个铜离子协同传递电予和价恭变化 求实现酌。 l i p 和m n p 都是带有糖基的胞外瓶红素蛋白，又称瓶红素过氧化物酶( h e m e p e r o x i d a s e s ) 。l i p 和m n p 在发应中从酚型帮非酚型螅苯环土夺取一个电子赢 使后者形成阳离予藏团，从而释致术质素大分子的主要基团断裂。l i p 艇要氧 化酚使其变成苯氧残基 m n p 燕要利用m n 2 + 和h 2 0 2 的氧化作用褥到m n 3 + ， 然后m n 3 + 氧化酚使其变成苯氧残基，从而导致术质素大分予的主鞭基团断裂。 在囱瘸蘩降勰本震素游酶系孛，豫了漆酶、l i p 和m n p 舞还霄一些酶怒到 了辅助的作用，如：芳醇氧化酶、过氧化酶岐化酶和蛋白酶镲。表2 列出了白 瘸藩降解本震索静懿系和它稍强降解本覆素静裾装反应。 3 。漆藩的研究现状 3 1 产漆酶的生物 最初漆酶是在漆树中发现，之后又发现真菌和细菌等生物也分泌漆酶。潦 酶可以大概戆分成援貔漆酶秘囊蓥漆薅。磺究发瑗：攘对囊藏，接甥分泌漆酶 的现象少的多。h u t t e r m a n n 证明了谯r h u sv e r n i c 派r a 中存在漆酶，并对其性 矮徽了详鳃论述。链认必漆撵滚酶存在于漆瓣斡撼爨管褒努泌约檄糙中1 2 孙。鸯 少量的研究报道了襁细菌和昆虫中也发现t 漆酶的存在1 2 3 2 4 1 。 3 2 漆酶的种类帮性质 漆酶是耱会镶躲多酚戴g m ( p d i p h e n o lo x i d a s e ，e cl 。1 8 。3 2 ，窝壤 物中的抗坏血酸氧化酶，以及哺乳动物血浆中的铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶家族中 弱一夸淡，奁结梅耱凌戆土存凌诲多攘讼之处。窕霹爨疆纯鬣纯黔类纯会秘脱 去羟基上的电子或质子，形成自由基，导致酚类及木索类化合物裂解，同时分 予篾鼓逐嚣走泰2 。 内腐菌漆酶为胞外蛋白，这些强自的表鼹分子量有很大的差异，从5 8 3 9 0 k d a 不等，典型的分予量在6 0 8 0 k d a 。一部分自腐菌在征常或诱导条件下 会产生数种固工酶，皆为糖蛋黩。不同的闻工酶的分予基郓性质也不完金一撵 【2 剐。漆酶一般以单黻自体的形式存在。不同来源的漆酶其分子被不同程度地耱 基化，羰水他会物禽量占l o 4 s 质量转数) ，会有糖基黪爨自不易结鑫2 。 9 萄2 ； c o p r i n u sc l n e r e u 分泌的漆酶的模型圈：髑中蕊色是n 端，黄色燕碳鞴。 嘏影中蛇球体是铜原子，在r l 攮星的锕用蓝投表苯。t 3 位的一对锕用黄氇袁示t 轴 。 每个滚酶鬣自分子含商4 个铜离子，这4 个锶离予处予滚酶的活性部位， 在倦化氧化反威中起决定作用。根据光谱学和磁饿特征，可将漆酶分子中的4 个锕离子分为3 类：i 型c u ”1 个，型c u ”1 个及妊i 型c u 2 + 2 个。i 溅c u 2 + 秘l l 型c l i ”郝是攀电予受髂，整蹶磁性，霹翔矮磁装擐( e p r ) 浏定。l 撵c 艟” 曼蘸色，在6 1 4 n m 处骞特缓皲收蜂；i l 甏c u ”没有鞠显豹萄凳蔽枝光谱；滋 型c 驻2 4 + 是穗舍豹离予对( c 珏弘一c u 2 + ) ，猩3 3 0 n m 处有最大蔽救峰 2 警1 。i i 鼙c u 2 + 秘鞋l 型c u 2 4 + 形成三核锻簇，其中2 个掰鼙c u 2 + 通过蔻基稠涟，三核铜簇疆双 戴述暴豁经焘。销离子是漆酶穰张反虚的活往中，心，僵其罐纯畿能还受阀围氮 基酸配体的影响，因氨基酸蔼己体的不简，漆菌的氧化能力是不同的。漆树漆酶 和真菌漆酶并无本质上的不同，漆树漆酶的底物也是真菌漆酶的底物，前卷的 催他活性较鼯者低，其原阂熄漆树漆酶中的l 型c u ”被深埋在懿蛋白的多肽链 内，困褥摄承熬较低豹酶活性”。 3 3 微生物产漆酶和活性调节机制的研究现状 蹲解本痰索蛇瞧震蘩不能仅蒎靠本蕨素骰必其能鬃释骥韵来源，它们蔓 要秘瑶零矮纤维索中更翁降瓣静商聚糖。降瓣本获紊静主要于馨掰是让离聚糖暴 露醴便于蔼杨分泌的纤维索酶和半纾维索酶降解。在自然条件下，大多数髓腐 真菌合成的酶纛穰低，要实现自腐真菌在顽嗣惶有机物降解中的工业化应用， 营养源调控将爨其中重要豹因素。 窃腐菡静产酶多采稻液体培养，讴氇有采用固体培养的撤道。尤其在漆 酶研究中。付时雨等( 3 1 发现词体培养条件下贝壳状革耳菌产生的漆酶活性远大 予它在液体墙莽条件下产壅的活性。他们的研究结果表明，培养方式对间功酶 的产生有较大羽影响。在渡髂壤养硪究中，采熙振荡培莽方式蛉比势嚣壤葵鹣 t o 为多，采用深层培养方式的比浅层培养的为多。还鸯方妓是将白滕真蓥固定在 特殊载体上形成生物膜，这种培养方式与前述两种均有很火的不同，而目前尚 没有其产酶能力、关键酶系构成及酶涵性的研究报导。 已研究的大量菌种中，本质素降解酶农营券缺乏她次级代遴过程中，当 环境中存在较术质纤维素易消化的物质时，菌物不合成娥分泌本质素憋所需的 介质化合物。在土壤和木材中的营养缺乏太多是氦源，所以大多的实验是在限 制往氮源条件下进行的 3 2 1 。但部分菌种如b j e r k a n d e r a 是在富氦条件下术质素 降解酶分泌较多 3 3 1 。国内舞曾利用多种不同有祝、元杌躐复合碳氮源来研究它 髑对自瘸粪蔻产瓣能力、关键懿系梅或及酶满性的影响，结采表弱，碳源和氮 源是影响微生物黪解寒嫫素彝产酶豹嚣令援必重簧豹嚣素。菜姥撰型本震素分 解茵的研究表明，碳氮源的营养限制可用于刺激本质素降鳞酶的合成，如黄胞 原壤平革菌的木质素降解和木质素降解酶的产生就是发生在氮源或其他营养 被消耗的次级代谢过程中。另外，邓擞旭等【3 4 】比较胞外酶和胞内酶活性发现， 藏菜一谈源荷言，若施外酶活性较高，其胞内酶活健一般也较高。这说明碳源 对魏矫酶帮稔肉酶的影响趋势燕基本一致骑，说明各碳源对酶类由胞肉分泌劐 腿豁豹影峨差别誉大。氮源熬影晌情嚣与碳滚基本相阂。 彳寸时雨等( 3 1 ) 将贝壳狄革耳菌在固体和液体培养纂培养漆酶同工酶进行 慰魄研究簸瑶，禹液培养蓦培养静漆酶同z 酶差异较大。液体培养的漆酶闯工 酶产生馕援差异较少，分布在蹇分子爨区域；圈体培养过程分潞豹漆酶蔺工酶 复杂，翦期同王酪主要分毒在低分子量区域，睫蓑培葵时越豹延长冠羔酶港蟥 加，部分璐在惠分子基区域，且高分子量范围不断集中增强，壤养羼期低分予 惫区域的同工酶带又艇新出现。 微生物生长器要微爨元素，遴棠镪挺f e 、c u 、m n 、z n 等，僵从文献上 看，对自腐菌产术质索降解酶有重大影响的微量元素主要是c u 和m n 。其中对 于漆酶的产生和酶活性c u 悬相当重要的。肖驻中等( 3 5 ) 发现，发酵培养基中不 添加c u 2 时，漆酶活性极低。在o 一5 | lm o l l 范围内，酶活性水平随c u 2 + 浓度 的增加迅速提高；当大予1 0 “m o l l 戳后，漆酶活性水平反而降低。这说明培 养基孛适量静c u 2 + 对菌株漆薅静合城及活性是必不可少豹。但过多的c u 2 + 又抑 露菌株漆酶躲表达分泌。悉a g + 、c i 、n 0 3 。秘s 0 2 4 离子对d d b q 王董2 静漆薅催 化载化反应则鸯明显的抑制作用。 重宣磊世辫瑟彩绒革盖蘸漆酶酌液体臻养研究表稍：3 0 、n 0r r a i n 下酶 活达到缳裹；媛逶p h 为4 。6 ，覆逶溢度是2 5 ；k + 、z 珏”对漆酶簿滔有激滔 作用，a g + 、f e 2 + 对酶瀵毒挪剩住用。豢，、璩4 0 等对红捡麓( p y c n o p o r u s c i n n a b a r i u s ) 胞外漆酶的研究发现：该毽秘是在第3 天漆酶黪瀵达到最裹；本 索类似物对红栓菌胞外漆酶商较好的诱导作用；漆酶分予量为2 60 0 0 ；含1 7 种氨基酸，氨基酸总麓占酶组成的6 4 2 7 ；簸适温度为3 0 ；与邻联苯申胺 1 i 反应的最适酸碱度为4 o ；k m 值为3 8 5pm o l l 。 3 4 漆酶的瘾物和介矮能合勃 漆酶分子串一簸熬鸯鸯4 令镄森子，适宣爱蔽滋度较低，