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东华火学硕士学位论文 电化学阻抗免疫传感界面构建及其应甩于多堑羞壁塑堕型堕塑 电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于 多环芳烃的检测研究 摘要 多环芳烃是一类具有致癌、致畸、致突变性的持久性有机污染物。 1 芘丁酸是p a h s 的衍生物，对人体和动植物均有毒性作用。因此， 对p a h s 及衍生物的快速检测具有重要意义。电化学免疫传感器作为 一种有效的微量和痕量分析手段，具有灵敏度高、分析速度快、选择 性强、仪器简单等优点，近年来被人们所广泛关注。文献调研表明， 利用电化学阻抗免疫传感器来监测环境中的多环芳烃及其衍生物的 研究较少，对小分子物质p a h s 的电化学免疫分析有待进一步探索。 本文以1 一芘丁酸为检测对象，采用不同的固定化技术将多环芳烃 抗体有效固定在电极表面，构建灵敏和特异性的传感界面。以修饰的 传感界面为敏感元件，根据循环伏安、交流阻抗等电化学方法表征免 疫传感器的构建过程，通过电化学交流阻抗谱测定抗原抗体反应后传 感器界面电子转移阻抗的变化来实现1 芘丁酸的定量分析，并据此探 索了利用电化学阻抗免疫传感器进行多环芳烃快速检测的新方法。 采用电沉积纳米金膜物理吸附的固定化技术，将多环芳烃抗体固 定在玻碳电极表面，应用电化学阻抗谱及循环伏安法测定修饰电极在 电解液中的电化学行为。实验结果显示，随着样品1 芘丁酸浓度的增 加，结合到纳米金修饰电极表面的抗原一抗体复合物也增加，使得氧 东华大学硕士学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃睑坳0 婴究 化还原对在电极表面电子转移阻力变大，导致电极表面电子转移阻抗 随之增加，这表明阻抗谱可以用于1 芘丁酸的定性检测分析。实验初 步建立了电化学阻抗谱和免疫传感器联用的多环芳烃检测方法。 采用n a f i o n 膜和金纳米粒子( n a n o a u n a f i o n ) 复合物作为电极 材料，构建操作简单、高度灵敏、无标记型电化学阻抗免疫传感器， 应用于1 一芘丁酸的检测。在优化实验条件下，由于n a f i o n 膜和金纳 米粒子的协同作用和良好生物兼容性，电极表面的a n t i p a h s 抗体量 极大提高。研究结果表明，n a n o a u n a n o n 复合电极对1 芘丁酸检测 的灵敏度和稳定性比单一金纳米电极的性能更优异。n a n o a u n a f i o n 免疫传感器的电子转移阻抗与1 一芘丁酸的浓度对数成一定的线性关 系，线性范围为o 1 1 5 0n g m l ，检测限为0 0 3n g - m l - 1 。对电化学 阻抗免疫传感器的选择性和准确性进行评价，均取得满意的结果。 利用巯基物质在金表面的白组装特性，在金电极表面形成稳定、 有序、尾基为羧基的巯基乙酸( m a a ) 单分子层自组装膜，再利用偶联 剂1 - 乙基一( 3 一二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 和n 羟基丁二酰 亚胺( n h s ) 的活化作用形成活性酯中间体，a n t i p a h s 抗体与单分子层 中的活性酯反应形成稳定的酰胺键，从而实现抗体在电极表面的有效 固定。在f e ( c n ) 6 3 - f e ( c n ) 6 4 体系中以1 芘丁酸为检测对象，考察了 传感器交流阻抗谱的电子转移阻抗在不同浓度1 芘丁酸中的响应变 化，实现了对1 一芘丁酸的定量分析。r e t 与p b a 的浓度对数在 o 0 5 5 0n g m l 。范围内具有良好的线性关系，线性方程为 r e t = 3 9 0 1 7 1 9 c + 4 1 3 5 3 ，相关系数r 2 = o 9 9 7 ，检测下限为o 0 5 苎墨燮美型型量堡垒垒垦蔓幽垫鱼壅垡壁昼亘塑垄壁基窒旦：芏童堕苎丝盟坌型堕壅 n g m l 。该免疫传感器在重现性和再生性方面也具有良好的表现。 关键词：免疫传感器；电化学交流阻抗谱；多环芳烃；纳米金 s t u d yo nt h e s e n s i n gi n t e r f a c e s f a b i u c a t i o n 0 f e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e i m m u n o s e n s o r a n dt h e a p p l i c a t l 0 nf o rt h ed e t e c t l 0 n o f p o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s a b s t r a c t 上j o j y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) a r eac l a s so f p e r s i s t e n to r g a l l i cp o l l u t a n t s ( p o p s ) w l d e j yp r e s e n t1 nt h ee n v i r o n m e n t ，m a n yw h i c ha r e c a r c i i l o g e n i c ，t e r a t o g e n e s i sa n dm u t a g e n i c i t v j 一上，y r e n e b u t y n ca c i d ( p b a ) i s 。n e 。fp a h sd e d v a t i v e sa n dh a n l l m lf o rh u m a n b e i n 譬a n d 。t h e r t l o r aa n df a u n a ，n l e r e f o r e ，i ti s o fn e c e s s a 秽t 。d e v e l o pa s e n s i t i v e ，r a p i da n dc 。s t e 腩c t i v e m 砒。df o 。i ，a h sd e t e c t i 。n a sa ne 伍c i e n tt r a c e a n a l y s i sm e t h 。d ，e l e c t r o c h e i i l i c a li m m u n 。s e n s 。r p 0 8 8 e 8 8 e st 1 1 em 嘶t 8 。f h i g hs e n s i t i v i 咄q u i c ka n a l y s i s ，s t r o n g s e l e c t i v i 哆a n ds i m p l es t m c t u r e e t c h 。w e v f e w e 8 e a r c h e sh a v eb e e n c 。n c e n t r a t e d0 n u t i l i z i n ge l e c 咖c h e l i l i c a li m p e d a n c e 蛐m u n o s e n s o r t om o n i t o rp a h sa n di t sd 砸v a t i v e su p t on o w f u n l l e ri n v e s t i g a t i o n ss h o u l db e c a 喇e d 。u tf o rt h e e l e c t r o c h 锄i c a l i m m u n 。a s s a yf o rs m a l lm 0 1 e c u l e s 。f 队h s 1 一p y r e n e b u y n ca c i d ( p b a ) w a sc h o s e na st h ee x a m i n a t i o no b j e c ti n m i sp a p e r d i 妇暗r e i l t 1 m m o b l l i z e dt e c l l l l o l o g i e s w e r ea d o p t e dt of i xm ep i a h s a n t i b o d yo nt l l ee l e c 缸o d es u r f a c e e 士士e c t l v e l y a n dt h e ns e n s i t i v ea n ds p e c i f i c s e n s i n gi n t e r f a c e sw e r ec o n s n l l c t e d t h em o d i f i e d s e n s o ri n t e r f a c e i st a k e na s t h es e n s i t i v ee l e m e n t 1 1 1 e nt h ec o n s t m c t i o n p r o c e s so ft h e 1 蛐u n o s e n s 0 r1 s d e s c 曲e d b ye l e c t r o c h e m i c a lm e a n ss u c ha sc y c l i c v o l t a m m e t 巧( c v )a n d e l e c r o c h e m l c a l i m p e d a n c es p e c t m s c o p y ( e i s ) ，e t c t h eq u a n l i t a t i v e a n a l y s i sf o rp b aw a s r e a l l z e d a c c o r d l n g t ot h ev a r i a t i o n o ft h e e l e c t r o nt r a n s f e r i m p e d a n c e( r e t )a n e rt h e 1 m 砌n o r e a c 1 0 nb e w e e na 1 1 t i g e na n d a 1 1 t i b o d yo nt h es e n s i n gi n t e 柏c ed e t e c t e db y e i s u j a s s yc a r b o n1 ss e l e c t e da st h eb a s a l e l e c t r o d e t h ea n t i p a h s a n t i b o d yw a ss t e a d i l v 1 m m o b l l l z e da tt h en a n 。a u g ce l e c t r 。d e d u et o l a 略es p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n ds a t i s f a c t 。r v b l o c o m p a l l b l l i t yo f 9 0 1 dn a n o p a n i c l e s t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro f t h em 。d i 6 e de l e c t r o d ei n t h e e i e c t r o l ”e1 sm o l l i t o r e da c c o 幽gt oe i s a n dc vi ti s s h o w nt h a tt h e q u a n t i t yo f 1 m m u n o c o m p l e xc o m b i n e d of h en a n o m e c e r9 0 1 dm o d i 6 e de l e c t r o d es u r f a c ew o u l d s e w i t ht h e i v m c r e a 8 emt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep a h s s a m p l e t h e r e f o r e ，t h ee l e c t m n i ct r a n s f e rr e s i s t a n c eo n t n ee l e c t r o d es u r f a c ei n c r e a s e sb y t h er e d o x ，w h i c hr e s u l t e di nt h ei n c r e a s ei nc h e e l e c t r o nt r a n s f e r 1 m p e d a n c e 。nt h ee l e c t r o d es u 而c e i ti s p r o v e dt h a tt h ei m p e d a n c e s p e c t r o s c 。p yc 。u l d b ea d o d i e d ml h eq u a l l t a t l v ed e t e c t i 。na n d a n a l y s i sf o rp b a i na d d i t i 。n ，t h ee i si m m u n 。s e n s o rf o rt h e d e t e c t l o no ff a h si ss e tu p p r e l i m i n a 叮d u r i n gt h ee x p e 打m e n t a 8 1 m p i e ，岫l y8 锄i v e ，a n di a b e l f r e ee 鼬。c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c 。p y ( e i s ) ? m u n 0 8 e n 8 0 。w a 8 d e v e l 。p e du s i n gn a f i 。na n dg 。l dn a n 。p a n i c l e s ( n a n 。一a u 瓜a f i 。n ) c 。m p o s i t e s 1 。t h ed e t e m l l l a t i 。fp b a u n d e rt h e 。咖a lc o i l d i t 崎t h e a m o u n c 。fi m m 。b i l i z a t i 。n 。f a n ) b o d yw a s s 培n i & a n n y i m p r o v e d o nt h en a n 。一a u 肘a f i 。ne l e c 仃0 d ed u e t 。t h es y i l e r g i s t i ce 脆c t ：n d b i 。c 。m p a t i b i l “y 。fn a f i 。nf i l ma n dg 。l dn a n 。p a r t i c l e s c 。m p 。s i t e s t h er e s u i t ss h 。w e dt h a t 攀胁? n ”n d 双8 b i l n ”h a n “啪f i o n c o m p o s i t e e l e c 咖d ef o r p b a d e t e c t i o nw e r em u c h ? e n e r u l a nm o s eo fn a n o a u m o d i f i e dg l a s s yc a r b 。n e l e c 廿o d e ( n a i l 。- a u g c e ) n ep l 。to f m c r e a s e de l e c 仃o n t r a n 蜘r e s i s t a n c e s ( r e t s ) a g a i n s tt h el 。龇l l i l l 。f p b a c o n c e n 州s l i n e a r 。v 盯t h em n g e 舶mo 1 。l5 0 n g m l - 1w i t had e t e c t i o nl i m i t 。3n g m l _ 1 t h e s e l e c t i v i t va n d a c c u r a c y 。ft h ep r o p o s e de i sj m m u n 。s e n s 。rw e r e e v a l u a t e dw i t hs a t i s f a c t 。r yr e s u l t s ? ne j e c 慨h e m i c a l i m p e d a n c es p e c 慨c o p y ( e i s ) i m m u n 。s e n s 。r f o r i h ed e t e “o n o fp a h s 二d ? 寥m m m 曲i 1 娩m g a n t i b o d ym r o u g ht h ea u - sc 。v a l e n tb o n d ap r e 眦e d g 。l d 篡i ：d ：， 8 f i 嘣i m m e r s e di n m e r c a p i o a c e t i ca c i ds 。l u t i 。nt 。f o 加as e l f - a s s 锄b l e dm 。n 。y e r 岱? t h e n a n f i p a h s a n t i b o d i e s a r e i m m o b i l i z e d l o t h es a m b ym e a n so f c o v a l e i l t i n ：i ： s t a a ( ：y 1 锄i n s t “n t 锄e d i a i e g e l l e m t e d b y l - e l h y l - 3 ( 3 蛐e m y l a m i n 。p r o p y l ) c ! b o m i n l i d “e d c ) a n d n h y d r o s u c c i n i m i d e ( n h s ) i i l 廿1 ep r e s c i l c e 。ff e ( c n ) 6 3 卯文c n 主4 - ： r e d o x p r o b e ，恤e l e c 仃d t r a n s f e r r e s i s t a n c e s ( r e t s ) w e r ed i r e c n yd e 眦t e db ye i sa r e r m e ：m m u n o s ? ：n s o r s p e c i 乱b i n d i n g 谢mp b ao fd i 船r e n tc 。n c e l l 衄t i 。n s a l i n e a rr e l a t i 。n s h i p b e m e e nm “n c r e a s e dr e a n dt l l “。g 捌t 1 1 芏i l i c v a l u e 。fp b ac 。n c e i l 昀t i 。n sw a sf o u n di n 孟 r 锄g e 0 f d 5 5 0 n g m l 。1w i t hm ed e t e c t i o nl i m i t 。f 0 0 5n g m l - 】n e r e g e n e r a t i o na 1 1 d 啪t i n g y 抽gp i n g ( e n v i r o 啪e n t a l e n 百n e 甜n 曲 s u p e r v i s e db y l i 坚i 垦塾墨b 星 k e yw o r d s ：i m m u n 。s 蚓蛳y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a m ；e c h 哟l i m p e d a n c es p e c t r o s c 叩y ；9 0 1 dn a n o p a n i c l e 8 v 东华大学硕士学位论文i 乜化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 1 绪论 持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp 0 1 1 u t a n t s ，p o p s ) 是一类难以通过物理 化学和生物降解的有机化合物的总称。因具有生物累积性，半挥发性和难降解性， 持久性有机污染物普遍存在于水体、土壤和生物组织等环境介质中。大多数的持 久性有机污染物具有“三致”效应，容易在生物体内富集，最终对人体和生态环 境产生巨大危害。持久性有机污染物种类繁多，多环芳烃( p 0 1 y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 作为其中的重要一种在自然界中广泛的存在。 1 1 多环芳烃概述 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 及其衍生物是一类重要的 持久性有机污染物( p o p s ) ，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的热解和不完 全燃烧【lj 。p a h s 是由2 个或2 个以上的苯环以稠环或非稠环的形式相连接而形 成，具有致癌、致畸及致突变等突出特点。人类及动物癌症病变有7 0 9 0 是 环境中化学物质引起的，而p a h s 则是环境致癌化学物质中数量最多的一类【2 1 。在 总数已达10 0 0 多种的致癌物中，p a h s 占了1 3 以上【3 】。1 9 7 9 年美国环保局f e p a ) 将1 6 种p a h s 规定为优先控制有毒有机污染物【4 1 ，目前其他多个国家和地区也都 对其进行了限制，中国政府也已经列出7 种多环芳烃于“中国环境优先污染物黑 名单，中【5 1 。 1 2 多环芳烃检测方法的研究现状 由于多芳烃的潜在毒性、致癌性及致畸作用，对人类健康和生态环境具有很 大的潜在危害，因而对其监测控制变得非常重要。p a h s 在环境介质中一般为微 量至痕量残留，国外已经对痕量多环芳烃的分析进行了一定程度的研究，目前己 使用多种技术进行样品的预处理和分析测定，主要有气相色谱【6 1 ，高效液相色谱 j ，荧光光谱法【8 j ，表面增强拉曼光谱技术【9 】，以及色谱法与其他方法的连用技 术m 汜j 等，其中气相色谱和高效液相色谱是目前应用较多的方法。美国e p a 6 1 0 规定多环芳烃的测定方法有气相色谱和高效液相色谱，我国g b l 3 1 9 8 9 l 则采用 高效液相色谱对水体中六种多环芳烃进行测定。 尽管上述检测方法具有较高的灵敏度和稳定性，但是一般都需要复杂的前处 理和富集浓缩过程，耗时长，仪器设备大型且昂贵，操作复杂不利于推广使用。 因此，迫切需要发展一类兼具高灵敏度，高选择性且耗时短，操作简便的检测方 法。 东华大学硕士学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 免疫分析是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应的分析技术，免疫反 应涉及抗原与抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合应用，具有常 规理化分析技术无可比拟的选择性和高灵敏度，非常适宜于复杂基质中痕量组分 的分析【l3 1 。目前国内外用于环境污染物检测的免疫分析技术多针对于微生物、 细菌毒素和有机农药等 1 4 6 | 。关于p a h s 的免疫分析检测技术研究，国内少见， 国外已有部分文献报道，主要有酶联免疫分析技术( e n z y m e1 i i l l ( e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) ，压电免疫检测技术( p i e z o e l e c t r i ci m m u n o a s s a y ) ，放射性免疫检测 技术( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) ，荧光免疫( n u o r e s c e n c ei m m u n o s e n s o r ) 以及电化学 免疫分析技术( e l e c t r o c h 锄i c a l i m m u n o a s s a y ，e c i a ) 等，其中研究较多的是酶联免 疫分析法mj 。随着生物电化学和探针技术的发展，电化学免疫分析技术把免疫 化学反应和生物电子传递有效地结合起来，具有快速、简便易行、灵敏度高，可 以对环境中的痕量污染物( 有机污染物、病原微生物等) 进行现场检测等优势，具 有很大的发展潜力。 1 3 电化学免疫传感器 自1 9 9 0 年h e n r y 等提出了免疫传感器的概念以来【1 8 】，免疫传感器在环境、 临床医学和食品工业等方面已有重要用途，因其具有体积小、特异性强、灵敏度 高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优点，己成为当前研 究的热点课题之一。其中，电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫检 测技术相结合而发展出来的，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点，它 是基于免疫反应前后引起电化学信号变化量来定量或定性分析。 1 3 1 电化学免疫传感器原理 免疫传感器是基于免疫检测技术与高灵敏的传感技术相结合的一类新型生 物传感器，其基本原理是将生物识别分子( 酶、抗原或抗体等) 固定在传感器基 体上，通过传感技术使吸附发生时产生物理、化学、电学或光学上的变化，转变 成可检测的信号来测定环境中待测分子的浓度，如图1 1 所示。在结构上主要由 生物敏感组件、换能器和信号数据处理器三部分组成。生物敏感组件指固定的生 物识别分子层；换能器通常称为基础电极或内敏感器( 如：电流或电位测量电极、 热敏电阻、压电晶体、场效应晶体管、光纤等) ，是一个电化学或光化学检测元 件，将识别分子膜上进行的生化反应转变成电、光信号；信号数据处理器用来接 收、处理以及记录产生的信号。根据换能器不同将免疫传感器划分为：光学免疫 传感器、压电免疫传感器、电化学免疫传感器、热敏电阻免疫传感器和场效应晶 体管免疫传感器等。 电化学免疫传感器是以抗原或抗体为分子识别元件，通过电极式传感元件把 免疫反应引起的化学物质浓度变化信号转变为相应的电信号的免疫传感器。采用 东华大学硕士学位论文 电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 各种电分析技术，如循环伏安法、溶出伏安法、脉冲伏安法、电化学交流阻抗谱 等，大大提高了免疫分析的灵敏度。具有测定选择性好、灵敏度高、测试费用低， 适合联机化可在有色甚至浑浊试液中进行测量并且可实现在线检测、容易微型化 等优点，所需仪器设备相对简单，具有简便、快速、体积小等特点，能广泛应用 于医疗、食品分析、工业生产、环境检测等领域。 、，、 酶、 电极、 卜 物理或化学秒 热敏电阻、 呲信爹 处 l 待测物 抗原或 压电晶体、 抗体、 场效应晶体 理 管、 器 d n a 等 光纤 图1 1 免疫传感器原理图 1 3 2 电化学免疫传感器分类 免疫传感器根据免疫试剂是否被标记分为非标记免疫传感器和标记免疫传 感器。 非标记免疫传感器：抗原抗体本身并不产生电流信号，但是作为生物大分 子，其在电极表面的吸附结合会阻碍传质或电子传递，籍此可实现非标记检测， 即直接利用待测抗原( 或抗体) 与固定在传感器表面的抗体( 或抗原) 发生特异吸附 时所产生的直接电或光信号进行检测。优点：操作简单，响应快；缺点：灵敏度 不高，样品需求量较大。基本过程如图1 2 。 + _ 二一匡： + 一c 蕊 卜 卜匿 一私毛。静一韵赫磊 一 襄 。j 一k匪 一 一墼肛 卜e 的间接定量分析。传感器的构建过程如图1 4 所示。 霉 g c c h i 沁s 3 n g n p 妃n t 黪鎏攀。一爹 赢j 、一漱a n “g 。n 图1 4 竞争式电流型免疫传感器实例( 以标记抗体为例) 【2 0 】 随着电化学仪器灵敏度的不断提高，基于免疫复合物的非电活性的特点，可 以通过响应电流在免疫反应前后的变化直接测定待测物【2 。近来无试剂电流型 免疫传感器越来越受到人们的亲睐，无试剂是指不需要标记生物分子，且不需要 添加标记物的反应底物，而直接通过电极表面固定的生物分子免疫反应前后引起 电信号变化进行分析物的检测，如将电子媒介体硫堇、甲苯胺蓝、二茂铁的衍生 物等固定到电极表面来探针抗体抗原的反应情况，从而进行定性定量分析。研究 表明，无试剂电流型免疫传感器具有制备简单、灵敏度高等优点。 卓颖等瞄】将纳米金、s i 0 2 硫堇纳米复合物、纳米金自组装到c y s 修饰的金 电极表面形成具有高表面能和良好氧化还原活性的夹心结构纳米复合膜用以吸 附抗体，s i 0 2 硫堇纳米复合物中的硫堇起到氧化还原探针的作用，从而制得一 种无试剂电流型c e a 免疫传感器，传感器制备过程如图1 5 所示。在免去酶标 抗原或抗体的复杂操作的同时可以定量的测定溶液中的抗原物质，且灵敏度高、 操作简便、特异性好。 ( 2 ) 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器兴起于七十年代，集酶免疫分析的高灵敏度和离子选择电 极、气敏电极的高选择性于一体，直接或者间接用于各种抗原、抗体的检测，它 具有可实时监测，响应时间较快等特点。基本原理是抗原或抗体在敏感膜上的结 合或继后的反应引起电极电位或膜电位发生改变，而且这种电位的变化与待测物 浓度之问存在对数关系，其关系遵循能斯特方程：e = e o 十r t z f l 9 0 c m 。在人i g g 、 一警 一 东华大学硕士学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的捡测硒究 乙型肝炎、人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 等的检测方面已有电位型免疫传感器的相 关研究报道【2 3 】。吕鸣样等【2 4 】将人绒毛膜促性腺素h c g 抗体固定在醋酸纤维膜中， 以氧电极为基体电极，采用免分离夹心法测定h c g ，结果与放射性免疫测定具 有高度相关性。 虽然电位测量式免疫传感器能进行定量测定，但是它们信号噪声比较低， 线性范围窄，与离子选择电极相联系的免疫传感器不可避免地要受到其他离子的 影响，并未得到实际应用【z 引。 口肇秒： o _ _ 。_ * _ _ _ _ _ _ _ 。_ 。自- - - 一 d 蕊兰 e 图1 5 无试剂免疫传感器实例纠 ( 3 ) 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是利用免疫反应产生或消耗离子，引起溶液或薄膜的电导 率发生变化来进行分析的传感裂2 6 1 。通常是通过固定在电极表面的酶催化底物 的反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而改变溶液的导电率。由于 待测样品的离子强度与缓冲液电容的变化会对这类传感器造成影响，加之溶液的 电阻是由全部离子移动决定的，使得它们还存在非特异性问题，因此这类免疫传 感器发展比较缓慢【2 7 】。 ( 4 ) 电容型免疫传感器 电容型免疫传感器是基于在双电层理论上的一种传感技术，物质的吸附和表 面电荷的改变对双电层结构都产生显著影响。金属电极插到溶液中时，电极溶 液界面的行为类似于平板电容器，电容器的电容值与金属电极表面介电层的厚度 和( 或) 介电常数相关，理论方程为： c = a o d 。 其中c 为界面电容，0 为真空介电常数，8 为电极溶液界面物质介电常数， 东华大学硕士学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 a 是电极与溶液的接触面积，d 是界面层厚度。当极性低的物质吸附到电极表面 上时，d 就会增大，就会减少，从而使界面电容降低。蛋白质分子量大、极性小， 当它吸附到电极表面时，会显着地降低电极溶液界面电容。 电容型免疫传感器是将抗体固定在电极表面，当抗原抗体在电极表面结合 时，界面电容相应地降低，据此检测抗原的量。同其它生物传感器一样，敏感膜 的制备技术是电容型免疫传感器中最为重要的环节。它要求首先在基底表面形成 一种电绝缘层，否则就会构成一种所谓的“短路 状态，电容传感器的质量最终 取决于敏感层的绝缘性。大部分选用的基底是金属和半导体 28 1 。杨柳俐等基于 电沉积生物活性的纳米羟基磷灰石在修饰电极上和使用二乙烯基砜进行共价键 合，成功建立了一种新的抗体固载方法并用于电容免疫检测。据此制备了一种非 标记的免疫电容传感器。与传统的免疫分析相比，优点在于可以实时监测抗体一 抗原反应，由于略去了标记步骤，从而简化了分析过程。 ( 5 ) 阻抗型免疫传感器 2 0 世纪6 0 年代初，荷兰物理化学家s l u ”e r s 在实验中实现了交流阻抗 谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c 仃o s c o p ye i s ) 方法在电化学研究上的应用，成 为e i s 的创始人。电化学阻抗谱是一种以小振幅的正弦波电位( 或电流) 作为扰动 信号的电化学测量方法。微小振幅正弦电压( 或电流) 不会对生物大分子造成干 扰，敏感性高，使其有可能成为一种良好的生物传感技术或与其他传感技术互 补，具有广阔的应用前景。目前，阻抗谱分析方法已在各种生物传感器中有所应 用【3 0 1 。 电化学阻抗的原理为测试的阻抗谱包括一个实轴z r e 部分和一个虚轴z i m 部 分，分别代表电解池的阻抗和电容。电极的交流阻抗z = z r 叶j z i m 。n y q u i s t 图是 以阻抗虚部z i m 对阻抗实部z r e 作的图，是最常用的阻抗数据的表示形式。如图 1 6 a 所示。 n y q u i s t 由一段半圆部分和一段直线部分组成，分别出现在交流频率在较高 和较低时的两种极限情况。半圆部分受电子转移速率控制，直线部分受扩散控制。 依据r a n d l e 和e r s h l e r 理论，对于一个发生氧化还原反应的电解池，可以模拟出 如图1 6 ( b ) 所示的等效电路，该等效回路包括一个溶液电阻r s ，代表电解液电 阻；个w 拍u r g 阻抗z w ，代表离子从溶液到电极表面因扩散产生的阻抗；一 个双电层电容c d l ，是电极电解质界面双电层的电容；以及一个电子转移阻抗 r e t ，代表氧化还原对的电子传递电阻。其中r s 和z w 分别由电解液的性质和氧 化还原探针在溶液中扩散的性质决定，不受电极表面电化学反应的影响。c d l 和 r e t 的大小则由电极电解质界面介电性质和绝缘性质决定。r e t 控制着氧化还原 探针在电极表面电子转移速率。表面被修饰后，当电极这层修饰物会促进或阻碍 电子在电极表面的传递，使得电子转移阻抗发生变化( 减小或增加) 。 东华大学硕士学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 五蚋 b n 客 i1 一 ll 。 一。r 1 厂蔷矗 图1 6 电化学交流阻抗的n y q u i s t 图( a ) 和r a l l d l e 等效电路( b ) 【3 。 阻抗型免疫传感器的基本原理是基于抗原抗体之间的结合降低了电活性探 针分子同电极之间的电子转移速率，即增加了电子转移阻抗r e t 。通过测量免疫 结合前后电子转移阻抗之差可以实现高灵敏检测的目的。另外，电化学交流阻抗 谱可以直接测试传感界面的物理化学性质，而不需要通过另外的标记放大测试信 号，简化测试步骤，大大缩短测试时间，也利于实现微型化和现场检测【3 2 】。 c h e nh u a n 等【j 副建立了一种基于金纳米粒子标记抗体放大检测信号的电化 学交流阻抗免疫传感器，用于人i g g 的检测，优化条件下，传感器在15 3 3 2 8 3 n li g g 范围内表现出良好的线性关系，检测限达到4 1n l 。 1 3 3 免疫界面生物识别分子的固定方法 生物识别分子的固定技术是免疫传感器性能好坏的关键。抗原抗体的固定方 式、数量及活性等直接影响传感器的重现性、检测限及循环使用等性能。为了研 制灵敏度高、选择性好、成本低而且寿命长的生物传感器，固定化技术一直是研 究的热点。通常，将生物识别分子固定于基底电极上或者固体基质内，主要有以 下几种基本方法： 1 3 3 1 吸附法 通过生物分子极性键、氢键、疏水键、静电以及兀电子等的相互作用，将生 东华大学硕l ：学位论文电化学阻抗免疫传感界面构建及其应用于多环芳烃的检测研究 物识别分子吸附于不溶性载体上的固定方法称为吸附法。常用的吸附载体包括： 无机多孑l 材料、活性炭、纳米粒子、离子交换树脂等。该方法具有操作简单，无 需使用化学试剂、生物组分不易降解、对生物活性影响小、成本低等特点。但是 存在易脱落，对溶液p h 值、温度、离子强度和换能器表面状况较为敏感等缺点。 1 3 3 2 包埋法 包括高分子载体包埋法、电聚合高分子包埋法。高分子载体包埋法免疫生物 分子包埋并固定在高分子聚合物三维空问网状结构中，常用的载体有聚丙烯酞 胺、n a f i o n 等合成的高聚物以及海藻酸、明胶、壳聚糖等天然的溶胶状高聚物等； 电聚合高分子包埋法是通过将聚合物单体和生物分子同时混合于电解液内，使单 体在电极表面氧化而聚合成聚合物薄膜，如聚毗咯( p p y ) 、聚苯胺等，从而将免 疫分子直接固定在电极表面；该方法实验条件温和，操作较简单，固定较牢固， 聚合物膜的孔径和厚度可控，对生物分子活性影响较小，但是增加了空间位阻， 不利于免疫结合，同时也不利于底物与产物的扩散 3 4 】。 1 3 3 3 共价键合法 共价键合法是通过共价键将生物识别分子固定于电极基质表面的方法，通常 要求在低温、低离子强度下和低p h 条件下进行。该方法的优点是结合较为牢固 且共价键通常情况下比较稳定，所以不易脱落。但是，由于共价键合反应可能引 起免疫分子结构变化，破坏部分活性位点，从而损伤抗原抗体的活性，而且操 作过程复杂、成本较高【3 5 i 。 1 3 3 4 交联法 交联法是通过采用双功能团试剂将生物分子共价结合到惰性载体上，或者生 物分子直接与载体共价交联形成网状结构。常用的交联剂有1 。乙基3 ( 3 一二甲氨丙 基) 一碳化二亚胺( e d c ) 、n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和戊二醛等。该法操作简 单，生物分子不易脱落，缺点是反应难以控制，所需的生物样品量多。 1 3 3 5 分子自组装法 自组装方法是近几年发展起来的通过自发的化学吸附( 通常是静电作用) 或 键合作用，在传感器界面形成二维有序单层膜，其特点是高度有序、定向密集、 组织完好和稳定的单分子层，如果自组装分子具有两个或者以上的活性基团，则 又可与别的物质反应，如此反复，构筑同质或异质多层膜。基于硫金体系的自 组装膜是目前的研究热点 3 6 1 。单层自组装方法操作简便，具有良好的稳定性、 有序性，但对自组装分子结构有限制，且容易受到杂质吸附、分子聚合、溶剂选 择、基片表面物理性质的影响【3 7 。 1 3 4 电化学免疫传感器的应用 电化学免疫传感器具有选择性好，种类多，测试费用低，不受样品颜色、浊 度的影响，所需仪器设备相对简单、快速、体积小等诸多优点。能广泛应用于医 9 东华大学硕士学位论文 fc l 化学阻抗免疫传感界面构建及j 应用于多环芳烃的检测研究 疗、食品分析、环境检测等领域。 1 3 4 1 食品卫生检测 电化学免疫传感器在食品检测中的应用主要体现在对生物性危害的检测。食 品中生物性危害主要包括致病菌、病毒、毒素等。t s e k e n i s 等【38 j 采用交流阻抗无 标记免疫传感器检测牛奶中的环丙沙星含量，用电沉积法将聚苯胺沉积到丝网印 刷电极上，用于固定环丙沙星抗体，带有抗体的电极接触到牛奶中的抗原物质， 电极的阻抗感应值随着抗原浓度的增加而增加。x i a of e i 等【”j j 各苏丹红i 号抗体 共价固定在金电极上，采用交流阻抗法，构建了检测苏丹红i 的电化学免疫传感 器，应用于实际辣椒样品的检测中，测试回收率在9 6 5 1 0 7 3 。 1 3 4 2 医学临床诊断 电化学免疫传感器在临床传染病检测中的应用主要体现在对传染病病原体、 特异性抗原和病原体感染后刺激机体所产生的特异性抗体的检测。还可以用来测 量多种细菌、病毒以及各种致癌物质。g e n g 等 4 0 】采用酶标抗体与大肠杆菌相 结合发展了一种电化学酶联免疫方法来检测大肠杆菌。酶与底物反应产生具有电 化学活性的物质l 一萘酚，并采用方波伏安法检测该电活性物质，得到的电流大小 与细菌的浓度成线性相关，检测限为4 7 x 1 0 3 c m m l 。袁若课题组在癌胚抗原 ( c e a ) 和甲胎蛋白( a f p ) 肿瘤标志物的检测方面，做了大量的研究，开发出 了多种电化学免疫传感器用于这两种物质的临床检测。 1 3 4 3 环境监测 传统的环境污染物分析过程常常需要繁杂、冗长的萃取、提纯、浓缩、色谱 分离等步骤，且试剂用量大、费用高，而电化学免疫传感器是以特异性的亲和反 应为基础，通过检测平衡状态时抗原抗体复合物，实现待测物的分析测定。免 疫化学反应发生在传感器表面，可以很方便地与未反应的抗体( 或抗原) 分离，特 异性好，灵敏度高，能在较短时间内进行痕量物质检测【4 l 】。并且可以实现自动 化、小型化，以及对单( 多) 种物质进行实时、在体、在线测定。 杀虫剂、农药、激素类物质都是小分子物质( 半抗原) ，它们必须先与一大分 子蛋白质连接，通过免疫实验，在生物体内产生抗体，杀虫剂、农药、激素类小 分子与产生的抗体可以产生特异性的结合，因而也可使用免疫传感器对其进行检 测。p a r e l l a d a 等【4 2 j 综述了电流型免疫传感器在环境检测方面的应用。 1 4 本课题的研究目的及意义 多环芳烃类物质数量多，分布广，对人类危害极大，有多种p a h s 已被鉴定 出具有致癌性，这使得近年来对于p a h s 的检测研究成为一个新的热点。美国环 保局将1 6 种p a h s 列为优先控制污染物并作为环境监测必检项目。因此，非常 有必要对上