（皮革化学与工程专业论文）极稀溶液中胶原蛋白分子构象稳定性研究.pdf

摘要胶原蛋白构象稳定性的提高对其应用性能的增强和应用范围的拓展具有重要意义。胶原蛋白分子侧链含有丰富的带电基团，许多金属离子可以通过与这些带电基团之间的配位反应使胶原蛋白发生分子内或者分子问的交联，这对提高胶原分子构象的稳定性非常重要。体系的p h 值、离子强度和温度等条件都能影响交联反应，从而改变胶原蛋白分子构象的稳定性。考察上述因素对胶原蛋白分子构象稳定性的影响对认识胶原的本质和应用有重要的理论和实际意义。胶原蛋白分子的物化性质，如分子量及其分布、等电点、带电基团的含量是影响胶原蛋白性能和应用的重要参数。本文采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法测量了实验用胶原蛋白的分子量及其分布，发现其分子量大约为3 0 0 k d 且分布非常集中；采用粘度法测定了i 型胶原蛋白的等电点；采用电导滴定法测定了胶原蛋白侧链羧基的含量，为量化胶原蛋白与金属离子的反应提供了可行的方法。通过粘度法和光散射法对胶原蛋白极稀溶液的研究具有较好的一致性，由于胶原蛋白结构的特殊性，当其溶液从稀区进入极稀区的过程中，表现出高分子极稀溶液的粘度依赖性现象，从而证明了胶原蛋白溶液动态接触浓度的存在。本文测量了一定条件下胶原蛋白溶液的动态接触浓度，并利用粘度法考察了p h 值、离子强度和温度对溶液动态接触浓度的影响。a l ”可与胶原分子侧链的羧基、羟基反应，使胶原蛋白发生交联，构象发生改变。影响两者反应的因素主要有： a 1 3 + c o o 】、溶液的p h 值、离子强度和温度，本文采用粘度法和光散射法剥这些因素产生的影响进行了研究。关键词：胶原构象稳定性交联粘度光散射动态接触浓度a b s t r a c tt h ei m p r o v e m e n to fc o l l a g e nc o n f o r m a t i o ns t a b i l i t yi ss i g n i f i c a n tt oi t sa p p l i c a t i o n t h e r ea r ea b u n d a n ti o n i z e dg r o u p so nt h es i d ec h a i n so fc o l l a g e na n dt h ec o l l a g e nc o n f o r m a t i o ns t a b i l i t yc a nb ei m p r o v e db yc r o s s l i n k i n gb e t w e e nm e t a lc o o p e r a t e sa n dt h ei o n i z e dg r o u p so fc o l l a g e n t h ec r o s s - l i n k i n gc a nb ea f f e c t e db yp h ，i o n i cs t r e n g t ha n dt e m p e r a t u r e ，w h i c hc a l li n f l u e n c et h ec o l l a g e nc o n f o r m a t i o ns t a b i l i t y i n v e s t i g a t i o no fe f f e c t st ot h ec o l l a g e nc o n f o r m a t i o ns t a b i l i t yc a u s e db yp h ，i o n i cs t r e n g t ha n dt e m p e r a t u r ei sv e r yi m p o r t a n tt oa p p l i c a t i o n so f c o l l a g e n t h ep e r f o r m a n c e sa n da p p l i c a t i o n so fc o l l a g e na r ea f f e c t e db yt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e rs u c ha sm o l e c u l a rw e i g h ta n di t sd i s t r i b u t i o no fc o l l a g e n ，t h ei s o e l e c t r i cp o i n ta n dt h ec a r b o x y lc o n t e n t so fc o l l a g e n t h em o l e c u l a rw e i g h ta n di t sd i s t r i b u t i o ni sm e a s u r e db ys d s p a g ea n dt h em o l e c u l a rw e i g h to fc o l l a g e nw eu s e di ne x p e r i m e n ti sa b o u t3 0 0 k d t h ei s o e l e c t r i cp o i n to fc o l l a g e ni sd e t e r m i n e db yv i s c o m e t r y t h ec o n t e n to fc a r b o x y li sm e a s u r e db yc o n d u c t o m e t r y , w h i c hg i v e sap r a c t i c a lm e t h o dt oq u a n t i f i c a t et h er e a c t i o nb e t w e e nm e t a lc o o p e r a t ea n dc o l l a g e n r e s u l t so fr e s e a r c ha b o u td i l u t ea n de x t r e m e l yd i l u t i o nc o l l a g e ns o l u t i o n sb yv i s c o m e t r ya n dd l sa r ec o n s i s t e n t ，t h ea b n o r m a lo f v i s c o s i t yo f p o l y m e rs o l u t i o n si sf o u n di ne x t r e m e l yd i l u t ec o l l a g e ns o l u t i o n s ，w h i c hh a sp r o v e nt h ee x i s t e n c eo fd y n a m i cc o n t a c tc o n c e n t r a t i o n ( c s ) t h ec so fc o l l a g e ns o l u t i o n su n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n si sm e a s u r e db yv i s c o m e t r ya n dd l sa n dt h ef a c t o r sa f f e c t e dc sa r ed i s c u s s e di nt h i sa r t i c l e a 1 3 + c a nr e a c tw i t hc 0 0 a n do h o nc o l l a g e ns i d ec h a i n s ，w h i c hc a ns t a b i l i z et h ec o l l a g e nm o l e c u l e sb yi n t e r a c t i o no ri n t r a - a c t i o no fc o l l a g e nc h a i n s f a c t o r ss u c ha s a l f c o o 一】，p i t ，i o n i cs t r e n g t ha n dt e m p e r a t u r ea f f e c t e dt h ec r o s s l i n k i n gb e t w e e nc o l l a g e na n dm e t a lc o o p e r a t ea r ei n v e s t i g a t e db yv i s c o m e t r ya n dd i ，s k e yw o r d s ：c o l l a g e nc o n f o r n r a t i o ns t a b i l i t yc r o s sl i n k i n gv i s c o m e t r yd l sc s山东轻_ _ 】二业学院硕士论文第一章绪论胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物高分子，广泛地存在于动物的骨、腱、皮肤及其它结缔组织中，具有支撑器官、保护机体的功能。对于胶原蛋白的研究，可以分为两个大的方面：生命科学、医学领域的基础研究和皮革等工业领域的应用研究【1 1 。在生命科学和医学领域，人们通过了解胶原蛋白结构的变化来推测某些病变的位置、原因，以研究某些因胶原蛋白的变性而引起的疾病，寻求治疗方法；在工业领域，人们通过探究胶原的结构特性，改进胶原的物理化学性质，使之成为具有良好生物兼容性的应用材料，例如在制革工业中，人们通过改变生皮中胶原纤维的交联结构，使之成为具有良好性能的皮革制品。近年来，随着胶原提取技术的发展，人们对其性质、结构等方面的研究逐渐深入，对胶原蛋白生物功能的认识日益提高，胶原蛋白的研究及应用己成为一个热点。胶原蛋白以其良好的生物兼容性已经在食品、纺织、化妆品和生物医学材料等多个领域发挥着巨大的作用，具有广泛的发展前景 2 - 4 1 。1 1 胶原蛋白分子的结构1 9 4 0 年，应用枸橼酸钠缓冲液从大鼠皮肤中溶解出可溶性胶原蛋白，揭开了胶原研究的历史。到目前为止，至少发现了3 0 余种胶原蛋白链的编码基因，这些不同的胶原蛋白链以不同的方式结合，形成了至少1 6 种以上的胶原蛋白分子【5 | 。常见的i 、i i 、i i i型胶原分子，被称为经典的纤维形成胶原蛋白，大约占体内总胶原的8 0 9 0 。胶原蛋白分子大多是由3 条左旋的链经右手螺旋绞合而成的三股螺旋结构。三股螺旋的分子量约为3 0 0 k d ，其每条g 【链含10 5 2 个氨基酸残基，长度大约是3 0 0 n m 。在这个超螺旋体中，各条肽链借助甘氨酸残基的肽键之间形成的氢键交联在一起垆j 。除氨基酸残基侧链的极性基团产生的离子键、氢键等次级键外，胶原分子内和分子间还存在着醇醛缩合交联、醛胺缩合交联和醛醇组氨酸交联，这些交联使得各条肽链之间牢固地连接起来，从而使胶原分子具有非常稳定的结构。在胶原分子链的三股螺旋结构中，每3 个氨基酸残基( g l y x y ) 就有1 个_ 甘氨酸残基，因为在所有的氨基酸残基中只有甘氨酸残基的侧链较短，三股螺旋结构的中心只能容纳甘氨酸残基，而没有足够的空阳j 容纳其他的氨基酸残基，同时也不至于影响第一章绪论三股螺旋结构的形成；而x 和y 位点上的氨基酸残基2 0 2 2 是亚氨基氨基酸，即脯氨酸和羟脯氨酸残基，而羟脯氨酸中的羟基对于氢键的形成以及三股螺旋结构的稳定性都是必需的；螺旋和非螺旋结构区赖氨酸和羟赖氨酸残基的共价交联，对于胶原分子内部不同结构部分之间或胶原超分子结构中胶原与其他成分间形成的稳定结构来说也非常重要。1 2 胶原蛋白构象的研究方法1 2 1x 射线衍射法x 射线技术多用于晶体方面的研究，虽然皮纤维结构复杂，含有许多非晶体成分，但也含有取向性好、结晶度高的肽链螺旋结构，因此这些结构可以用x 一射线衍射加以表征。在皮胶原的x 射线衍射谱图中，通常存在两个特征峰，分别表征皮胶原的复合螺旋间距与肽链间距。通过胶原两个特征峰位和峰强的变化可以推断胶原中肽链间距的变化，从而了解体系环境变化对胶原构象的影响【”。1 2 2 二维红外光谱法在红外光谱的基础上，1 9 8 6 年is a on o d a 首先提出了二维红外光谱( t w o d i m e n s i o ni n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，2 d i r ) 的概念【8 1 ，这是建立在对红外信号的时间分辨检测的基础上，研究分子内官能团之间和分子间相互作用的新方法。在二维红外光谱中，系统受到内部微扰的激发，产生红外吸收光谱的动念变化，对时间变化的红外信号进行相关分析，从而产生二维红外光谱。由于二维红外光谱具有很好的分辨率，在研究蛋白质的二级结构方面有独特的优势，日益引起关注，已经被用于肌红蛋白、血清清蛋白、乳白蛋白的研究中。人们主要利用二维相关分析对它们的二级结构进行解析，研究它们的二级结构在温度、压力等外界因素变化时发生的改变。肖和兰【9j 等人利用傅立叶红外光谱方法和二维相关分析研究了温度从1 5 到9 5 变化时胶原蛋白分子构象变化的规律，发现胶原蛋白在升温过程中，三股肽链之间的氢键减弱，逐渐解螺旋，每条肽链因伸直其螺旋度减少，整个蛋白的无序结构增加：胶原蛋白的二级结构变化先后顺序为c h 构象的变化 酰胺i 酰胺i i 酰胺i i i c h 2 构象的变化。1 2 3 激光拉曼光谱法振动光谱可以提供有关生物高分子材料化学组成以及二级和山东轻工业学院硕士论文三级结构方面的信息。例如，可以从蛋白质的红外和r a m a n 光谱中获得有关氨基酸序列及其三维结构方面的证据。实验表明，构成生命的许多基本要素一蛋白质、多肽等能被分离并用传统的r a m a n技术和共振r a m a n 技术对其进行研究。不过，存在于生物材料样品中的杂质和发色团往往会产生荧光效应，有些样品在经受可见光辐照时会发生破坏或变质，从而阻碍了有效数据的获得。原则上，使用近红外激发的f t r a m a n 光谱可克服上述缺点，即可对易发生激光诱导分解和荧光效应的体系进行研究。董瑞新 1 0 】等人在不同温度下对i 型胶原蛋白进行了拉曼光谱测定，发现随温度的升高，多数谱线向低波数移动，但c h 2 的变形振动谱线13 0 2c m 。1 向高波数移动，苯丙氨酸的特征振动谱线1 0 0 3c m 。的波数基本保持不变。同时还给出了拉曼谱线强度随温度的变化关系，得到了0 、4 0 、6 8 、9 0 四个变性峰，其中4 0 、6 8 的峰与d s c ( 差示扫描量热法) 和s h g ( 二次谐波法) 的测量结果一致，0 的峰为冰冻相变，9 0 的变性峰为胶原的二级结构被破坏所致；当温度达到15 0 时，谱线强度显著降低，大部分谱线消失，胶原的一级结构遭到破坏；实验还发现胶原纤维在低温区具有较好的复性特性。1 2 4 原子力显微镜法原子力显微镜( a f m ) 是一种可以在实空间观察到原子级分辨率图像的实验仪器，通过它可以观察到单个原子在物质表面的排列状态，了解表面电子行为有关的物理化学性质。a f m 探测针尖和被测样品之间的相互作用力，不受样品导电性的影响，可在大气条件下以高倍率观察样品表面，且不需要进行任何表面处理，可得到样品表面的三维形貌，因此得到了广泛的应用。广州暨南大学的何晓青等人j 用a f m 观察了不同浓度、p h值的i 型胶原溶液在云母表面的自组装情况，从而研究了胶原溶液浓度、酸度对胶原蛋白自组装的影响。结果表明，在酸性条件( p h = 2 7 ) 下，低浓度( c = o 8 i _ t g m l 、8 9 9 m l ) 的胶原蛋白在云母表面只是简单的吸附；随着浓度的增加( c = 0 5 m g m l 、1 0 m g m l ) ，胶原分子在云母表面开始组装成网状的结构；当浓度达到饱和浓度( c = 4 0 m g m l ) 时，胶原形成无规线团结构( c o i l ) 。在中性条件( p h = 7 2 - 7 4 ) 下，胶原更容易形成纤维，随着浓度的增加，纤维的长度和直径都增大。第一章绪论m c g o h 等【1 2 ： 用光散射和a f m 研究了加热条件下胶原单体组装成胶原纤维的过程，并提出了胶原蛋白分子逐级组装的假设模型。首先是胶原单体沿轴向的相互作用，随着胶原分子不断进行轴向连接，它们之间的横向作用逐渐加强，在连接达到一定的长度后，它们之间开始产生横向连接，从而形成短的微纤维。这些短的微纤维进一步延长形成长的微纤维，接着短的微纤维附着到长的微纤维上，最后形成了胶原纤维。1 2 5 其他方法p a u lj f l o r y 等人l i ”研究了稀溶液中鼠尾腱胶原的螺旋无规线团的转变，发现这种转变在一定温度范围内是一种可逆过程。当转变过程中温度和浓度发生变化时，伴随着溶液粘度和旋光度的变化。在胶原的螺旋一无规转变过程中，当温度从35 升到4 0 时，转化速率提高了大约13 0 倍；在3 5 到38 这3 的区间中，粘度和旋光度较长时间内保持不变，可能是由于存在一个构象转变的平衡过程。胶原分子可以以聚集的晶态( c r y s t a l l i n es t a t e ，c ) 存在，还可以在溶液中以原胶原螺旋( t r o p o c o l l a g e nh e l i c e s ，h ) 或是无规线团( r a n d o mc o i l s ，r c ) 的形态存在。e s t e l l ab i a n c h i 等人【14 1 在接近等电点的条件下研究了胶原三种形态之间的转变：c - - , r c ( i ) 、h r c ( i i ) 、h c ( i i i ) ，并且考察了温度、盐类型、盐浓度对三种转变的影响。当胶原从有序结构向无序结构转变时，如i 、i i ，是放热过程，而当其从无序结构向有序结构转变时，是一个吸热过程。1 3 影响胶原蛋白构象稳定性的因素氢键对胶原构象的稳定起着重要作用，研究表明在o l y x y三肽中，以g l y p r o h y p 对三股螺旋稳定性的贡献最大，这是因为羟脯氨酸参与了链间氢键的形成；o u s t a v s o n 也提出胶原纤维在4 0 一6 5 范围的湿热稳定性是依赖于羟脯氨酸上的羟基与相邻肽链上的羟基之间形成的氢键来维持的【1 ”。除了链间氢键，分子内和分子间的共价交联是赋予胶原高度化学和物理稳定性的又一重要因素，已知的交联方式有三种：酰胺缩合、羟醛缩合、羟醛组氨酸交联，它们都与赖氨酸、羟赖氨酸侧链的氨基有关；值得注意的是，这些交联结构都是可还原的，但是随着动物生理年龄的增加，可还原交联向不可还原性结构转变，从而使胶原结构更加趋于稳定。胶原分子间的侧向交联，对胶原原纤维表现出的高强度力学行山东轻下业学院硕士论文为具有重要意义，在s m i t h 四分之一错列模型中，同一轴上任意两个前后排列的原胶原分子头尾之问都有一段空隙( 约4 2 n m ) ，研究表明，在按四分之一错列排布的原胶原分子的头、尾部重叠区段通过赖氨酸或羟赖氨酸形成共价交联( 分别在氮端尾肽的第9 个残基位置( n 9 ) 和碳端尾肽的第17 个残基位置( c 17 ) ) ，以这种方式交联起来的原胶原分子，可以形成很长的具有机械强度的原纤维。总的来说，胶原蛋白分子内和分子间的结合都可以归结为以下几点因素：1 3 1 静电学因素( 1 ) 胶原分子大约有2 4 0 个赖氨酸、羟赖氨酸和精氨酸的氨基和胍基，以及2 3 0 个天冬氨酸和谷氨酸的羧基，这些基团都是带电荷的。在天然的纤维中，大部分基团通过分子内或分子间的相互作用形成离子键，给胶原纤维提供了很大的稳定能，只有少量的带电荷的基团是自由的。然而，通过改变环境的p h 值可以改变胶原纤维内的静电性质，由于氨基的解离常数大约是1 0 ，羧基的是4 ，在p h 值低于4 或高于1 0 时，静电相互作用被大大地扰乱，p h 改变的最终结果是减弱分子内和分子间的静电作用，生成溶胀的纤维，从而影响了胶原蛋白的构象。和氨基、羧基和羟基反应的任何试剂都可作为交联剂，与胶原蛋白侧链的基团发生交联反应，增加胶原蛋白的稳定性。( 2 ) 带电荷的离子与胶原纤维侧基的化学反应也能改变胶原蛋白的静电状态，从而影响胶原的构象稳定性。例如，赖氨酸和羟赖氨酸上的带正电荷的一氨基用醋酸酐进行化学修饰，将氨基转化为中性的乙酰基，修饰的结果增加了纤维的最终负电荷数量。相反，天门冬氨酸和谷氨酸上的带负电荷的羧基通过甲基化可以化学修饰成中性基团。在自然状态和生理条件下，每个胶原分子只有大约6 0 个游离羧基，这些基团有结合阳离子如c a 2 + 的能力，形成蛋白质c o o c a ，大约释放出能量5 ，0 2 k j t o o l ，这些能量对于完成氢键结合、离子键的相互作用是不够的，因为形成它所吸收的能量大约是6 7 0 k j t o o l 。然而，离子结合的程度在易溶盐如k c n s 存在下能提高，因为它能破坏离子键或改变p h 偏离胶原的等电点。大分子借助于共价键结合、离子键合、包埋、缠结或以上结合能与胶原结合。因此，应用化学修饰方法和调节溶液的p h 值一样，能得到一系列具有不同静电性能的胶原蛋白分子。第一章绪论1 3 2 空间因素美国宾州大学的兰德尔卡缅教授指出，从本质上来看，在拥挤的细胞，例如一个细胞罩的d n a 中，非常长的分子聚成螺旋结构是一个较佳的方式。在细胞稠密而拥挤的环境中，长分子链经常采用规则的螺旋状构造，这一构造有两点好处：可以让信息紧密地结合其中；还能够形成一个表面，允许其他微粒在一定的间隔处与它相结合。卡缅教授通过一个模型说明了这个问题：把一个能随意变形、但不会断裂的管子浸入由硬的球体组成的混合物中，管子就像是一个存在于十分拥挤的细胞空间中的一个分子。观察发现对于短小易变形的管子而言，u 形结构的形成所需的能量最小，空蒯也最少，而它的u 形结构，在几何学上与螺旋结构最为近似。卡缅指出：“看来，分子中的螺旋结构是自然界能够最佳地使用手中材料的一个例子。d n a 由于受到细胞内的空间局限而采用双螺旋结构，就像是由于公寓空间局限而采用螺旋梯的设计一样。”这是生物大分子采取螺旋结构的合理的数学解释。1 4 金属离子对胶原蛋白构象稳定性的影响一般认为，金属鞣剂是通过配位键与胶原上较多的羧基进行结台，使皮胶原具有良好的耐湿热稳定性i l “。a d c o v i n g t o n 指出胶原与鞣剂的反应率仅取决于胶原中离子化的羧基的数量。曾经有学者认为，金属鞣剂不一定要与皮胶原上的羧基结合，只与比羧基数量更多的碱性基( 如氨基等) 结合也可以，但是将裸皮中的羧基封闭，使鞣剂只能与氨基结合，鞣出的成革不耐沸水而且手感始终不如铬鞣革那样柔软、丰满，从而否定了上述观点。陈丽娟等采用原子吸收和控制p h 水洗法考察c u 2 + 与明胶大分子的结合能力，结果表明：当明胶浓度为19 ，p h = 3 9 时，水洗减少1 0 i _ t g g 左右的c u ”；增大明胶浓度到2 7 4 时，大量水洗也仅去除了2 3 u g g 的c u ”，因此推测金属离子是与蛋白质侧链基团配合的形式存在。金属配合物与胶原发生结台的位置是众多学者最为关心的问题，e h e i d e m a n nr ”1 等人在上世纪6 0 年代就从电子显微图像中的染色带及其它研究中发现，铬是与谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基相结合，其他方式的结合几乎是不可能的。从胶原的结构可以得到金属配合物与胶原结合的一些细节：带电荷的氨基酸的侧链排列对交联的牢度是非常重要的。5 个胶原链分子绕一个轴旋转形成一个微纤维，这种侧面排列通过自然交联的位置决定，因为这种自然交联不山东轻 ：业学院硕士论文允许在更大位置发生，仅允许在儿个埃之内。在胶原的一级结构中谷氨酸的侧链长度大约为5 。6 个a ，这些残基可以自由移动而且挠曲性很好，有结合能力的空间围绕在三条多肽中心形成的圆圈里。在胶原晶格早有四种位置的羧基可以和金属配合物发生交联同一分子内部三肽之间的羧基上：同一侧链基团在空间上相互重叠，很容易与铬交联，在1 d 区域内这样的位置总数为8 7 个：微纤维中不同分子的三肽侧链间：在某些情况下，两个三肽单位具有酸性氨基酸，少数情况下，四个三肽具有酸性氨基酸，此时会形成多点交联，这样的位置共有4 3 个；沿分子轴相邻的三肽之间：这种位置因为距离太远，有些不太可能与铬形成交联，这类位置共有1 9 个；交联发生在不同分子之间，且交联的两个酸性氨基酸在分子轴上错开一个三肽位置：在这些集团之间形成的交联可以促进胶原形成多点交联网络，这样的位置有6 1 个i m l 。如果一个交联分子有足够的交联点，而且尺寸合适，就会形成稠密的交联。考虑谷氨酸和天冬氨酸的p k a 差别，认为它们结合的几率几乎相等。然而现在有证据表明：反应很可能发生在侧链相对较短的天冬氨酸残基上这可能与反应的熵变有关。由此可以得出以下二则推论：( 1 ) 与赖氨酸的氨基作用所得到的游离羧基的活性相对很低，在提高t s 方面没有明显的效果。( 2 ) 增加天冬氨酸残基的数量可以提高有效交联作用。何有节、何先祺9 】利用核磁共振自旋晶格驰豫时间( t 1 ) 测定了天冬氨酸( a s p ) 、谷氨酸( g l u ) 等与c r ( ) 离子、稀土金属离子以及a l ( 四、m g ( ) 等的配合物不同位置质子的值，讨论了配合方式，通过计算c r ( 四天冬氨酸、c r ( i ) 一谷氨酸配合物中配体质子与中心离子之间的距离，对配合物的空问构型进行了推断。自旋- 晶格驰豫时间( t 1 ) 司以提供分子结构、动力学和热力学等方面的信息。t i 作为研究络合作用的探针，可以确定生物大分子的活性部位。若质子距配位点越近，则t 1 的变化会增大。根据试验结果，稀土金属离子n d 、c e ( 1 1 1 ) 加入到氨基酸后，c l h 的t 1 和a s p的p h 、g l u 的y h 的t 1 变化都很大，由此推断这两种氨基酸的两个羧基参与了配位：这些变化中，c 【h 的t 1 变化比d h ( a s p ) 、y h( g l u ) 的更大些，据此推测是由于氨基氮参与了配位。c r ( ) 离子加入到氨基酸后，各基团的h 的t l 变化都很大，h 比6 h ( a s p ) 、t - h ( g l u ) 的t 1 变化更大些，说明a s p 、g l u 的两个羧基和两个氨基都参加了配位。第一章绪论田云飞等人 2 0 利用原子力显微镜( a f m ) 研究了胶原纤维的精细结构，验证了“胶原纤维表面应存在6 7nm 左右的周期性结构”这一理论，并对由于探针本身形状引起的图形失真做了探讨。王小燕【2 l 】等人利用原子力显微镜准确直观地观察到i 型胶原蛋白形成的胶原纤维的种属差异性。这些研究都为更好地认识胶原纤维的精细结构提供了新的方法，从而使我们能够更加精确地判断金属配合物与胶原的作用点。金属配合物的结构、形态、数量等都对配合物与胶原的交联结合有很大的影响。通过对铬配合物长时间的研究发现，碱式硫酸铬主要是2 - 4 核的多核配合物，其中最多的是具有一或两个羧基和一个硫酸根桥键的二核配合物。从试验数据中可以知道两个铬之间的距离大约是3 a ，一个铬到最外面配体之间的距离大约是2 a ，这样二核到四核铬配合物的大小分别为7 a 、1 0 a 和13 a ，微纤维两个分子中心之间的距离是15 a ，从空间位阻的角度考虑，单核和四核铬配合物的量应该很少。r e n e l s o n 对作为抗汗剂的碱式氯化铝的研究表明，当碱式氯化铝中的羟基数与铝离子数之比为2 4 ( o h 一a 1 ”= 2 4 ) ，或者说碱度为2 4 3 = 8 0 时，碱式氯化铝的主要成份是含有13 个a 1 3 十的多核配合物。高剑新等 2 2 的研究进一步对此作出了肯定。张铭让等人从上世纪8 0 年代运用凝胶色谱、紫外可见光谱、红外光谱、离子交换色谱等方法，深入研究了铬鞣剂和铬锆铝多金属鞣剂鞣液的组成和性能的关系，并且提出：作为一种优良鞣剂，其组分必须具各：( 1 ) 鞣液中分子组分要多，一般七个左右( 2 ) 组分百分含量要相对均匀( 3 ) 组分分子大小和电荷分布要均匀( 4 ) 水合铬配离子少。丁克毅等人【23 1 应用凝胶过滤色谱( g f c ) 、a 1 核磁共振( ”a 1 n m r ) 2 及x 射线衍射等测试技术，研究了有机酸蒙囿硫酸铝配合物溶液的组分及组分的结构，对进一步认识铝鞣剂与胶原的结合有很大的指导意义。印度的n i s h a df a t h i m a n i s h t a r等人曾以二氯氧化锆和草酸锆为例，研究锆化合物与鼠尾键( r t t )的反应，结果发现锆鞣制的r t t 的湿热稳定性增加，而且二氯氧化锆比草酸锆的作用效果要强，n is h t a r 认为由于二氯氧化锆在溶液中生成了四核配合物，而草酸锆却以单核形式存在，这种结构上的差异导致了二氯氧化锆、草酸锆鞣性的不同。林炜等通过试验比较了c r c l 3 - a l c l3 、cr 2 ( s 0 4 ) 3 a i c l 3 等4 类铬铝溶液的稳定性、吸光率和耐碱性后发现：在一定的铝铬比范围内，cr ”、a 1 3 十之间存在山东轻t 业学院硕士论文着协同作用：并首次提出了c r a l 异金属配合物形成的取代反应模型。有人认为皮革丌始收缩时，不是受鞣制的热焓本质的影响，但是受熵本质的影响。c r ( ) 盐明显地增加活化热焓，结果g 升高，收缩温度升高，其他金属鞣剂产生不了这么大的h 。铝鞣的热焓比其他鞣剂鞣制低得多，但是其活化熵也低。c o n v i n t o n 从熵的角度有力地解释了铝( 四加速铬( 四鞣反应速率的问题：铝配合物使羧基定向，这有利于再和铬配合物反应。这里有类似于溶剂化作用，金属离子的溶剂化，或者和配位溶剂分子的结合是不稳定的，这意味着这种配位键易于生成，也易于断裂，所以溶剂化物的形成对胶原的有序性几乎没有影响，所以铝( ) 和胶原间的反应产生的熵变也小。由于热焓和熵的总效果，铝( ) 的配位作用的自由活化能比铬( 叨低得多。铬( ) 和铝( 叻与胶原羧基形成配合物是在同一个方向进行的，这意味着铝( ) 和胶原问的活性配合物的形成有利于能量的降低，降低了其后铬( 皿与胶原结合的能量的要求，从而迅速取代铝( 功和胶原形成牢固的结合。c o v i n g t o n 对鞣制反应中热焓的贡献进行了归纳，认为它遵从一些简单的规则金属鞣剂和胶原之间必须有稳定的、很高能量的相互作用，结合应该或至少部分是共价或多价氢键结合；交联键短而且有刚性。1 5 溶液中胶原蛋白构象稳定性的研究方法1 5 1 粘度法在高分子物理学的发展过程里，高分子稀溶液粘度的研究起了十分重要的作用，从中人们定义了一个重要参数：特性粘数b 1 ，它是指浓度趋近于无限稀释时的比浓增比粘度b 】_ l i m 玑。c ，其中玑。和c 分别是溶液的增比粘度和浓度。特性粘数实质上是孤立高分子链在溶液中的流体力学尺寸的表征，由此参数可获得关于单个高分子链的形态尺寸及溶剂化能力等方面的信息，所以测量特性粘数成了高分子表征的一一个重要步骤。( 1 ) 高分子稀溶液的浓度依赖性液体的粘度是液体分子进行相对运动时产生的一种内摩擦。e i n s t e i n 依据流体力学的基本理论，首先推导出描述含刚性球状粒子的稀悬浮液的相对粘度的方程：玎，= 1 + 【7 7 忙。然而，大量实验事实表明，e i n s t e i n 粘度方程并不适用于长链的高分子稀溶液，其实第一章绪论际粘度往往大大高于e i n s t e i n 粘度方程的预测值。h u g g i n s 根据大量的实验数据对方程进行修正得到了著名的h u g g i n s 方程：叩。c = h 】+ k t t b 】2 c ，h u g g i n s 方程形式简单，使用方便，能很好的描述绝大多数的实验数据，赋予的物理解释又比较直观，具有基础意义，目前已被普遍接受，并引发了许多关于h u g g i n s 方程的实验及理论研究。在高分子溶液粘度的有关实验中，通常都是在实验的浓度范围内，利用线性外推至浓度为零的方法，从h u g g i n s 方程求取特性粘数b 】和h u g g i n s 常数k 。，这样做实际上要求，即使溶液的浓度稀释到非常低的程度，h u g g i n s 方程也是适用的。然而，早在5 0 年代初人们就发现，在极稀浓度区高分子溶液的粘度往往表现出异常的行为，即当浓度低于某一特定值后，比浓增比粘度与浓度不再是简单的直线关系。当时对于这类异常现象提出了两种不同的解释，一种观点 2 4 - 2 6 1 认为，比浓增比粘度对浓度作图得到的曲线，在极稀溶液区产生偏离线性的斜率突变，反映了高分子线团在溶液行为中的临界现象的存在，并称此突变浓度为临界浓度。另一种观点2 7 。3 1 1 则认为该异常现象的出现主要是由于粘度测量过程中，高分子溶质吸附在粘度计毛细管管壁上导致毛细管的实效直径减小所致，因此，要得到只反映粘度行为的真实实验数据，必须首先消除溶质吸附等界面现象的干扰。吸附学说虽能很好的解释增比比浓粘度曲线在极稀浓度区向上弯曲的现象，却无法解释某些体系粘度曲线的向下弯曲，因而一直有人坚持认为，在极稀浓度区粘度曲线向下弯曲的突变点是一个特征转变浓度 3 2 , 33 】。华南理工大学的潘雁等人【】对测量高分子溶液粘度的过程中毛细管管壁与流动溶液间发生的溶质吸附等界面现象，作了详细的实验研究和理论分析，得到实验的表观相对粘度叩，。和真实相对粘度叩，。之间的定量厂矿r 1 、关系式：叩，。= 玎“。 1 + f 竺二i ，在重复年代的实验n4 - t 5 0o h m后，将所得的表观粘度用上式进行修正，所得的三组实验数据完全重合，说明高分子在毛细管管壁上吸附而产生的干扰效应可以完全消除。( 2 ) 高分子极稀溶液中的单分子链根据理论推测稀溶液早必定存在孤立的高分子链，但是，溶液究竟要稀到什么程度才能避免大分子间的相互作用的问题，长期以山东轻工业学院硕士论文来一直没有在理论上得到明确答案。8 0 年代初，钱人元等提出了动态接触浓度c s 的概念 3 6 , 3 7 1 ，以区别于d e g e n n e 提出的接触浓度c + 38 , 39 ，指出当浓度小于cs 时，溶液中的高分子链呈现孤立链的性质。动态接触浓度cs 要比c + 低好几个数量级，而且c s 的存在后来得到了体积排除色谱 4 0 1 和动态光散射4 1 1 等研究的证实。高分子在极稀溶液中将以孤立单链的形式存在，这既是一种逻辑上符合常识的判断，也得到了许多直观实验结果的支持，例如从极稀高分子溶液才能制得单链颗粒和单链单晶 4 2 , 43 l ，极稀高分子溶液经冰冻处理后只能产生链内物理交联 4 4 , 45 1 等。潘雁等人 4 4 1 又通过团簇理论直观的证明了极稀溶液中确实存在单分子链，只有当浓度超过一定值之后，才会出现诸如二聚体、三聚体的多聚团簇的形成。1 5 2 光散射法光散射技术是一门多学科的综合性技术，近年来，光电子和计算机技术的飞速发展使得光散射技术已经发展成为高分子和胶体研究的一种常用的测试手段，合成高聚物和生物大分子的许多重要性质是由大分子的分子量、分子形状和分子内部的可动性所决定。前者可通过静态光散射来确定，而有关大分子的内部运动和分子质心运动的信息，则可用动态光散射测得。在使用过程中，静态和动态光散射有机结合可用来研究高分子以及胶体粒子在溶液中的许多涉及到质量和流体力学体积变化的过程，如聚集与分散、结晶与溶解、吸收与解吸、高分子链的伸展与卷缩，并得到许多独特的微观分子参数。( 1 ) 静态光散射静态光散射中，通过测定时间平均散射光强的角度和浓度的依赖性，可以精确地得到高聚物的重均分子量m 。、根均方旋转半径r 。2 和第二维利系数a 2 。对高分子稀溶液或胶体分散液，小角度下测量所得的时间平均散射光强( 即r a y l e i g h 比g ( 0 1 ，0 为散射角)与m 。的关系为：罴= 上m w ( + 警3 a 酶砰旦2 + ”卜：c( 1 - ，)r 旧)l2。j。或简化为：罴= 上尬2 q2mw3卜。c( 1 - 2 )r f 们”其中：h = 4 r e2 2 ( d n d c ) 2 九4 称为光学常数，n 、d n d c 、九。和n a第一章绪论分别为溶剂的折光指数、溶液的折光指数增量、入射光在真空中的波长和a v o g a d r o 常数；c 为溶液的浓度；r ( 0 ) 为瑞利( r a y l e i g h )比，也称瑞利因子，当观测距离、入射光强度以及散射体积确定后，瑞利比是散射光强的量度：m 。为重均分子量；九= x o ，n 为入射光在溶液中的波长；r 。2 为均方旋转半径，是由高分子链的质量中心至各个链段的距离平方的平均值，反映高分子链的尺寸大小；0 和a 2 分别是散射角和第二维利系数；q = 4 n ns i n ( 0 2 ) l o ，称为散射矢量。用上式z i m m 作图，先外推c = 0 再以h c r ( 0 ) 对s i n 2 ( 0 2 ) 作图，截距给出1 m 。，再由斜率可得到r 。的数值：外推0 = 0 ，然后以h c r ( 0 ) 对c 作图，斜率为2 a 2 。这样，通过配制一系列不同浓度的溶液，测定各个溶液在不同散射角时的散射光强，用z i m m 作图法进行数据处理后，即可同时得到反映高分子链特征的三个基本静态参数m 。，r 。和a 2 。第二维利系数a 2 是组成粒子的各个散射体之间的相互作用的一种量度。当a ： o 时，各散射单元的作用力是相互排斥的，即对于高分子链来说，是处在良溶剂中，分子呈现扩张的趋势。另外，对稀溶液，当q r 。茎1 时，式( 1 2 ) 可以简化如下：竺：上f 1 + 三殿z gz1( 1 3 )r ( 0 )m w l3 4 利用静态光散射技术，可以有效地检测、跟踪高分子的质量、尺寸及形状的变化。因此，这一方法在高分子溶液性质及有关高分子的结构与形态研究中占有重要地位。由于散射光强的测定不依赖于溶剂环境和操作方法等外界条件，所以它是绝对的、直接的测定分子量的方法，测定范围是10 4 1 07 。( 2 ) 动态光散射动态光散射是测量散射光强随时间的涨落，因此称作“动态”。动态光散射是借助光子相关原理检测因布朗运动及d o p p t e r 效应而产生的散射光的微小频移而得到散射质点动态行为信息的技术。频移的方向及大小与散射质点运动的方向和速度有关，散射光场以入射光频率( i ) 1 为中心而展宽，即形成频率位移不大的散射光中心成份，频移范围一般在1 1 0 6 h z ( 而入射光频率一般在10 ”h z 数量山东轻t 业学院硼二匕论文级) ，所以称之为准弹性光散射或动态光散射。散射光的频移，包含了丰富的分子动态行为的信息。由于散射中心成分频移很小，需要用到光子相关技术这种特殊的检测手段，故动态光散射又常称为光子相关光谱。由于在散射信号中准弹性成分微弱，所以在激光问世后该技术才有可能建立和发展。它是由测定散射光中微小的频移及其角度依赖性来获得关于散射质点的动态行为，如稀溶液中高分子或胶体质点的平动扩散系数及对应的流体力学半径等动力学参数，半稀及浓溶液乃至固体材料中高分子的运动行为等。该技术不仅具有不干扰、不破坏体系原有状态的优点，而且对于多分散体系还能提供关于质点大小分布的信息。就分子尺度而言，此技术适于长程范围，约1 n m 至1 肛m ，涉及运动过程的时标属于长时间效应，约l 扯s 至1s 。在高斯光场白拍模式中，实测的是光强时间相关函数g ( 2 ( t ) ，然后求得散射电场时间相关函数g ( 1 ( t ) ，再由g ( 1 ( t ) 经累积矩等方法得到线宽r 或平均线宽厂，最后由r 或r 计算出扩散系数d 。和粒子尺寸大小参数r h ，若还需知道分布，则可由g ( 1 ( f )经拉氏变换得到线宽分布函数g ( f ) ，再经转变后求得分子量分布。其中，g ( 2 ( t ) 与g ( 1 ( t ) 关系如下：g ( 2 ( f ) = a 1 1 + 6 i g ( 1 ( f ) ( 1 4 )l。j式中，a 是测量基线，t 是驰豫时间，b 是仪器常数，也称空间相干因子，是评价相关仪器综合质量的重要参数，反映了净信号( g( t ) a ) 与基线a 的最大比值。b 的范围在0 1 之间，若第一或第二通道得到b 值在o ，2 左右，即表明在光电信增管光阴极上，混频效率达到了使用要求。b 值越高，表明信噪比越高。对于一个多分散体系，gc l ( t ) 包含了所有散射粒子的贡献，其与特征线宽分布函数g ( r ) 的依赖关系如下：g 1 1 ( r ) = f g ( 啦“d r( 1 - 5 )g ( r ) d e 即是线宽为r 的粒子的统计权重，由式( 1 5 ) 可知，g ( r ) 可由g ( 1 ( t ) 的拉普拉斯反演求得。g ( r ) 分布求得之后，即可求扩散系数d 。，进而可求流体力学半径r h 。如果粒子的平动扩散( 即br o w n 运动) 系数是散射光强涨落第一蕈绪论的唯一因素，那么线宽计算公式如下：f = d t q 2( 1 6 )这罩，d 。是平移扩散系数，是描述高分子动态行为的基本参数：q是散射矢量。扩散系数与粒子的形状无关，这里仅假定研究的是平移扩散系数，由d 。再利用s t o k e s e i n s t e i n 公式，即可求得流体力学半径r h 。r h = k b t 6 n q d t( 1 - 7 )式中，k b 为波尔兹曼常数；t 是绝对温度；1 1 为溶剂的粘度。严格来说，溶质分子的形状不同，s t o k e s e i n s t e i n 公式的形式不同，这里的溶质指的是未溶剂化的粒子。长期以来，除非专门研究形状，在线团到球的转变、分子的聚集、缔合、相转变等经典研究中，都把溶剂化后的分子作为一种球体进行近似处理。此外，从流体力学半径的定义来看，无论是球状、椭球状、棒状还是其它形状的粒子，溶剂化后在溶液中的整体扩散运动都近似于球体的运动。因此在处理溶剂化后的粒子时，s t o k es e i ns t e i n 公式有着广泛的适用性。由式( 1 6 ) 可见，因为d 。对给定样品是定值，所以r 通过q 2 表现出角度依赖性，即有：f q 2 = d t = d t o ( 1 + fr 9 2q 2 )( 1 8 )并有：蹦( c ) = d ：( 1 + 世“c )( 1 9 )这里，d ? ( c ) 、d 品分别为零角度、有限浓度和零角度、零浓度下的扩散系数，由此可见扩散系数的角度、浓度依赖性。由前面有限浓度及一定角度下所得的d 。，实际上是表观扩散系数。为得到真实的扩散系数