（制浆造纸工程专业论文）麦草浆木聚糖酶生物漂白的机理研究.pdf

摘要 随着生物技术的发展，木聚糖酶在造纸工业上的应用日益受到重视。但由 于木聚糖酶用于纸浆漂白的机理至今尚不完全清楚，这在一定程度上影响了木 聚糖酶在纸浆漂白中的广泛应用。为此国内外的科研人员对其进行了广泛、深 入地研究，并且取得了一定的成果。由于我国的国情是木材资源匮乏，而草类 资源丰富，因此研究草浆的生物漂白更具有现实意义。 本论文对木聚糖酶漂白麦草浆的工艺条件及其作用机理进行了研究。主要 进行了a u p e 8 9 木聚糖酶处理工艺条件的优化、木聚糖酶处理对c e i l 、h d 、 氧脱木素和0 p 漂白影响的研究，分析了木聚糖酶处理前后麦草浆的聚戊糖、 己烯糖醛酸含量的变化，利用扫描电镜、纤维测定仪研究了木聚糖酶处理前后 麦草浆纤维形态的变化，并利用紫外光谱、红外光谱、e s c a 分析了木聚糖酶 处理前后木素及木聚糖的降解。结果显示： a u p e 8 9 木聚糖酶处理麦草浆的较适宜条件为：酶用量7u 百1 ，温度 5 0 ，时间9 0 1 2 0 m i n ，p h 值7 o 8 0 ，浆浓8 。 木聚糖酶预处理和后处理对c e h 三段漂白有较好的辅助漂白作用。当酶 用量为7 0 8 5u g 1 时，木聚糖酶对c e h 三段漂白的助漂效果最为显著。 木聚糖酶处理结合h d 漂白流程漂白麦草浆可以在一定程度上改善纸浆 的可漂性。当木聚糖酶用量为7 5u g 。1 左右时漂白效果最为理想。 木聚糖酶处理用于氧脱木素中可以提高氧脱木素的效率，改善氧脱木素的 选择性。最适宜的木聚糖酶用量为7 5 1 0u 蛋1 。同时，木聚糖酶处理可以 提高o p 漂白浆的白度，改善漂白浆的物理强度。 木聚糖酶处理可以提高纸浆白度的稳定性，对c e h x 漂白浆来说，当酶 用量为1 0u g 。时，处理纸浆的白度和返黄改善率最高。 通过扫描电镜观察发现，经过酶处理后纸浆纤维变得柔软，纤维表面变得 蓬松，出现裂隙。纤维测定仪分析表明：木聚糖酶处理后麦草浆中长纤维的分 布频率降低，短小纤维的数量增加，细小组分含量增多。 木聚糖酶处理可以降低麦草浆中聚戊糖和己烯糖醛酸的含量，纸浆中沉积 在纤维表面的木聚糖的降解使部分与木聚糖形成l c c 的木素溶出，从而使纸 浆的白度增加，卡伯值降低。己烯糖醛酸含量的降低可以在一定程度上改善纸 浆的漂白性能。 紫外光谱分析表明，在木聚糖酶处理液中存在木素，这部分木素可能是由 于部分l c c 结构中木素一半纤维素复合体的降解产：生的。 红外光谱图分析表明，木聚糖酶处理可以降解纸浆中的木聚糖，使其含量 大大降低，同时还可以降解纸浆中部分的l c c 。对酶处理液和无酶处理液进行 红外分析发现，木聚糖酶处理较无酶处理可以使更多的木素溶出。 木聚糖酶处理还可以增加纸浆的结晶度，从而使得纸浆的物理强度也有所 增加。并且随着木聚糖酶用量的增加纸浆纤维素的结晶度随之增加。 通过e s c a 分析结果发现，麦草浆经木聚糖酶处理后其表面氧碳比降低 了，这表明纸浆表面木素浓度增加了。且随着酶用量的增加麦草浆表面的木素 浓度也随之增加。 关键词：木聚糖酶；麦草浆；漂白；l c c ；扫描电镜；己烯糖醛酸；化学分析 电子能谱 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to f b i o l o g i c a lt e c h n o l o g y , t h ex y l a n a s ea p p l i c a t i o n i s b e c o m i n gm o r ea n dm o r ei m p o r t a n ti nt h ep a p e ri n d u s t r y a st h em e c h a n i s mo f x y l a n a s et r e a t m e n to fp u l pi ss t i l li n c o m p l e t e l yc l e a ru n t i ln o w , w h i c hh a sa f f e c t e d i t sw i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni np u l pb l e a c h i n gi nac e r t a i ne x t e n td e g r e e ，m a n y r e s e a r c h e sh a v eb e e nc a r r i e do u tb yd o m e s t i ca n df o r e i g ns c i e n t i s t s c e r t a i nr e s u l t h a sb e e ny i e l d e dt o o i n0 1 1 1 c o u n t r y , w o o dr e s o u r c e sa r ev e r ys c a r c ea n dn o n - w o o d r e s o u r c e sw h i c hc a nb eq u i c k l yr e g e n e r a t e di ns h o r tt i m ei sa b u n d a n t ，t h e r e f o r et h e r e s e a r c ho f x y l a i l a s et r e a t m e n to f s t r a wp u l ph a st h ep r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i st h e s i s ，t h et e c h n i c a lp r o c e s sa n dm e c h a n i s mo fx y l a n a s et r e a t m e n to fw h e a t s t r a ww e r es t u d i e d t h eo p t i m a lt r e a t m e n tc o n d i t i o n sw i t hx y l m l a s ea u - p e 8 9w e r e d e t e r m i n e d t h ee f f e c to fx y l a n a s et r e a t m e n to nc e h ，h d ，o x y g e nd e l i g n i f i c a t i o n a n do pb l e a c h i n go fw h e a ts t r a wp u l pw e r ei n v e s t i g a t e d t h er u l eo fp e n t o s a na n d h e x a sc h a n g ei nw h e a ts t r a wp u l pw a sm e a s u r e dd u r i n gx y l a n a s et r e a t m e n tt o o f u r t h e r m o r e ，t h ec h a n g eo fp u l pm o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r ew a sa n a l y z e db ys e m ( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ) a n d f i b e r a n a l y z e r i t w a sa l s os t u d i e dt h e d e g r a d a t i o no fl j g n i na n dx y l a no fw h e a ts t r a wp u l pa f t e rx y l a n a s et r e a t m e n tw i t h u v ，f t i r ，e s c a a n dt h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea st h ef o l l o w s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rw h e a ts t r a wp u l px y l a n a s et r e a t e dw i ma u p e 8 9w e r e ： e n z y m ed o s a g e7u g ，t e m p e r a t u r e7 0 。c ，t i m e9 0 1 2 0m i n ，p hv a l u e7 o 8 0 ， p u l pc o n s i s t e n c y8 t h ep r e - t r e a t m e n ta n dp o s t t r e a t m e n tw i t hx y l a n a s eh a v eag o o df u n c t i o no f a s s i s t a n c et oc e h b l e a c h i n g t h ee f f e c tw a sm o s ti d e a lt oc e hb l e a c h i n gw h e nt h e d o s a g eo f x y l a n a s ew a s7 5 8 5u g w i t ht h es e l e c t e dh db l e a c h i n gs e q u e n c e ，t h eb l e a c h a b i l i t yo fw h e a ts t r a wp u l p c o u l db ei m p r o v e dw i t hx y l a n a s et r e a t m e n t t h eo p t i m u md o s a g eo f x y l a n a s ei s7 5 u - g x y l a n a s ep r e t r e a t m e n ti no x y g e nd e l i g n i f i c a t i o nc o u l dn o to n l yr a i s et h ee f f i c i e n c y o fo x y g e nd e l i g n i f i c a t i o nb u ti m p r o v et h es e l e c t i v i t yo fo x y g e nd e l i g n i f i c a t i o na s w e l l t h es t u d ya l s oi n d i c a t e dt h a tx y l a n a s et r e a t m e n tc o u l di n c r e a s et h eb r i g h t n e s s o fo pp u l p ，a n di m p r o v es t r e n g t hp r o p e r t i e so ft h ep u l p t h eo p t i m a lx y l a n a s e d o s a g ei s7 5 1 0u g - 1 t h eb r i g h t n e s ss t a b i l i z a t i o no fp u l pw a si m p r o v e dw i t hx y l a n a s et r e a t m e n t w h e n e n z y m ed o s a g ei s 10u + g ，t h eb r i g h t n e s sa n dr e v e r s i o ni m p r o v e m e n ti n d e xw a s t h eh i g h e s t t h es e mo b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tt h ex y l a n a s et r e a t n a e n tc o u l di m p r o v et h ef i b e r s w e l l i n g ，s o f t e n i n g ，a n dt h e r ew e r em a n yp o r e si nt h es u r f a c e sa f t e rx y l a n a s e t r e a t m e n t t h er e s u l t so ff i b e ra n a l y z e ds h o w e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o nf r e q u e n c yo f l o n gf i b e rw a sr e d u c e d ，t h eq u a n t i t yo fs h o r t e nf i b e rw a si n c r e a s e da n dt h et i n y c o m p o n e n tc o n t e n tw a sg o n eu p t h ec o n t e n t so fp e n t o s a na n dh e x ao fw h e a ts t r a wp u l pc o u l dd e c r e a s ea f t e r x y l a n a s et r e a t m e n t t h ed e g r a d a t i o no fx y l a nd e p o s i t sa tt h ef i b e rs u r f a c ep a r t i a l l y l e a d st ot h ed i s s o l v eo ft h el i g n i ni nl c c ，t h u sc a u s e dt h ei n c r e a s eo ft h ep u l p b r i g h t n e s sm a d t h er e d u c t i o no ft h ek a p p an u m b e r n eb l e a c h a b i l i t yw a si m p r o v e d a st h ec o n t e n to f h e x ar e d u c e d t h er e s u l t so fu v ( u l t r a v i o l e ts p e c t r a ) i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sl i g n i ni nt h ew a s t e l i q u i da f t e rx y l a n a s et r e a t i n gw i t hw h e a ts t r a wp u l p i ts e e m st h a tp a r to fl i g n i n p o s s i b l yw a sc a u s e df o rt h ed e g e n e r a t i o no fp a r t i a ll i g n i n h e m i c e l l u l o s el i n k a g e si n t h el c cs t r u c t u r e t h er e s u l t so ff t 瓜s p e c t r aa n a l y s i ss h o w e dt h a tx y l a n a s et r e a t m e n td e g r a d e d x y l a no fp u l ps u b s t a n t i a l l y a n dm e a n w h i l ep a r t i a l l yd e g r a d e dl c c 1 1 1 er e s u l t so f f t i ri n d i c a t e dt h a tm o r el i g n i nd i s s o l v e dw i t hx y l a n a s et r e a t m e n t t h ec r y s t a l l i n i t yo fp u l pc o u l di n c r e a s ew i t hx y l a n a s et r e a t m e n t ，t h u se n h a n c ep u l p s t r e n g t hp r o p e r t i e s t h ec r y s t a l l i n i t yo ff i b e ri n c r e a s e d 砸t ht h ei n c r e a s i n gx y l a n a s e d o s a g e t h er e s u l t so fe s c ai n d i c a t e dt h a tt h eo x y g e nt oc a r b o na t o m i cr a t i oo fw h e a t s t r a wp u l ps u r f a c ed e c r e a s e da f t e rx y l a n a s et r e a t m e n t w i t hi n c r e a s i n ge n z y m e d o s a g e ，t h es u r f a c el i g n i no f w h e a ts t r a wp u l pi n c r e a s e d k e y w o r d s ：x y l a n a s e ；w h e a ts t r a wp u l p ；b l e a c h i n g ：l c c ；s e m ；h e x a ；e s c a 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。 文中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意 义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的 论文或成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻 工业学院j 山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及 申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为山东轻工业学院。 ：地鞋嗍：堂年月丝日 导师签名： 日期： 2 q q 曼年上月；! 日 山东轻工业学院硕士学位论文 第一章绪论 纸是人类文明和文化科学得以记载、积累、传输和发展的重要物质条件， 它在人类发展的历史上起着极为重要的作用，为历史上的文化传播立下了卓著 功勋。通过以纸为载体的出版物使人类的各种信息和知识得到迅速地传播，妥 善地保存，悠久的历史遗产得到继承，从而推动了人类文化和科学技术的不断 发展。毋庸置疑，它在积淀人类文化财富、缔造社会文化宝库、延续和发展人 类文化中起着重大的中介作用。随着造纸工业的不断发展，纸的应用已扩展到 文化科学，f 1 常生活、医疗卫生、商业、国防和工农业生产等各个领域。到了 现代，造纸工业己成为全世界重要的制造产业，与社会经济同步发展。纸和纸 板不仅是文化科学知识的载体，而且还成为了国民经济中不可缺少的物资。 造纸工业是一个与国民经济和社会主义文明建设息息相关的重要产业部 门。当今世界各国已将纸及纸板的生产和消费水平，作为衡量一个国家现代化 水平和文明程度的重要标志之一。世界上经济发达国家一般都拥有发达的造纸 工业，美国和日本把造纸工业列为国内十大制造业之一。我国是制浆造纸工业 大国，纸和纸板的产量位居世晁第二，但人均拥有量却很落后，而且存在着原 料短缺、资源和能源消耗大、污染严重和技术落后等问题。这些问题的存在严 重阻碍了我国造纸工业的发展。如何在降低能源消耗和控制环境污染的前提 下，持续的发展造纸工业是制浆造纸业所面临的一个现实问题。由此可见，实 现我国造纸工业现代化还相当艰巨，与国际接轨还要付出艰辛的努力，造纸工 作者任重而道远。 造纸 i 业对环境污染大，主要是由于蒸煮废水的污染，而更严重的是漂白 废水的污染。近年来，随着人们环保意识的日益增强和环保法规的进一步严格， 迫使制浆造纸工业不断改进技术，朝着减少污染、消除污染的方向发展，环境 保护己成为世界制浆造纸工业今后发展的主题。传统方法的纸浆漂白，大多是 采用以氯元素为基础的漂剂，如氯和含氯化学品，但它们在漂白过程中能形成 可吸附的有机氯化物( a o x ) ，其中许多物质具有毒性、持久性以及生物积累 性，且在自然界中很难白行降解。已经引起专家及环保界广泛关注的二恶英【1 曾一度使人们对其淡虎色变，人们纷纷提出要消除自然界存在的a o x 、t o c l 。 对于造纸业，特别是对我国的造纸业，减少甚至消除有机氯化物势在必行。而 生物技术应用于纸浆漂白则可以做到这一点，从而减少漂白废水对环境的污 染。在这种情况下，生物技术在制浆造纸工业中( 特别是纸浆漂白) 的应用得 到造纸工作者们的广泛关注。近些年来困内外对生物漂白技术的研究方兴未 艾，其中利用微生物或酶进行纸浆漂白成为当前造纸工业中最为热门的绿色化 第一章绪论 学课题之- - 2 1 。 1 1 生物技术在纸浆漂白中的应用 现代科学技术使源于中国的古老的造纸术得到了很大的发展，使之从作坊 匠人的手艺中摆脱出来，成为一项现代工业。然而迅速发展的造纸工业对环境 造成严重污染，其中最主要的污染来自于漂白工序。而生物技术却恰恰能减轻 甚至消除漂白污染，因此，寻求利用微生物及其胞外酶代替化学品来进行无毒 性污染物产生的清洁生产的新技术、新工艺，就成了世界众多科技工作者的前 沿研究课题。近十几年来，随着生物技术的迅猛发展，生物漂白技术在纸浆漂 白中得到了越来越广泛的应用。其中，半纤维素酶已经实现了工业规模的漂白 应用，更具有吸引力的木素酶的应用研究正在继续。目前，生物漂白技术已经 成为制浆技术革新中最有发展前景、最诱人的课题之一。 生物漂白，即利用微生物或其分泌的酶处理纸浆，达到脱除木素或有利于 脱木素，并改善纸浆的可漂性或提高纸浆的白度的过程。用于纸浆生物漂白的 酶主要分为两大类【3 j ：半纤维素酶和木素降解酶。其中，半纤维素酶包括木聚 糖酶和聚甘露糖酶；而木素降解酶主要有木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆 酶组成。白腐菌有时也直接用于纸浆漂白。将生物技术应用于纸浆漂白可以节 省化学漂白剂的用量，改善纸浆的性能以及减少漂白污染。在生物漂白研究中 取得较大进展主要有以下三个方面：半纤维素酶的纸浆生物漂白；微生物 直接作用的纸浆生物漂白；木素降解酶的纸浆生物漂白。 1 1 1 半纤维素酶辅助漂白 半纤维素酶生物漂白的研究开始得较早，发展到现在已经成为一个比较成 功的漂白工艺技术。近年来有许多关于半纤维素酶( 特别是木聚糖酶) 漂白的 研究报道。芬兰科学家v i i k a r i 4 1 在19 8 6 年国际制浆造纸工业生物技术研讨会 上首次提出了利用半纤维素水解酶提高k p 浆的可漂性这一创意。试验发现用 半纤维素酶处理阔叶木浆和针叶木浆，分别可以节约总有效氯2 0 2 5 和 1 5 - 2 0 【5 j 。目前用于辅助漂白的半纤维素酶主要有木聚糖酶和甘露糖酶两种。 木聚糖酶能够渗透进入纸浆纤维微孔中，作用于纤维表面和内部，而聚甘露糖 酶只在纤维表面起作用【6 j 。而且木聚糖酶似乎对所有类型的纤维都有助漂作 用，而甘露糖酶的有效性则取决于纤维的种类。 木聚糖酶用于纸浆漂白可以降低漂白污染，是一种对环境友善的漂白方 法。木聚糖酶漂白硫酸盐浆一个显著的优点就是能够降低二氧化氯用量，提高 纸浆白度。国外许多硫酸盐浆厂已进行工业性试验，结果表明，木聚糖酶预处 山东轻工业学院顶士学位论文 理可降低化学浆漂白成本达2 0 ，可降低漂白负荷5 2 0 ，同时将木聚糖酶 用于全无氯漂白流程中m 也可以取得了较好的效果。 在我国，对木聚糖酶生物漂白的研究近年来也取得了一定进展。我国一些 纸厂已经将木聚糖酶辅助漂白应用到了实际生产当中。木聚糖酶预处理用于桉 木、蔗渣硫酸盐浆、松木及麦草化机浆漂白流程中都取得良好的效果 6 , 8 - h 1 。 陈嘉川等研究了木聚糖酶对麦草浆c e h 漂白的影响，发现酶预处理能提高纸 浆白度，改善成浆的强度，减少化学漂剂的用量【l2 1 。洪枫等研究表明，木聚 糖酶预处理对提高麦草化机浆白度的及改善可漂性也有一定的作用i l3 1 。木聚 糖酶漂白技术的应用，获得快速增长的原因可以概括为： ( 1 ) 木聚糖酶处理属于软技术，只需投入较少资金。 ( 2 ) 大多数情况下，工业化试验简单，投资少、成本低、风险小。 ( 3 ) 木聚糖酶处理可以降低漂白废水污染负荷及漂白化学药品用量， 成本低。 ( 4 ) c 1 0 2 受到限制的地区，用木聚糖酶处理可以提高纸浆厂的产量。 ( 5 ) 此工艺易与许多漂白工艺结合，可实现e c f 和t c f 漂白。 另一种半纤维素酶一聚甘露糖酶，由于能够进攻葡聚甘露糖，使其在提高 低卡伯值纸浆的可漂性方面有巨大的潜力。半乳甘露糖和葡聚甘露糖的主要水 解产物是甘露二糖、甘露三糖和各种寡糖。与木聚糖酶相比，甘露糖酶的助漂 机理研究相对较少。而且，木聚糖酶和甘露糖酶对纤维外表面的作用方式也不 同。另外，木聚糖酶似乎对所有类型的纤维都有作用，而聚甘露糖酶则只能改 善连蒸浆如e m c c 的可漂性。 虽然利用半纤维素酶进行生物漂白已经取得很大的成效，在短短的几年罩 从实验室研究、生产试验直到工业应用，证明它是成功的漂白新技术。但仍需 要不断改进以适应实际生产的要求。一般木聚糖酶中往往含有纤维素酶的活 性。特别是当内切纤维素酶的活性过高时，木聚糖酶会在酶处理过程中引起纤 维强度、浆粘度下降，因此对酶源的选择是十分关键的。同时，由于只有半纤 维素酶并不能达到完全无氯漂白，因此我们需要进一步发展能直接降解纸浆中 残余木素的酶。 1 1 2 微生物直接作用的生物漂白 自然界存在着许多降解木素的微生物，它们主要是真菌和某些细菌类。真 菌通过孢子或菌丝感染木材，菌丝分泌特异酶进攻木材纤维细胞壁，造成木材 腐朽。根据木材腐朽的类型把木素降解真菌分为白腐菌( w h i t e - - r o tf u n g u s ) 、 褐腐菌b r o w n - - r o tf u n g u s ) 和软腐菌( s o f t - - r o tf u n g u s ) 。白腐菌和褐腐菌属 第一章绪论 于胆子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) 软腐菌属于子囊菌( a s c o m y c e t e s ) 或半知菌( f u n g i i m p e r f e c t i ) 1 1 4 o 各种白腐菌对木素的作用结果具有共同的趋势。见表1 1 【”1 。 表1 i 白腐菌对木素的作用结果 木素成分变化情况 羧基增加 羰基增加 酚羟基减少 脂肪族羟基减少 氧碳比率增加 氢碳比率减少 甲氧基碳比率减少 随着木素生物降解研究进一步深入，特别是新的木素降解酶的发现，人们 期望通过微生物直接与浆中残余木素作用来去除纸浆中的残余木素，达到漂白 效果，或者减少化学漂剂的用量，减轻有毒有机物对环境造成的污染，这就促 使了第二代生物漂白的形成。 为了弄清白腐菌对纸浆的漂白作用，在1 9 9 2 年a r c h i b a l d 对白腐菌漂白纸 浆的作用进行了研究。研究发现，菌体在与纸浆纤维完全不接触的情况下仍能 对其产生漂白作用，证实漂白作用并不需要菌体与纸浆纤维物理接触，生物漂 白过程中的培养液含有能使浆中的残余木素降解的全部成分。如果最后证实微 生物漂白所需的时间主要取决于微生物产生这些成分的过程，则纸浆生物漂白 的时间有可能大大缩短1 3 j 。 1 1 3 木索降解酶的生物漂白 自从2 0 世纪8 0 年代初，从黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) 中发现了木素过氧化物酶( l i p ) 以来，人们对木素降解酶的生物漂白进行了大 量的研究近十年来在这个领域的研究十分活跃。木素降解酶的生物漂白是通过 木素降解酶直接作用于纸浆中的残余木素，并使之发生降解、溶出，从而有利 于纸浆的进一步漂白。纸浆生物漂白所用的生物降解酶主要是：木素过氧化物 酶( l i p ) 、锰过氧化物酶( m 1 1 p ) 、漆酶( l a c c a s e ) 。木素降解酶漂白围绕这三大 酶系进行了大量的研究工作，取得了理论和实际意义的进展。 山东轻1 业学院硕士学位论文 1 1 3 1 术素过氧化物酶 木素过氧化物酶是一系列含有一个f e ( 1 1 1 ) 一i i 卟啉环( i x ) 血红素辅基的 同功酶，其最重要的特点是能氧化富含电子的非酚型芳香化合物。在自然环境 中，木素过氧化物酶对木素的生物降解起重要的作用f 1 6 】。但在利用白腐菌对 硫酸盐浆漂白的过程中却只检测到锰酶和漆酶的活性，而没有检测到木素过氧 化物酶活性的存在。有的研究者报道，用木素过氧化物酶漂白纸浆对后续化学 漂白不仅没有促进作用，反而使白度下降。这可能是因为它对纸浆的漂白作用 与所处的微环境有很大的关系。它需要一个适宜的催化环境，才能表现出降解 木素的活性。在适合的缓冲溶液条件下，木素过氧化物酶单独或和其它酶适当 配合，对氧脱木素处理后的桉木硫酸盐浆具有一定的提高白度，降低k a p p a 值的效果。 近些年，人们对木素过氧化物酶漂白机制进行了大量研究。研究发现：木 素过氧化物酶在过氧化氢存在且浓度为低浓度时可作为氧化剂，经历一个双电 子氧化步骤和两个单电子还原步骤，使非酚型木素底物氧化成为阳离子游离 基，游离基再进行一系列非酶反应导致脂肪族侧链和芳环断裂，起作用机理如 图1 1 所示【3 】。 h 2 0 2 h 2 0 氧化木素术素 图1 1 木素过氧化物酶作用机理示意图 氧化木素 术素 木素过氧化物酶能催化氧化非酚型木素模型物中b 一1 和p o 一4 结构 的c 。一c 。键断裂，而木素分子中又富含这两种结构，因此木素过氧化物酶在 木素过氧化物酶木素生物降解中的作用受到重视。 1 1 3 2 锰过氧化物酶 m n p 与l i p 一样是一种血红素糖蛋白，在过氧化氢、m n 2 。和羧酸鳌合剂存 在下，m n ( i i ) 氧化成为m n ( i i i ) ，后者氧化木素酚型单元成为酚氧游离基，导 致木素氧化降解，其作用机制如图1 2 所示【3 j 。 第一章绪论 m n ( 1 l i ) m n ( i i ) h 2 0 2 图1 2 锰过氧化物酶作用机理示意图 锰过氧化物酶的漂白作用依赖锰、过氧化氢和螯合剂，该酶最合适的介体 是螯合作用的二羧酸类化合物如丙二酸和草酰乙酸，这些螯合剂都是白腐菌漂 白过程中胞内合成的。同时在漂白过程中，真菌也能分泌草酸盐和乙醛酸，这 是m n ( i i ) 的潜在的螯合剂。锰酶漂白纸浆时，螫合态的m n ( i i i ) 是残余木素的 氧化剂，它的氧化还原电势、稳定性、及电荷密度都将影响次生壁中残余木素 的氧化效率。 最初人们认为锰过氧化物酶只能降解酚型木素。后来研究发现：合成木素 和高分子量的氧化木素都可以在锰过氧化物酶的作用下降解。 同木素过氧化物酶漂白一样锰过氧化物酶漂白时也存在着一定的问题，主 要是锰过氧化物酶需要一个适宜的催化环境，它对高温和高浓过氧化氢f 高于 0 1m m o l l ) 敏感。这使其难以实现大规模牛产，而定浓度的过氧化氢是保持 螯合剂活性所必需的。 1 1 3 3 漆酶 在木素降解酶中漆酶作为木素降解酶用于纸浆漂白的研究是最晚的。漆酶 是一种含铜的酚氧化酶，产于不同种类的微生物和一些植物中，杂色木云芝菌 是其主要产生菌之一。漆酶是以分子氧为氧化剂，将酚型结构的木素单元氧化 成酚氧游离基，同时将分子氧还原成水。 在很早以前人们就知道漆酶与木素生物降解关系密切。但长期以来它一直 未能应用于浆的漂白中，这是因为它的氧化还原势较低( 0 3 0 8v 对标准氢 电极) ，只能氧化降解酚型木素结构，而对植物木素结构占丰要的非酚型结构 却不能氧化降解。进入9 0 年代后，有人发现，当漆酶与中介体组成一系统，漆 酶需要一些低氧化还原电位的中介体，这些中介体在漆酶的作用下会形成活性 高，且具有一一定稳定性的中介体。它们能从分子氧中获得电子，并传递给木索 分子从而使木素氰化降解。介体对于漆酶的漂白具有不可或缺的作用，对于介 体的研究也逐渐增多。 关于漆酶生物漂白的机理人们也做了大量的研究，但目前还不清楚，一般 认为漆酶进行四个单电子转移，使介体氧化成氧化态( 通常是自由基，或正离 x。x m 心x。x l l j 东轻1 ：业学院硕j 二学位论文 子自由基) ，一个四电子转移使氧气还原成水。其作用机制见图1 3 3 】o l a c c a s e m e d i a t o r 术索 氧化小素 图1 3l m s 氧化木素的机理示意图 虽然漆酶用于纸浆漂白的研究开始的相对较晚，但对于漆酶的研究却比木 素过氧化物酶和锰过氧化物酶漂白的研究更多、更深入。近年来，将漆酶应用 于生物漂白取得了很大的进展l l7 - 2 。 在三种木素降解酶系中，以漆酶介体系统最具潜在应用前景。因此，近 几年在围际上被广泛注重和研究。更有效、价格便宜、符合环保要求的介体筛 选、不同来源漆酶效果之间的比较以及作用机理是研究的焦点。 1 2 木聚糖酶概述 木聚糖是由b d 一1 ，4 木糖苷健连接起来并带有多种取代基的多聚五碳 糖，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物资源瞄j 。原料不同， 木聚糖的复合聚糖组分也不同。阔叶木中木聚糖是由聚o 乙酰基4 0 ，甲基葡 萄糖醛酸基木糖组成。在针叶木中木聚糖主要是由阿拉伯糖基一4 0 甲基葡萄 糖醛酸基木糖组成。阔h 十木中木聚糖的聚合度比针叶木的要高【2 3 1 ，并且分枝 也较小。 因为木聚糖的结构比较复杂，要将其完全降解成木糖单体也是一个复杂的 过程，其中涉及到多种木糖降解酶【2 。而木聚糖酶则是降解该物质的最主要 酶之一。木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖和木糖，是一种复合酶系。f “义的 木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，木聚糖酶系丰要包括 3 类口5 l ： 内切一b l ，4 一木聚糖酶，优先在不同位点上作用于木聚糖和长链木 寡糖，从b 一1 ，4 一木聚糖主链的内部切割木糖苷链，从而使木聚糖降解为木 寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和 阿拉伯糖。 外切一t 3 - - 1 ，4 一木聚糖酶，作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物 为木糖。 b 一木糖苷酶，该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基。狭义的木聚 第一章绪论 糖酶仪限于内切一b l ，4 一木聚糖酶。在木聚糖降解过程中，各中木聚糖酶 起着互相重叠但又各不相同的作用 2 6 1 。 对木聚糖酶的研究早在6 0 年代就已开始了 2 7 1 。最近十几年，随着生物技 术的不断发展和进步，特别是基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用后， 对木聚糖酶的了解更加深入，已经分离出多种木聚糖酶基因，并已工业生产出 多种木聚糖酶产品。木聚糖酶在食品工业、能源工业中显示出广阔的应用前景， 特别是在制浆造纸工业中木聚糖酶用于纸浆漂白，能够增加纸张白度，改善纸 张性能，降低含氯化合物的用量，从而有效减轻造纸业对环境的污染【2 8 。因 而木聚糖酶在纸浆漂白中的应用越来越引起造纸工作者们的关注。 1 2 1 木聚糖酶的生化特性 能够产生木聚糖酶的微生物分布十分广泛，包括真菌、细菌等。目前，我 们对木聚糖酶的研究只集中在细菌和真菌上，细菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基 比较单一，分子量范围在8 1 4 5 k d a ，而真菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基则较 复杂，分子量大小变化也较大【”1 。对于不同生物来源的木聚糖酶，p i 范围为p h 3 1 0 5 ，稳定p h 值范围为3 1 0 2 ，等电点变化范围在3 1 0 2 _ 间【2 ”。一般细 菌所产木聚糖酶比真菌所产木聚糖酶热稳定性好。大多数木聚糖酶的最佳p h 值是集中在5 左右，而且通常在p h 值2 9 都是稳定的【3 0 弓”。近些年来，人们对 中性和碱性的真菌木聚糖酶 3 3 , 3 4 1f 1 细菌木聚糖酶 3 5 , 3 6 1 的性质进行了研究，通过 研究发现：细菌木聚糖酶比真菌木聚糖酶能更好的适应高的p h 值。尽管关于 中性木聚糖酶用于漂白预处理研究已经广泛展开 3 5 , 3 7 1 ，但实验中所使用的大多 数酶都是粗酶制品，只有少量研究用的是经过提纯的木聚糖酶【3 8 ，3 ”。大多数木 聚糖酶在p h 值5 7 ，温度4 5 - - 5 5 的条件下使用才具有最大的活性。根据酶 的理化特性，可分为两大类，即分子量小于3 0k d a 的酶和分子量大于3 0k d a 的酶，通常前者称为碱性蛋白，后者称为酸性蛋白 2 9 1 。试验分析显示，细菌 通常可产牛两种木聚糖酶，即高分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的耐碱木聚 糖酶，但真菌中没有这种现象，通常只产生低分子量的耐碱木聚糖酶。 1 2 2 木聚糖酶分子的结构区域 随着木聚糖酶在造纸工业中的广泛应用，人们对木聚糖酶的研究不断深 入，人们希望能够运用蛋白： 程的手段研制出符合人们要求的木聚糖酶，这就 需要对该酶的蛋白分子结构及结构中的各功能区域有全面的了解，通过对分子 结构的认识，也能为木聚糖酶的作用机理研究及其对纸浆的漂白机理研究提供 理论基础。不同微牛物产生的木聚糖酶在结构和性质上有很大的差别。研究发 东轻工业学院硕士学位论文 现，木聚糖酶有的只含有单一区域即催化区，也有的同时具备催化区和多种非 催化区。多数木聚糖酶分子中含有多个功能区域，这些区域包括催化区、纤维 素结合区、木聚糖结合区、连接序列、重复序列、热稳定区、及其它未知功能 的非催化区，它们担负着不同的生物功能，不同来源的木聚糖酶分子的功能区 域之间同源性或高或低【4 0 ”。f 面对其几个功能区进行简单的介绍。 纤维素结合区 在自然界中，纤维索通常是与木聚糖等的半纤维素结合在一起的，因此有 些酶既能水解纤维素，也能水解半纤维索，成为双功能酶。一些木聚糖酶能结 合纤维素，虽然纤维素结合区对催化功能4 i 是必需的，但它们能调节酶对可溶 性和不溶性纤维素底物的特殊活力。木聚糖酶与木聚糖的结合主要是通过离子 之间的相互静电作用而非特异性结合的，因为木聚糖含有大量的4 一。一甲基 葡萄糖醛酸残基等可电离侧链基团，带有大量的负电荷，木聚糖酶在p i 低于 p i 带正电荷，容易与木聚糖结合，而p h 等寸二或高0 二p i 时，基本不结合【4 “。 纤维素结合结构区在木聚糖酶分子中是一种独立的兀催化功能的区域，该 区域可以和结晶纤维素结合，其主要特征是【4 3 ：( 1 ) 在靠近n 一末端和c 一末 端分别有一个c y s ；( 2 ) 除g l y 、a s p 之外还含有4 个很稳定的t r p ；( 3 ) 带电氨基 酸的含量低。 木聚糖结合区 与纤维素结合区相比木聚糖结合区在木聚糖酶分子中较少发现。其原因可 能是，木聚糖多聚物中带有许多类型的取代基，从而使能够结合所有木聚糖 的蛋白区域的进化成为不可能的。研究发现，t h e mo no n o s p o r g f u s s a x y n a 中 的x b d 表现出了对木聚糖和纤维素都具很大的吸附力。到目前为止，唯一的 一个含有能与木聚糖特异结合的区域的木聚糖酶是由粪肥纤维单孢菌产生的 x y n d ，x y n d 的x b d 对木聚糖的结合有高度的特异性【2 2 j 。 催化区 木聚糖酶的催化结构域表现着酶的水解特性，并作为酶分类的基础。通常 木聚糖酶仅有一个催化结构区，但n e o c a l l i m a s t i xf r o n t a l i s 的木聚糖酶3 和牛- 黄瘤胃球菌( r u m i n o c o c c u s f l a y ( f a c i e n s ) 产生的木聚糖酶含有两个催化结构区。 木聚糖酶的催化区承担着酶的水解特性，并作为该酶分类的基础。f 、g 组木聚 糖酶在分子量、净电荷、不带电荷的碱性和酸性氨基酸的比例等方面都不同。 按等电点的不同，g 组中木聚糖酶可分为高等电点和低等电点两个亚组( 其平 均等电点分别为9 5 和5 0 ) 4 ”。木聚糖酶的氨基酸组成在数量上变化很大，但 其催化区在大小上都趋向一致。催化区大都通过与已知区域的序列相关性的比 较鉴定出来。木聚糖酶与纤维素酶的催化区几乎无同源性，表明两酶是从不同 9 第昔绪论 的祖先进化而来。 1 2 3 木聚糖酶的催化机制 1 2 3 1 酶的催化特性 底物特异性 木聚糖酶底物特异性包括底物组成的特异性，对键的特异性和对取代基的 特异性。根据木聚糖酶对底物组成底物特异性可将其分为特异性酶和非特异性 酶。其中，特异性酶只作用木聚糖底物，非特异性的除作用木聚糖外，还作用 于纤维素和人工底物，它们为双功能酶，许多木聚糖酶为非特异性酶口引。 对主链和侧链的作用 木聚糖酶不但可以切断主链，而且根据它们是否可以催化释放出阿拉伯糖 侧链取代基，还可分为脱支链酶和非脱支链酶。前者可释放阿拉伯糖，后者则 无此作用。在同一种生物中可同时拥有脱支链木聚糖酶和非脱支链木聚糖酶， 这可能与确保最大限度水解木聚糖有关。 糖苷键类型 研究表明，木聚糖酶通常有十分特异的差向异构性，只水解b 1 ，4 一糖 昔键，并且两侧都是p 一1 ，4 一糖苷键，另外b 一】，4 一糖苷键连接的片段长 度对酶的活性也有影响，要求有4 个或4 个以上的糖基。木