（微生物学专业论文）bacillus+subtilis+mo01合成脂肽的发酵研究.pdf

删、, , i b 删, 1 9 8 0 9 ad i s s e r t a t i o no ft h er e q u i r e m e n t ss u b m i t t e dt on a n k a i u n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fp h i l o s o p h y f e r m e n t a t i o nr e s e a r c ho n l i p o p e p t i d e p r o d u c t i o nb y z h e n gz o n g m i n g s u p e r v i s e db y p r o f e s s o rl i ur u 1 i n c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s ， m o 0 1 n a n k a iu n i v e r s i t y , t i a n j i n ，3 0 0 0 7 1 ，p r c h i n a m a 弘2 0 0 5 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子 版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以 及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者 机构送交论文的复印件和电子版：在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文 的部分或全部内容用于学术活动。 签名爱f 铡 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在j 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 云仙维 学位论文作者签名： 御 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 繇秀1 7 妾卅 纱一了年r 月珂e l 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 摘要 中文摘要 本实验室从油田土壤分离到的一株枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l i sm o 0 1 ， 能够合成脂肽类生物表面活性剂，可以将水的表面张力从7 2m n m 1 降到2 8 m n m 1 。采用p h 2 0 等电点沉淀、有机溶剂抽提、及s e p h a d e xg 1 5 凝胶过滤， 纯化得到脂肽纯品。经检测脂肽的亲水基为六肽v a l g l u - v a l a s p l e u l y s ，是 目前未见报道的新型脂肽。对脂肽的定性、定量测定进行了详细研究，经薄层 层析实验进一步证实晟s u b t i l i sm o 0 1 所产表活剂为脂肽：建立的脂肽表面张 力定量法，用h p l c 证实了其可行性，从而获得脂肽的简易定量手段；得到该 脂肽的临界胶束浓度( c m c ) 为2 8 3 4 m g l 。摇瓶发酵实验分别对发酵的环境条件 和营养条件，如培养温度、初始p h 值、发酵周期、碳源、氮源、微量元素等 进行了研究。并采用响应面法( r s v 0 和中心组合设计( c c d ) 对初始p h 值、培养 温度和发酵周期三个培养条件进行优化，对碳源、氮源、铁离子和锌离子四个 培养基成分进行优化，使脂肽产量从3 0 0 m g l 增加到超过8 0 0 m g l 。1 0 l 发酵 罐小试实验，初步建立了脂肽发酵的动力学模型，为脂肽类表活剂的规模化生 产奠定基础。设计利用泡沫回收脂肽的研究显示，分离泡沫是富集、分离脂肽 的有效手段，并提出进一步研究的改进措施。 关键词：生物表面活性剂；枯草芽孢杆菌：脂肽：纯化：发酵动力学；c m c 值； 响应面；泡沫回收 ， 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文摘要 a b s t r a c t b a c i l l u ss u b t i l i sm o 一0 1 ，i s o l a t e df r o mo i lf i e l d ，p r o d u c el i p o p e p t i d e t h es u r f a c e t e n s i o no fw a t e r c o u l db er e d u c e dt o2 8m n m b yt h i ss u f f a c t a n t d i f f e r e n t a p p r o a c h e sf o rt h ep u r i f i c a t i o nw e r e i a s e d ，i n v o l v i n gp r e c i p i t a t i o na te x t r e m ep h s ， e x t r a c t i o nw i t l lo r g a n i cs o l v e n t s ，a n ds e p h a d e xg - 15f i l t r a t i o n t h ep u r i f i e d l i p o p e p t i d ew a so b t a i n e df o rs t r u c t u r em e a s u r e m e n t 砀el i p o p e p t i d ew a si d e n t i f i e d a san o v e ll i p o p e p t i d ew i t hap e p t i d es e g m e n ts e q u e n c ev a l g l u v a l - a s p l e u - l y s t l ca n dh p l cw e r ea p p l i e df o rt h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s n l es u r f a c et e n s i o nm e t h o dw a se s t a b l i s h e dt od e t e c tt h el i p o p e p t i d ec o n c e n t r a t i o n u s i n gm a t l a bc a l v ef i t t i n gt o o l s mc r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( c m c ) o ft h e b i o s u r f a c t a n tw a s2 8 3 4 m g l t h ep r e l i m i n a r ys i n g l e f a c t o r s s t u d i e sw e r e i n v e s t i g a t e dt od e t e r m i n et h ec u l t u r ec o n d i t i o n , c a r b o ns o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c e s ，a n d t r a c ee l e m e n t s t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g ya n dc e n t r a lc o m b i n e dd e s i g nw e r e e m p l o y e d t o o p t i m i z e t h e c u l t u r ec o n d i t i o n sa n dm e d i a c o m p o s i t i o n t h e c o r r e s p o n d i n go p t i m a ll e v e l so fd i f f e r e n tv a r i a b l e sw e r eo b t a i n e d t h ep r e d i c t e d p r o d u c t i v i t yw a s0 5 g lh i g h e rt h a nt h ei n i t i a ly i e l d 1 1 1 ea c t u a le x p e r i m e n t a l r e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h ep r e d i c t i o n t h es u b s e q u e n tb a t c hf e r m e n t a t i o n si n 10 lb i o r e a c t o rw e r ec o n d u c t e dt oe s t a b l i s ht h ef e r m e n t a t i o nk i n e t i c s t h ek i n e t i c s c o n s t a n t sw e r ee s t i m a t e dw i t hn o n l i n e a rf i t t i n g f o a m i n g ，ap r o f i c i e n tm e t h o df o rt h e r e c o v e r yo fs u r f a c ea c t i v es o l u t e sf r o md i l u t es o l u t i o n s ，w a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e df o r t h ee n r i c h m e n to ft h el i p o p e p t i d ef r o m 丑s u b t i l i sm o 一01c e l lc u l t u r eb r o t h s t h e r e s u l to fe x p e r i m e n ti n d i c a t e do v e r5 0 l i p o p e p t i d ew a sr e c o v e r e di nt h er e c e p t a c l e ， d e m o n s t r a t i n gt h ef o a m i n gw a se f f e c t i v e 1 1 1 em o d i f i c a t i o n sw e r ep u tf o r w a r df o r t h e f u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：b i o s u r f a c t a n t ，l i p o p e p t i d e ，p u r i f i c a t i o n ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，f e r m e n t a t i o n k i n e t i c s ，c m c ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , f o a m i n gr e c o v e r y i i 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文目录 目录 第l 章前言1 1 生物表面活性剂1 1 1 生物表面活性剂的特点l 1 2 生物表面活性剂的类型2 2 生物表面活性剂的功能7 3 脂肽合成的分子遗传学_ 9 3 1 非核糖体肽合成酶9 3 2 脂肽合成中信号传导的研究进展o 1 6 4 生物表面活性剂的应用研究1 8 5 立题目的、意义和技术路线2 3 第2 章脂肽分离纯化和测定2 4 l 引言2 4 2 材料和方法2 4 3 结果与讨论2 8 3 1 脂肽分离纯化条件的确定2 8 3 1 1 等电沉淀法分离脂肽2 8 3 1 2 萃取条件的确定2 9 3 1 3 凝胶过滤分离脂肽3 0 3 2 脂肽的测定3 1 3 2 1 脂肽的薄层层析定性测定和纯度测定3 0 3 2 2 脂肽的定量测定3 2 4 小结”3 5 第3 章脂肽发酵条件和培养基的优化? 3 6 l 引言3 6 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文目录 2 材料和方法3 6 3 结果与讨论3 9 3 1 摇瓶分批发酵培养的研究3 9 3 1 1 种子生长曲线的测定m 3 3 3 1 2 摇瓶发酵培养条件的研究? 4 0 3 1 3 摇瓶发酵培养基成分的单因素试验4 3 3 2 应用响应面法优化培养条件和培养基成分0 0 0 4 9 3 2 1 响应面法优化培养条件4 9 3 2 2 响应面法优化培养基成分5 3 4 小结5 9 第4 章脂肽的发酵动力学和泡沫回收脂肽的研究6 0 1 引言6 0 2 材料和方法6 0 3 结果与讨论6 2 3 1b a c i l l u ss u b t i l i sm o 0 1 发酵生产脂肽的发酵动力学研究6 2 3 2 利用泡沫回收脂肽的初步研究6 5 4 j 、结6 6 第5 章总结和展望6 7 1 全文总结6 7 2 仓0 新点6 8 3 展望6 8 参考文献7 0 致谢7 5 i i 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 1 生物表面活性剂 第一章前言 表面活性剂( s u r f a e t a n t ) ，是指同时含有亲水和疏水部分的分子，一般富集于 溶剂表面，能显著降低溶剂的表面张力，改变体系的表面状态，从而产生乳化、 破乳、起泡、消泡、分散、凝聚和润湿等独特的理化作用。生物表面活性剂 ( b i o s u r f a c t a n t ) 也有两亲结构，包括至少一个亲水和一个疏水部分。亲水部分可 能是酯、羟基、磷酸、羧酸、或糖类，它们或者是中性，或者带负电。疏水部 分是8 到1 8 个碳原子的脂肪酸。 生物表面活性剂可以降低表面( 或界面张力) 、或作为乳化剂、或兼有这两 个性能，在结构和特性上显示了多样性和独特性。目前每年有生物表面活性剂 超过9 0 亿美元的市场份额，由于环境友好的特性而被广泛用于生物技术和环境 清理，显示了比化工合成的表面活性剂较多的优势n 1 。 生物表面活性剂的特点 由于两亲的特性，表面活性剂趋向于聚集在界面和表面，这样就降低了不 同相间的斥力，使两相更容易混合。特别是生物表活剂能降低表面( 液气) 和 界面张力( 液液) 。例如，一个有效的生物表面活性剂s u r f a c t i n 可以将纯水的 表面张力从7 3 降到2 7 m n m 。当表活剂的单体加到溶液中，表面张力或界面张 力随浓度降低直到临界胶束浓度( c m c ) 。高于c m c 值，表面张力或界面张力 不再降低。如图1 1 浓度高于c m c 值时，表活剂单体开始自发地聚集成胶束， 小泡、和片层乜】。这些聚集体的形成有赖于极性头部和非极性尾部之间的许多 弱化学相互作用，包括疏水作用，范氏力，氢键。c m c 值依赖p h 值、离子强 度和溶液的温度。此外，溶剂的极性决定聚集体的结构。例如，水溶液中胶束 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 的极性头部向外面向水相，而疏水尾部形成胶束的核。相反，在油溶液中，极 性头部则结合成胶束的核心，而疏水尾部朝外排列。 生物表面活性剂的主要性能与化学表面活性剂相同，同时它们还具备了另 外一些特性：可生物降解，减少再次污染；无毒或低毒；一般不致敏、 可消化，因此可用于化妆品、食品和功能食品添加剂；可以使用工业废物生 产；具有更好的环境相容性； 在极端温度、p h 、盐浓度下的稳定性；结 构多样，适用于多种领域。其中最重要的是生物表面活性剂能够满足人们对“绿 色 工业的需要，是化学表面活性剂的最佳替代品。由于这些显著特点，关于 生物表面活性剂的研究日益增多，因此，利用生物工程手段提高其产量具有重 要意义。 l - l y d n ) p h i l l ch y 山o p h i u c h e a dg r o u p t a ug r o u p ( 摹) o i i i nw a l e rw a t e ri no s 妒她ms y s t e m 黪然 v e s i d e t d 。4 0 t 0 4 0 0r u n ) l a m 硼a oo r0 t l a y e r 图1 1 生物表面活性剂聚集体类型【2 】 f i g1 1t y p eo fa g g r e g a t ef o r m e db yb i o s u r f a c t a n t s 1 2 生物表面活性剂的类型 生物表面活性剂的分类依据是它们主要的结构特征和合成它们的微生物。在 任何异质的体系中，边界对于体系的整体特征非常重要。表面活性剂能改变界 面特征，乳化剂是表面活性剂的亚类，能稳定一种液体在另一种液体中的分配， 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 例如，油水乳状液。表面活性剂的双亲性质决定了它们聚集于界面上，微生物 经常粘附在表面或聚集于界面上，因此比表面积很大的微生物合成一系列表面 活性剂毫不奇怪。生物表面活性剂分为低分子量分子【3 】和紧密结合在表面上的 高分子量聚合物【4 】。 低分子量分子主要包括：糖脂( g l y c o l i p i d s ) 、脂肽( 1 i p o p e p t i d e s ) 和脂蛋 白( 1 i p o p r o t e i n s ) 、磷脂( p h o s p h o l i p i d s ) 、中性脂( n e u t r a ll i p i d s ) 、和脂肪酸( f a t t y a c i d s ) 。高分子量聚合物为聚合物生物表面活性剂( p o l y m e r i cb i o s u r f a c t a n t ) 。目 前已知代表性的生物表面活性剂及其产生菌列于表1 1 。 1 2 1 糖脂类 生物表面活性剂中研究最广泛的是糖脂。糖脂的糖基结合到一个或多个长 链脂肪酸上，分子量从5 0 0 到1 5 0 0d a 。研究的最清楚的包括鼠李糖脂，槐糖 脂，海藻糖脂和一类新糖脂m a n n o s y l e r y t h r i t o ll i p i d 。其它的糖脂包括纤维二糖 脂、葡萄糖脂、甘油糖脂、糖基生物乳化剂、和许多不同己糖脂。 鼠李糖脂：1 9 4 9 年j a v i s 和j o h n s o n 从铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a1 4 1 ) 中分离到鼠李糖脂研究其特性【6 】。e d w a r d s 和h a y a s h i 通过鉴定 相邻鼠李糖间的a 1 , 2 键阐明了鼠李糖的结构川。鼠李糖有多达6 眷不同的阴离 子形式。最多的鼠李糖脂是r 1 ，i 也型，分别含有一个和两个鼠李糖，两个p 羟基脂肪酸尾部( 经常是十二酸) 。r 3 ，r 4 型只有一个伊羟基脂肪酸尾部。除鼠 李糖脂的阴离子形式的中性或甲酯形式也有报道【8 】。鼠李糖脂可将表面张力己 烷水的界面张力分别降至3 0 m n m 以下和l m n m 。 海藻糖脂：广泛存在于分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 和棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 的大多数种当中，它是构成上述细菌细胞壁的 主要成分之一，海藻糖脂主要用于石油开采，其优越的破乳化性质有利于提高 石油的开采率，分子量从8 0 0 到3 0 0 0 不等【9 】。红串红球菌( r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s ) 会合成一种阴离子海藻糖脂。红串红球菌和节杆菌( a r t h r o b a c t e r s p ) 产生的海藻糖脂能分别使培养液中的表面和界面张力降低到2 5 m n m 至 3 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 4 0 m n m 和l m n m 之间。 表1 1 微生物表活剂的来源和特世5 】 t a b l e1 1m i c r o b i a ls o u r c ea n dp r o p e r t i e so f m i c r o b i a ls u r f a c t a n t s 堡! ! ! 竺堕苎燮q ! 量翌! ! 婴墨蜓塑! 竺墅塑垒型塑2曼垒丝! 曼堡堕! ! ! ! ! 堡璺墅塑亚婪! 型 g l y c o l i p i d s p a e r u g i n o s a 2 9 r h a m n o l i p i d s p s e u d o m o n a ss p rb o m b i c o l a ra p i c o l a rp e t r o p h i l u m l i p o p e p r i d e sa n dl i p o p r o t c i n s p c p t i d cl i p i d b 1 i c h e n i f o r m i s s c r r a w e t t i ns m a r c e s c e n s v i s c o s i np f l u o r e $ c e r l $ s u r t a c t i n日s u b t i l i s s u b t i l i s i nb s u b t i l i s o r a m i c i d i n s b b r e v i s p o l y m y x i n sb p o l y m y x a f a t t ya c i d s 。n e u t r a ll i p i d s ，a n dp h o s p h o l i p i d s f a t t ya c i d s c 1 e o u s n e u t r a ll i p i d s e r y t h r o p o l i s p h o s p h o l i p i d s rt h i o o x i d a n s p o l y m e r i cs u r f a c t a n t s e m u l s a n c a r b o h y d r a t e - p r o t e i n l i p i d p r o m i n p a p a r t i c u l a t eb i o s u r f a c t a n t s a c a l c o a c e t i c u $ a c a l c o a c e t i c u s ct r o p i c a l i s c 1 i p o l y f f c a p f l u o r e s c e n s d p o l y m o r p h i s p a o r u g i n o s a 2 孓0 0o 1 一l o 3 3 3 0 2 7 2 岳- 3 3 2 6 5 2 7 3 2 0 2 5 l 1 8 0 9 1 2 _ 之00 1 d 3 2 3 一1 6 0 3 01 5 0 3 2 2 7 2 3 v 髓i c l e sa n df i m b r i a e a c a l c o a c e t i c u s 。j 二弦 ! ! ! ! ! 竺! ! ! 竺i 型2 11 1 坐：i ! 槐糖脂：主要由酵母产生的，如球拟酵母( t o r u l o p s i sb o m b i c o l a ) 、嗜石油 球拟酵母( zp e t r o p h i l u m ) 和蜜蜂生球拟酵母( za p i c o l a ) b o 】。当球拟酵母或 假丝酵母( c a n d i d as p ) 以葡萄糖或正构烷烃及长链脂肪酸培养时，可以产生 一系列槐糖脂，m a g e r 等人采用球拟酵母发酵豆油得到的槐糖脂是一种性能优 越的乳化剂，常用于配制洗发香波，具有去头屑功效。槐糖脂中的羟基酸的链 长取决于所用底物正烷烃或脂肪酸的链长，酵母培养条件亦对槐糖脂的组成有 4 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 影响。槐糖脂能使正十六烷和水的界面张力从4 0 m n m 降到5 m n m ，并且对p h 值和温度的变化有很好的稳定性。 1 2 2 脂肽类 脂肽是生物表面活性剂的一种，它的亲水基为多肽，疏水基为长链脂肪酸， 二者以酰胺键和内酯键相连。此类表活剂的主要产生菌是枯草芽孢杆菌和地衣 芽孢杆菌。它们的一般结构是由短肽侧链与脂肪酸相连组成的。枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 合成环状脂肽s u r f a c t i n 是迄今为止最有效的生物表面活性剂 之一。s t r e p t o m y c e st e n d a e 合成胞外的疏水肽，称为s t r e p t o f a c t i n 1 1 】，是结构相 关的多肽混合物，分子量从1 0 0 3 到1 1 2 7 d a 。s u r f a e t i n 是最为有名的一个，它 是由一个七肽和p 羟基脂肪酸形成的内酯环结构【1 2 1 。表1 2 列举了一些芽孢杆 菌合成的典型含七氨基酸残基的脂肽【1 3 1 。 1 2 3 脂肪酸、磷脂和中性脂 磷脂整合到细胞结构中，是有表面活性的分子。不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p ) h o i - n 可产生磷脂酰乙醇胺，有乳化作用【1 4 】；曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 的一些 种和硫氧化硫杆菌也可大量产生磷脂；节杆菌菌株a k - 1 9 和绿脓假单胞菌( 户 a e r u g i n o s a ) 4 4 t i 在十六烷和橄榄油上生长时，能分别积累4 0 和8 0 ( w t w t ) 的磷脂；红串红球菌在正烷烃中生长时产生的磷脂酰乙醇胺能把水和十六烷之 间的界面张力降到l m n m 以下。 1 2 4 多聚生物表面活性剂 聚合物类生物表面活性剂的分子量可达5 0 ，0 0 0 到1 , 0 0 0 ，0 0 0 。经常以烃或蛋 白质为基础，结合有脂类，由一些细菌、古菌和酵母菌合成，它们有强乳化性 能，总体上不能显著降低表面张力 1 s l 。醋酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u s ) r a g 1 能产生一种有效的聚阴离子杂多糖，是水中烃类非常有 效的乳化剂；n a y o n v e n e z i a 等从抗辐射不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rr a d i o r e s i s t e n s ) k a 5 3 分离出 5 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 表1 2 几种主要脂肽的基本结构 t a b l e1 2l i p o p e p t i d e so f b a c i l l u ss p p l i p o p e t i d eo r g a n i s m s t r u c t u r e s u r f a e t i n e s p e r i n l t u r i n a i t u r i n c l i e h e n y s i na l i e h e n y s i nb l i c h e n y s i nc l i c h e n y s i nd a s u b t i l i s 晟s u b t i l i s 最s u b t i l i s b 1 i c h e n i f o r m i s b 1 i c h e n i f o r m i s b 1 i c h e n i f o r m i s b 1 i c h e n i f o r m i s s u r f a c t a n t8 6 b 1 i c h e n i f o r m i s b a e i l l o m y c i nl b s u b t i l i s f a - l g l u - l 。l c u d - l e u l - v a l l - a s p - d l e u l l e u f a b - l - g i u - l l e w d 1 e u l - v a l l - a s p - d - l c u l l e u e i 、，a l f a c 山a s n - l 1 y 卜d - a s n - l - g i n - l - p r o - d - a s h - l - s e r f a 。- l - a s n - l - t y r - d - a s h - l g i n l - p r o - d - a s n c - l a s h 。 d s e r - l t h r f a i - i 广g i u l - l e u - d - l e u - l - v 矾i ，- a s n d l e u l - l i e f a * - l - g l u l - l e u - d - l e u - l - v a l l - a s p - d - l e u - l - l e u l a q l g l u - l - l e u - d - l e u - o v 甜- l - a s p - d l e u - l - l i e f a a - l - g i n - l - l e u - d l e u - l - v a l - l - a s p - d - l e u - l - l i e f a s - l - g l x d - l - l c u d 1 朗l - v 引h 娃e - d - l e u l - b e 。 l v 矾 f a c - ir a s p l - 1 i y r - 】d - a m - l - s e r - l - g i n d p r o 。- l m r d s e t - b a e i l l o m y c i nd r s u b t i l i sf a t - l - a s p - i 砸d - a s n - l - p r o - l g i n d s e r l t h r 星兰! ! 1 2 坚z ! l 望呈垦：兰垒型垫呈笠：兰：垒：旦：兰：墅2 ：垒翌：兰：g ! 旦：兰：呈1 2 ：里：坐璺士：卫! f a 4 ，p 一羟基脂肪酸和c 末端羧酸形成酯键f a b ，p 一羟基脂肪酸和a s p 5 形成酯键 f ：a c ，b 一羟基脂肪酸和c 末端羧酸形成肽键 o l x d 只有1 和5 形成肽键 e 该位置氨基酸可被替代 了一种含丙氨酸的阴离子杂多糖蛋白生物表棉活性剂；脂多糖是解脂假丝酵母 ( c a n d i d al i p o l y t i c a ) 合成的细胞外水溶性乳化剂；c a m e r o n 等近来报道了用酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 大量生产甘露蛋白的办法；k a p p e l i 等从在 烷烃中生长的热带假丝酵母( c a n d i at r o p i c a l i s ) 中分离出一种甘露聚糖- 脂肪酸 复合物，它可稳定十六烷水的乳化液；苔粘双孢黑粉菌( s c h i z o n e l i a m a l a n o r a n m m a ) 和玉蜀黍黑粉菌( u s t i l a g om a y d i s ) 可产生一种生物表面活性 剂，它是含赤藓糖醇和甘露糖脂；d e s i a 等报道了生长在汽油上的荧光假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 可产生一种生物乳化剂，它由5 0 的碳水化合物、 1 9 6 的蛋自质和1 0 的脂组成。 1 2 5 微粒生物表面活性剂 不动杆菌h 0 1 - n 产生的囊泡，直径为2 0 - - 5 0 h m ，浮力密度为1 1 5 8 9 e r a 3 ；， 6 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 是由蛋白质、磷脂和糖多脂组成的。比起相同生物体的外面的膜，膜的囊泡大 约可以包含5 倍的磷脂和大约3 5 0 倍的多糖。这些胞外囊泡具有分隔烃类的微 乳化作用，这在微生物细胞吸收烷烃类物质中起了重要作用。 2 生物表面活性剂的功能 微生物合成许多表面活性剂，具有不同的化学结构和表面性能，不同的生 物表面活性剂在生产菌的生长中起不同的自然作用。此外，每个乳化剂的化学 结构和表面性能差异显著，在特定的生态位中，它们可能提供生存优势。许多 生物乳化剂有抗细菌和抗真菌性能。其它生物乳化剂通过增加水不溶性底物的 表面面积，释放底物，增加底物的可利用率。此外，乳化剂涉及微生物和表面 的吸附及解析、细菌的致病性、q s 、及生物被膜形成。近期试验显示，包被在 菌体表面的高分子量生物乳化剂可以在细菌间水平转移，改变它们的表面特性 及菌体和环境的相互作用。 尽管许多微生物可以合成生物乳化剂，这些生物表面活性剂在菌体的生长 中起到重要作用，但是很难概括微生物的生理作用。生物表面活性剂结构不同， 合成菌众多，表面活性不同，因此，可以想象生物表面活性剂由多种功能。 2 1 增加水不溶性疏水底物的表面积 烃作为碳源时，生长速率决定于油水界面的面积【1 6 1 。当表面积受限时，生物 量代数增加，而不是几何增加。菌体合成乳化剂的分布在表面时，油乳化后在 菌体附近形成微环境，为乳化剂合成菌提供竞争优势。 2 2 增加水不溶性疏水底物的可利用率 高分子量疏水化合物能够长时间存在的主要原因是其低水溶性，增加了对 表面的吸附作用，从而限制了微生物对其利用。当有机物不可逆地结合到表面 时，生物降解会被抑n t l 7 1 。生物表面活性剂可解吸结合底物，增加底物地水溶 7， 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 性，能降低表面张力的表活剂在这方面更有效，低c m c 值的低分予量表活剂 将烃类包裹进胶束的腔内。 2 3 结合重金属 已经证明鼠李糖脂可以从土壤中清除钙离子，铅离子和锌离子【1 8 】。添加等 摩尔浓度的鼠李糖脂可以降低钙离子的毒性，添加超过钙离子摩尔浓度1 0 的 鼠李糖脂则可以消除钙离子毒性【1 9 1 。鼠李糖脂降低金属离子毒性的机制可能是 鼠李糖脂对离子结合，并和茵体表面作用改变了钙离子的摄取能力。多糖类高 分子量表面活性剂通过接触而结合金属离子，a c a l c o a c e t i c u s 合成的乳化剂可 以结合铀离子。 2 4 涉及致病机制 鼠李糖被认为是铜绿假单胞菌( p a e r u g i n o s a ) 毒性相关的胞外产物，它的 合成受其它毒力因子的调节，其中a l g c 是鼠李糖合成过程的关键蛋白，a l g c 利用磷酸甘露醇变位酶活性和磷酸葡萄糖变位酶活性，参与藻酸盐和脂多糖的 合成。在鼠李糖合成中，a l g c 参与d t d p 1 鼠李糖途径的第一步【2 0 1 。 2 5 抗菌活性 许多脂肽类生物表面活性剂是有效的抗生素，这些物质包括枯草芽孢杆菌 ( 丑s u b t i l i s ) 合成环状脂肽，s t r e p t o m y c e st e n d a e 合成胞外疏水多肽s t r e p t o f a c t i n , 丑b r e v i s 合成的环状对称十肽抗生素短杆菌肽s 和b p o l y m y x a 合成的p o l y m y x i n 和枯草杆菌脂。达托霉素( d a p t o m y e i n ) 是由玫瑰链霉菌( s t r e p t o m y c e s r o s e o s p o r u s ) 合成的含有1 3 个氨基酸残基的脂肽，对s t r e p t o c o c c u sa u r e u s 及 e n t e r o c o c c u s 等引起的皮肤组织感染，有很强的抗性，经过临床试验，于2 0 0 4 年被美国f d a 批准【2 1 1 。 8 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 2 6 调节微生物与表面的吸附和解吸 分泌的生物表面活性剂能够在界面上形成被膜，促进微生物吸附到界面上， 同时抑制其它微生物的吸附四。例如附着与菌体鼠李糖显著提高铜绿假单胞菌 僻a e r u g i n o s a ) 表面的疏水性，而不动节杆菌( a c i n e t o b a c t e r ) 分泌的乳化剂降低 菌体表面的疏水性，说明微生物利用表面活性剂调节表明的疏水性 2 7 与q s 系统( q u o r u ms e n s i n g ) 相关 生物表面活性剂的合成依赖于较高的菌体浓度，高菌浓时合成表活剂可能 提供了选择优势。病原体在菌浓足够高时合成毒力因子是，形成对宿主的局部 攻击【2 3 1 。 2 8 生物被膜形成中的作用 近期研究显示异源细菌间存在着高分子量生物表面活性剂的水平转移，例 如a r a d i o r e s i s t e n sk a 5 3 合成的胞外聚合物a l a s a n 能够结合到s p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i se p a 5 0 5 和a c a l c o a c e t i c u sr a g 一1 表面并改变表面特性。 3 脂肽合成的分子遗传学 不是所有的蛋白质都由核糖体合成，微生物能以非核糖体途径合成天然多 肽，这些多肽是一系列低分子量的次级代谢产物，具有生物活性，可被用作抗 生素，免疫抑制剂，抗癌和抗病毒因子，铁载体及生物表面活性剂等。脂肽的 装配由非核糖体肽合成酶( n o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e s ，简称n r p s s ) 的 多模块酶以硫模板机制完成1 2 4 。 3 1 非核糖体肽合成酶 非核糖体肽合成酶由多个模块组成，模块的特异结卡句域具有特定的酶活， 9 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 催化相应单体结合到新生链肽中。这些结构域包括腺苷酰化结构域( a 结构域) 、 巯基化结构域( t 结构域) 、缩合结构域( c 结构域) 、差向异构结构域( e 结 构域) 和甲基化结构域( m 结构域) 等。如图1 2 所示，a 结构域从可利用的 底物池中选择同源的氨基酸，合成相应的氨酰基a m p ，氨酰基a m p 随后转移 到相邻t 结构域的磷酸泛酰巯基乙胺( p p a n t ) 长臂上，形成氨酰基一s 一酶中间产 物，其中p p a n t 辅基是在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶( p p t a s e s ) 催化下，从乙酰 c o a 转移到t 结构域上的【2 5 1 。氨酰基s 酶中间产物随后从a 结构域转移到c 结构域，和上游的氨酰基s t 结构域复合物、脂酰c o a 、或肽酰基s t 结构域 复合物发生缩合反应，形成肽键，新合成的肽酰基中间产物被t 结构域转移到 下游c 结构域，这样模块中的c a - t 基本单位引入氨基酸等单体而合成肽链。 已经