（食品科学专业论文）应用苯基硼酸酶法合成糖酯.pdf

摘要 摘要 糖酯是一类用可再生资源合成的、无毒、易生物降解的非离子型表面活性剂，目前 已经广泛应用于食品、医药和化妆品等行业，并且可以通过调控脂肪酸和糖的种类以及 酰化的程度来合成不同h l b 值的糖酯。本文针对目前酶法合成糖酯过程中糖在有机溶剂 中溶解度低和产物纯度不够高的问题，以葡萄糖月桂酸酯为典型产品，对苯基硼酸在糖 酯合成过程中的作用进行了研究。 首先对苯基硼酸在糖酯合成的影响过程进行了深入的研究。苯基硼酸的加入明显提 高了葡萄糖的溶解度和反应的专一性：在最佳参数葡萄糖苯基硼酸为1 ：2 ( m o l m 0 1 ) 时， 葡萄糖在叔丁醇中的溶解度大约提高了2 倍，且反应中只有葡萄糖月桂酸单酯生成；糖 的溶解度增加以后，成酯反应初期的反应速率提高了一倍，可望显著缩短反应时间；苯 基硼酸的引入对单糖和中等链长脂肪酸的酯化率提高有显著效果，对二糖和长链脂肪酸 酯化率的提高影响较小。 其次对苯基硼酸增溶条件下酶法合成葡萄糖月桂酸酯的间歇生产工艺进行了优化。 通过单因素实验，确定了间歇反应最佳工艺条件：葡萄糖5 0m o l l ，葡萄糖：苯基硼酸 为1 ：2 ( m o l m 0 1 ) ，酸醇摩尔比为3 ：1 ，脂肪酶添加量为2 0g l ，分子筛添加量为1 0 0g l ， 反应温度为5 0 ，反应溶剂为叔丁醇，反应时间2 4h 。在以上条件下，葡萄糖月桂酸 酯转化率最高为9 0 1 。 研究了苯基硼酸存在条件下，葡萄糖月桂酸酯合成的连续化工艺：溶剂为叔丁醇， 1 ，2 ：3 ，5 一葡萄糖苯基硼酸酯5 0m m o l l ，月桂酸1 5 0m m o l l ，脂肪酶1 0 9 ，分子筛5g ， 每天更换分子筛5g ，流速为o 2m l m i n 。本反应器的产量可以达到1 2 4g , ( l d ) ，葡萄 糖的转化率为5 9 2 ，葡萄糖酯的产量大大高于间歇式生产。研究了产物的分离纯化方 法，利用正己烷对产物进行三次洗涤、离心处理，得到的产物葡萄糖月桂酸酯纯度达到 8 9 4 6 。在此基础上设计了适合工业生产的工艺流程。 采用k a r lf i s c h e r 滴定法测定了反应体系中不同反应阶段的水分平衡浓度，估算了 表观平衡常数。通过k a r lf i s c h e r 滴定法制定了叔丁醇中3 a 分子筛的脱水等温线。利用 反应过程中水分的质量物料平衡以及物质守恒定律，建立了理论预测葡萄糖酯平衡转化 率的数学模型。验证了苯基硼酸存在时，叔丁醇溶剂中脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸单 酯的预测模型的正确性。除分子筛过量和酸醇摩尔比高的情况外，葡萄糖月桂酸单酯的 理论预测平衡转化率与实验值非常吻合。 关键词：有机相脂肪酶催化：葡萄糖酯；苯基硼酸；连续生产；平衡转化率预测 a b s t r a t e a b s t r a c t s u g a r e s t e r sa r e n o n - i o n i c ，n o n t o x i ca n db i o d e g r a d a b l e s u r f a c t a n t st h a tc a l lb e s y n t h e s i z e df r o mr e n e w a b l er e s o u r c e s t h e i rh y d r o p h i l i c l i p o p h i l i cb a l a n c e ( h l b ) m a yb e m o d u l a t e db yv a r y i n gt h ef a t t ya c i d ，t h es u g a ra n dt h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o n n o wt h e yh a v e b e e nw i d e l yu s e di nf o o d ，p h a r m a c e u t i c a la n dc o s m e t i ci n d u s t r i e s e n z y m a t i cs y n t h e s i so f s u g a re s t e r si nn o n a q u e o u sm e d i af a c e sw i t ht w od i m c u l t i e s ：t h eo n ei st h el o ws o l u b i l i t yo f s u g a ri no r g a n i cs o l v e n t ，t h eo t h e ri st h ei m p u r i t yo fe s t e ro b t a i n e d t h i sp a p e rd e a l sw i t h t h ei m p r o v e m e n to ft h es y n t h e s i so fs u g a re s t e rb yt h ea d d i t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i d n l ee f f e c to fp h e n y l b o r o n i ca c i do nt h es y n t h e s i so fs u g a re s t e rw e r ea tf i r s ts t u d i e d t h e i n t r o d u c t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i di n c r e a s e dt h es o l u b i l i t yo fg l u c o s ea n di m p r o v e dt h e s p e c i f i c i t yo f t h er e a c t i o n a tt h eo p t i m a lm o l a rr a t i oo f g l u c o s et op h e n y l b o r o n i ca c i d ，t h a t i sl ：2 ，t h es o l u b i l i t yo fg l u c o s ew a si n c r e a s e dt w ot i m e sa n dt h ep r o d u c t i o no n l ym o n o l a u r o y l g l u c o s ee s t e rw a sp r o d u c e d t h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t ew a sd o u b l e dw h e np h e n y l b o r o n i ca c i d w a sa d d e d t h ei n t r o d u c t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i di n c r e a s e dr e m a r k a b l yt h ec o n v e r s i o no f m o n o s a c c h a r i d ea n dt h a to ff a t t ya c i d sw i t hm e d i u mc a r b o nc h a i n s ，b u th a dl i t t l ee f f e c to n d i s a c c h a r i d ea n df a t t ya c i d sw i m l o n gc a r b o nc h a i n s 砀eb a t c hs y n t h e s i so fl a u r o y lg l u c o s ee s t e r si nt h ep r e s e n c eo fp h e n y l b o r o n i ca c i dw a s t h e no p t i m i z e d n l eo p t i m a lc o n d i t i o n so fs y n t h e s i sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：g l u c o s e 5 0m m o l l ，m o l a rr a t i oo fg l u c o s et op h e n y l b o r o n i ca c i d1 ：2 ，m o l a rr a t i oo fl a u r i ea c i dt o s u a g r3 ：1 ，d o s a g eo fl i p a s e2 0g la n dt h a to fm o l e c u l a rs i e v e s 10 0g l ，s o l v e n tt e r t - b u t y l a l c o h o l ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e5 0 ，r e a c t i o nt i m e2 4h ac o n v e r s i o nr a t i ou pt o9 0 1 w a s o b t a i n e d 1 1 1 ee f f e c to fp h e n y l b o r o n i ca c i do nt h ec o n t i n u o u ss y n t h e s i so fs u g a re s t e rw a sa l s o i n v e s t i g a t e d o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rc o n t i n u o u sp r o d u c t i o ni nt e r t b y t u la l c o h o lw e r ea s f o l l o w s ：1 , 2 ：3 ，5 - g l u c o s ep h e n y l b o f i ce s t e r5 0m m o l l ，l a u r i ea c i d15 0m m o l l ，d o s a g eo f l i p a s e10ga n dt h a to fm o l e c u l a rs i e v e5gp e rr e a t o r , 5gm o l e c u l a rs i e v ew e r ed a y l yr e p l a c e d ， f l o wr a t e0 2m l m i n 1 kp r o d u c t i v i t yo ft h i sc s t rr e a c t o rh a sr e a c h e dt o12 4g ( l d ) ， w h i c hw a sm u c hm o r et h a nt h a to fb a t c hr e a c t i o n 1 1 1 ec o n v e r s i o no fm a l t o s ei s5 9 2 t h e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fl a u r o y lg l u c o s ee s t e rw a sa l s ot e s t e d a f t e rw a s h i n gt h er e a c t i o n m i x t u r eb yh e x a n ea n dt h e nc e n t r i f u g a t e df o rt w ot i m e s ，t h ep u r i t yo ft h ef i n a lp r o d u c tw a s 8 9 4 6 af l o ws h e e tw a sp r o p o s e df o rt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n 砀ee q u i l i b r i u mo fw a t e ra td i f f e r e n tr e a c t i o ns t e p sw a sd e t e r m i n e db yt h ek a r lf i s c h e r m e t h o d t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r mo fw a t e ro n3 am o l e c u l a rs i e v ei nt e r t b u t y la l c o h o lw a s d e t e r m i n e db yt h es a m em e t h o d am a t h e m a t i cm o d e lw a sp r o p o s e do nt h eb a s eo ft h em a s s b a l a n c eo fw a t e ra n dt h el a wo fm a s sa c t i o nf o rp r e d i c t i n gt h ee q u i l i b r i u mc o n v e r s i o nr a t i of o r t h es y n t h e s i so fl a u r o y lg l u c o s ee s t e r t h ev a l i d i t yo ft h em o d e lw a sc o n f i r m e d t h e p r e d i c t e dc o n v e r s i o n sf o rm o n o l a u r o y lg l u c o s ee s t e ra g r e e dw e l lw i t ht h ee x p e r i m e n t a ld a t a e x c e p tf o rt h ec a s e sw h e r et h em o l a rr a t i oo ft h el a u r i ea c i dt ot h ea l c o h o lw a sh i 幽a n dt h e e x c e s sa m o u n to fm o l e c u l a rs i e v e k e y w o r d s ：l i p a s e - c a t a l y z e di no r g a n i cs o l v e n t ；l a u r o y lg l u c o s ee s t e r ；p h e n y l b o r o n i ca c i d ； c o n t i n u o u sp r o d u c t i o n ；p r e d i c t i o no ft h ee q u i l i b r i u mc o n v e r s i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究戍果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：劫亏堰 日规以、7 引 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件争磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，- j - 以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：酗冒口g 、；引 导师签名： 7 苫是 日 期：口苫- ；叫 第一章绪论 第一章绪论 1 1 非水介质中的脂肪酶催化 1 1 1 非水相酶催化体系 1 9 8 4 年z a k sa 和k l i b a n o va m 【i 】首次发表了关于有机相介质中脂肪酶的催化行为及 热稳定性的研究报道，使生物催化剂和酶工程的研究取得了突破性的进展，极大地拓宽 了酶促反应合成新化合物的应用领域。传统的酶学领域迅速产生了一个全新的分支 非水酶学。非水酶学的研究在近2 0 多年里取得了长足的发展，非水酶学方法在多肽合 成【2 】、聚合物合成【3 一q 、药物合成【5 吲以及立体异构体拆分【7 8 3 等方面显示出广阔的应用前 景。脂肪酶所应用的反应体系也有了较大的改善，主要集中在以下几个方面： 1 1 1 1 水有机溶剂两相体系 水有机溶剂两相体系是指由水相和非极性有机溶剂相组成的分相反应体系，酶溶 解于水相中，底物和产物溶解于有机相中，这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以 保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。水有机溶剂两相体系己成 功地用于强疏水性底物如甾体、脂类和烯烃类的生物转化。 1 1 1 2 微水有机溶剂单相体系 均相的有机溶剂体系是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水( 9 8 ) ，形成 固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。该体系中，溶剂容易夺取酶维持构象所必需的水， 导致酶失去活性。l g p 是常用来描述溶剂对生物催化体系影响的一个衡量参数，l g e 值越 大，溶剂的极性就越低。规律是：酶在l 酽 2 的极性溶剂中活性较低，在2 4 的溶剂中具有较高活性。有机溶剂体系对脂肪酶催化作用的积 极影响表现在保持体系较低的a w ，提高有机底物溶解性使反应速率加快，酶在载体上 的解吸减少使固定成本降低、低佛点溶剂使回收更为方便等方面【9 1 。 1 1 1 3 反胶束体系 反胶束体系是表面活性剂与少量水形成的有机溶剂体系【1 0 1 。表面活性剂溶于有机溶 剂，当浓度大于临界胶团浓度时，会在有机相中形成聚集体，成为反胶束。反胶束中以 极性基团头超内、非极性基团头朝外排列，形成亲水内核，称为“水池”，可增溶蛋白质 和酶。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中，大多数酶 能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”( s u p e r a c t i v i t y ) e 1 1 】。已报道有5 0 多种酶 在反胶束体系中具有催化活性。f e m a n d e s 等人【l2 】利用a o t 异辛烷反胶束体系研究t l l 脂肪酶( t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s el i p a s e ) 催化合成十二烷酸乙酯反应。优化实验表明，在 反应温度为3 0 、p h5 6 、w o 为1 0 、醇酸摩尔比为1 ：5 时，反应1h 后酯合成率可达9 2 。 胶束酶学研究的权威m a r t i n e k 预言，反胶束体系有可能成为生物转化的通用介质【1 3 1 。 1 1 1 4 超临界流体体系 超临界流体( s u p e r c d t i c a lf l u i d s ) 如超临界二氧化碳、氟里8 c f 3 h 、烷烃类( 甲烷、乙 烯、丙烷) 或某些无机化合物( s f 6 ，n 2 0 ) 等都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂。该体系 提高了底物的分散性，降低了体系的粘度，使底物与酶的结合更为容易。与有机溶剂相 江南大学硕士学位论文 比，底物的溶解性更好。由于溶剂的回收彻底，因此可以获得高纯度的产物，合成的酯 类更适合于在食品中应用。但在超临界c 0 2 中，反应混合物减压时，一些酶的活性有损 失，而高压设备又使连续生产和规模生产变得困难。因此这种方法的经济性受到质疑4 i 。 1 1 1 5 无溶剂或少溶剂反应体系 2 0 世纪9 0 年代绿色化学兴起，各国科学家为避免有机溶剂散失到环境中造成污染， 研究创造了许多取代传统有机溶剂的绿色化学方法，其中最彻底的是完全不用溶剂的无 溶剂有机合成，发展到酶催化反应中，即为无溶剂酶催化反应体系。无溶剂体系中酶直 接作用于反应底物，提高了反应底物浓度和产物浓度，反应速度快，产物收率高，后处 理简单，环境污染小，满足产品和生产的安全性是一种极具潜力的清洁反应新技术。对 酶的活性和选择性影响不大，同时由于没有溶剂等的稀释作用，产物浓度较高，反应速 度快【1 5 1 。y a n g 等 1 6 】在无溶剂条件下，l i p o z y m er mi m 催化猪油和大豆脂肪酸反应，得 到的产物与乳脂成分类似，其熔点( 3 2 2 5 c ) 及亚油酸与亚麻酸的比例都与乳脂的相同。 实验证明，猪油与大豆脂肪酸经酶催化酸解后得到的产物可以作为乳脂的代替品。 b o u s q u e t 1 7j 等人在无溶剂条件下用n o v o z y m4 3 5 固定化酶催化q 丁基葡萄糖苷与乳酸丁 酯发生酯交换反应，反应仅3 0 h 就有9 5 以上的0 5m o l l 的0 【丁基葡萄糖苷转化为产物， 得到了高浓度的产物( 1 7 0g l ) 。无溶剂酶促合成o c 丁基葡萄糖苷乳酸酯是一种非常有效 的方法，不仅适用于乳酸，对其他0 羟基酸也同样适用。 无溶剂体系的缺点是，底物或产物比例过高会明显地影响反应介质“溶剂”的组成和 性质。例如，在只有反应物的体系中，有介质粘度过高的可能性( 尤其是长链醇) ，这会 导致反应物混合性差，反应速度低【1 8 】。 1 1 1 6 离子液体 离子液体( i o n i cl i q u i d s ) 是近几年来研究较多的一种新型反应介质，它是由有机阳离 子和无机或有机阴离子构成的低熔点盐类，在室温或较低温( 1 0 0 ) 下呈液态，通常称 为室温离子液体1 1 9 】。作为一种新颖的、非水相的溶剂，具有可忽略的蒸汽压力、不挥发 性、高( 热、化学) 稳定性及对环境友好等特性，故称之为“绿色溶剂”。另外，离子液体 的极性、疏水性、粘度及溶解性均可通过其阳离子和阴离子的适当修饰来调节，故又称 之为“设计溶剂”【2 0 】。l a s z l o _ j g l c o m p t o n l 2 1 】研究了不同离子液体中- 乙酰l 苯丙氨酸乙基 酯和- 乙酰l 酪氨酸乙基酯转换成相应的丙基酯的反应，发现在 b m i m p f 6 或 【o m i m p f 6 】中的酯交换反应速率与异辛烷或乙腈中的反应速率具有相同的数量级【2 2 1 ， 相似的反应在 e m i m 【( c f 3 s 0 2 ) 2 n d p ( 反应条件少许不同) 的反应速率则高出一个数量 级【2 3 1 。 1 1 2 非水相脂肪酶技术的应用 随着经济的发展和社会的进步，人们的环保意识和食品安全性意识增强，酶法合成 显示出更大的优势和发展潜力。脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) 本质上是水解三酰化甘油酯键的 丝氨酸水解酶，在有机相中可使反应热力学平衡从水解反应转为其逆反应，如酯合成、 酯交换、肽合成、酯聚合、酰化等【2 4 啦】，在多个行业有重要的应用前景，如： 2 第一章绪论 1 1 2 1 食品行业 脂肪酸单甘油酯和糖酯，具有良好的表面活性，在食品业中的应用是多方面的： 乳化作用，糖酯既可用作水包油型乳化剂，又可作为油包水型乳化剂 3 3 - 3 4 】。如用于冰淇淋 生产，可使制品成型稳定，风味独特。作为乳化稳定剂，可均匀分散稳定制品的各组份， 使制品外观光滑完整，如用于果糖加工，可提高糖的乳化性能。控制结晶【3 5 】，糖酯有 促进结晶和控制结晶的双重作用，在巧克力生产中，既可防结晶生长，又能预防表面起 “霜”。单甘酯与油脂相互作用，能促进其晶型的生成，具有改良塑性油脂的延展性、酪 化性及吸水性的作用以及防止加热过程中飞溅等特点，已用于人造奶油、起酥油、蛋黄 酱、调味料及其他专用油脂的生产。对淀粉的络合作用，糖酯用于面包、糕点等的生 产，可强化面团，可使制品膨松、柔软，还有抗氧化防霉作用，防止面粉老化【婚3 8 】。单甘 酯与淀粉成复合剂时形成一个螺旋状结构，在螺旋状结构内表面形成亲油中心，极性羟 基在螺旋外部，单甘酯及其他表面活性剂物质长链插入螺旋内孔形成不可逆转化的复合 物，从而抑制了淀粉的老化。单甘酯与面筋蛋白相互作用可形成蛋白质一类脂一蛋白质 和淀粉一类脂一蛋白质的对称类型的复合体，从而增强了面筋品质，同时还是乳酸单甘 酯、柠檬酸单甘酯、琥珀酸单甘酯、二乙酰单甘酯等系n - 孚l , 化剂的母体【3 9 。4 2 1 。果品保 鲜 4 3 1 ，将果品在糖酯溶液中浸泡，凉干，在果品表面会形成薄膜，防止过多的水份蒸发， 起到保鲜作用。杀菌作用m 书】，糖酯用于肉制品及禽蛋食品，其杀菌作用可延长制品 的储存稳定性。降低胆固醇1 4 6 1 ，高胆固醇类食品加入糖酯，食品中的胆固醇会与糖酯 结合，不为人体吸收，而排出体外。可以用来开发医疗保健食品。 1 1 2 2 日用化妆品行业 近年来，经济的迅速增长，生活方式的改变，尤其受到“回归自然”和“健康”热潮的 影响，消费者要求化妆品具有实用、安全、营养、美容等综合效果。生物制品开始渗入 化妆品行业。 糖酯具有极高的安全性，且具有良好的乳化、分散、增溶等性能，能使油脂、药物 成份及化妆品其它成份分散稳定，因此特别适宜作眼部、面部化妆品乳化剂和乳化稳定 剂，也常用于洗发、护发制品、唇膏等化妆品及日化制品。此外，以蔗糖酯为主要成份 生产的化妆品，可在皮肤表面形成多孔的类脂藻膜，以保持皮肤水份，滋润护养皮肤，是 皮肤优良的润滑剂和保湿成份。糖酯还可防止油脂原料的分层变质，延长制品的货架寿 命和使用期限1 4 7 1 。 维生素a 及其衍生物广泛用于化妆品、护肤产品和食品、饲料的营养强化。但v a 非常不稳定( 很容易被空气氧化或由于紫外线失活) ，而且v a 对于皮肤刺激性强。通过 把v a 转化为v a 酯稳定化可以减少光致降解和刺激。可以用多种化学方法合成视黄醇 酯，但产量较低，且最终产物中有化学残留。在有机溶剂中用酶催化的生物学方法来生 产视黄醇酯【4 引，能有效地进行区域选择性和对映体选择性的酯化或转酯化。 1 1 2 3 医药行业 中碳链脂肪酸单甘酯的乳化性不好，不能作为乳化剂使用，但是它对于维生素类、 杀菌剂、急速、抗生素、保存料、着色料等各种医药品化合物溶解度很高。它具有将胆 江南大学硕士学位论文 甾醇等高熔点化合物大量溶解的性质，因此可以作为胆甾醇类胆结石的溶剂来利用，临 床效果极佳。此外中碳链脂肪酸单甘酯对枯草菌、霉菌、革兰氏阳性菌均有显著的抗菌 效果。同时临床试验证明它可将直肠粘膜细胞的细胞膜中的胆甾醇溶化，使细胞膜结构 变化，对促进直肠吸收有较好的效梨4 9 5 0 】。 多价不饱和脂类对人们健康非常有益，在药物工业方面应用潜力很大。3 多不饱 和脂肪酸( p u f a ) ? n t 亚麻酸，二十二碳六烯酸( d h a ) ，二十碳五烯酸( e p a ) 等多存在于深 海冷水鱼肝油和月见草籽油等油中，具有防治心脑血管疾病、降低糖尿病、高血压和癌 症的发病率、增加免疫力和促进儿童神经发育的作用。但长链p u f a 的吸收有一定困难， 且d h a 和e p a 对消化道有一定的刺激作用。以天然脂类化合物形式富集p u f a ，促进 p u f a 的吸收具有应用意义。c a r d a n 等【5 l 】报道在脂肪酶的作用下，将富含p u f a 的鳕鱼肝 油浓缩到甘酰酯中，可得n 8 5 甘三酯( 含2 5 e p a 和4 5 d h a ) 。s h i m a d a 等【5 2 】将p u f a 富集于胆甾醇和磷脂中，利用选择性脂肪酶将沙丁鱼油和自由脂肪酸中的e p a ，d h a 通 过酯化反应富集于胆固醇中。l e e 等【5 3 】利用1 ，3 位置专一性脂肪酶，将e p a 整合到短链 和中链三甘酰中，催化生产富含p u f a 的结构化脂质。 糖酯在医药工业中的应用很广泛。糖酯具有很强的表面活性作用( 如乳化、分散、 增溶及润滑等特性) ，而且与药物配伍性能良好，可改善崩解性能，加快释放速度，促使 药物分散均匀，防止沉淀结晶，因而有利于制品加工，延长药物保存时间。糖酯可作为一 种医药助剂的辅料，可作为内服药的乳化剂、分散剂、增溶剂、稳定剂和增稠剂以及乳膏 的基料，而且也可作为片剂的崩解剂、粘合剂、润滑剂以及激素类、消炎镇痛类、心血 管类等药物的透皮吸收剂的贮藏材料。当用于口服制剂时，能减少对胃肠道的刺激作用。 由于它对皮肤和粘膜不产生刺激作用，又不改变皮肤的p h 值，也适用于添加到栓剂和膏 剂中。糖酯还可供静脉注射用【5 4 4 6 。 1 1 2 4 化工和其他行业 脂肪酸单甘油酯在高分子合成领域可用作合成塑料的抗静电剂。蔗糖酯【5 4 1 在纺织工 业，可以用作匀染剂、抗静电剂来增加纺织物的润湿性和柔软性。在合成纤维上可以做 合纤助剂。在合成橡胶、塑料行业，可以做生产聚氨酯等反应用的乳化剂、塑料的无毒 稳定剂、增塑剂及改性添加剂，在石油工业中作泥浆抑制剂与灌注点降低剂，用于石油 开采等。 生物柴油是一类以天然植物油为原料制成的脂肪酸单酯，具有环保清洁、可再生、 安全性好等优点。用生物酶催化法合成生物柴油【5 7 - 5 8 1 ，不仅既可以催化精炼动植物油， 同时可以催化酸值较高且有一定水分含量的餐饮废油，具有反应条件温和，副产品分离 工艺简单，废水少，设备要求低等优点。 1 2 酶法合成糖酯的研究现状 1 2 1 糖酯概述 糖酯化合物是在自然界中广泛存在的一类在细胞膜上承担物质传输和能量传递的 具有重要生理活性的物质，同时，该类物质还具有两亲结构，是一类重要的非离子生物 表面活性剂。通过改变组成糖酯的脂肪酸碳链的长度和糖基上羟基的数目可以调节其亲 第一章绪论 水亲油平衡值，最高可达1 1 1 3 ，最低可到3 5 - 4 0 ，既可作为水包油型乳化剂，又可作为 油包水型乳化剂，具有去污、乳化、洗涤、分散、湿润、渗透、扩散、起泡、抗氧、粘 度调节、杀菌、防止老化、抗静电和防止晶析等多种功能，主要用于食品、化妆品、医 药、洗涤剂、纤维工业中。糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。 现在研究较成熟的，已经实现商品化的糖酯主要是蔗糖酯【5 引。7 0 年代以来对蔗糖酯 的研究分化为两大分支：一个分支以日本为代表，研究开发h l b ( 2 1 6 ) 的系列蔗糖产 品，主要用于食品行业，作食品乳化剂：另一分支以美国为代表，从人类营养学出发， 开发出脂肪替代品蔗糖聚酯( 平均酯化度6 8 ) 。 日本是世界上蔗糖酯的生产、消费大国，1 9 5 9 年大日本制糖工业株式会社首先实现 了蔗糖酯的工业化生产，同时批准蔗糖酯作为食品添加剂使用。目前日本是世界上蔗糖 酯生产规模最大的国家，主要生产厂家有三菱化成工业株式会社和第一工业株式会社， 总生产能力超过6 0 0 0t a 。 美国在蔗糖酯方面的研究仅次于日本，拥有大量的专利。一些主要工业国家，如英 国、法国、意大利、比利时、澳大利亚、荷兰等也均有生产，并获准用作食品添加剂。 我国从8 0 年代初就开始对蔗糖酯进行了系统的研究和开发，国内最早开展蔗糖酯研 究的是无锡轻工业学院( 现江南大学) ，后因成本较高中途停止。近年来，国内蔗糖酯 工业发展迅速，目前国内共有3 0 多个生产企业，主要生产厂家有湛江油脂化工厂、湛江 食品添加剂厂、浙江金华第二制药厂、带安振兴化工厂、上海伊凡尔精细化工公司、苏 州吴县蔗糖酯厂等。 糖酣5 8 】由于其良好的性能，市场需求量快速增加，近1 0 年来国际市场以每年 8 1 0 的速度增长。美国拥有大量的专利技术，也曾进行过工业化生产，但现已停产， 国内需求依赖进口。欧洲仅法国的原r h o n ep o u l e n c 公司生产，且产量也很小。原苏联和 东欧国家均未生产。 目前，我国糖酯的产量约为3 5 0 0t a 。其中8 0 用作食品乳化剂，需求量以每年 7 1 0 的速度增长，而蔗糖多酯的需求速度更迫切，将达到年均1 5 的速度。从上述 数据可以看出糖酯行业有广阔的前景。 1 2 2 合成方法 传统的合成糖酯的方法是化学法，反应条件激烈，容易发生糖的碳化和内酯化等副 反应，而且化学合成反应对酯键位置的选择性差，酯键数量难于控制，生成产物为多种 酯的异构体和副产品的混合物，并伴有难以解决的色泽加深问题。同时化学合成过程中 不可避免地会引入有毒的化学物质，其产品难以在食品、医药和化妆品等领域应用。随 着现代生物技术的迅猛发展和人们对安全性的要求越来越高，非水相酶技术在糖酯合成 中的应用成为研究的热点。非水相酶法合成糖酯主要有以下几种方法： 1 2 2 1 直接酰化法 猪胰脂肪酶在吡啶( 少数能溶解碳水化合物的溶剂之一) 中可催化葡萄糖、半乳糖、 甘露糖及果糖的伯羟基酰化反应制备糖酯，酰化剂为高活性的三氯乙醇脂肪酸( c 2 c 1 2 ) 酯。d u c r e t 等【5 9 】在合适的溶剂中用糖或糖酰基酯与羧酸反应，减压下蒸出溶剂和产生 江南大学硕士学位论文 的水，得到糖酯。多种脂肪酶【6 0 】可在吡啶中催化二糖或三糖( 如蔗糖、乳糖、海藻糖及 棉子糖) 的酯化反应，如枯草杆菌蛋白酶可在d m f 或毗啶中催化二糖( 如蔗糖、麦芽糖、 乳糖、纤维二糖等) 。 i 2 2 2 微乳化法 微乳液是将表面活性剂、水和油混合后自发形成的热力学稳定的具各向同性的透明 的溶液，微乳化法就是以微乳液为反应介质。p e t e rs k a g e l i n d 等 6 1 j 用脂肪酸钠作为乳化 剂形成微乳液体系来催化合成乙酸基葡萄糖苷，糖和脂肪酸的转化率分别为7 1 和9 6 ， 在整个反应过程中经过减压来消除酯化过程中产生的水。微乳液体系的优点在于利用产 物本身做乳化剂，从而降低分离纯化的难度，但缺点是反应过程中体系的稳定性可能会 遭到破坏。 1 2 2 3 糖基修饰法 对糖进行修饰以增加其在有机介质中的溶解度也是在糖酯合成中普遍采用的方法。 对糖的修饰有多种方式，常见的有缩酮和烷基糖苷【6 2 】形式。缩酮形式修饰的糖，经过酶 催化反应之后，在温和的酸解条件下脱去丙酮叉，最后得到单糖酯或双糖酯，产率较高。 但是，毕竟引入丙酮叉基团和脱去丙酮叉基团的反应，在一定程度上使糖脂的合成复杂 化【6 3 1 。引入烷基修饰基团的反应很简单，而且一些酶促反应后得到的产物本身就是很好 的表面活性剂，无需再脱去修饰基团。 1 2 2 4 固定化法 酶或糖固定化后，可以促进酶与糖充分接触从而提高反应的速度和产率。为了克服 糖在反应介质中的不溶性，t s i t s i m p i k o u 等【6 4 】把一系列单糖固定在硅胶上，而后将它们 引入到反应体系中，并比较了来自于c a n d i d aa n t a r c t i c a 和c a n d i d ar u g o s a 两种脂肪酶催化 月桂酸糖酯合成的反应，得到了较好的转化率和区域选择性( 反应1 0 0 在6 o h 位酰化) 。 张念湘等【6 5 】将葡萄糖( 或果糖、木糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖等) 用水溶解，加入定量 脂肪酶再用硅胶吸附，冷冻干燥，再在有机溶剂中与乙酸酐酰化得到糖酯。铁翠娟等嘲1 以吸附在硅藻土上的假丝酵母( c a n d i d as p 1 6 1 9 ) 脂肪酶为催化剂，在无溶剂体系中，合 成了海藻糖月桂酸酯，酯化程度达9 5 。 1 3 苯基硼酸与糖结合的研究与应用 还原糖的有机硼酸酯最早是通过熔融技术制备的，随后葡萄糖的苯基硼酸酯应用到 合成中，1 , 2 ：3 ，5 一葡萄糖苯基硼酸通常用于制备伯羟基取代的葡萄糖衍生物。1 9 7 3 年， p e t e r 等人【6 7 】合成了阿拉伯糖和木糖的苯基硼酸酯和丁基硼酸酯，并对其结构进行了核 磁鉴定。试验结果表明：硼酸酯在丙酮和吡啶中的制备效果没有明显的区别，这一过程 可以在极性较弱，低毒性的有机溶剂中进行。同时该反应简单易行，应用到其他生产工 艺的可行性很高。1 9 7 4 年，p e t e r 等人【6 8 】又合成了海藻糖、葡萄糖、果糖、甘油醛的苯 基硼酸酯并对其结构进行了核磁鉴定和质谱分析。 1 9 9 2 年，h a r t o h p a r k 等【6 9 】以苯基硼酸作为增溶剂，增加葡萄糖在苯中的溶解度， 再在葡萄糖苷酶的作用下合成龙胆二糖、槐糖、纤维二糖和昆不二糖。如果没有有机硼 6 第一章绪论 酸存在，该反应不会发生。针对非水相酶法合成糖酯过程中，糖在有机溶剂中的溶解度 过低，成为限制糖酯产量提高的“瓶颈”的问题，人们开始把苯基硼酸增溶与糖酯的合成 联系 7 0 】在一起。i k e d a 等f 7 l 】人研究了苯基硼酸增溶条件下p s e u d o m o n a ss 职脂蛋白酶催化 葡萄糖与乙烯基丁酸在叔丁醇中的反应，4 5 ，2 5 0r p m ，2 4h 后产率为1 0 0 。c h r i s t i 锄 s c h e c k e r m a n n 等1 7 2 1 考察了苯基硼酸对果糖与长链脂肪酸( 如棕榈酸、硬脂酸) 在正己烷 中合成的影响，反应条件为l i p o z y r l c t m 或c a n a d i d aa n t a r c t i c alg ，6 0 ，1 2 0r p m ， 2 4h 后糖酯转化率大约为4 0 。不同学者对苯基硼酸在糖酯合成中的研究条件差别很 大，结果也存在明显的差异。 苯基硼酸衍生物还有其他重要的应用。糖类【7 3 l 是人体不可缺少的能源和生理活性物 质，参与重要的生命过程，包括对外部信号的传递和识别、细胞膜的构建等，检测或识 别生物体中重要的单糖对理解生命过程有着重要的意义。目前，硼酸及其衍生物作为受 体对糖分子的识别被广泛研究与应用1 7 4 - 7 s 】。苯基硼酸衍生物在水中溶解度小，与环糊精 作用后可以增强其在水中的溶解性，很好的识别糖分子。 糖尿病【7 6 是一种以高血糖特别以进餐后血糖升高为主要特征的代谢性疾病，降低血 糖是目前治疗糖尿病的主要方法。由于血糖升高与进餐密切相关，而目前的给药方式难 以达到同步和适量，临床上经常出现降糖不理想或低血糖反应，因此人们一直在寻找能 够满足上述要求的糖敏感材料。其中以苯基硼酸材料最受人们关注。药物释放机理中， 药物扩散机理起控制作用。人们根据进餐后血糖浓度升高，糖能够迅速与苯基硼酸结合， 从而是使含有药物的凝胶体系中的亲水基团迅速增多，水溶性增大，膨胀率增大，药物 随着凝胶网络的增大而扩散。当血糖浓度低于正常水平的时候，与苯基硼酸结合的糖部 分解离出来，使的凝胶的水溶性较弱，膨胀率降低，宏观表现为药物浓度减小。苯基硼 酸材料的应用显著的缩短了糖敏感的响应时间，在糖尿病治疗领域有广阔的应用前景。 现在，苯基硼酸材料已经应用到了传感器、糖分离、淋巴细胞的分裂促进剂和治疗肿瘤 的靶向给药系统。 1 4 不同生物催化反应器合成糖酯 1 4 1 生物催化反应器的基本概念 生物反应器是指有效利用生物反应机能的系统( 或场所) 。生物反应器不仅包括传 统的发酵罐、酶反应器，还包括采用固定化技术后的固定化酶或细胞反应器、动植物细 胞培养用反应器和光合生物反应器等。生物反应器设计的主要目标是使产品的质量高， 成本低。生物反应器是整个生物过程的中心，是影响整个过程的经济效益的一个重要方 面，是实现生物技术产品产业化的关键设备。 在生物反应器中，反应物从反应液主体到生物催化剂表面的传递过程对于生物反应 过程影响很大，特别是机制的传递速率低于生物催化剂的反应速率时，生物催化剂的催 化效率将受到机制传递速率的限制。因此，产物的生成速率可通过提高限制性基质的传 递速率来加以改善。 在生物反应工程已经作为独立的科学出现的今天，随着大规模工业化生产的过程， 迫切需要将最优化技术应用到生物反应工程这一领域，提高生物反应控制的自动化和优 7 江南大学硕士学位论文 化控制水平，从而促进生物反应器的迅速发展。 1 4 2 生物催化反应器的分类 根据反应器的操作方式，生物反应器可分为间歇式反应器、连续式反应器和半间歇 式反应器等。 1 4 2 1 间歇式反应器 以酶为催化剂的间歇式生物反应器，物料一次性投入，产物一次性取出。底物和产 物的浓度随反应时间的变化而变化。在该类反应器内进行的反应过程是一个非稳态过 程，适用于多品种、小批量、反应速率慢的反应过程。 目前对有机相脂肪酶催化合成糖酯的工艺研究还处于探索阶段，所以大多数的报道 仅限于在间歇式反应器中合成糖酯。例如在间歇式反应器中有机相脂肪酶催化脂肪酸和 葡萄糖合成葡萄糖脂肪酸酣7 7 刁羽，以及一些其他单糖或二糖的脂肪酸酬7 9 铷】。 1 4 2 2 连续式反应器 采用连续式操作方式的反应器称为连续式生物反应器。连续式生物反应器中的反应 过程大多属于稳态过程，物料和反应液以一定的流速进入和流出反应器，不断地补充生 物转化所需要的底物，而转化产物则不断排出，使生物催化反应连续稳定地进行。连续 式生物反应器提高了生产效率，可以克服在间歇式生物反应器中，由于底物耗尽或产物 积累所造成反应持续时间短、产量低、副产物多等缺点。采用连续式反应器，由于反应 器内流体的流动状态会影响到底物的转化率，所以把握好反应液的流动状态与流体的混 合程度是很重要的。根据流体流动的特性连续式操作的生物反应器可以分为活塞式反应 器和全混流式反应器。 要最终实现酶法合成糖酯的工业化生产，必须采用连续式反应器进行生产。最近国 外也有一些采用这两种反应器连续催化合成糖酯的相关报道：女1 z h a n gx 等【8 1 1 利用c s t r 合成麦芽糖月桂酸单酯，w a t a n a b ey 等1 8 2 - 8 3 】分别利用了c s t r 和填充床反应器合成v c 饱 和脂肪酸酯，w i p h u mk a e w t h o n g i s 4 】等人利用c s t r 和填充床反应器连续合成了棕榈酸油 酸酯。p i a oj 等【8 5 8 6 】利用填充床反应器合成了赤藻糖月桂酸酯和其它一些糖酯。 1 4 2 3 半连续式反应器 原料