土壤中纤维素分解菌的分离鉴定.doc

土壤中纤维素分解菌的分离、鉴定以及酶活性分析 摘 要：纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。关键词：纤维素酶产生菌；鉴别培养基；透明水解圈一、 实验原理： （一）纤维素与纤维素酶（1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。 （2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。（二）纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实验材料及用具（一）实验材料（1） 样品的采集与处理样品的采集： 采集土样时，应选择富含纤维素的环境。若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右，也会有能分解纤维素的微生物生长。样品的处理：采集后的样品保存于4并在2d内使用。（2）培养基羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基（1000ml）CMC-Na： 20gNa2HPO4: 2.5gKH2PO4: 1.5g蛋白胨： 2.5g琼脂： 20gpH： 7.0-7.5. （二） 仪器及用具99ml无菌水（带玻璃珠，玻璃珠用量以充满瓶底为最好）1瓶，含9ml无菌水的试管6支，无菌培养皿，1ml无菌移液管，土壤样品，天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器等。三操作步骤土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（一） （一）土壤土壤取样土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。取表层一下510cm处的土样，放入无菌袋中保存备用。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。（二） （二）选择培养选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在121下高压蒸汽灭菌20m in。选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30下振荡培养12d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。（三） （三）梯度稀释（1） （1）制备土壤悬液：称取土壤5g迅速倒入含45ml无菌水的锥形瓶中振荡510min，使土壤充分打散，即成10-1的土壤悬液。（2）稀释：用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液1ml，吹入9ml的无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-310-6的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于上一次，以减少稀释中的误差。（四） （四）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）培养基的制备参照培养基组成配制。在1000mL三角瓶中装入500mL培养基，在121下高压蒸汽灭菌20min。 （2）倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入1520mL培养基，凝固后待用。（3）涂布平板：将稀释度为10-410-6的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。30倒置培养观察，直到出现明显的菌落。（4）染色与观察取含有明显菌落的培养基，滴加约一滴管的刚果红染料摇匀，染色约15分钟后加入1mol/l的nacl浸泡1015min，洗去染液，观察是否产生透明圈及其大小（五）实验结果记录及分析 (1)实验记录 （2）结果分析三个不同稀释度的培养皿产生的菌落数不同，浓度越大菌落数越多，大量菌落数连成一片，形成较大的透明圈。稀释度为10-6的培养皿内产生了单菌落，观察发现其透明圈较小，由酶的活性与透明圈大小具有一定的线性关系，判断出改种菌类对纤维素的分解能力较弱。（六）注意事项（1）在土壤稀释分离操作中，每稀释十倍最好更换一支移液管；（2）土壤细菌及真菌较多，培养时应选取较高的稀释度；